β−１，４−グルカンをα−グルカンに変換する方法
β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する、方法が提供される。この方法においては、上記β−１，４−グルカンは、セロビオースであり、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼであり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間は、デンプンなどのα−グルカンを消化してエネルギー源として利用している。α−グルカンは食品産業以外にも、医薬、化粧品、化学工業、製紙、繊維などにおける原料としても幅広く利用されており、非常に有用性の高い物質である。α−グルカンの中でも特に、アミロースは豊富な機能ゆえ、幅広い分野での利用が期待されている。
【０００３】
近年、人口増加により食糧危機が問題視されており、植物の生産するデンプンだけでは将来エネルギー源が不足すると予想されている。
【０００４】
一方、人間は、セルロースなどのβ−グルカンを消化できないので、エネルギー源として利用することができず、食物繊維成分としてのみ利用されている。それゆえ、β−グルカンを食糧危機問題の解決には利用できない。しかし、β−グルカンの年間生産量は、デンプンの約２万倍と推定されており、枯渇の心配はない。そのため、β−グルカンを、人間がエネルギー源とし得る物質に変換する種々の試みが行われている。
【０００５】
例えば、セルロースをグルコースまで分解し、エタノール醗酵に利用することが検討されている。グルコースは人間によって代謝され得るが、甘すぎるため、エネルギー源として大量に摂取することができない。
【０００６】
β−グルカンを人間にとってより摂取しやすい物質（特に、同じグルコースのポリマーであるデンプン）に変換することができれば、食糧危機問題の解決に大きな貢献ができるが、これまでにそのような技術は開示されていない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、β−グルカンを原料としてα−グルカンを産生することを試みた。β−グルカンを直接α−グルカンに変換することはできない。従来の方法においては、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）の作用によってＧ−１−Ｐおよびグルコースからセロビオースを合成する方法が知られている。セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の作用によって、Ｇ−１−Ｐおよびセロオリゴ糖（重合度ｎ）から重合度ｎ＋１のセロオリゴ糖を合成する方法もまた知られている。また、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの作用によって、Ｇ−１−Ｐおよび低分子量α−グルカンから高分子量α−グルカンを合成する方法が知られている。一般に、酵素によって触媒される反応は可逆反応であることが多いので、本発明者らは、ＣＢＰによって触媒される反応をセロビオースの分解方法に、ＣＤＰによって触媒される反応をセロオリゴ糖の分解方向に進ませてＧ−１−Ｐを産生し、そして得られるＧ−１−Ｐからα−グルカンを合成することができないかと考えて、β−１，４−グルカンからのα−グルカンの合成法の構築を検討した。この方法は、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いてβ−グルカンを加リン酸分解してＧ−１−Ｐを得て（第１工程）、このＧ−１−Ｐを原料としてグルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）によってα−グルカンを合成する（第２工程）２段階方法である。この方法のβ−グルカンを加リン酸分解する反応においてＧ−１−Ｐを効率よく得るためには、多量の無機リン酸を添加する必要があるが、この多量の無機リン酸は、次の反応であるＧ−１−Ｐを原料とするα−グルカンの合成反応を阻害するため、第１工程の反応終了後にこの無機リン酸を取り除かなければならない。しかし、その精製ステップには多大なコストがかかることが、この２段階方法の欠点の１つである。
【０００８】
また、Ｇ−１−Ｐを原料にα−グルカンを合成しようとすると、反応時に等モルのリン酸を副生するため、反応終了後に除去する必要を生じる。また、リン酸副産物に起因するｐＨの大幅な低下が見られるため、アルカリなどの添加あるいは高濃度の緩衝液を使用することにより反応液のｐＨを維持する操作等が必要となってしまい、そのため、この２段階方法は簡便な製造方法とはいえない。
【０００９】
そのため、これら欠点を克服する低コスト、簡便かつ効率的な方法の開発が望まれている。
【００１０】
２つの酵素反応工程からなる触媒反応を行うために、各酵素をカップリングさせて１つの反応系で反応させる方法が、他の触媒反応において開発されている。このような反応系の従来公知の例は、２種類のホスホリラーゼをカップルさせて利用する方法である。例えば、北岡ら（非特許文献１）はスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）とＣＢＰを同時に作用させることにより、スクロースをセロビオースに効率的に変換する技術を開示している。また、藤井ら（特許文献１）は、ＳＰとＧＰを同時に作用させることにより、スクロースをアミロースに効率的に変換する技術を開示している。
【００１１】
これらの技術は、２種類の酵素が、その基質および生産物を共有しあう（北岡らの例では、Ｇ−１−ＰはＳＰの生産物であると同時にＣＢＰの基質にもなっているし、またリン酸はＳＰの基質であると同時にＣＢＰの生産物にもなっている）という、複雑な反応を利用している。それゆえ、単一の酵素を用いる反応とは異なり、反応メカニズムが極めて複雑である。そのため、単に２種類の酵素を組み合わせても必ずしも原料となる基質を目的とする生産物に変換できないことが技術常識である。
【００１２】
北岡らは日本応用糖質科学会２００１年度大会において、ＳＰおよびＣＢＰを用いたシステムは、スクロースからＧ−１−Ｐを経由してセロビオースを合成する方法には有効に利用できるが、セロビオースからＧ−１−Ｐを経由してスクロースを合成する反応は進行しないことを口頭で報告している。この報告に基づいて本発明者らが確認実験（参考例２）を行ったところ、セロビオースからＧ−１−Ｐを経由してスクロースを合成する反応が進まないことが確認されている。
【００１３】
つまり、ＣＢＰによりＧ−１−Ｐを合成する酵素反応と、合成されたＧ−１−Ｐに対するさらなる酵素反応とを同時に行うことができないのである。
【００１４】
従って、セロビオースを出発物質として２段階の酵素反応を同時に行うことは困難であると考えられていた。
【００１５】
さらに、Ｇ−１−Ｐを経由する方法以外の方法においても、β−１，４−グルカンからα−グルカンを合成する効率的な方法が存在しなかったので、結局、β−１，４−グルカンからα−グルカンを合成する、低コスト、簡便かつ効率的な方法は存在しなかった。
【００１６】
β−１，４−グルカンからα−グルカンを産生する酵素反応には、グルコースが関与する。そのため、グルコース濃度を制御することによって、目的の酵素反応を効率的に行うことが可能になるとも考えられる。
【００１７】
北岡ら（非特許文献２）は、スクロースからセロビオースを合成するシステムにおいて、セロビオース合成側に反応を進行させるためには、アクセプターとして必須な原料であるグルコースの濃度を、反応系内で低く保つことが重要であることを主張している。そのため、ＳＰの作用により生じるフラクトースを、キシロースイソメラーゼを用いてグルコースに変換することで、グルコースを系外から添加することなく反応を進行させてセロビオースの収率を高めている。北岡らは、これは、グルコースがＣＢＰのＧ−１−Ｐに対する拮抗阻害剤であるため、高濃度のグルコースの蓄積はＣＢＰのセロビオース合成反応を著しく低下させるためであると説明している。従って、従来は、セロビオースを基質とする酵素反応においては、セロビオースの合成方向に反応を進めるためには反応液中のグルコース濃度を低下させ、逆にセロビオースの分解方向に反応を進めるためには反応液中のグルコース濃度を高めることが重要であると考えられていた。
【００１８】
本発明では、ＣＢＰを用いてその基質であるセロビオースを分解する反応を包含する。上記知見に基づけば、グルコース濃度が高いことは、セロビオース合成反応が阻害されセロビオース分解にとって有利な条件であると当業者は考える。
【００１９】
一方、２つの酵素を用いるセロビオースからアミロースへの変換反応において、ＣＢＰの反応の平衡は、Ｇ−１−Ｐ／リン酸比、グルコース／ＣＢＰ比によってコントロールされるため、グルコースの濃度のみを下げたとしても全体の反応が、セロビオースからアミロースへの変換に有利になるかどうかは不明である。実際、セロビオースからスクロースを合成する系においては、グルコース濃度を低下させても、反応収率を上げることはできなかった（参考例２）。このことは、２種類のホスホリラーゼを組み合わせた複雑な反応系においては、副産物を消去しても反応効率が向上しないことを意味する。
【特許文献１】国際公開第０２／０９７１０７号パンフレット
【非特許文献１】北岡ら、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４，１９９２，ｐｐ．２８１−２８３
【非特許文献２】北岡ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７５，２００２，ｐｐ．３５−５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、食糧とはなりえないβ−１，４−グルカンを、複雑な製造工程を経ることなく効率良くα−グルカンに変換する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの存在下でβ−グルカンを加リン酸分解してグルコース−１−リン酸を合成する反応と、α−グルカンホスホリラーゼの存在下でグルコース−１−リン酸とプライマーとを反応させてα−グルカンを合成する反応とをカップリングすることにより、β−１，４−グルカンからα−グルカンが効率よく合成されることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２２】
本発明者らはまた、従来の知見に反して、この反応系において、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの存在下でβ−グルカンを加リン酸分解する際に生じるグルコースの濃度を減少させることにより、α−グルカンをより一層効率的に製造することができることを予想外に見出した。
【００２３】
本発明の方法は、β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する。
【００２４】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、セロビオースであり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼであり得る。
【００２５】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、重合度３以上のセロオリゴ糖であり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロデキストリンホスホリラーゼであり得る。
【００２６】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、重合度３以上のセロオリゴ糖であり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼであり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記生産工程において、上記α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを、上記溶液から除去する工程をさらに包含し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記溶液は、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含み得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記溶液は、グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含み得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記溶液は、カタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含み得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記リン酸源は、無機リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸とグルコース−１−リン酸との混合物であり得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記リン酸源の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭであり得る。
【００３３】
１つの実施形態では、上記α−グルカンが、アミロースである、請求項１に記載の方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の方法により、非消化性のセルロースを消化性の食品へと効率よく変換できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。
【図２】図２は、β−１，４−グルカンとしてセロビオースを用い、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いた場合の、本発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。
【図３】図３は、セロビオースホスホリラーゼの濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図４】図４は、リン酸濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図５】図５は、セロビオース濃度と、プライマー濃度と、リン酸濃度との比率を一定としてセロビオース濃度を上昇させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図６】図６は、本発明の製造方法において、グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）またはグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加した場合のアミロース収率の変化を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１は、合成ＤＮＡプライマー１の塩基配列であり；
配列番号２は、合成ＤＮＡプライマー２の塩基配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書中では「α−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α−グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状α−グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状α−グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むα−グルカンは、分岐状α−グルカンである。α−グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状α−グルカンがより好ましい。本発明で製造されるα−グルカンは、好ましくは、アミロース、環状構造を有するグルカンまたは分岐構造を有するグルカンであり、より好ましくはアミロースである。１分子のα−グルカンに含まれる糖単位の数を、このα−グルカンの重合度という。
【００４０】
α−グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。
【００４１】
本発明の方法によって製造される分岐状α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは１０〜５０００であり、さらに好ましくは５０〜１０００であり、さらに好ましくは１００〜５００である。
【００４２】
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
【００４３】
α−グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、α−グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。α−グルカンの性質を損なわない程度の修飾としては、エステル化、エーテル化、架橋などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。
【００４４】
α−グルカンは、代表的には約１×１０３以上、好ましくは約５×１０３以上、より好ましくは約１×１０４以上、さらに好ましくは約５×１０４以上、さらに好ましくは約１×１０５以上の分子量を有する。α−グルカンは、代表的には約１×１０６以下、好ましくは約５×１０５以下、さらに好ましくは約１×１０５以下の分子量を有する。
【００４５】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質（例えば、プライマー、β−１，４−グルカンなど）の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。
【００４６】
＜α−グルカンの製造に用いる材料＞
本発明の製造方法では、例えば、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を用いる。この溶液の調製においては、例えば、β−１，４−グルカンと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼと、緩衝剤およびこれらを溶かしている溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【００４７】
本明細書において使用される用語「リン酸源」とは、ＣＢＰの触媒反応にリン酸を提供し得る分子をいい、無機リン酸（例えば、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４のような無機リン酸塩）ならびに有機リン酸塩（例えば、グルコース−１−リン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の製造方法では、溶液中にグルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含み得る。グルコースオキシダーゼを用いる場合、ムタロターゼをさらに含み得る。グルコースオキシダーゼを用いる場合はまた、本発明の溶液は、カタラーゼまたはペルオキシダーゼも含み得る。
【００４９】
本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするα−グルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から溶液中に添加してもよく、途中から溶液中に添加してもよい。
【００５０】
（１．β−１，４−グルカン）
本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００５１】
溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、代表的には約０．１％〜約４０％であり、好ましくは約０．５％〜約３０％であり、より好ましくは約１％〜約２０％であり、特に好ましくは約２％〜約１５％であり、最も好ましくは約３％〜約１２％である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−グルカンが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。
【００５２】
本明細書中では、溶液中のβ−１，４−グルカンモル濃度を、反応溶液中の無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計によって除算することによって得られる比率を、β−１，４−グルカン：リン酸比率という。すなわち、以下の通りである：
【００５３】
【数１】
全反応材料を投入して反応を始めて、反応中に材料の追加をしないのであれば、β−１，４−グルカン：リン酸比率は反応開始時が最大である。反応開始時のβ−１，４−グルカン：リン酸比率は、任意の比率であり得るが、好ましくは、約０．０１以上であり、より好ましくは約０．０３以上であり、さらに好ましくは約０．０６以上であり、特に好ましくは約０．１以上であり、最も好ましくは約０．１〜約０．６である。
【００５４】
（２．プライマー）
本発明の方法で用いられるプライマーとは、α−グルカンの合成においてグリコシド残基を付加するための出発物質として作用する分子をいう。なお、本明細書中では、グリコシド残基とグルコース残基とは交換可能に使用され得る。プライマーは、Ｇ−１−Ｐのグリコシド残基のアクセプターとして作用する分子ともいうことができる。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、反応開始時に含まれるプライマーに対して１つのグリコシド残基がα−１，４結合で転移することによって、このプライマーよりも重合度が１大きいα−グルカンが形成される。形成されたこのα−グルカンは、同じ溶液中で再度アクセプターとして作用することができる。このようにして、本発明の方法では、プライマーに対してグリコシド残基がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、任意の重合度のα−グルカンが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。
【００５５】
プライマーは、本発明の反応の出発物質として作用し得ればよく、例えば、本発明の方法によって合成されたα−グルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によってα−１，４−グルコシド鎖を再度伸長することも可能である。
【００５６】
プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。
【００５７】
プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００５８】
マルトオリゴ糖は、本明細書中では、約２個〜約１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは約３個〜約１０個の糖単位、より好ましくは約４個〜約１０個の糖単位、さらに好ましくは約５個〜約１０個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。１つの実施形態では、マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、より好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、さらに好ましくはマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。１つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する。ここで、「マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖」とは、重合度４以上のマルトオリゴ糖をいう。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。
【００５９】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。
【００６０】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約１×１０５程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。
【００６１】
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
【００６２】
グリコーゲンの分子量は代表的には約１×１０５〜約１×１０８であり、好ましくは約１×１０６〜約１×１０７である。
【００６３】
プルランは、マルトトリオースが規則正しく、階段状にα−１，６−結合した、分子量約１０万〜約３０万（例えば、約２０万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００６４】
カップリングシュガーは、ショ糖、グルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００６５】
澱粉は、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。
【００６６】
澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。
【００６７】
天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を５０％〜７０％まで高めたハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないワキシー澱粉である。
【００６８】
可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。
【００６９】
化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊していない澱粉である。
【００７０】
澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。
【００７１】
澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００７２】
澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にグルカンホスホリラーゼ（ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端からグルコース残基を１糖単位ずつ他の基質へと転移させる。グルカンホスホリラーゼは、α−１，６−グルコシド結合を切断することができないので、グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、α−１，６−グルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００７３】
デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【００７４】
澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【００７５】
本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも１つが、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの２種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。
【００７６】
（３．無機リン酸またはグルコース−１−リン酸）
本明細書中において、無機リン酸などのリン酸源とは、ＣＢＰの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒されるβ−１，４−グルカン加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。
【００７７】
無機リン酸は、反応開始時のＣＢＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。
【００７８】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【００７９】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００８０】
グルコース−１−リン酸は反応開始時のＣＢＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【００８１】
本発明の方法において、反応開始時の反応溶液中のリン酸とグルコース−１−リン酸との間の比率は、任意の比率であり得る。
【００８２】
反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭであり、さらにより好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭである。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、反応自体は起こるものの、α−グルカンの収率が低下する場合がある。これらの使用量が少なすぎると、α−グルカンの合成に時間がかかる場合がある。
【００８３】
本発明の方法における溶液中の無機リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。この溶液中のグルコース−１−リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の合計含有量を測定してもよい。
【００８４】
無機リン酸は、例えば、リン酸イオンとして以下の方法により求められる。無機リン酸を含む溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
【００８５】
グルコース−１−リン酸は、例えば、以下の方法により定量され得る。３００μｌの測定試薬（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、３ｍＭ ＮＡＤＰ、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５μＭグルコース−１，６−二リン酸、６μｇ／ｍｌ ホスホグルコムターゼ、６μｇ／ｍｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース−１−リン酸を含む溶液６００μｌを加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。通常は、１分間に１μｍｏｌのグルコース−１−リン酸を生成する活性を１単位とする。この定量法では、グルコース−１−リン酸のみが定量され、無機リン酸の量は定量されない。
【００８６】
（４．β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００８７】
【化１】
なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。
【００８８】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。
【００８９】
セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００９０】
【化２】
セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００９１】
【化３】
本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。
【００９２】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９３】
セロビオースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓであり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロビオースホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９４】
セロデキストリンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロデキストリンホスホリラーゼホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９５】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。
【００９６】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【００９７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【００９８】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００９９】
本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したβ−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１００】
本発明の方法で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、β−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子でβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物からβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを得てもよい。
【０１０１】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１０２】
クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【０１０３】
クローン化した遺伝子について、生産されるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。
【０１０４】
当業者は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。
【０１０５】
例えば、発現されたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現されたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。α−アミラーゼなどのグルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、α−グルカンの製造に用い得る。
【０１０６】
反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０５〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．１〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、特に好ましくは約０．５〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１〜７Ｕ／ β−１，４−グルカンである。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１０８】
（５．α−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．１）とは、α−１，４−グルカン（重合度ｎ）の加リン酸分解による、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）とα−Ｄ−グルコース−１−リン酸との産生を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）およびα−Ｄ−グルコース−１−リン酸からα−１，４−グルカン（重合度ｎ）を合成する反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、β−１，４−グルカンの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【０１０９】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【０１１０】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【０１１１】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【０１１２】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．などが挙げられる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１１３】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１１４】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【０１１５】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物から単離したα−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１１６】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１１７】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１１８】
遺伝子組換えによって得られたα−１，４−グルカンホスホリラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１１９】
反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、特に好ましくは約１〜８０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１２０】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１２１】
（６．グルコースイソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．５））
本発明の製造方法においては、溶液液中にグルコースイソメラーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたグルコースをフルクトースへと変換できる。グルコースはセロビオースの加リン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１２２】
本発明の製造方法で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換をも触媒し得るので、キシロースイソメラーゼとも呼ばれる。
【０１２３】
グルコースイソメラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。グルコースイソメラーゼを産生する微生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏ ｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓおよびＰａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｇｅｎｏｉｄｅｓが挙げられる。グルコースイソメラーゼを産生する動物の例としては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉが挙げられる。グルコースイソメラーゼは、植物由来であってもよい。グルコースイソメラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１２４】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に由来することが好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースイソメラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースイソメラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１２５】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースイソメラーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１２６】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、これらの生物から単離したグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１２７】
グルコースイソメラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１２８】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースイソメラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルコースイソメラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グルコースイソメラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースイソメラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１２９】
遺伝子組換えによるグルコースイソメラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１３０】
反応開始時の溶液中に含まれるグルコースイソメラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．１〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約０．５〜１０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１〜５Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グルコースイソメラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１３１】
グルコースイソメラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。グルコースイソメラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルコースイソメラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースイソメラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルコースイソメラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１３２】
（７．グルコースオキシダーゼ）
本発明の製造方法においては、溶液中にグルコースオキシダーゼをさらに含むことが好ましい。反応液中にグルコースオキシダーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたα−グルコースから自然変換されたβ−グルコースをβ−グルコノ−δラクトンへと変換できる。α−グルコースはセロビオースの加リン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースオキシダーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１３３】
本発明の製造方法で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、以下の反応を触媒し得る酵素である：
【０１３４】
【化４】
グルコースオキシダーゼは、微生物および植物に存在する。グルコースオキシダーゼを産生する微生物の例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍおよびＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍが挙げられる。グルコースオキシダーゼは植物由来であってもよい。グルコースオキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１３５】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅに由来することが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースオキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースオキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１３６】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースオキシダーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１３７】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、これらの生物から単離したグルコースオキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１３８】
グルコースオキシダーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１３９】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースオキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルコースオキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グルコースオキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースオキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１４０】
遺伝子組換えによるグルコースオキシダーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１４１】
反応開始時の溶液中に含まれるグルコースオキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約５〜４００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約１０〜３００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約２０〜２００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グルコースオキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１４２】
グルコースオキシダーゼは、精製されていても未精製であってもよい。グルコースオキシダーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルコースオキシダーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースオキシダーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルコースオキシダーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１４３】
（８．ムタロターゼ）
本発明の製造方法において溶液中にグルコースオキシダーゼを含む場合、溶液中にムタロターゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にムタロターゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたα−グルコースとβ−グルコースとを相互変換し得る。α−グルコースとβ−グルコースとは、ムタロターゼを加えなくとも自然に相互変換されるとはいえ、ムタロターゼを加えることによって相互変換が促進されるので、反応によって生じたα−グルコースを溶液から減らす効率をより向上させ得る。それゆえ、反応液中にグルコースオキシダーゼおよびムタロターゼを含むことにより、反応液中のα−グルコース濃度を低下させ、その結果、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１４４】
本発明の製造方法で用いられ得るムタロターゼは、α−グルコースとβ−グルコースとの相互変換を触媒し得る酵素である。
【０１４５】
ムタロターゼは、微生物、動物および植物に存在する。ムタロターゼを産生する微生物の例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが挙げられる。ムタロターゼを産生する動物の例としては、ブタおよびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓが挙げられる。ムタロターゼを産生する植物の例としては、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓが挙げられる。ムタロターゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１４６】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、ブタまたはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓに由来することが好ましく、ブタに由来することがより好ましい。本発明で用いられるムタロターゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いムタロターゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１４７】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、上記のような自然界に存在する、ムタロターゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１４８】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、これらの生物から単離したムタロターゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１４９】
ムタロターゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１５０】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、ムタロターゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ムタロターゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ムタロターゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるムタロターゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１５１】
遺伝子組換えによるムタロターゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１５２】
反応開始時の溶液中に含まれるムタロターゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０１〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．０１〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約０．０５〜１０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約０．１〜５Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。ムタロターゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１５３】
ムタロターゼは、精製されていても未精製であってもよい。ムタロターゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。ムタロターゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。ムタロターゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。ムタロターゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１５４】
（９．カタラーゼおよびペルオキシダーゼ）
本発明の製造方法において溶液中にグルコースオキシダーゼを含む場合、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを含むことにより、グルコースオキシダーゼによって触媒される反応によって生じる過酸化水素を酸素に変換し、酸素をリサイクルさせることができる。それゆえ、反応液中にグルコースオキシダーゼと、カタラーゼまたはペルオキシダーゼとを含むことにより、反応液中のα−グルコース濃度を低下させ、その結果、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１５５】
本発明の製造方法で用いられ得るカタラーゼは、過酸化水素を酸素と水とに分解する反応を触媒する酵素である。
【０１５６】
カタラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。カタラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｅｑｕｉｆｅｔａｌｅ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｈｉｐｐｉｋｏｎ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｐｈｉｌｕｍ ａｌｂｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ｓｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉおよびＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓが挙げられる。カタラーゼを産生する動物の例としては、Ｃａｐｒａ ａｅｇａｇｒｕｓ ｈｉｒｃｕｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓおよびＮｏｔｏｍａｓｔｕｓ ｌｏｂａｔｕｓ（多毛類）が挙げられる。カタラーゼを産生する植物の例としては、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ（藻類）およびＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍが挙げられる。カタラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１５７】
本発明で用いられ得るカタラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ（牛肝臓）またはＨｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ（ヒト赤血球）に由来することが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来することがより好ましい。本発明で用いられるカタラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いカタラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１５８】
本発明の製造方法で用いられ得るペルオキシダーゼは、過酸化水素を水素受容体として種々の有機物の酸化を触媒する酵素である。
【０１５９】
ペルオキシダーゼは、微生物、動物および植物に存在する。ペルオキシダーゼを産生する微生物の例としては、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｆｒｉｅｓｉｉ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ、Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ ｉｇｎｉａｒｉｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｐｈｉｌｕｍ ａｌｂｕｍ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓおよびＣｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓが挙げられる。なお、本明細書中では、微生物は、細菌および真菌を含む。ペルオキシダーゼを産生する動物の例としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓが挙げられる。ペルオキシダーゼを産生する植物の例としては、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）、Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ、Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｌａｐａｔｈｉｆｏｌｉａ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ Ｃａｒｒ．、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ Ｌ．，Ｋａｒｓｔｅｎ、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ、Ｖｉｔｉｓ Ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ、Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．が挙げられる。ペルオキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１６０】
本発明で用いられ得るペルオキシダーゼは、西洋ワサビおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、西洋ワサビに由来することがより好ましい。本発明で用いられるペルオキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いペルオキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１６１】
本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、カタラーゼまたはペルオキシダーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１６２】
本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、これらの生物から単離したカタラーゼまたはペルオキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１６３】
カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１６４】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、カタラーゼまたはペルオキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１６５】
遺伝子組換えによるカタラーゼまたはペルオキシダーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１６６】
反応開始時の溶液中に含まれるカタラーゼまたはペルオキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１．０〜２００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。カタラーゼまたはペルオキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１６７】
カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、精製されていても未精製であってもよい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１６８】
（１０．枝切り酵素）
本発明の方法において、α−１，６−グルコシド結合を含有する出発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。
【０１６９】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ ３．２．１．４１）との２つに分類される。
【０１７０】
枝切り酵素は、微生物および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。
【０１７１】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することが好ましく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１７２】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、上記のような自然界に存在する、枝切り酵素を産生する微生物および植物から直接単離され得る。
【０１７３】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、これらの微生物および植物から単離した枝切り酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１７４】
枝切り酵素は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１７５】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、枝切り酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。枝切り酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。枝切り酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される枝切り酵素は、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１７６】
遺伝子組換えによる枝切り酵素の生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１７７】
反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。枝切り酵素の重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１７８】
枝切り酵素は、精製されていても未精製であってもよい。枝切り酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。枝切り酵素は、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。枝切り酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。枝切り酵素はまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１７９】
（１１．ブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．１８））
本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１８０】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。
【０１８１】
ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１８２】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、ジャガイモ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することが好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングエンザイムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１８３】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、ブランチングエンザイムを産生する微生物、動物、および植物から直接単離され得る。
【０１８４】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、これらの微生物、動物、および植物から単離したブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１８５】
ブランチングエンザイムは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１８６】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、ブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１８７】
遺伝子組換えによるブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１８８】
反応開始時の溶液中に含まれるブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約１０〜１００，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約１００〜５０，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１，０００〜１０，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。ブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１８９】
ブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。ブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。ブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。ブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。ブランチングエンザイムはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１９０】
（１２．４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．１．２５））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。
【０１９１】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。
【０１９２】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１９３】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ｌｉｔｒａｌｉｓに由来することが好ましく、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い４−α−グルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１９４】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のような自然界に存在する、４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物および植物から直接単離され得る。
【０１９５】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、これらの微生物および植物から単離した４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１９６】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１９７】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、４−α−グルカノトランスフェラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１９８】
遺伝子組換えによる４−α−グルカノトランスフェラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１９９】
反応開始時の溶液中に含まれる４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。４−α−グルカノトランスフェラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０２００】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０２０１】
（１３．グリコーゲンデブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．２５／ＥＣ．３．２．１．３３））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。
【０２０２】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。
【０２０３】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグリコーゲンデブランチングエンザイムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変を加えることで得られる。
【０２０５】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物および動物から直接単離され得る。
【０２０６】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、これらの微生物および動物から単離したグリコーゲンデブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０２０７】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０２０８】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グリコーゲンデブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０２０９】
遺伝子組換えによるグリコーゲンデブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０２１０】
反応開始時の溶液中に含まれるグリコーゲンデブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グリコーゲンデブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０２１１】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０２１２】
（１４．溶媒）
本発明の方法に用いる溶媒は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０２１３】
なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、β−１，４−グルカンなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０２１４】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼまたはα−１，４−グルカンホスホリラーゼを調製する際にβ−１，４−グルカンホスホリラーゼまたはα−１，４−グルカンホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【０２１５】
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０２１６】
（１５．他の成分）
β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液中には、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとβ−１，４−グルカンとの間の相互作用およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０２１７】
＜α−グルカンの製造＞
本発明のα−グルカンは、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させる工程により製造される。
【０２１８】
図２に、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。β−１，４−グルカン（重合度ｎ）と無機リン酸から、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびβ−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）として伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０２１９】
なお、初発のβ−１，４−グルカンがセロビオースであって、β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合の、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を図２に示す。セロビオース（重合度２）と無機リン酸から、セロビオースホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびグルコースが生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる。
【０２２０】
本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のβ−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸のようなリン酸源、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、またはα−１，４−グルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸のようなリン酸源、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６．５〜約７．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。塩濃度は、好ましくは１．０ｍＭ〜５０ｍＭであり、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。
【０２２１】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、この溶液には、α−グルカンの生成の際に生成するグルコースを溶液から除去するために、例えば、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼ（およびムタロターゼ）をさらに添加してもよい。さらに、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを添加してもよい。あるいは、酵母のような、グルコースを資化することによってグルコースを溶液中から除去する微生物を添加してもよい。あるいは、グルコース特異的吸着樹脂を添加してもよい。酵素または微生物を添加する方法は、反応を連続して進行させながらグルコースを同時に除去し得るので好ましい。なお、本明細書中では、「除去する」とは、反応液中のグルコースの量を低減させることおよびグルコースを存在させなくすることを包含する。
【０２２２】
また、この溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。これらの酵素は、α−グルカン合成反応の開始時に添加されてもよく、反応の途中に添加されてもよく、また、反応が終了した後に添加されてもよい。
【０２２３】
次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は、好ましくは約３０℃〜約７０℃の温度であり、より好ましくは約３５℃〜約６０℃である。
【０２２４】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０２２５】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０２２６】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０２２７】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、上述したように、グルコースイソメラーゼなどの酵素を添加して、α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを除去する工程を、生産工程と同時に行うことが好ましい。他方、グルコースを除去する工程は、α−グルカン生産工程とタイミングをずらして行ってもよい。例えば、本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、反応によって生成されたグルコースを除去するために、溶液をクロマト分画、膜分画法などの物理的グルコース除去方法で処理し、その後再度、反応を進行させてもよい。物理的グルコース除去方法は、１回実施されても、２回以上実施されてもよい。２回以上実施する場合、例えば、反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間行うこととし得る。
【０２２８】
このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。
【０２２９】
反応終了後、溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもよい。
【０２３０】
＜精製方法＞
生産されたα−グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、グルコースである。α−グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
【０２３１】
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
【０２３２】
有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。
【０２３３】
（１）α−グルカン生産反応後、反応溶液を冷却することによりα−グルカンを沈澱させ、そして沈澱したα−グルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；
（２）α−グルカン生産反応の間もしくはα−グルカン生産反応後に反応溶液を冷却してα−グルカンをゲル化し、ゲル化したα−グルカンを回収し、そしてゲル化したα−グルカンから、グルコースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法；ならびに
（３）α−グルカン生産反応後、水に溶解しているα−グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してグルコースを除去する方法。
【０２３４】
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
【０２３５】
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
【実施例１】
【０２３６】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【０２３７】
（１．測定方法および計算方法）
本発明における各種酵素の活性および得られるα−グルカンの収率を、以下の測定方法によって測定した。
【０２３８】
（１．１ セロビオースホスホリラーゼの活性測定法）
３０μｌの４０ｍＭセロビオース水溶液と３０μｌの４０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液（試料）６０μｌを加えて１２０μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートすることにより反応を進行させた後、１００℃で１０分間保持することによって酵素を失活させる。続いて７８０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および１２０μｌの発色試薬（グルコースＡＲ−ＩＩ発色試薬（和光純薬社製））をこの混合液に添加して混合し、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。セロビオースホスホリラーゼ１単位とは、上記方法により２０ｍＭセロビオースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【０２３９】
（１．２ α−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性測定法）
５０μｌの４％クラスターデキストリン水溶液と５０μｌの５０ｍＭグルコース−１−リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液１００μｌを加えて２００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートして反応を進行させた後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、反応を停止させる。続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性を、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１単位とする。
【０２４０】
（１．３ 得られるα−グルカンの収率の計算方法）
本発明の製造方法によるα−グルカンの収率を、得られたα−グルカン中に取り込まれたグルコース残基のモル数が、最初に添加された初発セロビオースのモル数の何％にあたるかによって計算した。反応終了後の溶液にエタノールを終濃度５０％になるよう加えてα−グルカンを沈殿させて上清を捨て、更に適量の５０％エタノールでα−グルカンを２度洗浄した後、乾燥し、適量の水に溶解後、フェノール−硫酸法によりグルコース濃度を測定することにより、α−グルカンの収量（モル数）を計算した。この収量（モル数）をセロビオースのモル数で除算して１００倍することにより、収率を計算した。この計算式を次式に示す。
【０２４１】
【数２】
（１．４ α−グルカンの重量平均分子量の測定法）
本発明で合成したα−グルカンを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、α−グルカン約３００μｇ分を、示差屈折計および多角度光散乱検出器を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた。
【０２４２】
詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ（昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求めた。
【０２４３】
（２．酵素の調製）
本発明の実施例で用いた各種酵素を、以下の方法によって調製した。
【０２４４】
（２．１ 組換えセロビオースホスホリラーゼの調製方法）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの染色体遺伝子を抽出し、これをテンプレートとした。以下の２種の合成ＤＮＡプライマー：
合成ＤＮＡプライマー１：５’ ａａａｃｔｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｔｇａｔ ３’（配列番号１）および
合成ＤＮＡプライマー２：５’ ａａａｃｔｃｇａｇａａｔｔａｃｔｔｃａａｃｔｔｔｇｔｇａｇｔｃｔｔｔ ３’（配列番号２）
を用い、
９８℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で３分間の順で３０サイクル加熱の条件下でＰＣＲを行うことにより、ＣＢＰ遺伝子を含む領域を増幅させた。増幅した遺伝子を選択マーカー遺伝子Ｋｍｒとともに発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＣＢＰ１を得た。このプラスミドでは、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。
【０２４５】
このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来セロビオースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。
【０２４６】
得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２４７】
この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるようにこの培地に添加し、３７℃でさらに８時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、１３２Ｕ／ｍｌのセロビオースホスホリラーゼが含まれていた。
【０２４８】
この菌体破砕液を、５５℃で２０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいたＨｉｓ−Ｔａｇ吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に流してセロビオースホスホリラーゼをこの樹脂に吸着させた。この樹脂を、３００ｍＭ塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ２−メルカプトエタノール含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムと１５０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出させ、組換えセロビオースホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２４９】
（２．２ 組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼの調製方法）
馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１）を選択マーカー遺伝子Ａｍｐｒとともに発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２５０】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。
【０２５１】
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清（タンパク質１２５ｍｇを含む）を、平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）を用いてあらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してグルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えグルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２５２】
（実施例１−１〜１−６：種々のプライマー濃度でのアミロース合成）
以下の表１に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５３】
【表１】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量を上記１．４に従って決定した。結果を表１に示す。
【０２５４】
この結果、セロビオースに、リン酸の存在下でセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を作用させてグルコース−１−リン酸およびグルコースを生じる反応と、グルコース−１−リン酸に、プライマー存在下でグルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）を作用させてプライマーにグルコース残基を転移させる反応とを同一の溶液中で行うことにより、アミロースを製造することができた。また、反応液のプライマー濃度を変化させることで、合成されるアミロースの重合度を自在にコントロールできる、すなわち、高分子量のアミロースを合成したい場合、少ない量のプライマーを用いればよく、低分子量のアミロースを合成したい場合、多量のプライマーを用いればよいことが確認された。
【０２５５】
（実施例２−１〜２−５：種々のセロビオースホスホリラーゼ濃度でのアミロース合成）
以下の表２に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５６】
【表２】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表２および図３に示す。
【０２５７】
この結果、６．６０Ｕ／ｇセロビオースまでは、セロビオースホスホリラーゼの量を増やすほど、アミロースの収率が高くなるが、６．６０Ｕ／ｇセロビオースを超えると、セロビオースホスホリラーゼの量を増やしても、得られるアミロースの収率はそれほど増えないことがわかった。それゆえ、６．６０Ｕ／ｇセロビオースのセロビオースホスホリラーゼ濃度が好適な濃度であることがわかった。また、アミロース合成反応収率は最大で３３．８％であるので、これらの結果から、工業レベルでのアミロース生産が可能であることが確認された。
【０２５８】
（実施例３−１〜３−５：種々のリン酸濃度でのアミロース合成）
以下の表３に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５９】
【表３】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表３および図４に示す。
【０２６０】
この結果、リン酸濃度が１５ｍＭ〜３０ｍＭのときにアミロースの収率が最も高いが、５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲では、アミロースの収率はそれほど大きく変わらないため、５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲で効率的なアミロース合成を行えることがわかった。
【０２６１】
（実施例４−１〜４−３：種々のセロビオース濃度でのアミロース合成）
以下の表４に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２６２】
【表４】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表４および図５に示す。
【０２６３】
この結果、セロビオースとプライマーとリン酸との濃度比を変化させずにセロビオースの濃度を上昇させた場合、セロビオースの濃度の上昇によるアミロース合成の阻害は生じなかった。そのため、アミロースを大量に合成するために、セロビオースの濃度を上昇させることができることがわかった。
【０２６４】
（実施例５−１〜５−４：グルコースイソメラーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルオキシダーゼを用いたアミロース合成）
以下の表５に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２６５】
【表５】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表５および図６に示す。
【０２６６】
この結果、反応系にグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）またはグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加することによって、アミロースの収率が飛躍的に向上することがわかった。特に、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加した場合には、アミロースの収率は６４．８％と、これらの酵素を添加しない場合（３２．８％）の約２倍であった。
【０２６７】
この収率の向上は、セロビオースの加リン酸分解で生じるグルコースがＣＢＰおよびＧＰの反応を阻害するため、ＧＩまたはＧＯｘにより反応液中のグルコースを分解してその相対濃度を下げることにより、ＣＢＰおよびＧＰに対する反応阻害の問題を回避できたためであると考えられる。
【０２６８】
（実施例６：α−１，６分岐を含むグルカンの合成）
セロビオース０．３ｇ、プライマー（Ｇ４）０．７５マイクロモルを、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解させ、ここに上記の２．１の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ１．９８Ｕ、上記の２．２の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１５Ｕ、さらに特開２０００−３１６５８１号の実施例１に記載の方法に従って調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ブランチングエンザイム１，５００Ｕを加えて反応液を調製し、この反応液を４５℃で１６時間インキュベートした。インキュベート終了後、反応液に等量の１００％エタノールを加えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、分岐構造を有するグルカン０．０４８ｇを得た（収率約３２％）。
【０２６９】
（実施例６で得られたグルカンの分析）
実施例６で合成されたグルカンが分岐構造を有するか否か、および合成されたグルカンの平均単位鎖長を、Ｈ．Ｔａｋａｔａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２９５，９１−１０１（１９９６）に記載の方法に従って決定した。その結果、合成されたグルカンが分岐構造を有することおよび平均単位鎖長が１１であることが確認された。このように、反応液中にＣＢＰおよびＧＰに加えてブランチングエンザイムをさらに含むことにより、セロビオースから、分岐構造を有するグルカンを合成し得ることがわかった。
【０２７０】
（実施例７：環状構造を有するグルカンの合成）
セロビオース０．３ｇ、プライマー（Ｇ４）０．７５マイクロモルを、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解させ、ここに上記の２．１の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ１．９８Ｕ、上記の２．２の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１５Ｕ、さらにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼ１．５Ｕを加えて反応液を調製し、この反応液を４５℃で１６時間インキュベートした。なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼの唯一公知のＤＮＡ配列を使用して、上記２．２のα−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様の方法で調製したものを使用した。
【０２７１】
インキュベート終了後、反応液に等量の１００％エタノールを加えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、環状構造を有するグルカン（環状グルカン）と直鎖状グルカン（アミロース）との混合物を０．０５ｇ得た（収率約３３％）。
【０２７２】
（実施例７で得られたグルカンの分析）
４−α−グルカノトランスフェラーゼがアミロースに作用すると、アミロースから完全に環状のグルカンが切り出されて合成され、そしてその環状グルカンの鎖長分短くなったアミロースが残る。そこで、合成された環状グルカンの量を、Ｔ．Ｔａｋａｈａ，Ｍ．Ｙａｎａｓｅ，Ｈ．Ｔａｋａｔａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９０２−２９０８（１９９６）に記載の方法に従って測定した。この方法では、溶液中のアミロースをグルコース単位に分解し、残存する環状グルカンの量が測定される。この測定の結果、環状グルカンが形成されたことが確認された。また、測定された環状グルカンの量を出発原料のセロビオースの量と比較し、環状グルカンの収率を算出したところ、９．６％であった。従って、実施例７で得られたグルカンのうちの約２９％が環状グルカンであり、残りの約７１％が直鎖状のアミロースであることがわかった。このように、反応液中にＣＢＰおよびＧＰに加えて４−α−グルカノトランスフェラーゼをさらに含むことにより、セロビオースから、環状構造を有するグルカンを合成し得ることがわかった。
【０２７３】
（参考例１：スクロースホスホリラーゼの平衡収率）
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）の平衡収率を調べるために、Ｇ−１−Ｐを出発原料にした場合の平衡収率を求めた。
【０２７４】
まず、
終濃度５０ｍＭのＧ−１−Ｐ；
終濃度５０Ｕ／ｍｌの酵素（ＳＰ）；
終濃度５０ｍＭのアクセプター（フルクトース）；および
終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
を混合し、４５℃で６時間または１６時間インキュベート後、遊離したリン濃度をモリブデン法により測定した。得られたリン濃度から、この酵素についての平衡収率を次式に従って求めた：
平衡収率（％）＝リン濃度（ｍＭ）／５０×１００。
【０２７５】
結果を以下の表６に示す：
【０２７６】
【表６】
（参考例２：リン酸の存在下で２つのホスホリラーゼをカップリングさせた場合の生産物の収率）
以下の２つの場合の反応収率を求めた：
（２−１）セロビオースからのスクロース生産（ＣＢＰ＋ＳＰ＋Ｆｒｕ）；
（２−２）ＧＯｘ＋ＭＴ＋ＰＯｘ共存下での、セロビオースからのスクロース生産（ＣＢＰ＋ＳＰ＋Ｆｒｕ＋ＧＯｘ＋ＭＴ＋ＰＯｘ）。
【０２７７】
まず、終濃度５０ｍＭの出発原料（セロビオース）、終濃度１０、３０または１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、および終濃度５０Ｕ／ｍｌのそれぞれの酵素を混合し、４５℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液をインベルターゼで分解し、遊離するグルコース濃度を測定することでスクロース濃度を求めた。これらの２つの反応系のいずれにおいてもスクロースが生産物である。得られたスクロース濃度から、それぞれの反応系についての平衡収率を次式に従って求めた：
平衡収率（％）＝スクロース濃度（ｍＭ）／５０（ｍＭ）×１００。
【０２７８】
結果を以下の表７に示す：
【０２７９】
【表７】
この結果、セロビオースからスクロースを合成する反応の収率は、リン酸濃度を変えても、きわめて低かった。また、グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルオキシダーゼを用いて反応系からグルコースを消去することによってスクロースの収率アップを図ったが、ほとんど収率は上がらなかった。
【産業上の利用可能性】
【０２８０】
本発明の方法により、非消化性のβ−１，４−グルカン（特に、セルロースおよびその部分分解物）を可食性の食品へと変換できる。本発明の方法により、地球上に大量に存在するバイオマスであるβ−１，４−グルカンを、安価で効率的にα−１，４−グルカンに変換することができるので、食糧危機問題、ゴミ問題の解決にも大きく貢献する。
【０２８１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間は、デンプンなどのα−グルカンを消化してエネルギー源として利用している。α−グルカンは食品産業以外にも、医薬、化粧品、化学工業、製紙、繊維などにおける原料としても幅広く利用されており、非常に有用性の高い物質である。α−グルカンの中でも特に、アミロースは豊富な機能ゆえ、幅広い分野での利用が期待されている。
【０００３】
近年、人口増加により食糧危機が問題視されており、植物の生産するデンプンだけでは将来エネルギー源が不足すると予想されている。
【０００４】
一方、人間は、セルロースなどのβ−グルカンを消化できないので、エネルギー源として利用することができず、食物繊維成分としてのみ利用されている。それゆえ、β−グルカンを食糧危機問題の解決には利用できない。しかし、β−グルカンの年間生産量は、デンプンの約２万倍と推定されており、枯渇の心配はない。そのため、β−グルカンを、人間がエネルギー源とし得る物質に変換する種々の試みが行われている。
【０００５】
例えば、セルロースをグルコースまで分解し、エタノール醗酵に利用することが検討されている。グルコースは人間によって代謝され得るが、甘すぎるため、エネルギー源として大量に摂取することができない。
【０００６】
β−グルカンを人間にとってより摂取しやすい物質（特に、同じグルコースのポリマーであるデンプン）に変換することができれば、食糧危機問題の解決に大きな貢献ができるが、これまでにそのような技術は開示されていない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、β−グルカンを原料としてα−グルカンを産生することを試みた。β−グルカンを直接α−グルカンに変換することはできない。従来の方法においては、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）の作用によってＧ−１−Ｐおよびグルコースからセロビオースを合成する方法が知られている。セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の作用によって、Ｇ−１−Ｐおよびセロオリゴ糖（重合度ｎ）から重合度ｎ＋１のセロオリゴ糖を合成する方法もまた知られている。また、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの作用によって、Ｇ−１−Ｐおよび低分子量α−グルカンから高分子量α−グルカンを合成する方法が知られている。一般に、酵素によって触媒される反応は可逆反応であることが多いので、本発明者らは、ＣＢＰによって触媒される反応をセロビオースの分解方法に、ＣＤＰによって触媒される反応をセロオリゴ糖の分解方向に進ませてＧ−１−Ｐを産生し、そして得られるＧ−１−Ｐからα−グルカンを合成することができないかと考えて、β−１，４−グルカンからのα−グルカンの合成法の構築を検討した。この方法は、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いてβ−グルカンを加リン酸分解してＧ−１−Ｐを得て（第１工程）、このＧ−１−Ｐを原料としてグルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）によってα−グルカンを合成する（第２工程）２段階方法である。この方法のβ−グルカンを加リン酸分解する反応においてＧ−１−Ｐを効率よく得るためには、多量の無機リン酸を添加する必要があるが、この多量の無機リン酸は、次の反応であるＧ−１−Ｐを原料とするα−グルカンの合成反応を阻害するため、第１工程の反応終了後にこの無機リン酸を取り除かなければならない。しかし、その精製ステップには多大なコストがかかることが、この２段階方法の欠点の１つである。
【０００８】
また、Ｇ−１−Ｐを原料にα−グルカンを合成しようとすると、反応時に等モルのリン酸を副生するため、反応終了後に除去する必要を生じる。また、リン酸副産物に起因するｐＨの大幅な低下が見られるため、アルカリなどの添加あるいは高濃度の緩衝液を使用することにより反応液のｐＨを維持する操作等が必要となってしまい、そのため、この２段階方法は簡便な製造方法とはいえない。
【０００９】
そのため、これら欠点を克服する低コスト、簡便かつ効率的な方法の開発が望まれている。
【００１０】
２つの酵素反応工程からなる触媒反応を行うために、各酵素をカップリングさせて１つの反応系で反応させる方法が、他の触媒反応において開発されている。このような反応系の従来公知の例は、２種類のホスホリラーゼをカップルさせて利用する方法である。例えば、北岡ら（非特許文献１）はスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）とＣＢＰを同時に作用させることにより、スクロースをセロビオースに効率的に変換する技術を開示している。また、藤井ら（特許文献１）は、ＳＰとＧＰを同時に作用させることにより、スクロースをアミロースに効率的に変換する技術を開示している。
【００１１】
これらの技術は、２種類の酵素が、その基質および生産物を共有しあう（北岡らの例では、Ｇ−１−ＰはＳＰの生産物であると同時にＣＢＰの基質にもなっているし、またリン酸はＳＰの基質であると同時にＣＢＰの生産物にもなっている）という、複雑な反応を利用している。それゆえ、単一の酵素を用いる反応とは異なり、反応メカニズムが極めて複雑である。そのため、単に２種類の酵素を組み合わせても必ずしも原料となる基質を目的とする生産物に変換できないことが技術常識である。
【００１２】
北岡らは日本応用糖質科学会２００１年度大会において、ＳＰおよびＣＢＰを用いたシステムは、スクロースからＧ−１−Ｐを経由してセロビオースを合成する方法には有効に利用できるが、セロビオースからＧ−１−Ｐを経由してスクロースを合成する反応は進行しないことを口頭で報告している。この報告に基づいて本発明者らが確認実験（参考例２）を行ったところ、セロビオースからＧ−１−Ｐを経由してスクロースを合成する反応が進まないことが確認されている。
【００１３】
つまり、ＣＢＰによりＧ−１−Ｐを合成する酵素反応と、合成されたＧ−１−Ｐに対するさらなる酵素反応とを同時に行うことができないのである。
【００１４】
従って、セロビオースを出発物質として２段階の酵素反応を同時に行うことは困難であると考えられていた。
【００１５】
さらに、Ｇ−１−Ｐを経由する方法以外の方法においても、β−１，４−グルカンからα−グルカンを合成する効率的な方法が存在しなかったので、結局、β−１，４−グルカンからα−グルカンを合成する、低コスト、簡便かつ効率的な方法は存在しなかった。
【００１６】
β−１，４−グルカンからα−グルカンを産生する酵素反応には、グルコースが関与する。そのため、グルコース濃度を制御することによって、目的の酵素反応を効率的に行うことが可能になるとも考えられる。
【００１７】
北岡ら（非特許文献２）は、スクロースからセロビオースを合成するシステムにおいて、セロビオース合成側に反応を進行させるためには、アクセプターとして必須な原料であるグルコースの濃度を、反応系内で低く保つことが重要であることを主張している。そのため、ＳＰの作用により生じるフラクトースを、キシロースイソメラーゼを用いてグルコースに変換することで、グルコースを系外から添加することなく反応を進行させてセロビオースの収率を高めている。北岡らは、これは、グルコースがＣＢＰのＧ−１−Ｐに対する拮抗阻害剤であるため、高濃度のグルコースの蓄積はＣＢＰのセロビオース合成反応を著しく低下させるためであると説明している。従って、従来は、セロビオースを基質とする酵素反応においては、セロビオースの合成方向に反応を進めるためには反応液中のグルコース濃度を低下させ、逆にセロビオースの分解方向に反応を進めるためには反応液中のグルコース濃度を高めることが重要であると考えられていた。
【００１８】
本発明では、ＣＢＰを用いてその基質であるセロビオースを分解する反応を包含する。上記知見に基づけば、グルコース濃度が高いことは、セロビオース合成反応が阻害されセロビオース分解にとって有利な条件であると当業者は考える。
【００１９】
一方、２つの酵素を用いるセロビオースからアミロースへの変換反応において、ＣＢＰの反応の平衡は、Ｇ−１−Ｐ／リン酸比、グルコース／ＣＢＰ比によってコントロールされるため、グルコースの濃度のみを下げたとしても全体の反応が、セロビオースからアミロースへの変換に有利になるかどうかは不明である。実際、セロビオースからスクロースを合成する系においては、グルコース濃度を低下させても、反応収率を上げることはできなかった（参考例２）。このことは、２種類のホスホリラーゼを組み合わせた複雑な反応系においては、副産物を消去しても反応効率が向上しないことを意味する。
【特許文献１】国際公開第０２／０９７１０７号パンフレット
【非特許文献１】北岡ら、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４，１９９２，ｐｐ．２８１−２８３
【非特許文献２】北岡ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７５，２００２，ｐｐ．３５−５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、食糧とはなりえないβ−１，４−グルカンを、複雑な製造工程を経ることなく効率良くα−グルカンに変換する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの存在下でβ−グルカンを加リン酸分解してグルコース−１−リン酸を合成する反応と、α−グルカンホスホリラーゼの存在下でグルコース−１−リン酸とプライマーとを反応させてα−グルカンを合成する反応とをカップリングすることにより、β−１，４−グルカンからα−グルカンが効率よく合成されることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２２】
本発明者らはまた、従来の知見に反して、この反応系において、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの存在下でβ−グルカンを加リン酸分解する際に生じるグルコースの濃度を減少させることにより、α−グルカンをより一層効率的に製造することができることを予想外に見出した。
【００２３】
本発明の方法は、β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する。
【００２４】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、セロビオースであり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼであり得る。
【００２５】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、重合度３以上のセロオリゴ糖であり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロデキストリンホスホリラーゼであり得る。
【００２６】
１つの実施形態では、上記β−１，４−グルカンは、重合度３以上のセロオリゴ糖であり得、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼであり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記生産工程において、上記α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを、上記溶液から除去する工程をさらに包含し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記溶液は、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含み得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記溶液は、グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含み得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記溶液は、カタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含み得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記リン酸源は、無機リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸とグルコース−１−リン酸との混合物であり得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記リン酸源の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭであり得る。
【００３３】
１つの実施形態では、上記α−グルカンが、アミロースである、請求項１に記載の方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の方法により、非消化性のセルロースを消化性の食品へと効率よく変換できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。
【図２】図２は、β−１，４−グルカンとしてセロビオースを用い、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いた場合の、本発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。
【図３】図３は、セロビオースホスホリラーゼの濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図４】図４は、リン酸濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図５】図５は、セロビオース濃度と、プライマー濃度と、リン酸濃度との比率を一定としてセロビオース濃度を上昇させた場合のアミロース収率の変化を示す。
【図６】図６は、本発明の製造方法において、グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）またはグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加した場合のアミロース収率の変化を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１は、合成ＤＮＡプライマー１の塩基配列であり；
配列番号２は、合成ＤＮＡプライマー２の塩基配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書中では「α−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α−グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状α−グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状α−グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むα−グルカンは、分岐状α−グルカンである。α−グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状α−グルカンがより好ましい。本発明で製造されるα−グルカンは、好ましくは、アミロース、環状構造を有するグルカンまたは分岐構造を有するグルカンであり、より好ましくはアミロースである。１分子のα−グルカンに含まれる糖単位の数を、このα−グルカンの重合度という。
【００４０】
α−グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。
【００４１】
本発明の方法によって製造される分岐状α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは１０〜５０００であり、さらに好ましくは５０〜１０００であり、さらに好ましくは１００〜５００である。
【００４２】
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
【００４３】
α−グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、α−グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。α−グルカンの性質を損なわない程度の修飾としては、エステル化、エーテル化、架橋などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。
【００４４】
α−グルカンは、代表的には約１×１０３以上、好ましくは約５×１０３以上、より好ましくは約１×１０４以上、さらに好ましくは約５×１０４以上、さらに好ましくは約１×１０５以上の分子量を有する。α−グルカンは、代表的には約１×１０６以下、好ましくは約５×１０５以下、さらに好ましくは約１×１０５以下の分子量を有する。
【００４５】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質（例えば、プライマー、β−１，４−グルカンなど）の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。
【００４６】
＜α−グルカンの製造に用いる材料＞
本発明の製造方法では、例えば、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を用いる。この溶液の調製においては、例えば、β−１，４−グルカンと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼと、緩衝剤およびこれらを溶かしている溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【００４７】
本明細書において使用される用語「リン酸源」とは、ＣＢＰの触媒反応にリン酸を提供し得る分子をいい、無機リン酸（例えば、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４のような無機リン酸塩）ならびに有機リン酸塩（例えば、グルコース−１−リン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の製造方法では、溶液中にグルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含み得る。グルコースオキシダーゼを用いる場合、ムタロターゼをさらに含み得る。グルコースオキシダーゼを用いる場合はまた、本発明の溶液は、カタラーゼまたはペルオキシダーゼも含み得る。
【００４９】
本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするα−グルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から溶液中に添加してもよく、途中から溶液中に添加してもよい。
【００５０】
（１．β−１，４−グルカン）
本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００５１】
溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、代表的には約０．１％〜約４０％であり、好ましくは約０．５％〜約３０％であり、より好ましくは約１％〜約２０％であり、特に好ましくは約２％〜約１５％であり、最も好ましくは約３％〜約１２％である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−グルカンが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。
【００５２】
本明細書中では、溶液中のβ−１，４−グルカンモル濃度を、反応溶液中の無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計によって除算することによって得られる比率を、β−１，４−グルカン：リン酸比率という。すなわち、以下の通りである：
【００５３】
【数１】
全反応材料を投入して反応を始めて、反応中に材料の追加をしないのであれば、β−１，４−グルカン：リン酸比率は反応開始時が最大である。反応開始時のβ−１，４−グルカン：リン酸比率は、任意の比率であり得るが、好ましくは、約０．０１以上であり、より好ましくは約０．０３以上であり、さらに好ましくは約０．０６以上であり、特に好ましくは約０．１以上であり、最も好ましくは約０．１〜約０．６である。
【００５４】
（２．プライマー）
本発明の方法で用いられるプライマーとは、α−グルカンの合成においてグリコシド残基を付加するための出発物質として作用する分子をいう。なお、本明細書中では、グリコシド残基とグルコース残基とは交換可能に使用され得る。プライマーは、Ｇ−１−Ｐのグリコシド残基のアクセプターとして作用する分子ともいうことができる。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、反応開始時に含まれるプライマーに対して１つのグリコシド残基がα−１，４結合で転移することによって、このプライマーよりも重合度が１大きいα−グルカンが形成される。形成されたこのα−グルカンは、同じ溶液中で再度アクセプターとして作用することができる。このようにして、本発明の方法では、プライマーに対してグリコシド残基がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、任意の重合度のα−グルカンが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。
【００５５】
プライマーは、本発明の反応の出発物質として作用し得ればよく、例えば、本発明の方法によって合成されたα−グルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によってα−１，４−グルコシド鎖を再度伸長することも可能である。
【００５６】
プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。
【００５７】
プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００５８】
マルトオリゴ糖は、本明細書中では、約２個〜約１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは約３個〜約１０個の糖単位、より好ましくは約４個〜約１０個の糖単位、さらに好ましくは約５個〜約１０個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。１つの実施形態では、マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、より好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、さらに好ましくはマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。１つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する。ここで、「マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖」とは、重合度４以上のマルトオリゴ糖をいう。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。
【００５９】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。
【００６０】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約１×１０５程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。
【００６１】
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
【００６２】
グリコーゲンの分子量は代表的には約１×１０５〜約１×１０８であり、好ましくは約１×１０６〜約１×１０７である。
【００６３】
プルランは、マルトトリオースが規則正しく、階段状にα−１，６−結合した、分子量約１０万〜約３０万（例えば、約２０万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００６４】
カップリングシュガーは、ショ糖、グルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００６５】
澱粉は、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。
【００６６】
澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。
【００６７】
天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を５０％〜７０％まで高めたハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないワキシー澱粉である。
【００６８】
可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。
【００６９】
化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊していない澱粉である。
【００７０】
澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。
【００７１】
澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００７２】
澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にグルカンホスホリラーゼ（ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端からグルコース残基を１糖単位ずつ他の基質へと転移させる。グルカンホスホリラーゼは、α−１，６−グルコシド結合を切断することができないので、グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、α−１，６−グルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００７３】
デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【００７４】
澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【００７５】
本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも１つが、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの２種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。
【００７６】
（３．無機リン酸またはグルコース−１−リン酸）
本明細書中において、無機リン酸などのリン酸源とは、ＣＢＰの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒されるβ−１，４−グルカン加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。
【００７７】
無機リン酸は、反応開始時のＣＢＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。
【００７８】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【００７９】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００８０】
グルコース−１−リン酸は反応開始時のＣＢＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【００８１】
本発明の方法において、反応開始時の反応溶液中のリン酸とグルコース−１−リン酸との間の比率は、任意の比率であり得る。
【００８２】
反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭであり、さらにより好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭである。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、反応自体は起こるものの、α−グルカンの収率が低下する場合がある。これらの使用量が少なすぎると、α−グルカンの合成に時間がかかる場合がある。
【００８３】
本発明の方法における溶液中の無機リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。この溶液中のグルコース−１−リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の合計含有量を測定してもよい。
【００８４】
無機リン酸は、例えば、リン酸イオンとして以下の方法により求められる。無機リン酸を含む溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
【００８５】
グルコース−１−リン酸は、例えば、以下の方法により定量され得る。３００μｌの測定試薬（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、３ｍＭ ＮＡＤＰ、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５μＭグルコース−１，６−二リン酸、６μｇ／ｍｌ ホスホグルコムターゼ、６μｇ／ｍｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース−１−リン酸を含む溶液６００μｌを加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。通常は、１分間に１μｍｏｌのグルコース−１−リン酸を生成する活性を１単位とする。この定量法では、グルコース−１−リン酸のみが定量され、無機リン酸の量は定量されない。
【００８６】
（４．β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００８７】
【化１】
なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。
【００８８】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。
【００８９】
セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００９０】
【化２】
セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００９１】
【化３】
本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。
【００９２】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９３】
セロビオースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓであり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロビオースホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９４】
セロデキストリンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロデキストリンホスホリラーゼホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【００９５】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。
【００９６】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【００９７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【００９８】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００９９】
本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したβ−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１００】
本発明の方法で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、β−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子でβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物からβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを得てもよい。
【０１０１】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１０２】
クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【０１０３】
クローン化した遺伝子について、生産されるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。
【０１０４】
当業者は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。
【０１０５】
例えば、発現されたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現されたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られたβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。α−アミラーゼなどのグルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、α−グルカンの製造に用い得る。
【０１０６】
反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０５〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．１〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、特に好ましくは約０．５〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１〜７Ｕ／ β−１，４−グルカンである。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１０８】
（５．α−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．１）とは、α−１，４−グルカン（重合度ｎ）の加リン酸分解による、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）とα−Ｄ−グルコース−１−リン酸との産生を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）およびα−Ｄ−グルコース−１−リン酸からα−１，４−グルカン（重合度ｎ）を合成する反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、β−１，４−グルカンの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【０１０９】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【０１１０】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【０１１１】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【０１１２】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．などが挙げられる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１１３】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１１４】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【０１１５】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物から単離したα−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１１６】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１１７】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１１８】
遺伝子組換えによって得られたα−１，４−グルカンホスホリラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１１９】
反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、特に好ましくは約１〜８０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１２０】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１２１】
（６．グルコースイソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．５））
本発明の製造方法においては、溶液液中にグルコースイソメラーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたグルコースをフルクトースへと変換できる。グルコースはセロビオースの加リン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１２２】
本発明の製造方法で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換をも触媒し得るので、キシロースイソメラーゼとも呼ばれる。
【０１２３】
グルコースイソメラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。グルコースイソメラーゼを産生する微生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏ ｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓおよびＰａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｇｅｎｏｉｄｅｓが挙げられる。グルコースイソメラーゼを産生する動物の例としては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉが挙げられる。グルコースイソメラーゼは、植物由来であってもよい。グルコースイソメラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１２４】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に由来することが好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースイソメラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースイソメラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１２５】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースイソメラーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１２６】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、これらの生物から単離したグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１２７】
グルコースイソメラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１２８】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースイソメラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルコースイソメラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グルコースイソメラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースイソメラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１２９】
遺伝子組換えによるグルコースイソメラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１３０】
反応開始時の溶液中に含まれるグルコースイソメラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．１〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約０．５〜１０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約１〜５Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グルコースイソメラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１３１】
グルコースイソメラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。グルコースイソメラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルコースイソメラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースイソメラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルコースイソメラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１３２】
（７．グルコースオキシダーゼ）
本発明の製造方法においては、溶液中にグルコースオキシダーゼをさらに含むことが好ましい。反応液中にグルコースオキシダーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたα−グルコースから自然変換されたβ−グルコースをβ−グルコノ−δラクトンへと変換できる。α−グルコースはセロビオースの加リン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースオキシダーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１３３】
本発明の製造方法で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、以下の反応を触媒し得る酵素である：
【０１３４】
【化４】
グルコースオキシダーゼは、微生物および植物に存在する。グルコースオキシダーゼを産生する微生物の例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍおよびＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍが挙げられる。グルコースオキシダーゼは植物由来であってもよい。グルコースオキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１３５】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅに由来することが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースオキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースオキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１３６】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースオキシダーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１３７】
本発明で用いられ得るグルコースオキシダーゼは、これらの生物から単離したグルコースオキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１３８】
グルコースオキシダーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１３９】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースオキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルコースオキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グルコースオキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースオキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１４０】
遺伝子組換えによるグルコースオキシダーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１４１】
反応開始時の溶液中に含まれるグルコースオキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約５〜４００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約１０〜３００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約２０〜２００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グルコースオキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１４２】
グルコースオキシダーゼは、精製されていても未精製であってもよい。グルコースオキシダーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルコースオキシダーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースオキシダーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルコースオキシダーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１４３】
（８．ムタロターゼ）
本発明の製造方法において溶液中にグルコースオキシダーゼを含む場合、溶液中にムタロターゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にムタロターゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたα−グルコースとβ−グルコースとを相互変換し得る。α−グルコースとβ−グルコースとは、ムタロターゼを加えなくとも自然に相互変換されるとはいえ、ムタロターゼを加えることによって相互変換が促進されるので、反応によって生じたα−グルコースを溶液から減らす効率をより向上させ得る。それゆえ、反応液中にグルコースオキシダーゼおよびムタロターゼを含むことにより、反応液中のα−グルコース濃度を低下させ、その結果、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１４４】
本発明の製造方法で用いられ得るムタロターゼは、α−グルコースとβ−グルコースとの相互変換を触媒し得る酵素である。
【０１４５】
ムタロターゼは、微生物、動物および植物に存在する。ムタロターゼを産生する微生物の例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが挙げられる。ムタロターゼを産生する動物の例としては、ブタおよびＢｏｓ ｔａｕｒｕｓが挙げられる。ムタロターゼを産生する植物の例としては、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓが挙げられる。ムタロターゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１４６】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、ブタまたはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓに由来することが好ましく、ブタに由来することがより好ましい。本発明で用いられるムタロターゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いムタロターゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１４７】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、上記のような自然界に存在する、ムタロターゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１４８】
本発明で用いられ得るムタロターゼは、これらの生物から単離したムタロターゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１４９】
ムタロターゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１５０】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、ムタロターゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ムタロターゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ムタロターゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるムタロターゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１５１】
遺伝子組換えによるムタロターゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１５２】
反応開始時の溶液中に含まれるムタロターゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．０１〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．０１〜５０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり，特に好ましくは約０．０５〜１０Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンであり、最も好ましくは約０．１〜５Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。ムタロターゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１５３】
ムタロターゼは、精製されていても未精製であってもよい。ムタロターゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。ムタロターゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。ムタロターゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。ムタロターゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１５４】
（９．カタラーゼおよびペルオキシダーゼ）
本発明の製造方法において溶液中にグルコースオキシダーゼを含む場合、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを含むことにより、グルコースオキシダーゼによって触媒される反応によって生じる過酸化水素を酸素に変換し、酸素をリサイクルさせることができる。それゆえ、反応液中にグルコースオキシダーゼと、カタラーゼまたはペルオキシダーゼとを含むことにより、反応液中のα−グルコース濃度を低下させ、その結果、セロビオースの加リン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られるα−グルカンの収率を向上させることができる。
【０１５５】
本発明の製造方法で用いられ得るカタラーゼは、過酸化水素を酸素と水とに分解する反応を触媒する酵素である。
【０１５６】
カタラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。カタラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｅｑｕｉｆｅｔａｌｅ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｈｉｐｐｉｋｏｎ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｐｈｉｌｕｍ ａｌｂｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ｓｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉおよびＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓが挙げられる。カタラーゼを産生する動物の例としては、Ｃａｐｒａ ａｅｇａｇｒｕｓ ｈｉｒｃｕｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓおよびＮｏｔｏｍａｓｔｕｓ ｌｏｂａｔｕｓ（多毛類）が挙げられる。カタラーゼを産生する植物の例としては、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ（藻類）およびＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍが挙げられる。カタラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１５７】
本発明で用いられ得るカタラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ（牛肝臓）またはＨｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ（ヒト赤血球）に由来することが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来することがより好ましい。本発明で用いられるカタラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いカタラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１５８】
本発明の製造方法で用いられ得るペルオキシダーゼは、過酸化水素を水素受容体として種々の有機物の酸化を触媒する酵素である。
【０１５９】
ペルオキシダーゼは、微生物、動物および植物に存在する。ペルオキシダーゼを産生する微生物の例としては、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｆｒｉｅｓｉｉ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ、Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ ｉｇｎｉａｒｉｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｐｈｉｌｕｍ ａｌｂｕｍ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓおよびＣｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓが挙げられる。なお、本明細書中では、微生物は、細菌および真菌を含む。ペルオキシダーゼを産生する動物の例としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓが挙げられる。ペルオキシダーゼを産生する植物の例としては、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）、Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ、Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｌａｐａｔｈｉｆｏｌｉａ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ Ｃａｒｒ．、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ Ｌ．，Ｋａｒｓｔｅｎ、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ、Ｖｉｔｉｓ Ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ、Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．が挙げられる。ペルオキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１６０】
本発明で用いられ得るペルオキシダーゼは、西洋ワサビおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、西洋ワサビに由来することがより好ましい。本発明で用いられるペルオキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いペルオキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１６１】
本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、カタラーゼまたはペルオキシダーゼを産生する生物から直接単離され得る。
【０１６２】
本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、これらの生物から単離したカタラーゼまたはペルオキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１６３】
カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１６４】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、カタラーゼまたはペルオキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるカタラーゼまたはペルオキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１６５】
遺伝子組換えによるカタラーゼまたはペルオキシダーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１６６】
反応開始時の溶液中に含まれるカタラーゼまたはペルオキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１．０〜２００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。カタラーゼまたはペルオキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１６７】
カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、精製されていても未精製であってもよい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。カタラーゼまたはペルオキシダーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。カタラーゼまたはペルオキシダーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１６８】
（１０．枝切り酵素）
本発明の方法において、α−１，６−グルコシド結合を含有する出発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。
【０１６９】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ ３．２．１．４１）との２つに分類される。
【０１７０】
枝切り酵素は、微生物および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。
【０１７１】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することが好ましく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１７２】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、上記のような自然界に存在する、枝切り酵素を産生する微生物および植物から直接単離され得る。
【０１７３】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、これらの微生物および植物から単離した枝切り酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１７４】
枝切り酵素は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１７５】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、枝切り酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。枝切り酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。枝切り酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される枝切り酵素は、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１７６】
遺伝子組換えによる枝切り酵素の生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１７７】
反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。枝切り酵素の重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１７８】
枝切り酵素は、精製されていても未精製であってもよい。枝切り酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。枝切り酵素は、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。枝切り酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。枝切り酵素はまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１７９】
（１１．ブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．１８））
本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１８０】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。
【０１８１】
ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１８２】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、ジャガイモ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することが好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングエンザイムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１８３】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、ブランチングエンザイムを産生する微生物、動物、および植物から直接単離され得る。
【０１８４】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、これらの微生物、動物、および植物から単離したブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１８５】
ブランチングエンザイムは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１８６】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、ブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１８７】
遺伝子組換えによるブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１８８】
反応開始時の溶液中に含まれるブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約１０〜１００，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約１００〜５０，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１，０００〜１０，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。ブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１８９】
ブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。ブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。ブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。ブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。ブランチングエンザイムはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１９０】
（１２．４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．１．２５））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。
【０１９１】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。
【０１９２】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１９３】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ｌｉｔｒａｌｉｓに由来することが好ましく、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い４−α−グルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１９４】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のような自然界に存在する、４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物および植物から直接単離され得る。
【０１９５】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、これらの微生物および植物から単離した４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１９６】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０１９７】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、４−α−グルカノトランスフェラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１９８】
遺伝子組換えによる４−α−グルカノトランスフェラーゼの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０１９９】
反応開始時の溶液中に含まれる４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０５〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約０．５〜１００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。４−α−グルカノトランスフェラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０２００】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。４−α−グルカノトランスフェラーゼはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０２０１】
（１３．グリコーゲンデブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．２５／ＥＣ．３．２．１．３３））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。
【０２０２】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。
【０２０３】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグリコーゲンデブランチングエンザイムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変を加えることで得られる。
【０２０５】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のような自然界に存在する、グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物および動物から直接単離され得る。
【０２０６】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、これらの微生物および動物から単離したグリコーゲンデブランチングエンザイムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０２０７】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【０２０８】
遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に、グリコーゲンデブランチングエンザイムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０２０９】
遺伝子組換えによるグリコーゲンデブランチングエンザイムの生産および精製は、上記のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。
【０２１０】
反応開始時の溶液中に含まれるグリコーゲンデブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンに対して、代表的には約０．０１〜５，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、好ましくは約０．１〜１，０００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカン、より好ましくは約１〜５００Ｕ／ｇ β−１，４−グルカンである。グリコーゲンデブランチングエンザイムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０２１１】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、精製されていても未精製であってもよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グリコーゲンデブランチングエンザイムは、担体上に固定化されていることが好ましい。グリコーゲンデブランチングエンザイムはまた、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０２１２】
（１４．溶媒）
本発明の方法に用いる溶媒は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０２１３】
なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、β−１，４−グルカンなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０２１４】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼまたはα−１，４−グルカンホスホリラーゼを調製する際にβ−１，４−グルカンホスホリラーゼまたはα−１，４−グルカンホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【０２１５】
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０２１６】
（１５．他の成分）
β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液中には、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとβ−１，４−グルカンとの間の相互作用およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０２１７】
＜α−グルカンの製造＞
本発明のα−グルカンは、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させる工程により製造される。
【０２１８】
図２に、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。β−１，４−グルカン（重合度ｎ）と無機リン酸から、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびβ−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）として伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０２１９】
なお、初発のβ−１，４−グルカンがセロビオースであって、β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合の、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を図２に示す。セロビオース（重合度２）と無機リン酸から、セロビオースホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびグルコースが生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる。
【０２２０】
本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のβ−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸のようなリン酸源、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、またはα−１，４−グルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸のようなリン酸源、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６．５〜約７．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。塩濃度は、好ましくは１．０ｍＭ〜５０ｍＭであり、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。
【０２２１】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、この溶液には、α−グルカンの生成の際に生成するグルコースを溶液から除去するために、例えば、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼ（およびムタロターゼ）をさらに添加してもよい。さらに、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを添加してもよい。あるいは、酵母のような、グルコースを資化することによってグルコースを溶液中から除去する微生物を添加してもよい。あるいは、グルコース特異的吸着樹脂を添加してもよい。酵素または微生物を添加する方法は、反応を連続して進行させながらグルコースを同時に除去し得るので好ましい。なお、本明細書中では、「除去する」とは、反応液中のグルコースの量を低減させることおよびグルコースを存在させなくすることを包含する。
【０２２２】
また、この溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。これらの酵素は、α−グルカン合成反応の開始時に添加されてもよく、反応の途中に添加されてもよく、また、反応が終了した後に添加されてもよい。
【０２２３】
次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は、好ましくは約３０℃〜約７０℃の温度であり、より好ましくは約３５℃〜約６０℃である。
【０２２４】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０２２５】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０２２６】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０２２７】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、上述したように、グルコースイソメラーゼなどの酵素を添加して、α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを除去する工程を、生産工程と同時に行うことが好ましい。他方、グルコースを除去する工程は、α−グルカン生産工程とタイミングをずらして行ってもよい。例えば、本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、反応によって生成されたグルコースを除去するために、溶液をクロマト分画、膜分画法などの物理的グルコース除去方法で処理し、その後再度、反応を進行させてもよい。物理的グルコース除去方法は、１回実施されても、２回以上実施されてもよい。２回以上実施する場合、例えば、反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間行うこととし得る。
【０２２８】
このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。
【０２２９】
反応終了後、溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもよい。
【０２３０】
＜精製方法＞
生産されたα−グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、グルコースである。α−グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
【０２３１】
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
【０２３２】
有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。
【０２３３】
（１）α−グルカン生産反応後、反応溶液を冷却することによりα−グルカンを沈澱させ、そして沈澱したα−グルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；
（２）α−グルカン生産反応の間もしくはα−グルカン生産反応後に反応溶液を冷却してα−グルカンをゲル化し、ゲル化したα−グルカンを回収し、そしてゲル化したα−グルカンから、グルコースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法；ならびに
（３）α−グルカン生産反応後、水に溶解しているα−グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してグルコースを除去する方法。
【０２３４】
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
【０２３５】
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
【実施例１】
【０２３６】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【０２３７】
（１．測定方法および計算方法）
本発明における各種酵素の活性および得られるα−グルカンの収率を、以下の測定方法によって測定した。
【０２３８】
（１．１ セロビオースホスホリラーゼの活性測定法）
３０μｌの４０ｍＭセロビオース水溶液と３０μｌの４０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液（試料）６０μｌを加えて１２０μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートすることにより反応を進行させた後、１００℃で１０分間保持することによって酵素を失活させる。続いて７８０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および１２０μｌの発色試薬（グルコースＡＲ−ＩＩ発色試薬（和光純薬社製））をこの混合液に添加して混合し、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。セロビオースホスホリラーゼ１単位とは、上記方法により２０ｍＭセロビオースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【０２３９】
（１．２ α−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性測定法）
５０μｌの４％クラスターデキストリン水溶液と５０μｌの５０ｍＭグルコース−１−リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液１００μｌを加えて２００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートして反応を進行させた後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、反応を停止させる。続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性を、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１単位とする。
【０２４０】
（１．３ 得られるα−グルカンの収率の計算方法）
本発明の製造方法によるα−グルカンの収率を、得られたα−グルカン中に取り込まれたグルコース残基のモル数が、最初に添加された初発セロビオースのモル数の何％にあたるかによって計算した。反応終了後の溶液にエタノールを終濃度５０％になるよう加えてα−グルカンを沈殿させて上清を捨て、更に適量の５０％エタノールでα−グルカンを２度洗浄した後、乾燥し、適量の水に溶解後、フェノール−硫酸法によりグルコース濃度を測定することにより、α−グルカンの収量（モル数）を計算した。この収量（モル数）をセロビオースのモル数で除算して１００倍することにより、収率を計算した。この計算式を次式に示す。
【０２４１】
【数２】
（１．４ α−グルカンの重量平均分子量の測定法）
本発明で合成したα−グルカンを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、α−グルカン約３００μｇ分を、示差屈折計および多角度光散乱検出器を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた。
【０２４２】
詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ（昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求めた。
【０２４３】
（２．酵素の調製）
本発明の実施例で用いた各種酵素を、以下の方法によって調製した。
【０２４４】
（２．１ 組換えセロビオースホスホリラーゼの調製方法）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの染色体遺伝子を抽出し、これをテンプレートとした。以下の２種の合成ＤＮＡプライマー：
合成ＤＮＡプライマー１：５’ ａａａｃｔｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｔｇａｔ ３’（配列番号１）および
合成ＤＮＡプライマー２：５’ ａａａｃｔｃｇａｇａａｔｔａｃｔｔｃａａｃｔｔｔｇｔｇａｇｔｃｔｔｔ ３’（配列番号２）
を用い、
９８℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で３分間の順で３０サイクル加熱の条件下でＰＣＲを行うことにより、ＣＢＰ遺伝子を含む領域を増幅させた。増幅した遺伝子を選択マーカー遺伝子Ｋｍｒとともに発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＣＢＰ１を得た。このプラスミドでは、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。
【０２４５】
このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来セロビオースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。
【０２４６】
得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２４７】
この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるようにこの培地に添加し、３７℃でさらに８時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、１３２Ｕ／ｍｌのセロビオースホスホリラーゼが含まれていた。
【０２４８】
この菌体破砕液を、５５℃で２０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいたＨｉｓ−Ｔａｇ吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に流してセロビオースホスホリラーゼをこの樹脂に吸着させた。この樹脂を、３００ｍＭ塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ２−メルカプトエタノール含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムと１５０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出させ、組換えセロビオースホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２４９】
（２．２ 組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼの調製方法）
馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１）を選択マーカー遺伝子Ａｍｐｒとともに発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２５０】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。
【０２５１】
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清（タンパク質１２５ｍｇを含む）を、平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）を用いてあらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してグルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えグルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２５２】
（実施例１−１〜１−６：種々のプライマー濃度でのアミロース合成）
以下の表１に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５３】
【表１】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量を上記１．４に従って決定した。結果を表１に示す。
【０２５４】
この結果、セロビオースに、リン酸の存在下でセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を作用させてグルコース−１−リン酸およびグルコースを生じる反応と、グルコース−１−リン酸に、プライマー存在下でグルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）を作用させてプライマーにグルコース残基を転移させる反応とを同一の溶液中で行うことにより、アミロースを製造することができた。また、反応液のプライマー濃度を変化させることで、合成されるアミロースの重合度を自在にコントロールできる、すなわち、高分子量のアミロースを合成したい場合、少ない量のプライマーを用いればよく、低分子量のアミロースを合成したい場合、多量のプライマーを用いればよいことが確認された。
【０２５５】
（実施例２−１〜２−５：種々のセロビオースホスホリラーゼ濃度でのアミロース合成）
以下の表２に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５６】
【表２】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表２および図３に示す。
【０２５７】
この結果、６．６０Ｕ／ｇセロビオースまでは、セロビオースホスホリラーゼの量を増やすほど、アミロースの収率が高くなるが、６．６０Ｕ／ｇセロビオースを超えると、セロビオースホスホリラーゼの量を増やしても、得られるアミロースの収率はそれほど増えないことがわかった。それゆえ、６．６０Ｕ／ｇセロビオースのセロビオースホスホリラーゼ濃度が好適な濃度であることがわかった。また、アミロース合成反応収率は最大で３３．８％であるので、これらの結果から、工業レベルでのアミロース生産が可能であることが確認された。
【０２５８】
（実施例３−１〜３−５：種々のリン酸濃度でのアミロース合成）
以下の表３に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２５９】
【表３】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表３および図４に示す。
【０２６０】
この結果、リン酸濃度が１５ｍＭ〜３０ｍＭのときにアミロースの収率が最も高いが、５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲では、アミロースの収率はそれほど大きく変わらないため、５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲で効率的なアミロース合成を行えることがわかった。
【０２６１】
（実施例４−１〜４−３：種々のセロビオース濃度でのアミロース合成）
以下の表４に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２６２】
【表４】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表４および図５に示す。
【０２６３】
この結果、セロビオースとプライマーとリン酸との濃度比を変化させずにセロビオースの濃度を上昇させた場合、セロビオースの濃度の上昇によるアミロース合成の阻害は生じなかった。そのため、アミロースを大量に合成するために、セロビオースの濃度を上昇させることができることがわかった。
【０２６４】
（実施例５−１〜５−４：グルコースイソメラーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルオキシダーゼを用いたアミロース合成）
以下の表５に示す組成（反応開始時）の反応混合物を用いて、４５℃で１６時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。
【０２６５】
【表５】
反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記１．３および１．４に従って決定した。結果を表５および図６に示す。
【０２６６】
この結果、反応系にグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）またはグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加することによって、アミロースの収率が飛躍的に向上することがわかった。特に、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）＋ムタロターゼ（ＭＴ）＋ペルオキシダーゼ（ＰＯｘ）を添加した場合には、アミロースの収率は６４．８％と、これらの酵素を添加しない場合（３２．８％）の約２倍であった。
【０２６７】
この収率の向上は、セロビオースの加リン酸分解で生じるグルコースがＣＢＰおよびＧＰの反応を阻害するため、ＧＩまたはＧＯｘにより反応液中のグルコースを分解してその相対濃度を下げることにより、ＣＢＰおよびＧＰに対する反応阻害の問題を回避できたためであると考えられる。
【０２６８】
（実施例６：α−１，６分岐を含むグルカンの合成）
セロビオース０．３ｇ、プライマー（Ｇ４）０．７５マイクロモルを、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解させ、ここに上記の２．１の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ１．９８Ｕ、上記の２．２の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１５Ｕ、さらに特開２０００−３１６５８１号の実施例１に記載の方法に従って調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ブランチングエンザイム１，５００Ｕを加えて反応液を調製し、この反応液を４５℃で１６時間インキュベートした。インキュベート終了後、反応液に等量の１００％エタノールを加えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、分岐構造を有するグルカン０．０４８ｇを得た（収率約３２％）。
【０２６９】
（実施例６で得られたグルカンの分析）
実施例６で合成されたグルカンが分岐構造を有するか否か、および合成されたグルカンの平均単位鎖長を、Ｈ．Ｔａｋａｔａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２９５，９１−１０１（１９９６）に記載の方法に従って決定した。その結果、合成されたグルカンが分岐構造を有することおよび平均単位鎖長が１１であることが確認された。このように、反応液中にＣＢＰおよびＧＰに加えてブランチングエンザイムをさらに含むことにより、セロビオースから、分岐構造を有するグルカンを合成し得ることがわかった。
【０２７０】
（実施例７：環状構造を有するグルカンの合成）
セロビオース０．３ｇ、プライマー（Ｇ４）０．７５マイクロモルを、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解させ、ここに上記の２．１の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ１．９８Ｕ、上記の２．２の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１５Ｕ、さらにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼ１．５Ｕを加えて反応液を調製し、この反応液を４５℃で１６時間インキュベートした。なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来４−α−グルカノトランスフェラーゼの唯一公知のＤＮＡ配列を使用して、上記２．２のα−１，４−グルカンホスホリラーゼと同様の方法で調製したものを使用した。
【０２７１】
インキュベート終了後、反応液に等量の１００％エタノールを加えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、環状構造を有するグルカン（環状グルカン）と直鎖状グルカン（アミロース）との混合物を０．０５ｇ得た（収率約３３％）。
【０２７２】
（実施例７で得られたグルカンの分析）
４−α−グルカノトランスフェラーゼがアミロースに作用すると、アミロースから完全に環状のグルカンが切り出されて合成され、そしてその環状グルカンの鎖長分短くなったアミロースが残る。そこで、合成された環状グルカンの量を、Ｔ．Ｔａｋａｈａ，Ｍ．Ｙａｎａｓｅ，Ｈ．Ｔａｋａｔａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９０２−２９０８（１９９６）に記載の方法に従って測定した。この方法では、溶液中のアミロースをグルコース単位に分解し、残存する環状グルカンの量が測定される。この測定の結果、環状グルカンが形成されたことが確認された。また、測定された環状グルカンの量を出発原料のセロビオースの量と比較し、環状グルカンの収率を算出したところ、９．６％であった。従って、実施例７で得られたグルカンのうちの約２９％が環状グルカンであり、残りの約７１％が直鎖状のアミロースであることがわかった。このように、反応液中にＣＢＰおよびＧＰに加えて４−α−グルカノトランスフェラーゼをさらに含むことにより、セロビオースから、環状構造を有するグルカンを合成し得ることがわかった。
【０２７３】
（参考例１：スクロースホスホリラーゼの平衡収率）
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）の平衡収率を調べるために、Ｇ−１−Ｐを出発原料にした場合の平衡収率を求めた。
【０２７４】
まず、
終濃度５０ｍＭのＧ−１−Ｐ；
終濃度５０Ｕ／ｍｌの酵素（ＳＰ）；
終濃度５０ｍＭのアクセプター（フルクトース）；および
終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
を混合し、４５℃で６時間または１６時間インキュベート後、遊離したリン濃度をモリブデン法により測定した。得られたリン濃度から、この酵素についての平衡収率を次式に従って求めた：
平衡収率（％）＝リン濃度（ｍＭ）／５０×１００。
【０２７５】
結果を以下の表６に示す：
【０２７６】
【表６】
（参考例２：リン酸の存在下で２つのホスホリラーゼをカップリングさせた場合の生産物の収率）
以下の２つの場合の反応収率を求めた：
（２−１）セロビオースからのスクロース生産（ＣＢＰ＋ＳＰ＋Ｆｒｕ）；
（２−２）ＧＯｘ＋ＭＴ＋ＰＯｘ共存下での、セロビオースからのスクロース生産（ＣＢＰ＋ＳＰ＋Ｆｒｕ＋ＧＯｘ＋ＭＴ＋ＰＯｘ）。
【０２７７】
まず、終濃度５０ｍＭの出発原料（セロビオース）、終濃度１０、３０または１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、および終濃度５０Ｕ／ｍｌのそれぞれの酵素を混合し、４５℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液をインベルターゼで分解し、遊離するグルコース濃度を測定することでスクロース濃度を求めた。これらの２つの反応系のいずれにおいてもスクロースが生産物である。得られたスクロース濃度から、それぞれの反応系についての平衡収率を次式に従って求めた：
平衡収率（％）＝スクロース濃度（ｍＭ）／５０（ｍＭ）×１００。
【０２７８】
結果を以下の表７に示す：
【０２７９】
【表７】
この結果、セロビオースからスクロースを合成する反応の収率は、リン酸濃度を変えても、きわめて低かった。また、グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルオキシダーゼを用いて反応系からグルコースを消去することによってスクロースの収率アップを図ったが、ほとんど収率は上がらなかった。
【産業上の利用可能性】
【０２８０】
本発明の方法により、非消化性のβ−１，４−グルカン（特に、セルロースおよびその部分分解物）を可食性の食品へと変換できる。本発明の方法により、地球上に大量に存在するバイオマスであるβ−１，４−グルカンを、安価で効率的にα−１，４−グルカンに変換することができるので、食糧危機問題、ゴミ問題の解決にも大きく貢献する。
【０２８１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、
β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−１，４−グルカンが、重合度３以上のセロオリゴ糖であり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロデキストリンホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記β−１，４−グルカンが、重合度３以上のセロオリゴ糖であり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生産工程において、前記α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを、前記溶液から除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、カタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リン酸源が、無機リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸とグルコース−１−リン酸との混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リン酸源の濃度が、１ｍＭ〜５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記α−グルカンが、アミロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、
β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−１，４−グルカンが、重合度３以上のセロオリゴ糖であり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロデキストリンホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記β−１，４−グルカンが、重合度３以上のセロオリゴ糖であり、前記β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生産工程において、前記α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを、前記溶液から除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、カタラーゼまたはペルオキシダーゼをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リン酸源が、無機リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸とグルコース−１−リン酸との混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リン酸源の濃度が、１ｍＭ〜５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記α−グルカンが、アミロースである、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６８１１
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６１８１（Ｐ２００５−５１６１８１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８４１６
【国際出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８４１６
【国際出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]