アシルＣｏＡ：エタノールＯ−アシルトランスフェラーゼ／エステラーゼ遺伝子及びその用途
【課題】エステル生成能の制御された醸造酵母、その酵母を用いるエステル含量の増大あるいは減少した酒類の製造法などを提供する。
【解決手段】アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子をベクターを介して導入して、香味に優れた酒類を製造する形質転換酵母を得、該酵母を用いて酒類を製造する。さらに具体的には、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEEB1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnon-ScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母を得、当該酵母を用いて酒類を製造する。
【解決手段】アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子をベクターを介して導入して、香味に優れた酒類を製造する形質転換酵母を得、該酵母を用いて酒類を製造する。さらに具体的には、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEEB1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnon-ScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母を得、当該酵母を用いて酒類を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEeb1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnon-ScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類においてエステルは重要な重要な香り成分の１つである。清酒やワイン、ウイスキーなどではエステルの増加は酒に華やかな香りをもたらし、官能的に高い評価をもたらすことが知られている。一方ビールにおいてはエステルは重要な香気成分ではあるが、過剰なエステルはエステル臭として嫌われる。従って酒の種類によってエステル生成量を適度に制御することが重要である。
これまでに、酒のエステル含量を高める目的でエステル高生産酵母が育種されている。酵母に変異処理を施し、(または施さずに)エステル高生産酵母を効率よく分離するために，セルレニン等の脂肪酸合成酵素を阻害する薬剤含有培地で、カプロン酸を高生産する能力のある菌株を取得する方法、及び５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン等のロイシンアナログ含有培地で、イソアミルアルコール、酢酸イソアミルを高生産する菌株を取得する方法（特許文献１：特開2002-253211号公報）、３位が水酸化されたプレグナン骨格を有するステロイドを含有する培地で生育した菌株を取得する方法（特許文献２：特開2002-191355号公報）等がすでに報告されている。
【０００３】
一方、遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法ではSaccharomyces cerevisiaeのアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF１を醸造用酵母で高発現させた例（特許文献３：特開平06-062849号公報）や、ATF１の発現を抑制した例（特許文献４：特開平06-253826号公報）、醸造用酵母のエステラーゼ遺伝子EST2を破壊し、エステル量を増加させた例（特許文献５：特開平09-234077号公報）が報告されている。また、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子EEB1を破壊することにより、中鎖脂肪酸エステルが減少することが報告されている(非特許文献１)。一方でEEB1破壊により酢酸エステルが増加することも報告されている(非特許文献２)。
【特許文献１】特開2002-253211号公報
【特許文献２】特開2002-191355号公報
【特許文献３】特開平06-062849号公報
【特許文献４】特開平06-253826号公報
【特許文献５】特開平09-234077号公報
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006
【非特許文献２】ASBC 2002 meeting Abstract P-6 、[online]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のとおり、製品中のエステル含量を増大させるために、変異株の取得が行なわれているが、その結果予期せぬ発酵遅延や、好ましくない香味成分の増加が認められる場合もあり、実用酵母とするには問題があった。このことから、発酵速度や製品の品質を損なうことなく、望みの量のエステルを生産できる酵母の育種方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が減少すること、また、得られた遺伝子の発現を抑制させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が増加、中鎖脂肪酸エステル生成量が減少することを確認して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のエステル生成量の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００７】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００８】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【０００９】
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８a）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（３）に記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【００１０】
（１０）上記（８）又は（９）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）上記（８）に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が低下した上記(１０)に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。（１３）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が低下した上記（１１）に記載の醸造用酵母。
【００１１】
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８)配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
（１８a）上記（１８）に記載の方法によって、エステル生成能が高い、あるいは低い酵母を選別する方法。
（１８b）上記（１８a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１２】
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
（２０）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２０ａ）被検酵母を培養して、エステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を測定し、目的とするエステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２３）上記（１０）〜（１３）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、エステル含量を制御することができるため、香味に優れた酒類を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を増大もしくは減少させることによって、エステルの量を制御することが可能であると考えた。本発明者らは、このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードするnonScEEB1遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１５】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えばSaerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。
【００１６】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１７】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００１８】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１９】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２０】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
【００２２】
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
【００２３】
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００２４】
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
【００２５】
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００２６】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２７】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２８】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２９】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）又は上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
【００３０】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３１】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中のアミノ酸や糖、高級アルコールやエステルなどの濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００３２】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつエステル含量が増加、あるいは減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でエステル含量を制御した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつエステル含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、エステル含量を増加させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のエステル生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価することもできる。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択することによって酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、エステル生成能の高いまたは低い、あるいはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。エステル生成能は、例えば、J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991やJ. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006に記載の方法によって測定することができる。アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えば、Saerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ（nonScEEB1）遺伝子のクローニング
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、nonScEEB1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScEEB1_for（配列番号：３）／nonScEEB1_rv（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScEEB1の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.4kb）を取得した。
【００４１】
上記のようにして得られたnonScEEB1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScEEB1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４２】
実施例２：ビール試醸中のnonScEEB1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScEEB1遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScEEB1遺伝子が発現していることを確認した。
【００４３】
実施例３：nonScEEB1遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法に従い、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScEEB1_delta_for（配列番号：５）、nonScEEB1_delta_rv（配列番号：６）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００４４】
実施例４：ビール試験醸造におけるエステル生成量の解析
親株（W34/70-2株）ならびに実施例５で得られるnonScEEB1破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 13％
麦汁容量 １L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 5g/L
【００４５】
発酵もろみを経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。発酵終了時における酢酸エステル濃度の定量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991）を用いて行う。発酵終了時における中鎖脂肪酸エステル濃度は、発酵もろみ上清20ｇに酢酸エチル６０ｇを加え激しく浸透して水層を除去し、200μlまで濃縮した後、ガスクロマトグラフィー（nipponn jozo kyouaishi, 90:919-22,1995）で定量する。
【００４６】
以上のようにして、本発明で開示されたビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼの発現量を制御された酵母を用いれば、発酵工程や発酵期間を変えることなく、エステルの生成量を制御することが可能となる。これによって香味に優れた酒類を製造することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の酒類製造法によれば、製品に華やかな香りを付与するエステル含量が増大するため、香味の優れた酒類を製造することが可能となる。また、過剰なエステルが好まれないビールなどの麦芽飲料においてはエステル量が減少し、より好ましい香味の酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScEEB1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
［配列番号：３］ プライマー
［配列番号：４］ プライマー
［配列番号：５］ プライマー
［配列番号：６］ プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼであるEeb1pをコードする遺伝子EEB1、特にビール酵母に特徴的なnon-ScEEB1遺伝子の発現量を制御することによって、製品の香味に寄与するエステルの生成能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類においてエステルは重要な重要な香り成分の１つである。清酒やワイン、ウイスキーなどではエステルの増加は酒に華やかな香りをもたらし、官能的に高い評価をもたらすことが知られている。一方ビールにおいてはエステルは重要な香気成分ではあるが、過剰なエステルはエステル臭として嫌われる。従って酒の種類によってエステル生成量を適度に制御することが重要である。
これまでに、酒のエステル含量を高める目的でエステル高生産酵母が育種されている。酵母に変異処理を施し、(または施さずに)エステル高生産酵母を効率よく分離するために，セルレニン等の脂肪酸合成酵素を阻害する薬剤含有培地で、カプロン酸を高生産する能力のある菌株を取得する方法、及び５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン等のロイシンアナログ含有培地で、イソアミルアルコール、酢酸イソアミルを高生産する菌株を取得する方法（特許文献１：特開2002-253211号公報）、３位が水酸化されたプレグナン骨格を有するステロイドを含有する培地で生育した菌株を取得する方法（特許文献２：特開2002-191355号公報）等がすでに報告されている。
【０００３】
一方、遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法ではSaccharomyces cerevisiaeのアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF１を醸造用酵母で高発現させた例（特許文献３：特開平06-062849号公報）や、ATF１の発現を抑制した例（特許文献４：特開平06-253826号公報）、醸造用酵母のエステラーゼ遺伝子EST2を破壊し、エステル量を増加させた例（特許文献５：特開平09-234077号公報）が報告されている。また、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子EEB1を破壊することにより、中鎖脂肪酸エステルが減少することが報告されている(非特許文献１)。一方でEEB1破壊により酢酸エステルが増加することも報告されている(非特許文献２)。
【特許文献１】特開2002-253211号公報
【特許文献２】特開2002-191355号公報
【特許文献３】特開平06-062849号公報
【特許文献４】特開平06-253826号公報
【特許文献５】特開平09-234077号公報
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006
【非特許文献２】ASBC 2002 meeting Abstract P-6 、[online]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のとおり、製品中のエステル含量を増大させるために、変異株の取得が行なわれているが、その結果予期せぬ発酵遅延や、好ましくない香味成分の増加が認められる場合もあり、実用酵母とするには問題があった。このことから、発酵速度や製品の品質を損なうことなく、望みの量のエステルを生産できる酵母の育種方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が減少すること、また、得られた遺伝子の発現を抑制させた形質転換酵母を作製し、酢酸エステル生成量が増加、中鎖脂肪酸エステル生成量が減少することを確認して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のエステル生成量の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００７】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００８】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【０００９】
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８a）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（３）に記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【００１０】
（１０）上記（８）又は（９）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）上記（８）に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が低下した上記(１０)に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。（１３）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が低下した上記（１１）に記載の醸造用酵母。
【００１１】
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８)配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
（１８a）上記（１８）に記載の方法によって、エステル生成能が高い、あるいは低い酵母を選別する方法。
（１８b）上記（１８a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１２】
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
（２０）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２０ａ）被検酵母を培養して、エステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を測定し、目的とするエステル生成能またはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２３）上記（１０）〜（１３）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、エステル含量を制御することができるため、香味に優れた酒類を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、酵母のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を増大もしくは減少させることによって、エステルの量を制御することが可能であると考えた。本発明者らは、このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼをコードするnonScEEB1遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１５】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えばSaerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。
【００１６】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１７】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００１８】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１９】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２０】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
【００２２】
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
【００２３】
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００２４】
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
【００２５】
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００２６】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２７】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２８】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２９】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）又は上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
【００３０】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３１】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中のアミノ酸や糖、高級アルコールやエステルなどの濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００３２】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつエステル含量が増加、あるいは減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でエステル含量を制御した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつエステル含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、エステル含量を増加させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のエステル生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価することもできる。なお、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択することによって酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、エステル生成能の高いまたは低い、あるいはアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。エステル生成能は、例えば、J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991やJ. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006に記載の方法によって測定することができる。アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性は、例えば、Saerensらの方法（J. Biol. Chem. 281:4446-4456, 2006）によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ（nonScEEB1）遺伝子のクローニング
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子、nonScEEB1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScEEB1_for（配列番号：３）／nonScEEB1_rv（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScEEB1の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.4kb）を取得した。
【００４１】
上記のようにして得られたnonScEEB1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScEEB1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４２】
実施例２：ビール試醸中のnonScEEB1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScEEB1遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScEEB1遺伝子が発現していることを確認した。
【００４３】
実施例３：nonScEEB1遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法に従い、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScEEB1_delta_for（配列番号：５）、nonScEEB1_delta_rv（配列番号：６）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００４４】
実施例４：ビール試験醸造におけるエステル生成量の解析
親株（W34/70-2株）ならびに実施例５で得られるnonScEEB1破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 13％
麦汁容量 １L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 5g/L
【００４５】
発酵もろみを経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。発酵終了時における酢酸エステル濃度の定量は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（J. Am. Soc. Brew. Chem.49:152-157,1991）を用いて行う。発酵終了時における中鎖脂肪酸エステル濃度は、発酵もろみ上清20ｇに酢酸エチル６０ｇを加え激しく浸透して水層を除去し、200μlまで濃縮した後、ガスクロマトグラフィー（nipponn jozo kyouaishi, 90:919-22,1995）で定量する。
【００４６】
以上のようにして、本発明で開示されたビール酵母特有のアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼの発現量を制御された酵母を用いれば、発酵工程や発酵期間を変えることなく、エステルの生成量を制御することが可能となる。これによって香味に優れた酒類を製造することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の酒類製造法によれば、製品に華やかな香りを付与するエステル含量が増大するため、香味の優れた酒類を製造することが可能となる。また、過剰なエステルが好まれないビールなどの麦芽飲料においてはエステル量が減少し、より好ましい香味の酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScEEB1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
［配列番号：３］ プライマー
［配列番号：４］ プライマー
［配列番号：５］ プライマー
［配列番号：６］ プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が低下した請求項１０に記載の醸造用酵母。
【請求項１２】
請求項９に記載のベクターを導入することによって、または、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【請求項１３】
請求項７に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が低下した請求項１１に記載の醸造用酵母。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１８】
配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養して、請求項７に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１３に記載の酵母および請求項２０〜２２に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が低下した請求項１０に記載の醸造用酵母。
【請求項１２】
請求項９に記載のベクターを導入することによって、または、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【請求項１３】
請求項７に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が低下した請求項１１に記載の醸造用酵母。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１８】
配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養して、請求項７に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１３に記載の酵母および請求項２０〜２２に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１６５３５２（Ｐ２００９−１６５３５２Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４９１２２（Ｐ２００６−４９１２２）
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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