イヌの胸腺間質リンホポエチンタンパク質およびその使用
【課題】アトピー性皮膚炎およびその関連の臨床症状を含む、イヌにおけるアトピー性障害に対する新規のより実用的な治療を提供する。
【解決手段】本発明は、イヌＴＳＬＰタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸を開示する。また、イヌＴＳＬＰタンパク質の特異的なエピトープを含むタンパク質のペプチド断片を開示する。イヌＴＳＬＰタンパク質および関連のペプチド断片は、免疫学的アッセイおよび抗ＴＳＬＰ抗体を誘発するワクチンに対する抗原として使用し得る。さらに、本発明は、イヌＴＳＬＰ遺伝子、イヌＴＳＬＰタンパク質および関連のペプチド断片を作製および使用する方法を開示する。
【解決手段】本発明は、イヌＴＳＬＰタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸を開示する。また、イヌＴＳＬＰタンパク質の特異的なエピトープを含むタンパク質のペプチド断片を開示する。イヌＴＳＬＰタンパク質および関連のペプチド断片は、免疫学的アッセイおよび抗ＴＳＬＰ抗体を誘発するワクチンに対する抗原として使用し得る。さらに、本発明は、イヌＴＳＬＰ遺伝子、イヌＴＳＬＰタンパク質および関連のペプチド断片を作製および使用する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年１２月１４日に出願された、米国仮出願第６０／８７５，１３５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する本出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、イヌの胸腺間質リンホポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）タンパク質（イヌ“ＴＳＬＰ”）、イヌＴＳＬＰをコードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞、ならびにイヌＴＳＬＰを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アトピー性疾患などのレアギン介在障害を患う動物（例えば、ヒト）は、ＩｇＥ抗体に関わる即時型アレルギー反応を発症する遺伝的傾向を有する。複数の遺伝因子が、そのような動物で見られる、結果として生じる表現型の発現に関与する。アトピー性疾患において観察される即時型過敏症は、チリダニ類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、花粉、カビおよび鱗屑などの特定のアレルゲンへの曝露から生じる。当然のことながら、アトピー性疾患を有する個体は、喘息、アトピー性皮膚炎、および内因性のＩｇＥ放出に関連した他の障害をより患う可能性がある。
【０００４】
アレルギー性皮膚炎、喘息などのアトピー性疾患は、飼いイヌなどのイヌ種にも発生する。そのようなイヌは、一般的に１〜３歳の間にアトピーの徴候を示し始める。本疾患の遺伝的性質により、ゴールデンレトリーバー、大部分のテリア、アイリッシュセッター、ラサアプソ、ダルメシアン、ブルドッグおよびオールドイングリッシュシープドッグなどのいくつかの品種が、よりアトピー性の傾向が大きい。しかし、雑種などの他のイヌ種も、この状態を患うことが知られている。少なくとも１つの特定のタイプのアトピー（アトピー性皮膚炎）の発生率は、ヒトおよびイヌで同様に著しく増加している。
【０００５】
通常、アトピーのイヌは、足、鼻口部、耳、腋窩または鼠径部をこすり、なめ、噛み、噛みつきまたはひっかくため、脱毛、皮膚の赤色化および肥厚が生じる。一部の症例では、いくつかの皮膚の状態が組み合わさり、単一のアレルギーだけでは、そのようなかゆみが生じないと思われるかゆみを動物に引き起こしている。更に悪化させる、これらの問題は、空中に浮遊するアレルゲン（花粉など）、食物中のアレルゲン、寄生虫（ノミなど）由来のアレルゲンによる可能性がある。また、皮膚の細菌および／または酵母感染症も、掻痒感を増大し得る。
【０００６】
アトピーの不快な症状を軽減する１つの簡単な方法は、刺激するアレルゲンを避けることである。残念なことに、一般的に、そのような回避は実際的でない。これまで、開業獣医師は、経口抗ヒスタミン剤、経口または局所コルチコステロイド抗炎症剤、他の免疫系抑制剤（例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス）、脂肪酸補助剤を投与、およびアレルゲン特異的免疫療法（同定された抗原の注射を必要とする）を実施することによってイヌのアトピー性皮膚炎を治療してきた。しかし、すべての場合で、このような治療は効果がない。さらに、そのような治療は、コストがかかり、および／または重大な副作用を生じる。したがって、より安全、より有効かつより経済的な、イヌのアトピー性皮膚炎の症状を治療または抑制するためのアプローチが以前から必要とされている。
【０００７】
哺乳動物の免疫応答は、“免疫ネットワーク”と呼ばれる一連の複雑な細胞間相互作用に基づいている。多くの免疫反応は、サイトカインと呼ばれる可溶性タンパク質とリンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞とのネットワーク様の相互作用を中心に展開され、ここで、サイトカインはこれらの細胞間相互作用を仲介／制御／調節する際に重要な役割を果たす。したがって、サイトカインおよび免疫細胞は、様々な炎症性障害につながる特定の生理的機構または経路を仲介する役割を果たす。
【０００８】
アレルギー性炎症は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などの無調節なＴＨ２誘導サイトカインを、Ｔ細胞に産生させるように導く複雑な免疫カスケードの結果である。次に、これらのサイトカインは、気管支過敏性、ＩｇＥ産生、好酸球増加および粘液産生を誘発する（例えば、非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３を参照）。
【０００９】
胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）は、最初はマウスで、（ｉ）表面ＩｇＭ＋Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ならびに（ｉｉ）ＢおよびＴ細胞増殖を補助する因子として同定されたＩＬ−７様サイトカインである（非特許文献４、また非特許文献５を参照）。現在、ＴＳＬＰは、ＩＬ−７ＲαサブユニットおよびＴＳＬＰ−Ｒと呼ばれる固有の受容体サブユニットを含む細胞受容体を結合することが知られている。この相互作用は、骨髄系細胞（例えば、単球）などの造血細胞または樹状細胞における、ＳＴＡＴ活性化または胸腺と活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）の発現を通したシグナル伝達を誘発する（例えば、参考として本明細書で援用される、共同所有される特許文献１を参照）。
【００１０】
またＴＳＬＰは、マウスで、アトピー性皮膚炎および喘息などのアレルギー疾患の病因において重要な役割を果たす場合がある。例えば、ＴＳＬＰ遺伝子の発現が特に皮膚において誘発されたトランスジェニックマウスは、炎症性の真皮細胞浸潤を含有する湿疹性病変、皮膚ホーミング受容体を発現するＴｈ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞の劇的な増加およびＩｇＥの血漿濃度の上昇などのアトピー性皮膚炎の免疫学的および臨床的特徴を示す。さらに、肺特異的ＴＳＬＰ導入遺伝子を発現するマウスの肺は、白血球の広範囲に及ぶ浸潤、杯細胞過形成、上皮下線維症、Ｔヘルパー２型サイトカインの増加、ＩｇＥ濃度の増加などの喘息の免疫学的および臨床的特徴を示す。
【００１１】
Ｓｉｍｓら、は、発現クローニングを使用してネズミＴＳＬＰのｃＤＮＡ配列を得たが、ネズミＴＳＬＰに基づいたハイブリダイゼーションプローブでヒト相同体のクローンをつくることができなかった（非特許文献６）。その後、ヒト相同体を、詳細なＥＳＴ分析によって同定した。ヒトＴＳＬＰヌクレオチド配列は、対応するマウス配列とわずか４３％の相同性しか持たないことが発見された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，８９０，７３４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ＢｕｓｓｅおよびＬｅｍａｎｓｋｅ，Ｊｒ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００１）３４４：３５０−６２
【非特許文献２】Ｈｏｌｇａｔｅ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．（２０００）３２０：２３１−２３４
【非特許文献３】Ｒｅｎａｕｌｄ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）５４：５７７−５８９
【非特許文献４】Ｆｒｉｅｎｄら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９４）２２：３２１−３２８
【非特許文献５】Ｌｅｖｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）１６２：６７７−６８３
【非特許文献６】Ｓｉｍｓら、Ｊ ｅｘｐ Ｍｅｄ，（２０００）１９２：６７１−６８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アトピー性皮膚炎およびその関連の臨床症状を含む、イヌにおけるアトピー性障害に対する新規のより実用的な治療を提供する必要性が残る。さらに、そのような治療の開発につながる可能性のあるイヌにおけるアトピー性障害に導く免疫カスケードに関係する因子を単離する必要がある。
【００１５】
本明細書の任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が例示出願に対する“先行技術”として使用できることの承認と解釈すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、アトピー性皮膚炎およびその関連の臨床症状を含む、イヌにおけるアトピー性障害に対する新規のより実用的な治療を提供する。したがって、本発明は、アトピー性障害に導く免疫カスケードに関わる新規な単離および／または組換え胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）タンパク質を提供する。さらに本発明は、そのようなＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片を提供する。本発明の特定の態様において、ＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００１７】
したがって、本発明は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質であって、このタンパク質をワクチンとしてイヌの対象に投与すると、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質を結合する抗体が、ワクチン接種したイヌの対象から得られた、結果として生じたイヌの血清で検出できる、ＴＳＬＰタンパク質を提供する。関連の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸を含むイヌＴＳＬＰに対して惹起された抗体と交差反応性である。
【００１８】
さらに本発明は、エピトープ特異的イヌＴＳＬＰモノクローナル抗体に結合する、配列番号２のアミノ酸配列（２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く）に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質を提供する。
【００１９】
より特定の実施形態において、そのＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、そのＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質である。別の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基２９〜１５５を含む成熟イヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００２１】
また、本発明のＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片を提供する。そのような抗原性断片は、配列番号８〜１０１のアミノ酸配列によって個々に定められた１つ以上のエピトープを含む抗原性断片を含む。特定の実施形態において、本発明の抗原性断片は、配列番号３０、３１、３２および／または３４のアミノ酸配列を含む１つ以上のエピトープを含む。別の実施形態において、抗原性断片は、配列番号３０、３１、３２および／または３４のアミノ酸配列の重複部分内に含有されるアミノ酸配列を有し得る（すなわち、
【００２２】
【化１】
（配列番号：１１８））。特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片は、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を結合することができる。
【００２３】
【化２】
のアミノ酸配列（配列番号１１８）の抗原性断片は、大きさにおいて、約５〜約２１のアミノ酸残基の範囲に及ぶ可能性がある。
【００２４】
また、本発明の任意のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、またはそのような１つ以上の完全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せの有効量を含み得るワクチンが提供される。一実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質である。特定の実施形態において、ワクチンは、配列番号２のアミノ酸残基７１〜９２の５〜２２の連続するアミノ酸を含む、イヌＴＳＬＰタンパク質の１つ以上の抗原性断片を含有する（本明細書では配列番号１１８と定義）。そのような抗原性断片の例は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を含む本明細書で開示されるエピトープを含む。本発明のすべてのワクチンは、薬学的の許容されるアジュバントを更に含み得る。
【００２５】
本発明のワクチンは、抗イヌＴＳＬＰ抗体を誘発する方法において使用することができる。そのような方法の１つは、有効量のワクチンで哺乳動物を免疫化することを含む。この方法は、場合によって、イヌにおいてＴＳＬＰの活性を下方制御する方法および／または有効量のワクチンでイヌを免疫化することを含む、アトピーのイヌのアレルギー症状を治療もしくは防止する方法を含む。改善されるアレルギー症状は、アレルギー性皮膚炎、喘息などを含み得る。
【００２６】
本発明のワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与、乱切法およびその組合せなどの経路によって投与することができる。
【００２７】
さらに、本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸分子を提供する。そのような一実施形態において、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。このタイプの特定の実施形態において、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。約１８の連続するヌクレオチド、約２４の連続するヌクレオチド、約３６の連続するヌクレオチド、約４５の連続するヌクレオチド、約６６以上の連続するヌクレオチドの配列番号１のヌクレオチド配列の断片も、本発明の一部である。厳格なハイブリッド形成条件で配列番号１とハイブリッド形成する完全長ＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸を含む、約１８のヌクレオチド、約２４のヌクレオチド、約３６のヌクレオチド、約４５のヌクレオチド、約６６以上のヌクレオチドも本発明によって提供される。さらに、本発明のすべての核酸分子およびその断片は、異種のヌクレオチド配列を含み得る。
【００２８】
また本発明は、前述の核酸分子および／またはその断片を含む発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、そのような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、場合によって原核または真核宿主細胞である。一実施形態において、原核宿主細胞は、大腸菌である。このタイプの特定の実施形態において、宿主細胞は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳである。
【００２９】
さらに本発明は、イヌＴＳＬＰをコードする上記の核酸分子（例えば、配列番号１）の１つおよび／またはその断片を含む、組換えウイルスベクターおよび／または裸のＤＮＡベクターを提供する。そのようなベクターを、例えば、アトピー性皮膚炎を有するイヌへの投与に適したワクチンに使用することができる。
【００３０】
また本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質を生成する方法を提供する。そのような方法の１つは、本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することを含む。さらに、この方法は、培養した宿主細胞または培地からＴＳＬＰタンパク質を単離および／または精製するステップを含む。また、得られた単離および／または精製ＴＳＬＰタンパク質は、本発明の一部である。
【００３１】
また、本発明のワクチンによってハイブリドーマ系において誘発された抗ＴＳＬＰ抗体は、本発明の一部である。このタイプの一実施形態において、哺乳動物のハイブリドーマ系を使用する。特定の実施形態において、抗体を、単離および／または精製する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得る。本発明によれば、非イヌ種において誘発されたモノクローナル抗体を、場合によって、イヌの対象に注射すると、最小限に抗原性であるように、イヌ化するように操作することができる。ある好ましい実施形態において、本発明による任意の抗体の結合ドメインは、場合によって、例えば、開裂によっておよび／または組換えＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２結合タンパク質として、元の抗体より小さい結合断片に変換される。また、自然発生の重鎖抗体（例えば、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（登録商標））の固有な構造的および機能的特性を含有する抗体誘導性治療用タンパク質も本発明に含まれる。さらに、ＴＳＬＰに対する高親和性および低免疫原性を有する抗体代用物（例えば、ＴＳＬＰ受容体の結合部から調製されたアビマー）も、本発明に含まれる。本発明の抗イヌＴＳＬＰ抗体／アビマーを、有効量の抗イヌＴＳＬＰ抗体を投与することにより、アトピーのイヌのアレルギー症状を治療する方法において容易に使用することができる。
【００３２】
また本発明は、本発明の有効量のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、または完全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せと組合せて有効量の非ＴＳＬＰ免疫原を含むワクチンを提供する。このタイプの特定の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質である。より特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
さらに本発明は、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質、その断片ならびに／またはイヌＴＳＬＰおよびその断片により誘発された抗体を使用する診断法を提供する。一実施形態において、本発明は、イヌから表皮試料を得ることと、この表皮試料におけるイヌＴＳＬＰタンパク質の存在を判定することとを含む、イヌのアトピー性皮膚炎を診断する方法を提供する。
【００３４】
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）またはその抗原性断片であって、該ＴＳＬＰタンパク質が２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＴＳＬＰタンパク質が配列番号２のアミノ酸を含むイヌＴＳＬＰに対して惹起された抗体と交差反応性である、胸腺間質リンホポエチンタンパク質またはその抗原性断片。
（項目２）
前記ＴＳＬＰがエピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体と結合する、項目１に記載のＴＳＬＰ。
（項目３）
イヌＴＳＬＰである、項目１に記載のＴＳＬＰ。
（項目４）
配列番号２のアミノ酸残基２９〜１５５を含む、項目３に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質。
（項目５）
前記断片が配列番号８〜１０１またはその２つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片。
（項目６）
配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４またはその２つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の抗原性断片。
（項目７）
前記抗原性断片が
【化９】
（配列番号１１８）の５〜２２の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含み、該抗原性断片がエピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体に結合する、項目４に記載のＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片。
（項目８）
薬学的に許容されるアジュバント、ならびに有効量の、項目１に記載のＴＳＬＰタンパク質、該ＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片およびその組合せから成る群から選択される免疫原を含むワクチン。
（項目９）
前記ＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片が配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４またはその組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載のワクチン。
（項目１０）
項目１に記載のＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸分子。
（項目１１）
項目４に記載のＴＳＬＰタンパク質をコードする、またはその抗原性断片をコードする核酸分子。
（項目１２）
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
項目１１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載の発現ベクターを含むワクチン。
（項目１５）
適切な培地で宿主細胞を培養することを含む、ＴＳＬＰタンパク質を生成する方法であって、該宿主細胞が項目１３に記載の発現ベクターを含み、該ＴＳＬＰタンパク質が発現される、方法。
（項目１６）
培養した前記宿主細胞または前記培地から前記ＴＳＬＰタンパク質を単離することを更に含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目８に記載のワクチンの有効量で哺乳動物を免疫化することを含む、該哺乳動物において抗ＴＳＬＰ抗体を誘発する方法。
（項目１８）
項目８に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、該イヌにおけるＴＳＬＰ活性を下方制御する方法。
（項目１９）
項目８に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療または予防する方法。
（項目２０）
前記アレルギー症状がアレルギー性皮膚炎または喘息を含む、項目１９に記載の方法。（項目２１）
項目８に記載のワクチンによって哺乳動物において、または哺乳動物のハイブリドーマ系において誘発される抗イヌＴＳＬＰ抗体。
（項目２２）
項目２１に記載の抗イヌＴＳＬＰ抗体の有効量を投与することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療する方法。
（項目２３）
非ＴＳＬＰ免疫原の有効量を更に含む、項目８に記載のワクチン。
（項目２４）
非ＴＳＬＰ免疫原の有効量を更に含む、項目９に記載のワクチン。
（項目２５）
イヌから表皮試料を得ることと、該表皮試料において項目４に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質の存在を測定することとを含む、該イヌにおけるアトピー性皮膚炎を診断する方法。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図および詳細な説明を参考とすることによって、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示する。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。ＴＳＬＰタンパク質バンドを矢印によって示す。
【図２】図２Ａは、イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の抗Ｈｉｓ（Ｃ Ｔｅｒｍ）／ＡＰ Ａｂと反応させた。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。イヌＴＳＬＰタンパク質は、（矢印によって示されるように）総タンパク質および不溶性タンパク質において検出された。図２Ｂは、イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。タンパク質を、ヒトＴＳＬＰに特異的なラットモノクローナル抗体で反応させた。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。イヌＴＳＬＰタンパク質は、（矢印によって示されるように）総タンパク質および不溶性タンパク質において検出された。
【図３】図３Ａは、大腸菌宿主細胞由来のＴＳＬＰの発現および精製を図示する。また、イヌＴＳＬＰと融合パートナーのＧＳＴタンパク質および６つのヒスチジン残基タグとの融合を表す、可溶性大腸菌画分に存在する＠６１ｋｄのバンドを示す。“Ｍ”は、タンパク質標準を示す（図３Ａ〜３Ｄすべてで同じ）。レーン１およびレーン２は、それぞれＩＰＴＧ誘導のない場合およびＩＰＴＧ誘導のある場合のプラスミド１２６５−９３Ｂを含有する大腸菌Ｂ１２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの可溶性画分である。矢印は、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質バンドを示す（図３Ａ〜３Ｄすべてで同じ）。図３Ｂは、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂によって精製される可能性のあることを示す。レーン１〜３は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂の異なる溶出画分を表す。図３Ｃは、レーンＢの融合タンパクがさらにＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製される可能性のあることを示す。本図は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂によるＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの精製後のＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質の再精製を図示する。レーン１は、フロースルーであり、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂の溶出（ｅｌｅｃｕｔｉｏｎ）である。図３Ｄは、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質のウエスタンブロットを図示し、融合タンパク質が抗ＧＳＴ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｃａｔ Ｎｏ．２７４５７７０１）によって認識されることが認められる。
【図４】アトピー性皮膚炎と診断されたイヌ＃１０１９７から得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックからの切片のＦＩＴＣ染色を図示する。切片を、ウサギ抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体で反応させ、反応をストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で可視化した。蛍光強度（明るい領域）は、組織内に存在するＴＳＬＰへのウサギ抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体の結合を示す。
【図５】図５Ａは、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌから得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックからの切片の免疫ペルオキシダーゼ染色を図示する。この切片において、ラット抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体による皮膚試料の表皮領域の拡散した染色が認められる［暗い領域］。図５Ｂは、対照の切片を図示する。切片は、対照のリン酸緩衝液のみで処理した、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌから得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックに由来した。
【図６】ラット抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体によるイヌＴＳＬＰタンパク質のエピトープマッピングを図示する。特に興味があるピークは、エピトープ番号２２〜２６（配列番号２９〜３３）のものである。またエピトープ２２〜２６では、Ｎ末端の誘導体化により調査し（５５以上のピーク）、結合エピトープがＮ末端残基を必要としないことを確認した。
【図７】イヌ（配列番号３２）とエピトープ２５のヒトアナログ（配列番号３）のＴＳＬＰペプチド配列の比較を図示する。
【図８】図８Ａは、イヌＴＳＬＰ遺伝子のＤＮＡ配列を図示する（配列番号１）。図８Ｂは、図８Ａによって図示したＤＮＡ配列によって発現される、予測のＴＳＬＰポリペプチドを図示する（配列番号２）。星印は、最初のシグナル配列（残基１〜２８）のＮ末端を示し、下線を引いた残基７１〜９２（配列番号１１８）は、表２の重複するエピトープ２２〜２６が測定されたドメインを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
アトピー性皮膚炎（“ＡＤ”）は、Ｔｈ２介在アレルギー性炎症性疾患である。本疾患は、それ自体、ヒトおよびイヌの患者で多くの同様な臨床徴候を呈する。イヌにおけるＡＤの免疫病因は、皮膚病変に関わる細胞型およびサイトカインに関してヒトのＡＤと類似していると考えられる。
【００３７】
Ｔｈ２リンパ球上に選択的に発現するＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）へのＴＡＲＣリガンド（ＣＣＬ２２）の結合は、アレルギー性病変へのこれらの細胞の選択的移動を誘発する。ＴＡＲＣおよびその受容体ＣＣＲ４がイヌのＡＤ皮膚の病変において上方制御されることが報告されている。ＴＳＬＰは、ヒトのＴＡＲＣの強力な誘導物質であるので、ＴＳＬＰがイヌのＡＤの病変に存在する可能性があると仮定された。したがって、ヒトＴＳＬＰに対して惹起された抗体を、ＡＤイヌ患畜の病変皮膚に対して試験した。これらの皮膚試料の免疫組織化学検査により、図４で示すように、病変の抗ヒトＴＳＬＰ抗体と反応性である抗原の存在を確認した。しかし、本明細書に開示されるような哺乳動物種ではＴＳＬＰの核酸およびアミノ酸配列の相違が大きいため、ネズミおよびヒトＴＳＬＰをコードする遺伝子に対するイヌの相同分子種を同定する作業は、特に困難であると判明した。
【００３８】
本発明のＴＳＬＰおよび／またはその１つ以上の抗原性断片で飼いイヌを免疫化することは、免疫化されたイヌにおいて、内因性ＴＳＬＰの活性レベルを減少させ、したがって、１つ以上のアトピー性症状（例えば、喘息および／またはアトピー性皮膚炎において生じる症状）を緩和、排除および／または予防するはずである。さらに、イヌＴＳＬＰタンパク質を、飼いイヌまたは他の哺乳動物種の研究および／または診断試薬として用いるための抗イヌＴＳＬＰ抗体を誘発するための免疫原として使用することができる。あるいは、特別の場合において、イヌＴＳＬＰタンパク質および／またはイヌＴＳＬＰをコードする核酸は、免疫障害のあるイヌの免疫系の構成要素を、例えば、ＳＴＡＴ活性化またはＴＡＲＣ発現（例えば、造血細胞における）を通して、上方制御するために役立つ可能性がある。
【００３９】
本発明を完全に理解するために、以下の定義を提供する。
【００４０】
記述における便宜上の単数形用語の使用は、決してそのような制限を付けることを意図するものではない。したがって、例えば“ポリペプチド”を含む組成物への参照は、１つ以上のそのようなポリペプチドへの参照を含む。本明細書で使用する“約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）”という用語は、“約（ａｂｏｕｔ）”という用語と交換可能に使用され、値が、示された値の２０パーセント以内であることを示す（すなわち、“約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）”５０のアミノ酸残基を含有するペプチドは、４０〜６０の間のアミノ酸残基を含有し得る）。
【００４１】
“結合組成物”という用語は、例えば、抗体−抗原相互作用において、特異的にイヌＴＳＬＰに結合する分子を意味する。この特異性は、例えば、特定の実施形態または関連の実施形態の群（例えば、イヌＴＳＬＰおよび／またはイヌの抗体）に特異的など、多少、包括的である。
【００４２】
本明細書で使用する“イヌ”という用語は、特に明記しない限り、すべての飼いイヌ、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓまたはＣａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓを含む。
【００４３】
本明細書で使用する“ポリペプチド”という用語は、“タンパク質”および“ペプチド”という用語と交換可能に用いられ、ペプチド結合によって接続される１つ以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。本明細書で使用する“ポリペプチド”という用語は、重要な断片またはセグメントを含み、少なくとも約８つのアミノ酸、一般的に少なくとも１２のアミノ酸、典型的に少なくとも約１６のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸、および特に好ましい実施形態において、少なくとも約３０以上のアミノ酸（例えば、３５、４０、４５、５０など）のアミノ酸残基のストレッチを包含する。そのような断片は、例えば、すべての実際的な組合せで、残基１、２、３などで始まり、例えば１５５、１５４、１５３などで終わる、実質的にすべての位置で始まり、および／または終わる末端を有することができる。
【００４４】
場合によって、ポリペプチドは、遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされるあるアミノ酸残基を欠いている場合がある。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、切断されるポリペプチドのＮ末端上にアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードする可能性があり、したがって、最終的なタンパク質の一部でない可能性がある。
【００４５】
本明細書で使用するアミノ酸配列は、２つのアミノ酸配列が同一および／または以下の定義のように中性置換（ｎｅｕｔｒａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）もしくは保存的置換だけによって異なる場合、２番目のアミノ酸配列に１００％“相同”である。したがって、２つのアミノ酸配列の約８０％が同一および／または中性もしくは保存的置換のみによって異なる場合、アミノ酸配列は２番目のアミノ酸配列と約８０％“相同”である。
【００４６】
機能的に同等のアミノ酸残基を、しばしば、保存的アミノ酸置換において生じる配列内の残基と置換させることができる。そのような変更は、本明細書で使用する“保存的置換”という用語を定義する。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する同様の極性の別のアミノ酸によって置換することができ、結果としてサイレントな変更をもたらす。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。そのような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した見かけの分子量、または等電点に影響しないであろう。
【００４７】
特に好ましい保存的置換は、陽電荷を維持することができるようにＡｒｇに対するＬｙｓおよびその逆、陰電荷を維持することができるようにＡｓｐに対するＧｌｕおよびその逆、遊離−−ＯＨを維持することができるようにＴｈｒに対するＳｅｒ、ならびに遊離ＮＨ２を維持することができるようにＡｓｎに対するＧｌｎの置換である。またアミノ酸を、以下の類似の群（１）プロリン、アラニン、グリシン、セリンおよびスレオニン、（２）グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、（３）ヒスチジン、リジンおよびアルギニン、（４）システイン、（５）バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ならびに（６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンに配置することができる。
【００４８】
関連の実施形態において、２つの相同性の高いＤＮＡ配列を、それら自身の相同性またはそれらがコードするアミノ酸の相同性によって同定することができる。そのような配列の比較は、配列のデータバンクで入手可能な標準のソフトウェアを使用して実施することができる。特定の実施形態において、２つの相同性の高いＤＮＡ配列は、約８０％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、さらにより好ましくは約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。より具体的には、２つの相同性の高いアミノ酸配列は、約８０％の同一性、さらにより好ましくは約９０％の同一性、さらにより好ましくは約９５％の同一性を有する。
【００４９】
本明細書で使用するタンパク質およびＤＮＡ配列の同一性率（パーセント）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（米国マサチューセッツ州バーリントン）より市販されているＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖ９、ならびに配置デフォルトパラメータおよび同一性に対するデフォルトパラメータを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して測定することができる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０を参照。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、Ｄｏｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘ（登録商標）プラットフォームのために、例えば、ＥＭＢＬＩ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから無料でダウンロードできる。さしあたりのダウンロードリンクは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／．で見つけられる。これらおよび他の入手可能なプログラムも、同一または類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を測定するために使用することができる。
【００５０】
“ポリヌクレオチド”または“核酸分子”は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列さえ含むが、これに限定されるものでない、ヌクレオチドを含む分子である。また、本用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知技術の任意の塩基アナログを含む核酸分子を包含することも企図される。
【００５１】
本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する核酸を提供する。核酸分子の一本鎖形態を、適切な温度および溶液のイオン強度条件下で、他の核酸分子にアニールできる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と“ハイブリッド形成可能”である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ．Ｉ．（２０００）を参照）。
【００５２】
高いストリンジェンシーのハイブリッド形成条件は、最も高いＴｍ（例えば、５０％のホルムアミド、５×または６× ＳＳＣ）に対応する。ハイブリッド形成は、２つの核酸が相補配列を含有することが必要である。しかし、ハイブリッド形成のストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチも可能である。核酸をハイブリッド形成するための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補の程度に基づく。２つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍ値は大きい。核酸ハイブリッド形成の相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを算出するための式は、導き出された強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ．Ｉ．（２０００）を参照）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）でのハイブリッド形成については、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する。
【００５３】
好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１２ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、長さは少なくとも約２４ヌクレオチドであり、最も好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチドである。特定の実施態様において、“標準的なハイブリッド形成条件”という用語は、５５℃のＴｍを意味し、前述のような条件を利用する。別の特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、それぞれ、ハイブリッド形成および洗浄条件に対してＴｍが６５℃であることを意味する。
【００５４】
ＤＮＡ“コード配列”または特定のタンパク質またはペプチドを“コードする配列”は、適切な調節エレメントの制御下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。
【００５５】
コード配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得るが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’方向に位置する。
【００５６】
“作動可能に結合した”は、そのように記述されるコンポーネントがこれらの通常の機能を実行するように配列されるエレメントの配置を意味する。したがって、コード配列に作動可能に結合した調節エレメントは、コード配列の発現を生じさせることができる。調節エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、介入するまだ翻訳されていない転写配列は、プロモーターとコード配列の間に存在する可能性があり、プロモーターは依然としてコード配列に“作動可能に結合した”と考えることができる。
【００５７】
本明細書で使用する“異種のヌクレオチド配列”は、自然において自然に形成しない核酸を形成させるために、組換え法によって本発明のヌクレオチド配列に加えられるヌクレオチド配列である。そのような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードすることができる。したがって、異種のヌクレオチド配列は、調節的および／または構造的特性を含有するペプチドおよび／またはタンパク質をコードすることができる。別のそのような実施形態において、異種のヌクレオチド配列は、組換え核酸が発現されたあと、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードすることができる。さらに別の実施形態において、異種のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能することができる。異種のヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含むことができる。
【００５８】
本明細書で使用する“融合タンパク質”および“融合ペプチド”という用語は、交換可能に使用され、“キメラタンパク質および／またはキメラペプチド”および融合“インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）タンパク質／ペプチド”を包含する。融合タンパクは、ペプチド結合によって少なくとも一部の別のタンパク質（例えば、非イヌＴＳＬＰタンパク質）に結合した本発明の少なくとも一部のイヌＴＳＬＰタンパク質を含み、および／またはイヌＴＳＬＰポリペプチド（例えば、ペプチド結合で結合された配列番号２のアミノ酸残基７１〜７５および１０１〜１０５から成る１０アミノ酸残基の融合ペプチド）において隣接／連続した順番で天然に存在しないイヌＴＳＬＰタンパク質（例えば、エピトープ）の２つ以上の非連続部分の組合せを含む。好ましい実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質の部分は、作動可能である（例えば、その抗原性を保持する）。融合タンパクは、マーカータンパク質、または本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質の単離および／もしくは精製（例えば、ＦＬＡＧタグ、下記の実施例を参照）および／もしくは抗原性を助けるタンパク質を含むことができる。非イヌＴＳＬＰ配列は、イヌＴＳＬＰ配列に対してアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００５９】
本発明の融合タンパクをコードする組換えＤＮＡ分子は、例えば、イヌのＴＳＬＰコード配列にインフレームで結合した少なくとも非イヌＴＳＬＰタンパク質の一部をコードする配列を含むことができ、さらにイヌＴＳＬＰ配列と非イヌＴＳＬＰ配列との好ましくは接合部および接合部近くの特定のプロテアーゼ（例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子）に対する切断部位をコードすることができる。特定の実施態様において、融合タンパクは、原核細胞内で発現される。そのような融合タンパクは、本タンパク質に特異的なアフィニティーカラムおよび／またはイヌＴＳＬＰに融合したタグの使用を通して、本発明のイヌＴＳＬＰを単離するために使用することができる（下記の実施例を参照）。例えば、精製されたイヌＴＳＬＰを、次にタンパク質分解酵素および前述したような切断部位を使用することによって融合タンパク質から放すことができる。
【００６０】
“ベクター”または“複製ベクター”は、別のＤＮＡセグメントが付着したセグメントの複製を生じさせるように付着または取り込ませることが可能なレプリコン（例えばプラスミド、ウイルス、ファージまたはコスミド）である。また本用語は、当該の取り込ませたまたは付着させたＤＮＡセグメントを含むレプリコンを含む。
【００６１】
本発明で使用できるベクターは、微生物プラスミド、ウイルス、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片および宿主のゲノムへの核酸の組込みを促進することができる他の媒体を含む。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターであるが、同等の機能を果たし、当該技術分野で公知であるか、公知になる他のすべてのベクターは、本明細書の使用に適している。（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、 （ｅｄｓ．），Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．を参照）。
【００６２】
本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質をコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が互換性を有する制限部位を含む際容易に達成される。これができない場合は、ＤＮＡおよび／もしくはベクターの末端を、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成された一本鎖ＤＮＡ突出部を消化して平滑末端に戻すことによって改変するか、または適切なＤＮＡポリメラーゼで一本鎖の末端を充填することによって、同じ結果を達成する必要があり得る。あるいは、所望の部位を、例えば、末端上へヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることによって作製することができる。そのようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特異的なオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位も、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより生成することができる。例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）を参照。また、切断されたベクターおよびＤＮＡ断片を、必要に応じて、ホモポリマー末端化により改変し得る。
【００６３】
本発明で使用される組換え発現ベクターは、典型的に、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質および／またはその抗原性断片をコードする核酸を含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、通常、互換性を有する宿主細胞における核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子調節エレメントに作動可能に連結される。遺伝子調節エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含むことができ、典型的に、転写プロモーター、転写の開始を制御する選択的オペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含む。また、発現ベクターは、宿主細胞から独立してベクターの複製を可能にする複製開始点を含み得る。
【００６４】
本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸の発現を、原核細胞または真核細胞のいずれかにおける従来法によって実施することができる。
【００６５】
“宿主細胞”は、外因性の核酸分子を一過性または恒久的に含有するか、または包含および発現することができる細胞である。細胞は、そのような外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されると、外因性ＤＮＡによって“形質転換される”。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮＡに組み込まれても（共有結合によって）、組み込まれなくても良い。原核生物および酵母において、例えば、外来性ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）に保持され得る。真核細胞に関して、安定して形質転換される細胞は、外来性ＤＮＡが染色体に組み込まれ、染色体複製を通して娘細胞により遺伝される細胞である。この安定性は、外来性ＤＮＡを含有する娘細胞集団から成る細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によって示される。
【００６６】
原核生物は、グラム陰性および陽性菌（例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の両方を含む。真核生物は、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞およびトリ）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類および齧歯類）の両方の動物細胞由来の確立された組織培養細胞系を含む。
【００６７】
原核宿主ベクター系は、多くの異なる種に対する多種多様なベクターを含む。ＤＮＡ増幅のためのベクターは、ｐＢＲ３２２もしくは多くのその誘導体、またはｐＥＴ４２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む。
【００６８】
典型的に使用される原核発現調節配列は、プロモーターを含んで使用され、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７））、例えば、ｐＵＣ−シリーズ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０））、例えば、（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）、ラムダＰＬプロモーター系（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８（１９８１））、ラムダ−ｐＰもしくはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）、アラビノース誘導プロモーター（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
２９２：１２８（１９８３））、Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）、またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）などのハイブリッドプロモーターから誘導されたプロモーターを含む。また、そのような調節配列を含有する数多くの他の発現ベクターは、当該技術分野で公知であり、市販されている。（また、Ｂｒｏｓｉｕｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”，ｉｎ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６．を参照）。
【００６９】
また、他の原核生物において使用できる大腸菌のために適切なベクターと遺伝的に同等なベクターも、本発明のＴＳＬＰタンパク質を発現させるために使用することができる。
【００７０】
酵母は、高等な真核組織培養細胞と同様に、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質、ならびに／または抗イヌＴＳＬＰ抗体および／もしくはそれらの抗体の断片の組換え体の生産のための宿主として企図される。任意の高等な真核組織培養細胞系（昆虫バキュロウイルス発現系を含む）が使用できるが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換または形質移入および増殖は慣用手法となっている。有用な細胞株の例は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ラット胎仔腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株（例えば、ＳＦ９）、トリ細胞株（例えば、ＤＦ−１１）、Ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞系およびサル（ＣＯＳ）細胞株を含む。
【００７１】
このような細胞株のための発現ベクターは、通常、例えば、複製開始点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含有する。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスなどの供給源から誘導されたプロモーターを有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表例は、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６（１９８５））、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７））、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、およびその誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）を含む。
【００７２】
一旦発現されると、本発明のイヌＴＳＬＰは、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当該技術分野の標準的方法に従って精製することができる（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− −Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照）。医薬用途には、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。精製は、部分的であっても、所望される均質性までであってもよい。イヌＴＳＬＰが治療的に使用される場合、本タンパク質は、実質的にエンドトキシンを含んではならない。結合抗−ＴＳＬＰ抗体カラム、または結合ＴＳＬＰ−受容体カラム上の発現したＴＳＬＰの選択的精製は、高度に精製されたイヌＴＳＬＰタンパク質を得るための利用可能な方法である。
【００７３】
精製の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、核酸は、沈殿、クロマトグラフィー、超遠心分離法および他の手段によって精製することができる。タンパク質およびポリペプチドは、ペプチドと同様に、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出ならびに向流分配を含むが、これに限定されるものではない様々な方法により精製することができる。いくつかの目的のために、ポリヒスチジン配列または抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）およびＧＳＴ）などがあるが、これらに限定されるものでない精製を促進する更なる配列タグをタンパク質が含有する、組換え系でポリペプチドを生成することが好ましい。次に、ポリペプチドは、宿主細胞の粗溶菌液から、適切な固相マトリックスのクロマトグラフィーによって精製することができる。あるいは、ポリペプチドに対して惹起された抗体またはその結合断片を、精製試薬として使用することができる。
【００７４】
溶媒および電解液は、生物活性の保存に使用されるタイプの中で、通常、生物学的に互換性を有する緩衝液であり、通常、生理的水性溶媒に近い。通常、溶媒は、中性のｐＨを有し、典型的に、約５〜１０の間であり、好ましくは約７．５のｐＨである。場合によって、１種または複数の界面活性剤を加え、典型的には、軽い非変性の界面活性剤である、例えば、ＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナート）もしくはＣＨＡＰＳ（３−［３コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ−オ］−１−プロパンスルホン酸塩を加えるか、または本タンパク質の構造的もしくは生理的特性の顕著な破壊を避けるために十分低い濃度の界面活性剤を加える。他の例において、強力な界面活性剤を、著しい変性を生じさせるために使用することができる。
【００７５】
あるいは、大腸菌または他の細菌由来の機能的な異種タンパク質を、強力な変性剤を使用した可溶化、および続くリフォールディングによって封入体から単離することができる。公知技術の変性剤は、単に一例として、尿素、チオシアン酸カリウム、グアナジンＨＣｌ（“ＧｕＨＣｌ”）、ヨウ素酸カリウムおよび／またはヨウ化ナトリウムならびにこれらの組合せを含む。好ましくは、ＧｕＨＣｌは、アルカリ条件下で（例えば、約ｐＨ８）、還元剤（例えば、濃度約６Ｍ〜約８Ｍ）として使用する。場合によって、別の還元剤のジチオスレイトール“ＤＴＴ”を、単独で、または、ＧｕＨＣｌと併せて使用する。ＤＴＴが使用される際に、濃度は、単に一例として、約５０ｍＭ〜約０．５ｍＭ ＤＴＴの範囲である。可溶化ステップの間、当該技術分野で周知のように、還元剤が、ジスルフィド結合を分離または変性させるために存在しなければならない。１つの例示的な還元緩衝液は、０．１ＭトリスｐＨ８．０、６Ｍグアニジン、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．３Ｍ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。
【００７６】
再生は、典型的に、酸化剤の存在下で、変性または還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に希釈する（例えば、１００倍）することによって達成される。好収率の正しいリフォールディングを可能にするという条件で、任意の適切な公知技術の酸化剤を使用することができる。例えば、酸化およびリフォールディングは、Ｓａｘｅｎａ，ら、１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：５０１５−５０２１（参考として本明細書で援用される）に記載のように、および特に上記のＢｕｃｈｎｅｒ，ら、に記載のように、還元および酸化された形態で、低分子量チオール試薬によってもたらすことができる。再生は、典型的に、変性または還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に希釈（例えば、１００倍）することによって達成される。１つの例示的なリフォールディング緩衝液は、トリスＨＣｌ １００ｍＭ、ｐＨ１０．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、ＧＳＳＧ ５５１ｍｇ／Ｌ、０．５Ｍアルギニンである。ＧＳＳＧは、グルタチオンの酸化型である。
【００７７】
一般的に、ポリペプチドの大きさおよび構造は、実質的に安定状態であるべきで、通常、変性状態であるべきではない。本ポリペプチドは、四次構造で他のポリペプチドと会合するか（例えば、溶解性を与えるために）、または脂質もしくは界面活性剤と会合し得る。
【００７８】
実質的に純粋は（例えば、タンパク質の文脈で）、典型的に、タンパク質が元の供給源微生物由来の他の夾雑タンパク質、核酸、または他の生物物質を含まないことを意味する。純度は標準法によって、典型的に、重量によって評価することができ、通常、少なくとも約４０％純粋、一般的に少なくとも約５０％純粋、しばしば少なくとも約６０％純粋、典型的に少なくとも約８０％純粋、好ましくは約９０％純粋、および最も好ましい実施形態において少なくとも約９５％純粋である。しばしば、担体または賦形剤が加えられる。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、バイオアッセイおよび当該技術分野で公知の他の方法によって評価することができる。機能的態様から、本発明に従って単離されるイヌＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質に特異的である免疫応答を誘発できるように、前駆体イヌＴＳＬＰタンパク質および／または成熟イヌＴＳＬＰタンパク質を含む他の物質から十分に分離されたイヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００７９】
ポリペプチドまたは断片の溶解性は、環境およびポリペプチドに左右される。温度、電解質環境、ポリペプチドの大きさおよび分子特性、ならびに溶媒の性質などの多くのパラメータは、ポリペプチド溶解性に影響を及ぼす。典型的に、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約６５℃の範囲である。通常、温度は約１８℃より高い。診断目的では、温度は、およそ室温か、それより暖かい温度であるが、アッセイの成分の変性温度未満である。治療的目的では、温度は、通常、体温であり、典型的に、約３６℃〜約４０℃（例えば、イヌでは約３９℃）であるが、ある状況下では、温度はｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏで上昇または下降し得る。
【００８０】
本明細書で使用する、特定のタンパク質に関する“抗原性断片”という用語は、抗原性である（すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる）そのタンパク質の断片（例えば、完全長タンパク質からわずか単一アミノ酸が失われている大きな断片など）である。例えば、本発明のイヌＴＳＬＰの抗原性断片は、抗原性であるイヌＴＳＬＰの断片である。そのような断片は、免疫化のために担体分子に断片を結合した後に、これらをＴＳＬＰタンパク質に対する抗体を生成するために使用できる限り、それ自身で免疫原である（すなわち、担体なしに免疫反応を誘発することができる）必要はない。しかし、好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。
【００８１】
特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、５〜１５０のアミノ酸残基を含有する。１つの特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、１２０を超えるアミノ酸残基を含有する。別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、１０〜１２０のアミノ酸残基を含有する。さらに別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、２０〜１００のアミノ酸残基を含有する。さらに別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、２５〜７５のアミノ酸残基を含有する。
【００８２】
イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、組換え供給源から、天然の供給源から単離されたタンパク質から、または、化学合成によって得ることができる。さらに、抗原性断片は、イヌＴＳＬＰまたはその断片のタンパク分解後、組換え発現によって得ることができ、または例えば、ペプチド合成によって、新たに生成することができる。
【００８３】
ワクチン
本発明は、さらに、本発明のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、または全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せの有効量を含むワクチンを提供する。例えば、下記の表２に列挙したようなイヌＴＳＬＰタンパク質および／またはその断片を、タンパク質またはペプチド適合性のワクチン組成物中に取り込ませることができる。そのようなワクチン組成物は、当該技術分野において周知であり、例えば、生理的適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびにＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）またはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）などの薬学的に許容されるアジュバントを含み得るが、必ずしも含む必要はない。
【００８４】
ワクチン組成物は、それを必要とするイヌの対象において（例えば、イヌの対象におけるＴＳＬＰ活性の下方制御に反応する疾患または障害の臨床徴候を治療するために）、内因性抗ＴＳＬＰ抗体を誘発するために使用することができる。代わりに、またはそれと共に、本発明のワクチンは、イヌＴＳＬＰをスクリーニングおよび／または同定するために抗血清を誘発するために（例えば、ＴＳＬＰを過剰発現させるイヌを特定するための検査キットの補助として）使用することもできる。
【００８５】
下記の表２に開示されたＴＳＬＰのペプチドなどのＴＳＬＰのペプチドおよびその変異体を、個々にまたは様々な組合せのいずれかで免疫原として使用することができる。そのようなペプチドは、場合によって、化学的または組換えＤＮＡ法のいずれかによって、互いにおよび／または担体として知られる大きなタンパク質に結合することができる。担体は、免疫応答の標的として宿主動物によるペプチド認識を高め、ＴＳＬＰペプチドの免疫原性を増加させるために作用する。いくつかの担体が当該技術分野で公知であり、破傷風トキソイドまたは破傷風毒素由来の無毒性Ｃ断片、ジフテリアトキソイド、ＰｈｏＰタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ベータガラクトシダーゼ、ＢＨＶ−１ウイルス由来のｇＤタンパク質、狂犬病ウイルス由来のＧタンパク質、イヌのジステンパーウイルス由来のＦタンパク質および公知の“ユニバーサル”Ｔ細胞エピトープの重合によって生成された合成担体などの合成担体を含む。
【００８６】
免疫原として有用なＴＳＬＰペプチドは、天然ＴＳＬＰタンパク質の表面へのアクセス可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）、親水性、原子の移動性および抗原性などの属性を評価する公知のアルゴリズムを使用して、表２に記載のＴＳＬＰペプチドおよびその変異体から選択することができる。また、表２に列挙されたペプチドおよびその変異体由来のエピトープを、天然のＴＳＬＰタンパク質、および特にＴＳＬＰの生物活性を中和することが可能なこれらの抗体と反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体とのこれらの反応性を基にして選択することができる。そのような抗原は、標準のペプチド合成技術を使用して本明細書に開示された配列から調製された合成ペプチドを含み得、および／または代わりに、組換えもしくは天然ＴＳＬＰタンパク質から得た断片であり得る。
【００８７】
本発明の薬学的に許容されるアジュバントは、天然の供給源、組換え供給源、および／または化学的に合成した供給源などを含む、任意の多くの供給源から入手し得る。アジュバントとして使用される化学物質の例は、アルミニウム化合物、代謝性および非代謝性油、ブロックポリマー、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激錯体）、ビタミンおよびミネラル（ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２を含むが、これに限定されるものではない）、ならびにＱｕｉｔ Ａ（サポニン類）、フロインド完全アジュバント、商標ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９４１）の下で販売されるようなポリアルケニルエーテルまたはジビニルグリコールと架橋したアクリル酸のポリマー、ならびに水エマルジョン中に均一分散したミクロンサイズの油滴（例えば、商標Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）の下で販売されるような）を含むが、これに限定されるものではない。時には、特に免疫刺激剤として呼ばれているアジュバントの更なる例は、細菌および菌類の細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質、糖タンパク質、ムラミルペプチド、β−１，３／１，６−グルカン）、植物から誘導された様々な複合糖質（例えば、グリカン、アセマンナン（acemannan））、動物から誘導された様々なタンパク質
およびペプチド（例えば、ホルモン類、サイトカイン、共刺激因子）、ならびにウイルスおよび他の供給源から誘導された新規な核酸（例えば、二重鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）を含む。さらに、上述した物質の多くの組合せは、アジュバント作用をもたらし、したがって、本発明のアジュバントを形成し得る。
【００８８】
本発明のワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与およびその組合せを含む、任意の経路で投与することができる。
【００８９】
抗体
また本発明は、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質と特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル（ｍＡｂ）抗体を含む。本明細書で使用する、“抗体”という用語は、免疫グロブリンおよび／またはその断片を意味する。自然発生の免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドから成る。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。また、本発明による１つ以上の抗体は、抗体断片、すなわち、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）、改変一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、参考として本明細書で援用される）、および二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含有する。一般的に、Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）（これらすべてを参考として本明細書で援用される）を参照。
【００９０】
例えば、標準法を使用して本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質によって免疫化された動物から生成された血清を、直接使用することができるが、さもなければ、プラズマフェレシスまたは固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡもしくはＰｒｏｔｅｉｎ ＧなどのＩｇＧ特異的吸着剤による吸着クロマトグラフィーなどの標準法を使用して、ＩｇＧ画分をこの血清から分離することができる。あるいは、モノクローナル抗体を調製することができ、場合によって、抗原結合断片または組換え結合タンパク質を、そのようなｍＡｂｓから誘導することができる。そのようなＭＡｂまたはその断片を、場合によって、それぞれ公知技術の方法またはその簡単な変更法によって、ヒト化またはイヌ化することができる。
【００９１】
本明細書で使用する“エピトープ特異的な”イヌＴＳＬＰ抗体は、イヌＴＳＬＰの断片に対して産生される抗体であって、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の５つのアミノ酸配列の１つ以上を含むエピトープを含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をさらに結合する、イヌＴＳＬＰの断片に対して産生される抗体である。特定の実施形態において、エピトープ特異的なイヌＴＳＬＰ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００９２】
選択的に本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質を結合するｍＡｂｓを産生するハイブリドーマは、周知の技法によって生成される。通常、本プロセスは、所望の抗体を産生するＢリンパ球と不死化細胞系の融合を伴う。あるいは、不死化抗体産生細胞系を生成するための非融合法を使用することができる（例えば、ウイルス誘発形質転換（Ｃａｓａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７６（１９８６））。不死化細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が、利便性および入手可能性のために最も多く使用されている。
【００９３】
抗原を注射した哺乳動物から抗体産生リンパ球を得るための技法は周知である。一般的に、ヒト起源の細胞が使用される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用されるが、さもなければ非ヒト哺乳動物の供給源からは、脾臓またはリンパ節細胞が使用される。宿主動物に精製抗原（ヒト細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作する）の反復用量を注射し、動物に所望の抗体産生細胞を産生させたあと、これらを不死化細胞系との融合のために回収する。また、融合のための技法は、当該技術分野で周知であり、一般的に、細胞をポリエチレングリコールなどの融合化剤（ｆｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と混合することを包含する。
【００９４】
ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択などの標準的手法によって選択される。所望の抗体を分泌するこれらは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などの標準のイムノアッセイを使用して選択される。抗体は、標準的タンパク質精製法を使用して媒体から回収される（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））。
【００９５】
多くの利用可能な文献で、上記の技法を適用することにおけるガイダンスを提供している（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２））。モノクローナル抗体も、周知のファージライブラリー系を使用して生成することができる（例えば、Ｈｕｓｅ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）、Ｗａｒｄ，ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照）。
【００９６】
ポリクローナルであるかモノクローナルであるにせよ、このように生成された抗体は、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってイヌＴＳＬＰタンパク質を精製するための周知の方法によって固体支持体に結合した固定化型で、使用することができる。
【００９７】
イヌＴＳＬＰタンパク質に対する抗体も、イヌＴＳＬＰタンパク質を検出または定量化するイムノアッセイの基礎として、標識されないかまたは標準法によって標識されて使用することができる。使用される特定の標識は、イムノアッセイのタイプによって決まる。使用することができる標識の例は、放射標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルならびにウンベリフェロン）、化学発光物質（例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルアジンジオン）および酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）含むが、これに限定されるものではない。
【００９８】
抗体は、公知の方法によるそのような標識でタグをつけることができる。例えば、カップリング剤（例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンチジンなど）は、蛍光、化学発光または酵素標識で抗体にタグをつけるために使用することができる。関係する一般的な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ （Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，米国フロリダ州オーランドに記載されている。そのようなイムノアッセイは、例えば、受容体の精製中に得られる画分に対して行うことができる。
【００９９】
また、本発明の抗体は、発現クローニング系においてイヌＴＳＬＰタンパク質を発現している特定のｃＤＮＡクローンを同定するために使用することができる。受容体のリガンド結合部位に特異的な中和抗体も、イヌＴＳＬＰタンパク質の機能を遮断または下方制御するためのアンタゴニスト（阻害剤）として使用することができる。そのような中和抗体を、慣用実験によって容易に同定することができる。
【０１００】
イヌＴＳＬＰタンパク質活性の拮抗作用は、完全な抗体分子または周知の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片）を使用して達成することができる。そのような断片の定義は、上記または例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）、Ｐａｒｈａｍ，Ｃｈａｐｔｅｒ
１４，ｉｎ Ｗｅｉｒ，ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）で見い出すことができる。また、抗体断片の使用および生成も記載されている（例えば、Ｆａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号）および抗体半分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号））。公知の抗体の重および軽鎖可変領域配列に基づき組換えＦｖ断片を作製するための方法は、さらに、例えばＭｏｏｒｅら、（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）］によって記載されている。あるいは、これらを標準法によって化学的に合成することができる。
【０１０１】
また本発明は、抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）を含み、これらは抗原として上記の抗体を使用して生成される。これらの抗体は、リガンドの構造を模倣し得るので有用である。
【０１０２】
非イヌの哺乳動物または非イヌのハイブリドーマ系から生成される抗体は、場合によって、イヌに注射する際、実質的にこれらを非抗原性にするよう操作することができる（すなわち、これらをイヌ化することができる）。ヒトへの治療的投与のために免疫原性をより低くするために動物由来のモノクローナル抗体を変更するプロセス（ヒト化）は、積極的に追及されており、多くの出版物に記載されている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，Ｌ．ら、“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８））。あるいは、非イヌの哺乳動物由来のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）を、イヌの抗体またはその配列とキメラ化して、標準のネズミのモノクローナル抗体より免疫原性の低いレシピエント宿主に見られる抗体を獲得する。例えば、米国特許第５，５９３，８６１号“Ｄｏｇ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（参考として本明細書で援用される）を参照。
【０１０３】
さらにＷａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，（Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３１６０（１９７７））は、イヌのＩｇＭおよびイヌのＩｇＡ重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。これらの研究者は、イヌのＩｇＡ由来のκ軽鎖のアミノ酸配列を決定した（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１５：３０３（１９７８））。ＭｃＣｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１６：５６５（１９７９）は、イヌのμ鎖の完全なアミノ酸配列を開示している。Ｔａｎｇら、（Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８０：２５９ （２００１））は、１つのイヌのＩｇＧ−Ａγ鎖ｃＤＮＡおよび４つのイヌのＩｇＧ−Ａγ鎖タンパク質配列を開示している。上記のＴａｎｇら、は、さらに、ヒト、マウス、ブタおよびウシＩｇＧの保存領域からデザインされた縮重オリゴヌクレオチドプライマーによるイヌの脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅について述べている。さらに、Ｋｒａｈら、（２００４年９月１６日に発行された米国公開第２００４０１８１０３９号、参考として本明細書で援用される）は、非イヌ抗体をイヌ化するための１つのプロセスに関して詳細に述べている。
【０１０４】
イヌＴＳＬＰ遺伝子の単離
Ａ．最初の試み
イヌＴＳＬＰを同定するための最初の試みは、ＢＬＡＴ（公共ゲノムデータベースＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）から組み立てられたラット、チンパンジーおよびアカゲザルＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列によるクローン化ヒトおよびマウスＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列の配列アラインメントに基づいていた。チンパンジーＴＳＬＰは、アミノ酸レベルでヒトＴＳＬＰと１００％同一であるが、アカゲザルＴＳＬＰでは、成熟タンパク質においてヒトＴＳＬＰと９０％以上（１２／１５１の残基が異なる）の相同性を有する。しかし、ヒトおよびヒト以外の霊長類のＴＳＬＰタンパク質およびｃＤＮＡ配列は、ネズミＴＳＬＰ配列と非常に異なる。ヒトおよびマウスＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列は、相同性がわずかに４３％であるので、これらの種間における低いストリンジェンシーの異種間ハイブリッド形成によるクローン化はできない。さらに、ラットＴＳＬＰ配列は、マウスＴＳＬＰと比較して、成熟タンパク質のアミノ酸残基配列に３９／１２１の変化を示し、このことは、近縁種のネズミ種間でさえ、ＴＳＬＰ配列が著しく異なっていることを示している。
【０１０５】
あいにく、本明細書で開示したように、イヌＴＳＬＰ配列も、すべての全く異なるネズミおよび同様な霊長類の配列と異なることが判明した。したがって、低いストリンジェンシーの異種間ハイブリッド形成によりイヌＴＳＬＰを得ることは成功しないことが判明した。実際に、ヒト、マウス、ラットおよびサルの配列情報を使用してネスト化ＰＣＲ法でイヌＴＳＬＰ相同分子種をクローン化する試みにおいてデザインされたプライマーは、イヌＴＳＬＰに対応した単一バンドさえ同定することに失敗した。
【０１０６】
Ｂ．イヌＴＳＬＰ遺伝子の単離の成功
次に、利用可能な、ヒトＴＳＬＰ配列を用いて組み立てられたイヌゲノムデータベース（全体のゲノムショットガン配列決定に由来する。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚによって一般的に公開されている）により、イヌＴＳＬＰのエキソン１および４の部分的な同定に至った。簡単に述べると、重要な配列相同性のいくつかのヒットが、この最初の検索で同定された（下記の“ヒット”１〜６を参照）。これらの配列は、集められ、イヌＴＳＬＰ遺伝子の部分的な電子配列を拡張および組み立てるための検索配列（ｑｕｅｒｙ）として使用した。
【０１０７】
【化３−１】
【０１０８】
【化３−２】
【０１０９】
【化３−３】
この電子的に組み立てた配列のヒト、サル、ラットおよびマウスＴＳＬＰとの比較では、ＴＳＬＰのイヌの相同分子種の一部としての、この配列の同定につながる、保存されたイントロン／エキソン境界および実質的な配列同一性が証明された。続いて、ＰＣＲプライマーを、この発見に基づいてデザインし、この遺伝子の欠損したセグメントを増幅するために使用した。２つの部分的に重複するクローンが、二重ネスト化ＰＣＲによって、イヌの活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ｃＤＮＡライブラリーから得られた。完全なイヌＴＳＬＰ ｃＤＮＡを、ネスト化ＰＣＲによって明らかにする試み、または５’もしくは３’末端へ配列を拡張しようとする更なる試みは、成功しなかった。しかし、このライブラリーからの人力による自然のＤＮＡ配列の組み立てと合わせて、イヌの全体のゲノムショットガン配列データ（Ｉｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に対して、これらのクローンから拡張した配列の情報を使用して、データベース検索を反復して行うことで、完全長イヌＴＳＬＰ ｃＤＮＡの電子的組み立てにつながった。次に、このｃＤＮＡ配列の物理的クローンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した。
【０１１０】
結論として、現行および最高水準の技法である分子クローニング法を用いて、ヒト、マウス、ラットまたはサルの配列から、直接、イヌのＴＳＬＰ配列を誘導することはできなかった。分子ＰＣＲクローン法と合わせて、ゲノムデータベース上のイントロン／エキソン境界アサインメントおよび配列同一性を用いて、組み立てられたヒト、マウス、ラットおよびＮＨＰ ＴＳＬＰ遺伝子を使用した複雑なデータベースの反復的検索だけが、イヌＴＳＬＰをコードする遺伝子の同定につながった。
【０１１１】
イヌのＴＳＬＰは、一旦得られると、成熟ヒトＴＳＬＰタンパク質のアミノ酸配列と比較して５８／１３２の変化（６１％の同一性）を示し、成熟マウスＴＳＬＰタンパク質のアミノ酸配列と比較して８３／１２９の変化（３３％の同一性）を示した（下記参照）。
【０１１２】
Ｃａｎｉｓ ｆｉａｍｉｌｉａｒｉｓとヒトのＴＳＬＰ成熟タンパク質の配列比較
【０１１３】
【化４】
Ｃａｎｉｓ ｆｉａｍｉｌｉａｒｉｓとマウスのＴＳＬＰ成熟タンパク質の配列比較
【０１１４】
【化５】
したがって、前述の困難を克服することによって、本発明は、ここで、イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡ配列およびコードされたイヌＴＳＬＰタンパク質を提供する。イヌＴＳＬＰタンパク質およびあるその断片は、タンパク質上の様々なエピトープ（直鎖および立体配置的エピトープの両方）に対する抗体を産生するための有用な抗原（例えば、免疫原）である。また、イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡは、“裸の”ＤＮＡとしてまたはワクチン接種された動物の細胞内でＴＳＬＰを発現するために適したプラスミドもしくは動物のウイルスベクターの形態にかかわらず、免疫化のためおよび／または研究試薬としてのＴＳＬＰタンパク質を産生するためのベクターおよび宿主細胞を提供することにおいて、ならびに抗ＴＳＬＰ抗体を産生するためのＤＮＡベースのワクチンを提供することにおいて有用である。
【０１１５】
このように得られたイヌＴＳＬＰ遺伝子配列を、図８Ａ（配列番号１）で図示し、予測される発現ＴＳＬＰタンパク質を、図８Ｂ（配列番号２）に図示する。残基１〜２８は、シグナル配列を表し、残基２９〜１５５は、成熟タンパク質を表す。
【０１１６】
相同ＴＳＬＰタンパク質を同定するためのアッセイ
また本発明は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除き、配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質であって、これらをワクチンとしてイヌに投与すると、配列番号２のアミノ酸配列を含有するイヌＴＳＬＰタンパク質を結合する抗体を産生する、ＴＳＬＰタンパク質を提供する。また、そのようなＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片も提供する。
【０１１７】
実際に、推定のＴＳＬＰタンパク質が本発明のＴＳＬＰであることを実証する１つの方法は、そのようなタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰと結合する抗体を産生することができるかどうか試験することである。そのような方法の１つは、推定上のＴＳＬＰ−ＧＳＴ抗原を５〜５００μｇの範囲の様々な用量でイヌに（例えば、注射して）ワクチン接種することである。そのような抗原を、水酸化アルミニウム系アジュバント（例えば、Ｒｅｈｙｄｒｏｇｅｌ）に調合することができる。次に、イヌに、０日目、２１日目および４２日目の３回、筋肉内注射する。血清サンプルを、０日目、２１日目、４２日目および６３日目にワクチン接種したイヌおよび対照（ワクチン接種を受けていない）イヌから収集する。
【０１１８】
抗原でワクチン接種をされたイヌの抗体の誘導は、ＥＬＩＳＡアッセイにより以下のように評価することができる。配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質を、コーティング緩衝液（炭酸水素ナトリウムｐＨ９．０）に５μｇ／ｍｌまで希釈し、９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に１００μｌ／ウェルで分配する。プレートを、４℃で終夜インキュベートする。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴに２％のスキムミルク）２００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で６０分間インキュベートする。次にプレートをＰＲＳＴで３回洗浄する。次に、１：１００で希釈した試験イヌ抗血清１００μｌ／ウェルを、最上列の適切なウェルに加える。次に、血清試料を、適切なプレート位置に１０倍に希釈する。プレートを室温で６０分間インキュベートしたあと、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【０１１９】
次に、ヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と結合し、１：２０，０００に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ１００μｌ／ウェルを、各ウェルに加える。次に、プレートを室温で６０分間インキュベートする。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をすべてのウェルに加える。呈色反応を、室温で１０〜２０分間生じさせたあと、０．１８Ｍ硫酸５０μｌ／ウェルを加えることによって停止させる。
【０１２０】
すべてのウェルの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール）を使用して４５０ｎｍの波長で測定する。推定上のＴＳＬＰ抗原を注射したイヌから得た血清試料は、検出可能であると考慮されるので、アッセイが免疫化前にイヌから得られた血清試料によって生じるバックグラウンドより３倍以上のＯ．Ｄ．値を示す際、抗原は本発明のＴＳＬＰタンパク質と同定される。同様に、ＴＳＬＰ抗原に関する相対的抗体価は、抗原による免疫化の前にイヌから得られた血清試料によって生じるバックグラウンドより３倍以上のＯ．Ｄ．値を示す最も高い血清希釈に基づいて測定される。
【０１２１】
イヌＴＳＬＰタンパク質の特異的なエピトープに対する抗体
抗体は、自然発生の形態、および組換えの形態における、種、多型または対立遺伝子変異体、およびその断片を含むイヌＴＳＬＰタンパク質の様々なエピトープに対して産生し得る。さらに、抗体は、自然のまたは変性された異変体を含む、活性化形態または不活性化形態のいずれかにおける、イヌＴＳＬＰに対して産生し得る。抗イディオタイプ抗体も、企図される。
【０１２２】
抗原の所定の断片に対する抗体（結合断片および単鎖の異変体を含む）は、当該技術分野で標準のアジュバントおよび／または免疫原タンパク質への結合と共に、イヌＴＳＬＰおよび／またはその断片による動物の免疫化によって産生し得る。こうして免疫化される動物は、イヌＴＳＬＰの活性を下方制御するために免疫化されるイヌであり得る。
【０１２３】
適切な宿主（例えば、Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスの近交系）を、典型的に標準のアジュバントおよび標準のマウスの免疫化プロトコールを使用して（上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｉｄ．を参照）、選択されたタンパク質により免疫化する。アジュバントを、ワクチン投与の前、と併せて、または後に標的の動物に投与することができる。
【０１２４】
あるいは、本明細書に開示の配列から誘導され、担体タンパク質に結合した合成ペプチドを免疫原として使用することができる。ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定される免疫原による固相イムノアッセイ）において免疫原タンパク質に対して力価検定（ｔｉｔｒａｔｅ）する。１×１０４以上の力価のポリクローナル抗血清を選択し、例えば、上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｉｄ．（５７０〜５７３ページ）に記載のような競合結合イムノアッセイを使用して、他のＩＬ−７ファミリーメンバー（例えば、ネズミＩＬ−７）に対するこれらの交差反応性に関して試験する。好ましくは少なくとも１つの他のＩＬ−７ファミリーメンバーを、例えば、霊長類ＩＬ−７と併せて、この測定に使用する。ＩＬ−７ファミリーメンバーを、組換えタンパク質として生成し、本明細書に記載のような標準の分子生物学およびタンパク質化学の技法を使用して単離する。
【０１２５】
競合結合形式のイムノアッセイを、交差反応性の測定に使用することができる。例えば、配列番号２のタンパク質を、固体支持体に固定できる。アッセイに加えられるタンパク質は、固定化抗原への抗血清の結合と競合する。固定化タンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタンパク質の能力を、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と比較する。上記のタンパク質のパーセント交差反応性を、標準の算出法を使用して算出する。上記で列挙された各タンパク質と１０％未満の交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次に交差反応性抗体を、上記で列挙したタンパク質による免疫吸着法によってプールした抗血清から取り出す。
【０１２６】
次に、免疫吸着およびプールした抗血清を、上記のような競合結合イムノアッセイにおいて使用し、２番目のタンパク質と免疫原タンパク質（例えば、配列番号２のＩＬ−７様タンパク質）を比較する。この比較を行うために、２種のタンパク質を、広範囲の濃度でそれぞれ測定し、固定タンパク質への抗血清の結合を５０％阻害するために必要な各タンパク質の量を決定する。必要とされる２番目のタンパク質の量が、選択されたタンパク質または必要とされるタンパク質のタンパク質量の２倍未満である場合、その時、２番目のタンパク質は、免疫原に対して惹起された抗体に特異的に結合すると言われる。
【０１２７】
また、本発明の抗体は、診断的適用に有用であり得る。捕捉抗体または非中和抗体として、これらを、受容体への結合を阻害することなしに、抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。中和抗体として、これらは競合結合アッセイで有用であり得る。また、これらは、イヌＴＳＬＰタンパク質またはその受容体を検出するかまたは定量化する際に有用である。（例えば、Ｃｈａｎ（ｅｄ．１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．；Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ（ｅｄｓ．１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．およびＮｇｏ（ｅｄ．１９８８）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照）。交差吸収、除去または他の手段は、明確な選択のための（例えば、固有または共有の種特異性）の調整を提供する。これらは、抗原の様々な群を同定する試験の基礎であり得る。
【０１２８】
さらに、本発明の抗原結合断片を含む抗体は、抗原に結合し、機能的結合（例えば、生物反応を誘発し得る受容体への結合）を阻害する強力なアンタゴニストであり得る。さらに、これらの抗体は、薬物または他の治療的薬剤に、直接またはリンカーによって間接的に結合することができ、薬物ターゲティングを行うことができる。
【０１２９】
本明細書に開示の配列から誘導され、担体タンパク質に結合した合成ペプチドを免疫原として使用することができる。どんな場合でも、抗原性断片は、他の物質、特に、ポリペプチドに（免疫原として使用される融合または共有結合したポリペプチドとして）結合し得る。抗原およびその断片は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイドなどの様々な免疫原に融合または共有結合し得る。ポリクローナル抗血清の調製法の説明について、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ，１９６９、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，を参照。
【０１３０】
場合によっては、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどの様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。そのようなモノクローナル抗体の調製法についての説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．），Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，および本書で引用される参考文献；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；および特にＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（ここではモノクローナル抗体を生成するある方法について記載している）に見い出すことができる。
【０１３１】
他の適切な技法は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの曝露、または、代わりにファージまたは同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を伴う。（Ｈｕｓｅら、（１９８９）“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，“Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１およびＷａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６を参照）。キメラ、イヌ化および／または、ヒト化抗体を含む、本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変の有無にかかわらず使用することができる。
【０１３２】
しばしば、本発明のポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを示す物質を結合することによって標識される。そのような結合は、共有結合または非共有結合のいずれかで達成することができる。多種多様な標識および結合法は、公知であり、科学および特許文献において広範囲に報告される。適切な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などを含む。そのような標識の使用を教示している特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号を含む。また、組換えまたはキメラ免疫グロブリンを生成することができる、Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｏｒｅ，ら、米国特許第４，６４２，３３４号；およびＱｕｅｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照、またはトランスジェニックマウスにおいて作製することができるＭｅｎｄｅｚら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６を参照。これらの参考文献は、参考として本明細書で援用される。
【０１３３】
また本発明の抗体を、タンパク質を単離する際に、アフィニティークロマトグラフィーに使用することができる。抗体が固体支持体に結合している場合に、カラムを調製することができる（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら、（１９８４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：３−５５）を参照）。あるいは、固体支持体に結合した抗体を、対応する抗体を精製するために使用することができる。
【０１３４】
また、各イヌＴＳＬＰに対して産生される抗体は、抗イディオタイプ抗体を産生するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連した様々な免疫学的状態を検出または診断する際に有用である。
【０１３５】
ＲＮＡ阻害
イヌＴＳＬＰを産生する細胞内でのイヌＴＳＬＰをコードするＲＮＡとの干渉は、ＴＳＬＰの生物活性を阻害し、その結果として、アトピー性皮膚炎などの多くのＴＳＬＰ関連の障害を治療する更なる手法である。このために、化学的に合成されるか、または適切な送達ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）内でクローン化される二重鎖ＲＮＡ分子を、ＴＳＬＰをコードする内因性ｍＲＮＡ濃度を減少させる目的で、能動的にＴＳＬＰ ｍＲＮＡを産生する細胞内に導入することができる。これらＲＮＡ分子の挿入後（所望の細胞へのプラスミドまたはウイルスベクターの挿入後の、外部から送達された分子またはＲＮＡの転写の場合）、これらは、短いヌクレオチド断片（ｓｉＲＮＡと呼ばれる）へのリボヌクレアーゼＩＩＩ型タンパク質の開裂活性を通して処理される。次に、これらｓｉＲＮＡ断片は、ＲＮＡヘリカーゼの活性化によるｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しの結果として活性化されるＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるヌクレアーゼ含有多タンパク質複合体に組み込まれる。ここで、一本鎖ｓｉＲＮＡ鎖が、ＲＩＳＣ複合体をその標的のｍＲＮＡへ導いたあと、ＲＩＳＣのエンドヌクレアーゼの活性によって切断され、続いて分解される。
【０１３６】
より具体的には、ＴＳＬＰ遺伝子またはその断片を含有するプラスミドを、多くの市販の真核生物プラスミドのいずれか１つにおいてクローン化し、ここではＴＳＬＰ遺伝子またはその断片の転写が、適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）によって引き起こされる。次に、精製したプラスミドＤＮＡ（１〜１００ｕｇ）を、皮膚病変、またはアトピー性皮膚炎の特性を示す皮膚病変の周囲に注射する。次に、プラスミドＤＮＡの注射を、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの顕著な減少を引き起こすために必要な頻度で繰り返すことができる。この減少を、患部から皮膚生検を得ることと、定量的ＰＣＲなどの方法によってＴＳＬＰ ｍＲＮＡの濃度を測定することとによって評価することができる。
【０１３７】
本発明の以下の調製例は、本発明の更なる理解を提供するために役立つものであるが、いかなる方法であれ、本発明の実効的範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１）
イヌＴＳＬＰ ＤＮＡおよびタンパク質配列
イヌＴＳＬＰを発現するイヌ遺伝子を、電子データベースでのデータマイニングおよび上記で詳述したような分子生物学方法を使用した反復的なプロセスによって同定した。
【０１３９】
結果
イヌのＴＳＬＰ遺伝子配列を、図８Ａ（配列番号１）に図示し、ＴＳＬＰタンパク質を発現する予測タンパク質を、図８Ｂ（配列番号２）に図示する。星印によって示される図８Ｂの残基１〜２８（配列番号２）は、シグナル配列を表し、残基２９〜１５５は、成熟タンパク質を表す。
【０１４０】
（実施例２）
イヌＴＳＬＰのクローニングおよび発現
イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡを、本明細書に記載のように同定し、ドナーベクターの当該技術分野標準法ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）にクローン化した。遺伝子の組み立ておよびドナーベクターへのクローニングを、ＤＮＡ２．０と呼ばれる受託臨床試験実施機関で実施し、この結果、同定したゲノムイヌＴＳＬＰ遺伝子を含有するｐＤＯＮＲ２２１．Ｇ０３２７６と呼ばれるプラスミドを構築した。成熟した（すなわち、シグナル配列なしで）イヌＴＳＬＰタンパク質をコードするＤＮＡを、それぞれＮｃｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖ部位を含有する２種のプライマーを使用してｐＤＯＮＲ２２１．Ｇ０３２７６からＰＣＲで増幅した。
【０１４１】
【化６】
Ｎｃｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖの消化後、ＰＣＲ生成物を、ベクターｐＩＶＥＸ １．３ ＷＧ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃３７２８８０３）のＮｃｏ ＩおよびＳｍａ Ｉ部位に挿入した。これにより、Ｃ末端で６つのＨｉｓ残基（“Ｈｉｓ６タグ”）と融合した成熟イヌＴＳＬＰをコードする遺伝子を含有するプラスミドを生じた。挿入物の正しい配列を含有するプラスミドを、プラスミド１２６５−９３．Ｄと名づけた。プラスミド１２６５−９３．Ｄを使用して、製造者の推奨に従って（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ＃３０６４８５９）、ＲＴＳ Ｐｒｏｔｅｏｍａｓｔｅｒ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでＴＳＬＰを発現させた。図１に示すように、＠１６ｋＤａのバンドがレーン２および４で明らかだった（矢印）。ウエスタンブロット試験（図２Ａおよび２Ｂ）では、このバンドが、抗Ｈｉｓタグ抗体（図２Ａ）およびヒトＴＳＬＰに特異的なラットモノクローナル抗体（図２Ｂ）と特異的に反応することを示している。
【０１４２】
（実施例３）
宿主細胞からのイヌＴＳＬＰの生成
大腸菌で組換えＴＳＬＰタンパク質を発現させるために、ｃＴＳＬＰをコードするヌクレオチド配列（すなわち、シグナル配列をコードするＴＳＬＰを欠いているヌクレオチド）を、それぞれＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーと共に、テンプレートとしてプラスミド１２６５−６６Ｃを使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０１４３】
【化７】
Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ消化後、ＰＣＲ生成物をｐＥＴ４２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入した。このプロセスにより、Ｎ末端でＧＳＴタグおよびＣ末端で６×Ｈｉｓタグと融合した成熟ｃＴＳＬＰをコードするプラスミドを生成した。挿入物の正しい配列を含有するプラスミドを、１２６５−９３Ｂと名づけた。ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパクの発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳにおいて実施した。プラスミド１２６５−９３Ｂを担持する大腸菌細胞を、３０℃でＯ．Ｄ．６００＝０．６まで培養したあと、タンパク質の発現を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに３０℃で２時間インキュベートすることによって誘発した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、可溶性大腸菌画分内に存在する正しい大きさ（約６１ｋＤａ）のタンパク質バンド（矢印）を示している（図３Ａ）。ウエスタンブロットは、発現したタンパク質が抗ＧＳＴ抗体と反応することを示している（図３Ｄ）。ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓタンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂によって精製することができる（図３Ｂ）。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂による更なる精製後、大部分のＧＳＴ―ＴＳＬＰタンパク質が、カラムのフロースルー中に含有された（図３Ｃ）。
【０１４４】
（実施例４）
イヌＴＳＬＰの免疫蛍光検出
イヌの皮膚および扁桃組織におけるイヌＴＳＬＰタンパク質の発現を、ヒトＴＳＬＰタンパク質に対して産生されるウサギポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学検査（「ＩＨＣ」）によって測定した。免疫組織化学検査は、生理食塩水を注射した正常なイヌの皮膚、および様々な皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、多形性紅斑および接合部型表皮水疱症など）と診断されたイヌの皮膚から得られたパラフィン包埋組織に対して実施した。さらに、ＴＳＬＰタンパク質の発現を、２匹のイヌから得られた凍結扁桃組織において測定した。ＩＨＣによりＴＳＬＰ発現を測定する手順は以下の通りである。
【０１４５】
Ｉ．切片の調製
１．皮膚試料を埋め込まれたパラフィンブロックを、５〜７ミクロンの厚さに切断し、接着を促進するためにポリ−Ｌ−リジンで処理したスライドにのせた。
【０１４６】
２．切片を、キシレンで脱パラフィンし、連続的にエタノール溶液で再水和した。
【０１４７】
３．抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、クエン酸塩緩衝液（０．５ｍｌ／リットルの濃度でＴｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウムを、約９９〜１００℃に達するまで研究室マイクロ波を使用して、２５分間）において実施した。これは、パラフィン包埋プロセスの間マスクされる、組織切片の抗原性を回復するプロセスである。
【０１４８】
ＩＩ．免疫染色
１．切片を、抗体の非特異的結合を減少させるために、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に希釈した１０％通常のロバ血清中で１時間インキュベートした。
【０１４９】
２．過剰な血清を、静かに除去し、切片をＰＢＳに希釈した（１：１００）ウサギの抗体で覆い、湿潤チャンバーにおいて室温で１時間または４℃で終夜インキュベートした。
【０１５０】
３．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５１】
４．過剰なＰＢＳを、静かに除去し、切片を、湿潤チャンバーにおいて室温でＰＢＳに１：５０００で希釈したビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体で３０分間覆った。
【０１５２】
５．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５３】
６．過剰なＰＢＳを除去し、切片を、５マイクログラム／ｍｌの濃度で、ストレプトアビジン−フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ）結合体／ＰＢＳ中で、室温で３０分間インキュベートした。
【０１５４】
７．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５５】
８．次に、切片を、ヘモトキシリンで２〜３分間、対比染色した。
【０１５６】
９．次に、切片を蛍光顕微鏡で検査した。
【０１５７】
１０．適切な画像を撮影した。
【０１５８】
１１．実験対照は、一次抗ＴＳＬＰ抗体の除去または一次抗ＴＳＬＰ抗体と通常のウサギ抗体との交換を含んだ。
【０１５９】
下記の表１では、ＩＨＣ試験の結果を要約する。
【０１６０】
【表１】
ＴＳＬＰの発現が、ＡＤと診断されたイヌ由来の皮膚組織の８０％で検出されたが、生理食塩水を注射した正常皮膚組織ではわずか２０％で検出された。またＴＳＬＰは、多形性紅斑のイヌおよび遺伝的皮膚疾患（接合部型表皮水疱症）のイヌ由来の組織のそれぞれ６６％および１００％で検出された。皮膚エリテマトーデスのイヌ由来の皮膚組織においてＴＳＬＰタンパク質の発現は認められなかった。パラフィン包埋皮膚組織において、ＴＳＬＰの発現は、汗腺において検出された。冷凍されたイヌの扁桃組織のＴＳＬＰの発現は、重層扁平上皮および付随する唾液腺において検出された。イヌ皮膚試料の陽性ＩＨＣ染色の例を図４に示す。ここでは、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌ由来のパラフィン包埋皮膚組織試料を示す。
【０１６１】
（実施例６）
イヌＴＳＬＰの免疫ペルオキシダーゼ検出
また、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌの皮膚から調製されたパラフィン包埋組織ブロックにおけるイヌＴＳＬＰタンパク質の発現を、検出法として免疫組織化学検査を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色によって測定した。この方法においては、ヒトＴＳＬＰタンパク質に対して惹起されたエピトープ特異的ラットモノクローナル抗体を、一次抗体として使用した。免疫ペルオキシダーゼ染色によってＴＳＬＰ発現を測定するための手順は、以下の通りであった。
【０１６２】
特殊試薬
通常の新生子ウシ血清：＃Ｎ−４７６２ Ｓｉｇｍａ
パラフィン包埋皮膚組織
一次抗体：ラット抗ヒトＴＳＬＰ ｍＡｂラットＩｇＧ２ａ
二次抗体：ラビット抗ラットＩｇＧ（ビオチン化）：ＢＡ−４０００ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム
検出試薬：ストレプトアビジン−ＨＲＰ：＃４３−８３２３ Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ
ＡＥＣ基質キット：Ｂｉｏｇｅｎｅｘ ＃ＨＫ１２９−５Ｋ、米国カリフォルニア州サンラモン
１．切片試料４〜６ｕｍ。
２．空気乾燥１０分、室温。
３．アセトン中で１０分固定。
４．ＰＢＳ（０．０１リン酸緩衝生理食塩水）中で３分すすぐ。
５．０．１％アジ化ナトリウムを含む０．３％過酸化水素中での７〜１０分間のインキュベーションによってクエンチする。
６．ＰＢＳ中で５分すすぐ。
７．湿室において切片を１％通常の新生子ウシ血清で２０分ブロックする。
８．スライドを排水し、室温で、１：１００の希釈で一次抗体を２時間加える。
９．５分すすぐ。
１０．湿室において室温で二次抗体（ラビット抗ラットＩｇＧ＠１：４００）を３０分加える。
１１．５分すすぐ。
１２．排水し、室温で検出試薬（ストレプトアビジン−ＨＲＰ＠１：４００）を３０分間加える。
１３．２×５分すすぐ。
１４．ＡＥＣを２．５分加える。所望の染色強度およびバックグラウンドに従って調整する。
１５．ヘマトキシリンで対比染色し、マウントする。
【０１６３】
ＡＤのイヌ由来のイヌ皮膚組織のセットを、エピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体を使用したＩＨＣによって試験した。図５に示した結果は、この抗体がヒトＴＳＬＰと抗原エピトープを共有する分子と反応することを示している。イヌのＡＤ皮膚試料の染色は、表皮が肥厚している慢性炎症の部位で強かった。このパターンは、ヒトのＡＤ皮膚病変でのＴＳＬＰ発現位置について知られることと一致しており、さらにイヌの皮膚ＡＤ病変で認められる分子がイヌＴＳＬＰであることを示唆するものである。ＰＢＳ、または異なるタンパク質（リンパ球タンパク質）に特異的な異なるラットモノクローナル抗体のいずれかで観察された染色は見られなかった。
【０１６４】
（実施例７）
イヌＴＳＬＰのエピトープマッピング
ＴＳＬＰ活性を中和することができるワクチンへの包含に有用であるイヌＴＳＬＰ上のエピトープを同定するために、イヌＴＳＬＰタンパク質配列に基づいた重複ペプチドのセットを合成し、中和する抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体と反応するこれらの能力について試験した。この目的のために、それぞれが１５アミノ酸長で、２アミノ酸ずつずれた重複ペプチドを、ＭＩＭＯＴＯＰＥＳ（米国ミネソタ州ミネアポリス）においてピン上に合成した。これらペプチドの配列を表２に列挙する。ペプチド１〜５７を、構成ＮＨ２−ＰＥＰＴＩＤＥ−ＰＩＮで、アミド化された末端で合成した。ペプチド５８〜９４（親ペプチド１〜３７の複製）を、構成ＡＣＥＴＹＬ−ＰＥＰＴＩＤＥ−ＰＩＮで、アセチル化された末端で作製した。
【０１６５】
表２に列挙されるペプチドを担持するピンを、製造業者（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）の推奨の手順に従って、ＥＬＩＳＡアッセイ形式で試験した。図６に示すように、アミノ酸配列
【０１６６】
【化８】
（配列番号３２）のペプチド＃２５（エピトープ２５）は、ＰＡＢ１００モノクローナル抗体に対して最も反応性が高かった。このペプチド配列と、対応する推定上のヒトＴＳＬＰペプチド配列との比較を図７に示す。
【０１６７】
【表２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載の実施形態に加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような変更が、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。
【０１６８】
さらに、核酸またはポリペプチドに対して示されたすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されるものであることが理解される。
【０１６９】
様々な出版物が本明細書に引用されているが、全体として、この開示を参考することにより本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年１２月１４日に出願された、米国仮出願第６０／８７５，１３５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する本出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、イヌの胸腺間質リンホポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）タンパク質（イヌ“ＴＳＬＰ”）、イヌＴＳＬＰをコードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞、ならびにイヌＴＳＬＰを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アトピー性疾患などのレアギン介在障害を患う動物（例えば、ヒト）は、ＩｇＥ抗体に関わる即時型アレルギー反応を発症する遺伝的傾向を有する。複数の遺伝因子が、そのような動物で見られる、結果として生じる表現型の発現に関与する。アトピー性疾患において観察される即時型過敏症は、チリダニ類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、花粉、カビおよび鱗屑などの特定のアレルゲンへの曝露から生じる。当然のことながら、アトピー性疾患を有する個体は、喘息、アトピー性皮膚炎、および内因性のＩｇＥ放出に関連した他の障害をより患う可能性がある。
【０００４】
アレルギー性皮膚炎、喘息などのアトピー性疾患は、飼いイヌなどのイヌ種にも発生する。そのようなイヌは、一般的に１〜３歳の間にアトピーの徴候を示し始める。本疾患の遺伝的性質により、ゴールデンレトリーバー、大部分のテリア、アイリッシュセッター、ラサアプソ、ダルメシアン、ブルドッグおよびオールドイングリッシュシープドッグなどのいくつかの品種が、よりアトピー性の傾向が大きい。しかし、雑種などの他のイヌ種も、この状態を患うことが知られている。少なくとも１つの特定のタイプのアトピー（アトピー性皮膚炎）の発生率は、ヒトおよびイヌで同様に著しく増加している。
【０００５】
通常、アトピーのイヌは、足、鼻口部、耳、腋窩または鼠径部をこすり、なめ、噛み、噛みつきまたはひっかくため、脱毛、皮膚の赤色化および肥厚が生じる。一部の症例では、いくつかの皮膚の状態が組み合わさり、単一のアレルギーだけでは、そのようなかゆみが生じないと思われるかゆみを動物に引き起こしている。更に悪化させる、これらの問題は、空中に浮遊するアレルゲン（花粉など）、食物中のアレルゲン、寄生虫（ノミなど）由来のアレルゲンによる可能性がある。また、皮膚の細菌および／または酵母感染症も、掻痒感を増大し得る。
【０００６】
アトピーの不快な症状を軽減する１つの簡単な方法は、刺激するアレルゲンを避けることである。残念なことに、一般的に、そのような回避は実際的でない。これまで、開業獣医師は、経口抗ヒスタミン剤、経口または局所コルチコステロイド抗炎症剤、他の免疫系抑制剤（例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス）、脂肪酸補助剤を投与、およびアレルゲン特異的免疫療法（同定された抗原の注射を必要とする）を実施することによってイヌのアトピー性皮膚炎を治療してきた。しかし、すべての場合で、このような治療は効果がない。さらに、そのような治療は、コストがかかり、および／または重大な副作用を生じる。したがって、より安全、より有効かつより経済的な、イヌのアトピー性皮膚炎の症状を治療または抑制するためのアプローチが以前から必要とされている。
【０００７】
哺乳動物の免疫応答は、“免疫ネットワーク”と呼ばれる一連の複雑な細胞間相互作用に基づいている。多くの免疫反応は、サイトカインと呼ばれる可溶性タンパク質とリンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞とのネットワーク様の相互作用を中心に展開され、ここで、サイトカインはこれらの細胞間相互作用を仲介／制御／調節する際に重要な役割を果たす。したがって、サイトカインおよび免疫細胞は、様々な炎症性障害につながる特定の生理的機構または経路を仲介する役割を果たす。
【０００８】
アレルギー性炎症は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などの無調節なＴＨ２誘導サイトカインを、Ｔ細胞に産生させるように導く複雑な免疫カスケードの結果である。次に、これらのサイトカインは、気管支過敏性、ＩｇＥ産生、好酸球増加および粘液産生を誘発する（例えば、非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３を参照）。
【０００９】
胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）は、最初はマウスで、（ｉ）表面ＩｇＭ＋Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ならびに（ｉｉ）ＢおよびＴ細胞増殖を補助する因子として同定されたＩＬ−７様サイトカインである（非特許文献４、また非特許文献５を参照）。現在、ＴＳＬＰは、ＩＬ−７ＲαサブユニットおよびＴＳＬＰ−Ｒと呼ばれる固有の受容体サブユニットを含む細胞受容体を結合することが知られている。この相互作用は、骨髄系細胞（例えば、単球）などの造血細胞または樹状細胞における、ＳＴＡＴ活性化または胸腺と活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）の発現を通したシグナル伝達を誘発する（例えば、参考として本明細書で援用される、共同所有される特許文献１を参照）。
【００１０】
またＴＳＬＰは、マウスで、アトピー性皮膚炎および喘息などのアレルギー疾患の病因において重要な役割を果たす場合がある。例えば、ＴＳＬＰ遺伝子の発現が特に皮膚において誘発されたトランスジェニックマウスは、炎症性の真皮細胞浸潤を含有する湿疹性病変、皮膚ホーミング受容体を発現するＴｈ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞の劇的な増加およびＩｇＥの血漿濃度の上昇などのアトピー性皮膚炎の免疫学的および臨床的特徴を示す。さらに、肺特異的ＴＳＬＰ導入遺伝子を発現するマウスの肺は、白血球の広範囲に及ぶ浸潤、杯細胞過形成、上皮下線維症、Ｔヘルパー２型サイトカインの増加、ＩｇＥ濃度の増加などの喘息の免疫学的および臨床的特徴を示す。
【００１１】
Ｓｉｍｓら、は、発現クローニングを使用してネズミＴＳＬＰのｃＤＮＡ配列を得たが、ネズミＴＳＬＰに基づいたハイブリダイゼーションプローブでヒト相同体のクローンをつくることができなかった（非特許文献６）。その後、ヒト相同体を、詳細なＥＳＴ分析によって同定した。ヒトＴＳＬＰヌクレオチド配列は、対応するマウス配列とわずか４３％の相同性しか持たないことが発見された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，８９０，７３４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ＢｕｓｓｅおよびＬｅｍａｎｓｋｅ，Ｊｒ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００１）３４４：３５０−６２
【非特許文献２】Ｈｏｌｇａｔｅ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．（２０００）３２０：２３１−２３４
【非特許文献３】Ｒｅｎａｕｌｄ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）５４：５７７−５８９
【非特許文献４】Ｆｒｉｅｎｄら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９４）２２：３２１−３２８
【非特許文献５】Ｌｅｖｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）１６２：６７７−６８３
【非特許文献６】Ｓｉｍｓら、Ｊ ｅｘｐ Ｍｅｄ，（２０００）１９２：６７１−６８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アトピー性皮膚炎およびその関連の臨床症状を含む、イヌにおけるアトピー性障害に対する新規のより実用的な治療を提供する必要性が残る。さらに、そのような治療の開発につながる可能性のあるイヌにおけるアトピー性障害に導く免疫カスケードに関係する因子を単離する必要がある。
【００１５】
本明細書の任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が例示出願に対する“先行技術”として使用できることの承認と解釈すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、アトピー性皮膚炎およびその関連の臨床症状を含む、イヌにおけるアトピー性障害に対する新規のより実用的な治療を提供する。したがって、本発明は、アトピー性障害に導く免疫カスケードに関わる新規な単離および／または組換え胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）タンパク質を提供する。さらに本発明は、そのようなＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片を提供する。本発明の特定の態様において、ＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００１７】
したがって、本発明は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質であって、このタンパク質をワクチンとしてイヌの対象に投与すると、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質を結合する抗体が、ワクチン接種したイヌの対象から得られた、結果として生じたイヌの血清で検出できる、ＴＳＬＰタンパク質を提供する。関連の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸を含むイヌＴＳＬＰに対して惹起された抗体と交差反応性である。
【００１８】
さらに本発明は、エピトープ特異的イヌＴＳＬＰモノクローナル抗体に結合する、配列番号２のアミノ酸配列（２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く）に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質を提供する。
【００１９】
より特定の実施形態において、そのＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、そのＴＳＬＰタンパク質は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質である。別の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基２９〜１５５を含む成熟イヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００２１】
また、本発明のＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片を提供する。そのような抗原性断片は、配列番号８〜１０１のアミノ酸配列によって個々に定められた１つ以上のエピトープを含む抗原性断片を含む。特定の実施形態において、本発明の抗原性断片は、配列番号３０、３１、３２および／または３４のアミノ酸配列を含む１つ以上のエピトープを含む。別の実施形態において、抗原性断片は、配列番号３０、３１、３２および／または３４のアミノ酸配列の重複部分内に含有されるアミノ酸配列を有し得る（すなわち、
【００２２】
【化１】
（配列番号：１１８））。特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片は、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を結合することができる。
【００２３】
【化２】
のアミノ酸配列（配列番号１１８）の抗原性断片は、大きさにおいて、約５〜約２１のアミノ酸残基の範囲に及ぶ可能性がある。
【００２４】
また、本発明の任意のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、またはそのような１つ以上の完全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せの有効量を含み得るワクチンが提供される。一実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質である。特定の実施形態において、ワクチンは、配列番号２のアミノ酸残基７１〜９２の５〜２２の連続するアミノ酸を含む、イヌＴＳＬＰタンパク質の１つ以上の抗原性断片を含有する（本明細書では配列番号１１８と定義）。そのような抗原性断片の例は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を含む本明細書で開示されるエピトープを含む。本発明のすべてのワクチンは、薬学的の許容されるアジュバントを更に含み得る。
【００２５】
本発明のワクチンは、抗イヌＴＳＬＰ抗体を誘発する方法において使用することができる。そのような方法の１つは、有効量のワクチンで哺乳動物を免疫化することを含む。この方法は、場合によって、イヌにおいてＴＳＬＰの活性を下方制御する方法および／または有効量のワクチンでイヌを免疫化することを含む、アトピーのイヌのアレルギー症状を治療もしくは防止する方法を含む。改善されるアレルギー症状は、アレルギー性皮膚炎、喘息などを含み得る。
【００２６】
本発明のワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与、乱切法およびその組合せなどの経路によって投与することができる。
【００２７】
さらに、本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質またはその抗原性断片をコードする核酸分子を提供する。そのような一実施形態において、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。このタイプの特定の実施形態において、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。約１８の連続するヌクレオチド、約２４の連続するヌクレオチド、約３６の連続するヌクレオチド、約４５の連続するヌクレオチド、約６６以上の連続するヌクレオチドの配列番号１のヌクレオチド配列の断片も、本発明の一部である。厳格なハイブリッド形成条件で配列番号１とハイブリッド形成する完全長ＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸を含む、約１８のヌクレオチド、約２４のヌクレオチド、約３６のヌクレオチド、約４５のヌクレオチド、約６６以上のヌクレオチドも本発明によって提供される。さらに、本発明のすべての核酸分子およびその断片は、異種のヌクレオチド配列を含み得る。
【００２８】
また本発明は、前述の核酸分子および／またはその断片を含む発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、そのような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、場合によって原核または真核宿主細胞である。一実施形態において、原核宿主細胞は、大腸菌である。このタイプの特定の実施形態において、宿主細胞は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳである。
【００２９】
さらに本発明は、イヌＴＳＬＰをコードする上記の核酸分子（例えば、配列番号１）の１つおよび／またはその断片を含む、組換えウイルスベクターおよび／または裸のＤＮＡベクターを提供する。そのようなベクターを、例えば、アトピー性皮膚炎を有するイヌへの投与に適したワクチンに使用することができる。
【００３０】
また本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質を生成する方法を提供する。そのような方法の１つは、本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することを含む。さらに、この方法は、培養した宿主細胞または培地からＴＳＬＰタンパク質を単離および／または精製するステップを含む。また、得られた単離および／または精製ＴＳＬＰタンパク質は、本発明の一部である。
【００３１】
また、本発明のワクチンによってハイブリドーマ系において誘発された抗ＴＳＬＰ抗体は、本発明の一部である。このタイプの一実施形態において、哺乳動物のハイブリドーマ系を使用する。特定の実施形態において、抗体を、単離および／または精製する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得る。本発明によれば、非イヌ種において誘発されたモノクローナル抗体を、場合によって、イヌの対象に注射すると、最小限に抗原性であるように、イヌ化するように操作することができる。ある好ましい実施形態において、本発明による任意の抗体の結合ドメインは、場合によって、例えば、開裂によっておよび／または組換えＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２結合タンパク質として、元の抗体より小さい結合断片に変換される。また、自然発生の重鎖抗体（例えば、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（登録商標））の固有な構造的および機能的特性を含有する抗体誘導性治療用タンパク質も本発明に含まれる。さらに、ＴＳＬＰに対する高親和性および低免疫原性を有する抗体代用物（例えば、ＴＳＬＰ受容体の結合部から調製されたアビマー）も、本発明に含まれる。本発明の抗イヌＴＳＬＰ抗体／アビマーを、有効量の抗イヌＴＳＬＰ抗体を投与することにより、アトピーのイヌのアレルギー症状を治療する方法において容易に使用することができる。
【００３２】
また本発明は、本発明の有効量のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、または完全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せと組合せて有効量の非ＴＳＬＰ免疫原を含むワクチンを提供する。このタイプの特定の実施形態において、ＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質である。より特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
さらに本発明は、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質、その断片ならびに／またはイヌＴＳＬＰおよびその断片により誘発された抗体を使用する診断法を提供する。一実施形態において、本発明は、イヌから表皮試料を得ることと、この表皮試料におけるイヌＴＳＬＰタンパク質の存在を判定することとを含む、イヌのアトピー性皮膚炎を診断する方法を提供する。
【００３４】
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
胸腺間質リンホポエチンタンパク質（ＴＳＬＰ）またはその抗原性断片であって、該ＴＳＬＰタンパク質が２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該ＴＳＬＰタンパク質が配列番号２のアミノ酸を含むイヌＴＳＬＰに対して惹起された抗体と交差反応性である、胸腺間質リンホポエチンタンパク質またはその抗原性断片。
（項目２）
前記ＴＳＬＰがエピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体と結合する、項目１に記載のＴＳＬＰ。
（項目３）
イヌＴＳＬＰである、項目１に記載のＴＳＬＰ。
（項目４）
配列番号２のアミノ酸残基２９〜１５５を含む、項目３に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質。
（項目５）
前記断片が配列番号８〜１０１またはその２つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片。
（項目６）
配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４またはその２つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の抗原性断片。
（項目７）
前記抗原性断片が
【化９】
（配列番号１１８）の５〜２２の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含み、該抗原性断片がエピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体に結合する、項目４に記載のＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片。
（項目８）
薬学的に許容されるアジュバント、ならびに有効量の、項目１に記載のＴＳＬＰタンパク質、該ＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片およびその組合せから成る群から選択される免疫原を含むワクチン。
（項目９）
前記ＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片が配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４またはその組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載のワクチン。
（項目１０）
項目１に記載のＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸分子。
（項目１１）
項目４に記載のＴＳＬＰタンパク質をコードする、またはその抗原性断片をコードする核酸分子。
（項目１２）
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
項目１１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載の発現ベクターを含むワクチン。
（項目１５）
適切な培地で宿主細胞を培養することを含む、ＴＳＬＰタンパク質を生成する方法であって、該宿主細胞が項目１３に記載の発現ベクターを含み、該ＴＳＬＰタンパク質が発現される、方法。
（項目１６）
培養した前記宿主細胞または前記培地から前記ＴＳＬＰタンパク質を単離することを更に含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目８に記載のワクチンの有効量で哺乳動物を免疫化することを含む、該哺乳動物において抗ＴＳＬＰ抗体を誘発する方法。
（項目１８）
項目８に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、該イヌにおけるＴＳＬＰ活性を下方制御する方法。
（項目１９）
項目８に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療または予防する方法。
（項目２０）
前記アレルギー症状がアレルギー性皮膚炎または喘息を含む、項目１９に記載の方法。（項目２１）
項目８に記載のワクチンによって哺乳動物において、または哺乳動物のハイブリドーマ系において誘発される抗イヌＴＳＬＰ抗体。
（項目２２）
項目２１に記載の抗イヌＴＳＬＰ抗体の有効量を投与することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療する方法。
（項目２３）
非ＴＳＬＰ免疫原の有効量を更に含む、項目８に記載のワクチン。
（項目２４）
非ＴＳＬＰ免疫原の有効量を更に含む、項目９に記載のワクチン。
（項目２５）
イヌから表皮試料を得ることと、該表皮試料において項目４に記載のイヌＴＳＬＰタンパク質の存在を測定することとを含む、該イヌにおけるアトピー性皮膚炎を診断する方法。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図および詳細な説明を参考とすることによって、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示する。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。ＴＳＬＰタンパク質バンドを矢印によって示す。
【図２】図２Ａは、イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の抗Ｈｉｓ（Ｃ Ｔｅｒｍ）／ＡＰ Ａｂと反応させた。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。イヌＴＳＬＰタンパク質は、（矢印によって示されるように）総タンパク質および不溶性タンパク質において検出された。図２Ｂは、イヌＴＳＬＰタンパク質を発現する真核生物無細胞タンパク質合成系由来のタンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。タンパク質を、ヒトＴＳＬＰに特異的なラットモノクローナル抗体で反応させた。レーン１：タンパク質標準、レーン２：総タンパク質、レーン３：可溶性タンパク質、レーン４：不溶性タンパク質。イヌＴＳＬＰタンパク質は、（矢印によって示されるように）総タンパク質および不溶性タンパク質において検出された。
【図３】図３Ａは、大腸菌宿主細胞由来のＴＳＬＰの発現および精製を図示する。また、イヌＴＳＬＰと融合パートナーのＧＳＴタンパク質および６つのヒスチジン残基タグとの融合を表す、可溶性大腸菌画分に存在する＠６１ｋｄのバンドを示す。“Ｍ”は、タンパク質標準を示す（図３Ａ〜３Ｄすべてで同じ）。レーン１およびレーン２は、それぞれＩＰＴＧ誘導のない場合およびＩＰＴＧ誘導のある場合のプラスミド１２６５−９３Ｂを含有する大腸菌Ｂ１２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの可溶性画分である。矢印は、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質バンドを示す（図３Ａ〜３Ｄすべてで同じ）。図３Ｂは、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂によって精製される可能性のあることを示す。レーン１〜３は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂の異なる溶出画分を表す。図３Ｃは、レーンＢの融合タンパクがさらにＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製される可能性のあることを示す。本図は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂によるＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの精製後のＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質の再精製を図示する。レーン１は、フロースルーであり、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂の溶出（ｅｌｅｃｕｔｉｏｎ）である。図３Ｄは、ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質のウエスタンブロットを図示し、融合タンパク質が抗ＧＳＴ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｃａｔ Ｎｏ．２７４５７７０１）によって認識されることが認められる。
【図４】アトピー性皮膚炎と診断されたイヌ＃１０１９７から得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックからの切片のＦＩＴＣ染色を図示する。切片を、ウサギ抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体で反応させ、反応をストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で可視化した。蛍光強度（明るい領域）は、組織内に存在するＴＳＬＰへのウサギ抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体の結合を示す。
【図５】図５Ａは、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌから得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックからの切片の免疫ペルオキシダーゼ染色を図示する。この切片において、ラット抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体による皮膚試料の表皮領域の拡散した染色が認められる［暗い領域］。図５Ｂは、対照の切片を図示する。切片は、対照のリン酸緩衝液のみで処理した、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌから得た病変皮膚組織のパラフィン包埋ブロックに由来した。
【図６】ラット抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体によるイヌＴＳＬＰタンパク質のエピトープマッピングを図示する。特に興味があるピークは、エピトープ番号２２〜２６（配列番号２９〜３３）のものである。またエピトープ２２〜２６では、Ｎ末端の誘導体化により調査し（５５以上のピーク）、結合エピトープがＮ末端残基を必要としないことを確認した。
【図７】イヌ（配列番号３２）とエピトープ２５のヒトアナログ（配列番号３）のＴＳＬＰペプチド配列の比較を図示する。
【図８】図８Ａは、イヌＴＳＬＰ遺伝子のＤＮＡ配列を図示する（配列番号１）。図８Ｂは、図８Ａによって図示したＤＮＡ配列によって発現される、予測のＴＳＬＰポリペプチドを図示する（配列番号２）。星印は、最初のシグナル配列（残基１〜２８）のＮ末端を示し、下線を引いた残基７１〜９２（配列番号１１８）は、表２の重複するエピトープ２２〜２６が測定されたドメインを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
アトピー性皮膚炎（“ＡＤ”）は、Ｔｈ２介在アレルギー性炎症性疾患である。本疾患は、それ自体、ヒトおよびイヌの患者で多くの同様な臨床徴候を呈する。イヌにおけるＡＤの免疫病因は、皮膚病変に関わる細胞型およびサイトカインに関してヒトのＡＤと類似していると考えられる。
【００３７】
Ｔｈ２リンパ球上に選択的に発現するＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）へのＴＡＲＣリガンド（ＣＣＬ２２）の結合は、アレルギー性病変へのこれらの細胞の選択的移動を誘発する。ＴＡＲＣおよびその受容体ＣＣＲ４がイヌのＡＤ皮膚の病変において上方制御されることが報告されている。ＴＳＬＰは、ヒトのＴＡＲＣの強力な誘導物質であるので、ＴＳＬＰがイヌのＡＤの病変に存在する可能性があると仮定された。したがって、ヒトＴＳＬＰに対して惹起された抗体を、ＡＤイヌ患畜の病変皮膚に対して試験した。これらの皮膚試料の免疫組織化学検査により、図４で示すように、病変の抗ヒトＴＳＬＰ抗体と反応性である抗原の存在を確認した。しかし、本明細書に開示されるような哺乳動物種ではＴＳＬＰの核酸およびアミノ酸配列の相違が大きいため、ネズミおよびヒトＴＳＬＰをコードする遺伝子に対するイヌの相同分子種を同定する作業は、特に困難であると判明した。
【００３８】
本発明のＴＳＬＰおよび／またはその１つ以上の抗原性断片で飼いイヌを免疫化することは、免疫化されたイヌにおいて、内因性ＴＳＬＰの活性レベルを減少させ、したがって、１つ以上のアトピー性症状（例えば、喘息および／またはアトピー性皮膚炎において生じる症状）を緩和、排除および／または予防するはずである。さらに、イヌＴＳＬＰタンパク質を、飼いイヌまたは他の哺乳動物種の研究および／または診断試薬として用いるための抗イヌＴＳＬＰ抗体を誘発するための免疫原として使用することができる。あるいは、特別の場合において、イヌＴＳＬＰタンパク質および／またはイヌＴＳＬＰをコードする核酸は、免疫障害のあるイヌの免疫系の構成要素を、例えば、ＳＴＡＴ活性化またはＴＡＲＣ発現（例えば、造血細胞における）を通して、上方制御するために役立つ可能性がある。
【００３９】
本発明を完全に理解するために、以下の定義を提供する。
【００４０】
記述における便宜上の単数形用語の使用は、決してそのような制限を付けることを意図するものではない。したがって、例えば“ポリペプチド”を含む組成物への参照は、１つ以上のそのようなポリペプチドへの参照を含む。本明細書で使用する“約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）”という用語は、“約（ａｂｏｕｔ）”という用語と交換可能に使用され、値が、示された値の２０パーセント以内であることを示す（すなわち、“約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）”５０のアミノ酸残基を含有するペプチドは、４０〜６０の間のアミノ酸残基を含有し得る）。
【００４１】
“結合組成物”という用語は、例えば、抗体−抗原相互作用において、特異的にイヌＴＳＬＰに結合する分子を意味する。この特異性は、例えば、特定の実施形態または関連の実施形態の群（例えば、イヌＴＳＬＰおよび／またはイヌの抗体）に特異的など、多少、包括的である。
【００４２】
本明細書で使用する“イヌ”という用語は、特に明記しない限り、すべての飼いイヌ、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓまたはＣａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓを含む。
【００４３】
本明細書で使用する“ポリペプチド”という用語は、“タンパク質”および“ペプチド”という用語と交換可能に用いられ、ペプチド結合によって接続される１つ以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。本明細書で使用する“ポリペプチド”という用語は、重要な断片またはセグメントを含み、少なくとも約８つのアミノ酸、一般的に少なくとも１２のアミノ酸、典型的に少なくとも約１６のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸、および特に好ましい実施形態において、少なくとも約３０以上のアミノ酸（例えば、３５、４０、４５、５０など）のアミノ酸残基のストレッチを包含する。そのような断片は、例えば、すべての実際的な組合せで、残基１、２、３などで始まり、例えば１５５、１５４、１５３などで終わる、実質的にすべての位置で始まり、および／または終わる末端を有することができる。
【００４４】
場合によって、ポリペプチドは、遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされるあるアミノ酸残基を欠いている場合がある。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、切断されるポリペプチドのＮ末端上にアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードする可能性があり、したがって、最終的なタンパク質の一部でない可能性がある。
【００４５】
本明細書で使用するアミノ酸配列は、２つのアミノ酸配列が同一および／または以下の定義のように中性置換（ｎｅｕｔｒａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）もしくは保存的置換だけによって異なる場合、２番目のアミノ酸配列に１００％“相同”である。したがって、２つのアミノ酸配列の約８０％が同一および／または中性もしくは保存的置換のみによって異なる場合、アミノ酸配列は２番目のアミノ酸配列と約８０％“相同”である。
【００４６】
機能的に同等のアミノ酸残基を、しばしば、保存的アミノ酸置換において生じる配列内の残基と置換させることができる。そのような変更は、本明細書で使用する“保存的置換”という用語を定義する。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する同様の極性の別のアミノ酸によって置換することができ、結果としてサイレントな変更をもたらす。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。そのような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した見かけの分子量、または等電点に影響しないであろう。
【００４７】
特に好ましい保存的置換は、陽電荷を維持することができるようにＡｒｇに対するＬｙｓおよびその逆、陰電荷を維持することができるようにＡｓｐに対するＧｌｕおよびその逆、遊離−−ＯＨを維持することができるようにＴｈｒに対するＳｅｒ、ならびに遊離ＮＨ２を維持することができるようにＡｓｎに対するＧｌｎの置換である。またアミノ酸を、以下の類似の群（１）プロリン、アラニン、グリシン、セリンおよびスレオニン、（２）グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、（３）ヒスチジン、リジンおよびアルギニン、（４）システイン、（５）バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ならびに（６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンに配置することができる。
【００４８】
関連の実施形態において、２つの相同性の高いＤＮＡ配列を、それら自身の相同性またはそれらがコードするアミノ酸の相同性によって同定することができる。そのような配列の比較は、配列のデータバンクで入手可能な標準のソフトウェアを使用して実施することができる。特定の実施形態において、２つの相同性の高いＤＮＡ配列は、約８０％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、さらにより好ましくは約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。より具体的には、２つの相同性の高いアミノ酸配列は、約８０％の同一性、さらにより好ましくは約９０％の同一性、さらにより好ましくは約９５％の同一性を有する。
【００４９】
本明細書で使用するタンパク質およびＤＮＡ配列の同一性率（パーセント）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（米国マサチューセッツ州バーリントン）より市販されているＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖ９、ならびに配置デフォルトパラメータおよび同一性に対するデフォルトパラメータを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して測定することができる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０を参照。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、Ｄｏｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘ（登録商標）プラットフォームのために、例えば、ＥＭＢＬＩ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから無料でダウンロードできる。さしあたりのダウンロードリンクは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／．で見つけられる。これらおよび他の入手可能なプログラムも、同一または類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を測定するために使用することができる。
【００５０】
“ポリヌクレオチド”または“核酸分子”は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列さえ含むが、これに限定されるものでない、ヌクレオチドを含む分子である。また、本用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知技術の任意の塩基アナログを含む核酸分子を包含することも企図される。
【００５１】
本発明は、本発明のＴＳＬＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する核酸を提供する。核酸分子の一本鎖形態を、適切な温度および溶液のイオン強度条件下で、他の核酸分子にアニールできる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と“ハイブリッド形成可能”である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ．Ｉ．（２０００）を参照）。
【００５２】
高いストリンジェンシーのハイブリッド形成条件は、最も高いＴｍ（例えば、５０％のホルムアミド、５×または６× ＳＳＣ）に対応する。ハイブリッド形成は、２つの核酸が相補配列を含有することが必要である。しかし、ハイブリッド形成のストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチも可能である。核酸をハイブリッド形成するための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補の程度に基づく。２つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍ値は大きい。核酸ハイブリッド形成の相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを算出するための式は、導き出された強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ．Ｉ．（２０００）を参照）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）でのハイブリッド形成については、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する。
【００５３】
好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１２ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、長さは少なくとも約２４ヌクレオチドであり、最も好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチドである。特定の実施態様において、“標準的なハイブリッド形成条件”という用語は、５５℃のＴｍを意味し、前述のような条件を利用する。別の特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、それぞれ、ハイブリッド形成および洗浄条件に対してＴｍが６５℃であることを意味する。
【００５４】
ＤＮＡ“コード配列”または特定のタンパク質またはペプチドを“コードする配列”は、適切な調節エレメントの制御下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。
【００５５】
コード配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得るが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’方向に位置する。
【００５６】
“作動可能に結合した”は、そのように記述されるコンポーネントがこれらの通常の機能を実行するように配列されるエレメントの配置を意味する。したがって、コード配列に作動可能に結合した調節エレメントは、コード配列の発現を生じさせることができる。調節エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、介入するまだ翻訳されていない転写配列は、プロモーターとコード配列の間に存在する可能性があり、プロモーターは依然としてコード配列に“作動可能に結合した”と考えることができる。
【００５７】
本明細書で使用する“異種のヌクレオチド配列”は、自然において自然に形成しない核酸を形成させるために、組換え法によって本発明のヌクレオチド配列に加えられるヌクレオチド配列である。そのような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードすることができる。したがって、異種のヌクレオチド配列は、調節的および／または構造的特性を含有するペプチドおよび／またはタンパク質をコードすることができる。別のそのような実施形態において、異種のヌクレオチド配列は、組換え核酸が発現されたあと、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードすることができる。さらに別の実施形態において、異種のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能することができる。異種のヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含むことができる。
【００５８】
本明細書で使用する“融合タンパク質”および“融合ペプチド”という用語は、交換可能に使用され、“キメラタンパク質および／またはキメラペプチド”および融合“インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）タンパク質／ペプチド”を包含する。融合タンパクは、ペプチド結合によって少なくとも一部の別のタンパク質（例えば、非イヌＴＳＬＰタンパク質）に結合した本発明の少なくとも一部のイヌＴＳＬＰタンパク質を含み、および／またはイヌＴＳＬＰポリペプチド（例えば、ペプチド結合で結合された配列番号２のアミノ酸残基７１〜７５および１０１〜１０５から成る１０アミノ酸残基の融合ペプチド）において隣接／連続した順番で天然に存在しないイヌＴＳＬＰタンパク質（例えば、エピトープ）の２つ以上の非連続部分の組合せを含む。好ましい実施形態において、イヌＴＳＬＰタンパク質の部分は、作動可能である（例えば、その抗原性を保持する）。融合タンパクは、マーカータンパク質、または本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質の単離および／もしくは精製（例えば、ＦＬＡＧタグ、下記の実施例を参照）および／もしくは抗原性を助けるタンパク質を含むことができる。非イヌＴＳＬＰ配列は、イヌＴＳＬＰ配列に対してアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００５９】
本発明の融合タンパクをコードする組換えＤＮＡ分子は、例えば、イヌのＴＳＬＰコード配列にインフレームで結合した少なくとも非イヌＴＳＬＰタンパク質の一部をコードする配列を含むことができ、さらにイヌＴＳＬＰ配列と非イヌＴＳＬＰ配列との好ましくは接合部および接合部近くの特定のプロテアーゼ（例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子）に対する切断部位をコードすることができる。特定の実施態様において、融合タンパクは、原核細胞内で発現される。そのような融合タンパクは、本タンパク質に特異的なアフィニティーカラムおよび／またはイヌＴＳＬＰに融合したタグの使用を通して、本発明のイヌＴＳＬＰを単離するために使用することができる（下記の実施例を参照）。例えば、精製されたイヌＴＳＬＰを、次にタンパク質分解酵素および前述したような切断部位を使用することによって融合タンパク質から放すことができる。
【００６０】
“ベクター”または“複製ベクター”は、別のＤＮＡセグメントが付着したセグメントの複製を生じさせるように付着または取り込ませることが可能なレプリコン（例えばプラスミド、ウイルス、ファージまたはコスミド）である。また本用語は、当該の取り込ませたまたは付着させたＤＮＡセグメントを含むレプリコンを含む。
【００６１】
本発明で使用できるベクターは、微生物プラスミド、ウイルス、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片および宿主のゲノムへの核酸の組込みを促進することができる他の媒体を含む。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターであるが、同等の機能を果たし、当該技術分野で公知であるか、公知になる他のすべてのベクターは、本明細書の使用に適している。（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、 （ｅｄｓ．），Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．を参照）。
【００６２】
本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質をコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が互換性を有する制限部位を含む際容易に達成される。これができない場合は、ＤＮＡおよび／もしくはベクターの末端を、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成された一本鎖ＤＮＡ突出部を消化して平滑末端に戻すことによって改変するか、または適切なＤＮＡポリメラーゼで一本鎖の末端を充填することによって、同じ結果を達成する必要があり得る。あるいは、所望の部位を、例えば、末端上へヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることによって作製することができる。そのようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特異的なオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位も、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより生成することができる。例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）を参照。また、切断されたベクターおよびＤＮＡ断片を、必要に応じて、ホモポリマー末端化により改変し得る。
【００６３】
本発明で使用される組換え発現ベクターは、典型的に、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質および／またはその抗原性断片をコードする核酸を含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、通常、互換性を有する宿主細胞における核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子調節エレメントに作動可能に連結される。遺伝子調節エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含むことができ、典型的に、転写プロモーター、転写の開始を制御する選択的オペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含む。また、発現ベクターは、宿主細胞から独立してベクターの複製を可能にする複製開始点を含み得る。
【００６４】
本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質をコードする核酸の発現を、原核細胞または真核細胞のいずれかにおける従来法によって実施することができる。
【００６５】
“宿主細胞”は、外因性の核酸分子を一過性または恒久的に含有するか、または包含および発現することができる細胞である。細胞は、そのような外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されると、外因性ＤＮＡによって“形質転換される”。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮＡに組み込まれても（共有結合によって）、組み込まれなくても良い。原核生物および酵母において、例えば、外来性ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）に保持され得る。真核細胞に関して、安定して形質転換される細胞は、外来性ＤＮＡが染色体に組み込まれ、染色体複製を通して娘細胞により遺伝される細胞である。この安定性は、外来性ＤＮＡを含有する娘細胞集団から成る細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によって示される。
【００６６】
原核生物は、グラム陰性および陽性菌（例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の両方を含む。真核生物は、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞およびトリ）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類および齧歯類）の両方の動物細胞由来の確立された組織培養細胞系を含む。
【００６７】
原核宿主ベクター系は、多くの異なる種に対する多種多様なベクターを含む。ＤＮＡ増幅のためのベクターは、ｐＢＲ３２２もしくは多くのその誘導体、またはｐＥＴ４２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む。
【００６８】
典型的に使用される原核発現調節配列は、プロモーターを含んで使用され、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７））、例えば、ｐＵＣ−シリーズ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０））、例えば、（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）、ラムダＰＬプロモーター系（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８（１９８１））、ラムダ−ｐＰもしくはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）、アラビノース誘導プロモーター（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
２９２：１２８（１９８３））、Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）、またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）などのハイブリッドプロモーターから誘導されたプロモーターを含む。また、そのような調節配列を含有する数多くの他の発現ベクターは、当該技術分野で公知であり、市販されている。（また、Ｂｒｏｓｉｕｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”，ｉｎ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６．を参照）。
【００６９】
また、他の原核生物において使用できる大腸菌のために適切なベクターと遺伝的に同等なベクターも、本発明のＴＳＬＰタンパク質を発現させるために使用することができる。
【００７０】
酵母は、高等な真核組織培養細胞と同様に、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質、ならびに／または抗イヌＴＳＬＰ抗体および／もしくはそれらの抗体の断片の組換え体の生産のための宿主として企図される。任意の高等な真核組織培養細胞系（昆虫バキュロウイルス発現系を含む）が使用できるが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換または形質移入および増殖は慣用手法となっている。有用な細胞株の例は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ラット胎仔腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株（例えば、ＳＦ９）、トリ細胞株（例えば、ＤＦ−１１）、Ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞系およびサル（ＣＯＳ）細胞株を含む。
【００７１】
このような細胞株のための発現ベクターは、通常、例えば、複製開始点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含有する。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスなどの供給源から誘導されたプロモーターを有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表例は、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６（１９８５））、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７））、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、およびその誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）を含む。
【００７２】
一旦発現されると、本発明のイヌＴＳＬＰは、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当該技術分野の標準的方法に従って精製することができる（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− −Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照）。医薬用途には、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。精製は、部分的であっても、所望される均質性までであってもよい。イヌＴＳＬＰが治療的に使用される場合、本タンパク質は、実質的にエンドトキシンを含んではならない。結合抗−ＴＳＬＰ抗体カラム、または結合ＴＳＬＰ−受容体カラム上の発現したＴＳＬＰの選択的精製は、高度に精製されたイヌＴＳＬＰタンパク質を得るための利用可能な方法である。
【００７３】
精製の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、核酸は、沈殿、クロマトグラフィー、超遠心分離法および他の手段によって精製することができる。タンパク質およびポリペプチドは、ペプチドと同様に、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出ならびに向流分配を含むが、これに限定されるものではない様々な方法により精製することができる。いくつかの目的のために、ポリヒスチジン配列または抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）およびＧＳＴ）などがあるが、これらに限定されるものでない精製を促進する更なる配列タグをタンパク質が含有する、組換え系でポリペプチドを生成することが好ましい。次に、ポリペプチドは、宿主細胞の粗溶菌液から、適切な固相マトリックスのクロマトグラフィーによって精製することができる。あるいは、ポリペプチドに対して惹起された抗体またはその結合断片を、精製試薬として使用することができる。
【００７４】
溶媒および電解液は、生物活性の保存に使用されるタイプの中で、通常、生物学的に互換性を有する緩衝液であり、通常、生理的水性溶媒に近い。通常、溶媒は、中性のｐＨを有し、典型的に、約５〜１０の間であり、好ましくは約７．５のｐＨである。場合によって、１種または複数の界面活性剤を加え、典型的には、軽い非変性の界面活性剤である、例えば、ＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナート）もしくはＣＨＡＰＳ（３−［３コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ−オ］−１−プロパンスルホン酸塩を加えるか、または本タンパク質の構造的もしくは生理的特性の顕著な破壊を避けるために十分低い濃度の界面活性剤を加える。他の例において、強力な界面活性剤を、著しい変性を生じさせるために使用することができる。
【００７５】
あるいは、大腸菌または他の細菌由来の機能的な異種タンパク質を、強力な変性剤を使用した可溶化、および続くリフォールディングによって封入体から単離することができる。公知技術の変性剤は、単に一例として、尿素、チオシアン酸カリウム、グアナジンＨＣｌ（“ＧｕＨＣｌ”）、ヨウ素酸カリウムおよび／またはヨウ化ナトリウムならびにこれらの組合せを含む。好ましくは、ＧｕＨＣｌは、アルカリ条件下で（例えば、約ｐＨ８）、還元剤（例えば、濃度約６Ｍ〜約８Ｍ）として使用する。場合によって、別の還元剤のジチオスレイトール“ＤＴＴ”を、単独で、または、ＧｕＨＣｌと併せて使用する。ＤＴＴが使用される際に、濃度は、単に一例として、約５０ｍＭ〜約０．５ｍＭ ＤＴＴの範囲である。可溶化ステップの間、当該技術分野で周知のように、還元剤が、ジスルフィド結合を分離または変性させるために存在しなければならない。１つの例示的な還元緩衝液は、０．１ＭトリスｐＨ８．０、６Ｍグアニジン、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．３Ｍ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。
【００７６】
再生は、典型的に、酸化剤の存在下で、変性または還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に希釈する（例えば、１００倍）することによって達成される。好収率の正しいリフォールディングを可能にするという条件で、任意の適切な公知技術の酸化剤を使用することができる。例えば、酸化およびリフォールディングは、Ｓａｘｅｎａ，ら、１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：５０１５−５０２１（参考として本明細書で援用される）に記載のように、および特に上記のＢｕｃｈｎｅｒ，ら、に記載のように、還元および酸化された形態で、低分子量チオール試薬によってもたらすことができる。再生は、典型的に、変性または還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に希釈（例えば、１００倍）することによって達成される。１つの例示的なリフォールディング緩衝液は、トリスＨＣｌ １００ｍＭ、ｐＨ１０．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、ＧＳＳＧ ５５１ｍｇ／Ｌ、０．５Ｍアルギニンである。ＧＳＳＧは、グルタチオンの酸化型である。
【００７７】
一般的に、ポリペプチドの大きさおよび構造は、実質的に安定状態であるべきで、通常、変性状態であるべきではない。本ポリペプチドは、四次構造で他のポリペプチドと会合するか（例えば、溶解性を与えるために）、または脂質もしくは界面活性剤と会合し得る。
【００７８】
実質的に純粋は（例えば、タンパク質の文脈で）、典型的に、タンパク質が元の供給源微生物由来の他の夾雑タンパク質、核酸、または他の生物物質を含まないことを意味する。純度は標準法によって、典型的に、重量によって評価することができ、通常、少なくとも約４０％純粋、一般的に少なくとも約５０％純粋、しばしば少なくとも約６０％純粋、典型的に少なくとも約８０％純粋、好ましくは約９０％純粋、および最も好ましい実施形態において少なくとも約９５％純粋である。しばしば、担体または賦形剤が加えられる。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、バイオアッセイおよび当該技術分野で公知の他の方法によって評価することができる。機能的態様から、本発明に従って単離されるイヌＴＳＬＰタンパク質は、イヌＴＳＬＰタンパク質に特異的である免疫応答を誘発できるように、前駆体イヌＴＳＬＰタンパク質および／または成熟イヌＴＳＬＰタンパク質を含む他の物質から十分に分離されたイヌＴＳＬＰタンパク質である。
【００７９】
ポリペプチドまたは断片の溶解性は、環境およびポリペプチドに左右される。温度、電解質環境、ポリペプチドの大きさおよび分子特性、ならびに溶媒の性質などの多くのパラメータは、ポリペプチド溶解性に影響を及ぼす。典型的に、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約６５℃の範囲である。通常、温度は約１８℃より高い。診断目的では、温度は、およそ室温か、それより暖かい温度であるが、アッセイの成分の変性温度未満である。治療的目的では、温度は、通常、体温であり、典型的に、約３６℃〜約４０℃（例えば、イヌでは約３９℃）であるが、ある状況下では、温度はｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏで上昇または下降し得る。
【００８０】
本明細書で使用する、特定のタンパク質に関する“抗原性断片”という用語は、抗原性である（すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる）そのタンパク質の断片（例えば、完全長タンパク質からわずか単一アミノ酸が失われている大きな断片など）である。例えば、本発明のイヌＴＳＬＰの抗原性断片は、抗原性であるイヌＴＳＬＰの断片である。そのような断片は、免疫化のために担体分子に断片を結合した後に、これらをＴＳＬＰタンパク質に対する抗体を生成するために使用できる限り、それ自身で免疫原である（すなわち、担体なしに免疫反応を誘発することができる）必要はない。しかし、好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。
【００８１】
特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、５〜１５０のアミノ酸残基を含有する。１つの特定の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、１２０を超えるアミノ酸残基を含有する。別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、１０〜１２０のアミノ酸残基を含有する。さらに別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、２０〜１００のアミノ酸残基を含有する。さらに別の実施形態において、イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、２５〜７５のアミノ酸残基を含有する。
【００８２】
イヌＴＳＬＰの抗原性断片は、組換え供給源から、天然の供給源から単離されたタンパク質から、または、化学合成によって得ることができる。さらに、抗原性断片は、イヌＴＳＬＰまたはその断片のタンパク分解後、組換え発現によって得ることができ、または例えば、ペプチド合成によって、新たに生成することができる。
【００８３】
ワクチン
本発明は、さらに、本発明のＴＳＬＰタンパク質、１つ以上のその抗原性断片、または全長タンパク質と１つ以上のそのような断片の組合せの有効量を含むワクチンを提供する。例えば、下記の表２に列挙したようなイヌＴＳＬＰタンパク質および／またはその断片を、タンパク質またはペプチド適合性のワクチン組成物中に取り込ませることができる。そのようなワクチン組成物は、当該技術分野において周知であり、例えば、生理的適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびにＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）またはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）などの薬学的に許容されるアジュバントを含み得るが、必ずしも含む必要はない。
【００８４】
ワクチン組成物は、それを必要とするイヌの対象において（例えば、イヌの対象におけるＴＳＬＰ活性の下方制御に反応する疾患または障害の臨床徴候を治療するために）、内因性抗ＴＳＬＰ抗体を誘発するために使用することができる。代わりに、またはそれと共に、本発明のワクチンは、イヌＴＳＬＰをスクリーニングおよび／または同定するために抗血清を誘発するために（例えば、ＴＳＬＰを過剰発現させるイヌを特定するための検査キットの補助として）使用することもできる。
【００８５】
下記の表２に開示されたＴＳＬＰのペプチドなどのＴＳＬＰのペプチドおよびその変異体を、個々にまたは様々な組合せのいずれかで免疫原として使用することができる。そのようなペプチドは、場合によって、化学的または組換えＤＮＡ法のいずれかによって、互いにおよび／または担体として知られる大きなタンパク質に結合することができる。担体は、免疫応答の標的として宿主動物によるペプチド認識を高め、ＴＳＬＰペプチドの免疫原性を増加させるために作用する。いくつかの担体が当該技術分野で公知であり、破傷風トキソイドまたは破傷風毒素由来の無毒性Ｃ断片、ジフテリアトキソイド、ＰｈｏＰタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ベータガラクトシダーゼ、ＢＨＶ−１ウイルス由来のｇＤタンパク質、狂犬病ウイルス由来のＧタンパク質、イヌのジステンパーウイルス由来のＦタンパク質および公知の“ユニバーサル”Ｔ細胞エピトープの重合によって生成された合成担体などの合成担体を含む。
【００８６】
免疫原として有用なＴＳＬＰペプチドは、天然ＴＳＬＰタンパク質の表面へのアクセス可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）、親水性、原子の移動性および抗原性などの属性を評価する公知のアルゴリズムを使用して、表２に記載のＴＳＬＰペプチドおよびその変異体から選択することができる。また、表２に列挙されたペプチドおよびその変異体由来のエピトープを、天然のＴＳＬＰタンパク質、および特にＴＳＬＰの生物活性を中和することが可能なこれらの抗体と反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体とのこれらの反応性を基にして選択することができる。そのような抗原は、標準のペプチド合成技術を使用して本明細書に開示された配列から調製された合成ペプチドを含み得、および／または代わりに、組換えもしくは天然ＴＳＬＰタンパク質から得た断片であり得る。
【００８７】
本発明の薬学的に許容されるアジュバントは、天然の供給源、組換え供給源、および／または化学的に合成した供給源などを含む、任意の多くの供給源から入手し得る。アジュバントとして使用される化学物質の例は、アルミニウム化合物、代謝性および非代謝性油、ブロックポリマー、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激錯体）、ビタミンおよびミネラル（ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２を含むが、これに限定されるものではない）、ならびにＱｕｉｔ Ａ（サポニン類）、フロインド完全アジュバント、商標ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９４１）の下で販売されるようなポリアルケニルエーテルまたはジビニルグリコールと架橋したアクリル酸のポリマー、ならびに水エマルジョン中に均一分散したミクロンサイズの油滴（例えば、商標Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）の下で販売されるような）を含むが、これに限定されるものではない。時には、特に免疫刺激剤として呼ばれているアジュバントの更なる例は、細菌および菌類の細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質、糖タンパク質、ムラミルペプチド、β−１，３／１，６−グルカン）、植物から誘導された様々な複合糖質（例えば、グリカン、アセマンナン（acemannan））、動物から誘導された様々なタンパク質
およびペプチド（例えば、ホルモン類、サイトカイン、共刺激因子）、ならびにウイルスおよび他の供給源から誘導された新規な核酸（例えば、二重鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）を含む。さらに、上述した物質の多くの組合せは、アジュバント作用をもたらし、したがって、本発明のアジュバントを形成し得る。
【００８８】
本発明のワクチンは、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与およびその組合せを含む、任意の経路で投与することができる。
【００８９】
抗体
また本発明は、本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質と特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル（ｍＡｂ）抗体を含む。本明細書で使用する、“抗体”という用語は、免疫グロブリンおよび／またはその断片を意味する。自然発生の免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドから成る。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。また、本発明による１つ以上の抗体は、抗体断片、すなわち、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）、改変一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、参考として本明細書で援用される）、および二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含有する。一般的に、Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）（これらすべてを参考として本明細書で援用される）を参照。
【００９０】
例えば、標準法を使用して本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質によって免疫化された動物から生成された血清を、直接使用することができるが、さもなければ、プラズマフェレシスまたは固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡもしくはＰｒｏｔｅｉｎ ＧなどのＩｇＧ特異的吸着剤による吸着クロマトグラフィーなどの標準法を使用して、ＩｇＧ画分をこの血清から分離することができる。あるいは、モノクローナル抗体を調製することができ、場合によって、抗原結合断片または組換え結合タンパク質を、そのようなｍＡｂｓから誘導することができる。そのようなＭＡｂまたはその断片を、場合によって、それぞれ公知技術の方法またはその簡単な変更法によって、ヒト化またはイヌ化することができる。
【００９１】
本明細書で使用する“エピトープ特異的な”イヌＴＳＬＰ抗体は、イヌＴＳＬＰの断片に対して産生される抗体であって、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の５つのアミノ酸配列の１つ以上を含むエピトープを含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または２８アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をさらに結合する、イヌＴＳＬＰの断片に対して産生される抗体である。特定の実施形態において、エピトープ特異的なイヌＴＳＬＰ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００９２】
選択的に本発明のイヌＴＳＬＰタンパク質を結合するｍＡｂｓを産生するハイブリドーマは、周知の技法によって生成される。通常、本プロセスは、所望の抗体を産生するＢリンパ球と不死化細胞系の融合を伴う。あるいは、不死化抗体産生細胞系を生成するための非融合法を使用することができる（例えば、ウイルス誘発形質転換（Ｃａｓａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７６（１９８６））。不死化細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が、利便性および入手可能性のために最も多く使用されている。
【００９３】
抗原を注射した哺乳動物から抗体産生リンパ球を得るための技法は周知である。一般的に、ヒト起源の細胞が使用される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用されるが、さもなければ非ヒト哺乳動物の供給源からは、脾臓またはリンパ節細胞が使用される。宿主動物に精製抗原（ヒト細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作する）の反復用量を注射し、動物に所望の抗体産生細胞を産生させたあと、これらを不死化細胞系との融合のために回収する。また、融合のための技法は、当該技術分野で周知であり、一般的に、細胞をポリエチレングリコールなどの融合化剤（ｆｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と混合することを包含する。
【００９４】
ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択などの標準的手法によって選択される。所望の抗体を分泌するこれらは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などの標準のイムノアッセイを使用して選択される。抗体は、標準的タンパク質精製法を使用して媒体から回収される（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））。
【００９５】
多くの利用可能な文献で、上記の技法を適用することにおけるガイダンスを提供している（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２））。モノクローナル抗体も、周知のファージライブラリー系を使用して生成することができる（例えば、Ｈｕｓｅ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）、Ｗａｒｄ，ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照）。
【００９６】
ポリクローナルであるかモノクローナルであるにせよ、このように生成された抗体は、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってイヌＴＳＬＰタンパク質を精製するための周知の方法によって固体支持体に結合した固定化型で、使用することができる。
【００９７】
イヌＴＳＬＰタンパク質に対する抗体も、イヌＴＳＬＰタンパク質を検出または定量化するイムノアッセイの基礎として、標識されないかまたは標準法によって標識されて使用することができる。使用される特定の標識は、イムノアッセイのタイプによって決まる。使用することができる標識の例は、放射標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルならびにウンベリフェロン）、化学発光物質（例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルアジンジオン）および酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）含むが、これに限定されるものではない。
【００９８】
抗体は、公知の方法によるそのような標識でタグをつけることができる。例えば、カップリング剤（例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンチジンなど）は、蛍光、化学発光または酵素標識で抗体にタグをつけるために使用することができる。関係する一般的な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ （Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，米国フロリダ州オーランドに記載されている。そのようなイムノアッセイは、例えば、受容体の精製中に得られる画分に対して行うことができる。
【００９９】
また、本発明の抗体は、発現クローニング系においてイヌＴＳＬＰタンパク質を発現している特定のｃＤＮＡクローンを同定するために使用することができる。受容体のリガンド結合部位に特異的な中和抗体も、イヌＴＳＬＰタンパク質の機能を遮断または下方制御するためのアンタゴニスト（阻害剤）として使用することができる。そのような中和抗体を、慣用実験によって容易に同定することができる。
【０１００】
イヌＴＳＬＰタンパク質活性の拮抗作用は、完全な抗体分子または周知の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片）を使用して達成することができる。そのような断片の定義は、上記または例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）、Ｐａｒｈａｍ，Ｃｈａｐｔｅｒ
１４，ｉｎ Ｗｅｉｒ，ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）で見い出すことができる。また、抗体断片の使用および生成も記載されている（例えば、Ｆａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号）および抗体半分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号））。公知の抗体の重および軽鎖可変領域配列に基づき組換えＦｖ断片を作製するための方法は、さらに、例えばＭｏｏｒｅら、（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）］によって記載されている。あるいは、これらを標準法によって化学的に合成することができる。
【０１０１】
また本発明は、抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）を含み、これらは抗原として上記の抗体を使用して生成される。これらの抗体は、リガンドの構造を模倣し得るので有用である。
【０１０２】
非イヌの哺乳動物または非イヌのハイブリドーマ系から生成される抗体は、場合によって、イヌに注射する際、実質的にこれらを非抗原性にするよう操作することができる（すなわち、これらをイヌ化することができる）。ヒトへの治療的投与のために免疫原性をより低くするために動物由来のモノクローナル抗体を変更するプロセス（ヒト化）は、積極的に追及されており、多くの出版物に記載されている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，Ｌ．ら、“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８））。あるいは、非イヌの哺乳動物由来のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）を、イヌの抗体またはその配列とキメラ化して、標準のネズミのモノクローナル抗体より免疫原性の低いレシピエント宿主に見られる抗体を獲得する。例えば、米国特許第５，５９３，８６１号“Ｄｏｇ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（参考として本明細書で援用される）を参照。
【０１０３】
さらにＷａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，（Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３１６０（１９７７））は、イヌのＩｇＭおよびイヌのＩｇＡ重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。これらの研究者は、イヌのＩｇＡ由来のκ軽鎖のアミノ酸配列を決定した（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１５：３０３（１９７８））。ＭｃＣｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１６：５６５（１９７９）は、イヌのμ鎖の完全なアミノ酸配列を開示している。Ｔａｎｇら、（Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８０：２５９ （２００１））は、１つのイヌのＩｇＧ−Ａγ鎖ｃＤＮＡおよび４つのイヌのＩｇＧ−Ａγ鎖タンパク質配列を開示している。上記のＴａｎｇら、は、さらに、ヒト、マウス、ブタおよびウシＩｇＧの保存領域からデザインされた縮重オリゴヌクレオチドプライマーによるイヌの脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅について述べている。さらに、Ｋｒａｈら、（２００４年９月１６日に発行された米国公開第２００４０１８１０３９号、参考として本明細書で援用される）は、非イヌ抗体をイヌ化するための１つのプロセスに関して詳細に述べている。
【０１０４】
イヌＴＳＬＰ遺伝子の単離
Ａ．最初の試み
イヌＴＳＬＰを同定するための最初の試みは、ＢＬＡＴ（公共ゲノムデータベースＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）から組み立てられたラット、チンパンジーおよびアカゲザルＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列によるクローン化ヒトおよびマウスＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列の配列アラインメントに基づいていた。チンパンジーＴＳＬＰは、アミノ酸レベルでヒトＴＳＬＰと１００％同一であるが、アカゲザルＴＳＬＰでは、成熟タンパク質においてヒトＴＳＬＰと９０％以上（１２／１５１の残基が異なる）の相同性を有する。しかし、ヒトおよびヒト以外の霊長類のＴＳＬＰタンパク質およびｃＤＮＡ配列は、ネズミＴＳＬＰ配列と非常に異なる。ヒトおよびマウスＴＳＬＰ ｃＤＮＡ配列は、相同性がわずかに４３％であるので、これらの種間における低いストリンジェンシーの異種間ハイブリッド形成によるクローン化はできない。さらに、ラットＴＳＬＰ配列は、マウスＴＳＬＰと比較して、成熟タンパク質のアミノ酸残基配列に３９／１２１の変化を示し、このことは、近縁種のネズミ種間でさえ、ＴＳＬＰ配列が著しく異なっていることを示している。
【０１０５】
あいにく、本明細書で開示したように、イヌＴＳＬＰ配列も、すべての全く異なるネズミおよび同様な霊長類の配列と異なることが判明した。したがって、低いストリンジェンシーの異種間ハイブリッド形成によりイヌＴＳＬＰを得ることは成功しないことが判明した。実際に、ヒト、マウス、ラットおよびサルの配列情報を使用してネスト化ＰＣＲ法でイヌＴＳＬＰ相同分子種をクローン化する試みにおいてデザインされたプライマーは、イヌＴＳＬＰに対応した単一バンドさえ同定することに失敗した。
【０１０６】
Ｂ．イヌＴＳＬＰ遺伝子の単離の成功
次に、利用可能な、ヒトＴＳＬＰ配列を用いて組み立てられたイヌゲノムデータベース（全体のゲノムショットガン配列決定に由来する。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚによって一般的に公開されている）により、イヌＴＳＬＰのエキソン１および４の部分的な同定に至った。簡単に述べると、重要な配列相同性のいくつかのヒットが、この最初の検索で同定された（下記の“ヒット”１〜６を参照）。これらの配列は、集められ、イヌＴＳＬＰ遺伝子の部分的な電子配列を拡張および組み立てるための検索配列（ｑｕｅｒｙ）として使用した。
【０１０７】
【化３−１】
【０１０８】
【化３−２】
【０１０９】
【化３−３】
この電子的に組み立てた配列のヒト、サル、ラットおよびマウスＴＳＬＰとの比較では、ＴＳＬＰのイヌの相同分子種の一部としての、この配列の同定につながる、保存されたイントロン／エキソン境界および実質的な配列同一性が証明された。続いて、ＰＣＲプライマーを、この発見に基づいてデザインし、この遺伝子の欠損したセグメントを増幅するために使用した。２つの部分的に重複するクローンが、二重ネスト化ＰＣＲによって、イヌの活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ｃＤＮＡライブラリーから得られた。完全なイヌＴＳＬＰ ｃＤＮＡを、ネスト化ＰＣＲによって明らかにする試み、または５’もしくは３’末端へ配列を拡張しようとする更なる試みは、成功しなかった。しかし、このライブラリーからの人力による自然のＤＮＡ配列の組み立てと合わせて、イヌの全体のゲノムショットガン配列データ（Ｉｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に対して、これらのクローンから拡張した配列の情報を使用して、データベース検索を反復して行うことで、完全長イヌＴＳＬＰ ｃＤＮＡの電子的組み立てにつながった。次に、このｃＤＮＡ配列の物理的クローンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した。
【０１１０】
結論として、現行および最高水準の技法である分子クローニング法を用いて、ヒト、マウス、ラットまたはサルの配列から、直接、イヌのＴＳＬＰ配列を誘導することはできなかった。分子ＰＣＲクローン法と合わせて、ゲノムデータベース上のイントロン／エキソン境界アサインメントおよび配列同一性を用いて、組み立てられたヒト、マウス、ラットおよびＮＨＰ ＴＳＬＰ遺伝子を使用した複雑なデータベースの反復的検索だけが、イヌＴＳＬＰをコードする遺伝子の同定につながった。
【０１１１】
イヌのＴＳＬＰは、一旦得られると、成熟ヒトＴＳＬＰタンパク質のアミノ酸配列と比較して５８／１３２の変化（６１％の同一性）を示し、成熟マウスＴＳＬＰタンパク質のアミノ酸配列と比較して８３／１２９の変化（３３％の同一性）を示した（下記参照）。
【０１１２】
Ｃａｎｉｓ ｆｉａｍｉｌｉａｒｉｓとヒトのＴＳＬＰ成熟タンパク質の配列比較
【０１１３】
【化４】
Ｃａｎｉｓ ｆｉａｍｉｌｉａｒｉｓとマウスのＴＳＬＰ成熟タンパク質の配列比較
【０１１４】
【化５】
したがって、前述の困難を克服することによって、本発明は、ここで、イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡ配列およびコードされたイヌＴＳＬＰタンパク質を提供する。イヌＴＳＬＰタンパク質およびあるその断片は、タンパク質上の様々なエピトープ（直鎖および立体配置的エピトープの両方）に対する抗体を産生するための有用な抗原（例えば、免疫原）である。また、イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡは、“裸の”ＤＮＡとしてまたはワクチン接種された動物の細胞内でＴＳＬＰを発現するために適したプラスミドもしくは動物のウイルスベクターの形態にかかわらず、免疫化のためおよび／または研究試薬としてのＴＳＬＰタンパク質を産生するためのベクターおよび宿主細胞を提供することにおいて、ならびに抗ＴＳＬＰ抗体を産生するためのＤＮＡベースのワクチンを提供することにおいて有用である。
【０１１５】
このように得られたイヌＴＳＬＰ遺伝子配列を、図８Ａ（配列番号１）で図示し、予測される発現ＴＳＬＰタンパク質を、図８Ｂ（配列番号２）に図示する。残基１〜２８は、シグナル配列を表し、残基２９〜１５５は、成熟タンパク質を表す。
【０１１６】
相同ＴＳＬＰタンパク質を同定するためのアッセイ
また本発明は、２８アミノ酸残基のシグナル配列を除き、配列番号２のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＳＬＰタンパク質であって、これらをワクチンとしてイヌに投与すると、配列番号２のアミノ酸配列を含有するイヌＴＳＬＰタンパク質を結合する抗体を産生する、ＴＳＬＰタンパク質を提供する。また、そのようなＴＳＬＰタンパク質の抗原性断片も提供する。
【０１１７】
実際に、推定のＴＳＬＰタンパク質が本発明のＴＳＬＰであることを実証する１つの方法は、そのようなタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰと結合する抗体を産生することができるかどうか試験することである。そのような方法の１つは、推定上のＴＳＬＰ−ＧＳＴ抗原を５〜５００μｇの範囲の様々な用量でイヌに（例えば、注射して）ワクチン接種することである。そのような抗原を、水酸化アルミニウム系アジュバント（例えば、Ｒｅｈｙｄｒｏｇｅｌ）に調合することができる。次に、イヌに、０日目、２１日目および４２日目の３回、筋肉内注射する。血清サンプルを、０日目、２１日目、４２日目および６３日目にワクチン接種したイヌおよび対照（ワクチン接種を受けていない）イヌから収集する。
【０１１８】
抗原でワクチン接種をされたイヌの抗体の誘導は、ＥＬＩＳＡアッセイにより以下のように評価することができる。配列番号２のアミノ酸配列を含むイヌＴＳＬＰタンパク質を、コーティング緩衝液（炭酸水素ナトリウムｐＨ９．０）に５μｇ／ｍｌまで希釈し、９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に１００μｌ／ウェルで分配する。プレートを、４℃で終夜インキュベートする。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴに２％のスキムミルク）２００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で６０分間インキュベートする。次にプレートをＰＲＳＴで３回洗浄する。次に、１：１００で希釈した試験イヌ抗血清１００μｌ／ウェルを、最上列の適切なウェルに加える。次に、血清試料を、適切なプレート位置に１０倍に希釈する。プレートを室温で６０分間インキュベートしたあと、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【０１１９】
次に、ヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と結合し、１：２０，０００に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ１００μｌ／ウェルを、各ウェルに加える。次に、プレートを室温で６０分間インキュベートする。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をすべてのウェルに加える。呈色反応を、室温で１０〜２０分間生じさせたあと、０．１８Ｍ硫酸５０μｌ／ウェルを加えることによって停止させる。
【０１２０】
すべてのウェルの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール）を使用して４５０ｎｍの波長で測定する。推定上のＴＳＬＰ抗原を注射したイヌから得た血清試料は、検出可能であると考慮されるので、アッセイが免疫化前にイヌから得られた血清試料によって生じるバックグラウンドより３倍以上のＯ．Ｄ．値を示す際、抗原は本発明のＴＳＬＰタンパク質と同定される。同様に、ＴＳＬＰ抗原に関する相対的抗体価は、抗原による免疫化の前にイヌから得られた血清試料によって生じるバックグラウンドより３倍以上のＯ．Ｄ．値を示す最も高い血清希釈に基づいて測定される。
【０１２１】
イヌＴＳＬＰタンパク質の特異的なエピトープに対する抗体
抗体は、自然発生の形態、および組換えの形態における、種、多型または対立遺伝子変異体、およびその断片を含むイヌＴＳＬＰタンパク質の様々なエピトープに対して産生し得る。さらに、抗体は、自然のまたは変性された異変体を含む、活性化形態または不活性化形態のいずれかにおける、イヌＴＳＬＰに対して産生し得る。抗イディオタイプ抗体も、企図される。
【０１２２】
抗原の所定の断片に対する抗体（結合断片および単鎖の異変体を含む）は、当該技術分野で標準のアジュバントおよび／または免疫原タンパク質への結合と共に、イヌＴＳＬＰおよび／またはその断片による動物の免疫化によって産生し得る。こうして免疫化される動物は、イヌＴＳＬＰの活性を下方制御するために免疫化されるイヌであり得る。
【０１２３】
適切な宿主（例えば、Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスの近交系）を、典型的に標準のアジュバントおよび標準のマウスの免疫化プロトコールを使用して（上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｉｄ．を参照）、選択されたタンパク質により免疫化する。アジュバントを、ワクチン投与の前、と併せて、または後に標的の動物に投与することができる。
【０１２４】
あるいは、本明細書に開示の配列から誘導され、担体タンパク質に結合した合成ペプチドを免疫原として使用することができる。ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定される免疫原による固相イムノアッセイ）において免疫原タンパク質に対して力価検定（ｔｉｔｒａｔｅ）する。１×１０４以上の力価のポリクローナル抗血清を選択し、例えば、上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｉｄ．（５７０〜５７３ページ）に記載のような競合結合イムノアッセイを使用して、他のＩＬ−７ファミリーメンバー（例えば、ネズミＩＬ−７）に対するこれらの交差反応性に関して試験する。好ましくは少なくとも１つの他のＩＬ−７ファミリーメンバーを、例えば、霊長類ＩＬ−７と併せて、この測定に使用する。ＩＬ−７ファミリーメンバーを、組換えタンパク質として生成し、本明細書に記載のような標準の分子生物学およびタンパク質化学の技法を使用して単離する。
【０１２５】
競合結合形式のイムノアッセイを、交差反応性の測定に使用することができる。例えば、配列番号２のタンパク質を、固体支持体に固定できる。アッセイに加えられるタンパク質は、固定化抗原への抗血清の結合と競合する。固定化タンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタンパク質の能力を、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と比較する。上記のタンパク質のパーセント交差反応性を、標準の算出法を使用して算出する。上記で列挙された各タンパク質と１０％未満の交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次に交差反応性抗体を、上記で列挙したタンパク質による免疫吸着法によってプールした抗血清から取り出す。
【０１２６】
次に、免疫吸着およびプールした抗血清を、上記のような競合結合イムノアッセイにおいて使用し、２番目のタンパク質と免疫原タンパク質（例えば、配列番号２のＩＬ−７様タンパク質）を比較する。この比較を行うために、２種のタンパク質を、広範囲の濃度でそれぞれ測定し、固定タンパク質への抗血清の結合を５０％阻害するために必要な各タンパク質の量を決定する。必要とされる２番目のタンパク質の量が、選択されたタンパク質または必要とされるタンパク質のタンパク質量の２倍未満である場合、その時、２番目のタンパク質は、免疫原に対して惹起された抗体に特異的に結合すると言われる。
【０１２７】
また、本発明の抗体は、診断的適用に有用であり得る。捕捉抗体または非中和抗体として、これらを、受容体への結合を阻害することなしに、抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。中和抗体として、これらは競合結合アッセイで有用であり得る。また、これらは、イヌＴＳＬＰタンパク質またはその受容体を検出するかまたは定量化する際に有用である。（例えば、Ｃｈａｎ（ｅｄ．１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．；Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ（ｅｄｓ．１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．およびＮｇｏ（ｅｄ．１９８８）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照）。交差吸収、除去または他の手段は、明確な選択のための（例えば、固有または共有の種特異性）の調整を提供する。これらは、抗原の様々な群を同定する試験の基礎であり得る。
【０１２８】
さらに、本発明の抗原結合断片を含む抗体は、抗原に結合し、機能的結合（例えば、生物反応を誘発し得る受容体への結合）を阻害する強力なアンタゴニストであり得る。さらに、これらの抗体は、薬物または他の治療的薬剤に、直接またはリンカーによって間接的に結合することができ、薬物ターゲティングを行うことができる。
【０１２９】
本明細書に開示の配列から誘導され、担体タンパク質に結合した合成ペプチドを免疫原として使用することができる。どんな場合でも、抗原性断片は、他の物質、特に、ポリペプチドに（免疫原として使用される融合または共有結合したポリペプチドとして）結合し得る。抗原およびその断片は、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイドなどの様々な免疫原に融合または共有結合し得る。ポリクローナル抗血清の調製法の説明について、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ，１９６９、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，を参照。
【０１３０】
場合によっては、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどの様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。そのようなモノクローナル抗体の調製法についての説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．），Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，および本書で引用される参考文献；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；および特にＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（ここではモノクローナル抗体を生成するある方法について記載している）に見い出すことができる。
【０１３１】
他の適切な技法は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの曝露、または、代わりにファージまたは同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を伴う。（Ｈｕｓｅら、（１９８９）“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，“Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１およびＷａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６を参照）。キメラ、イヌ化および／または、ヒト化抗体を含む、本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変の有無にかかわらず使用することができる。
【０１３２】
しばしば、本発明のポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを示す物質を結合することによって標識される。そのような結合は、共有結合または非共有結合のいずれかで達成することができる。多種多様な標識および結合法は、公知であり、科学および特許文献において広範囲に報告される。適切な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などを含む。そのような標識の使用を教示している特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号を含む。また、組換えまたはキメラ免疫グロブリンを生成することができる、Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｏｒｅ，ら、米国特許第４，６４２，３３４号；およびＱｕｅｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照、またはトランスジェニックマウスにおいて作製することができるＭｅｎｄｅｚら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６を参照。これらの参考文献は、参考として本明細書で援用される。
【０１３３】
また本発明の抗体を、タンパク質を単離する際に、アフィニティークロマトグラフィーに使用することができる。抗体が固体支持体に結合している場合に、カラムを調製することができる（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら、（１９８４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：３−５５）を参照）。あるいは、固体支持体に結合した抗体を、対応する抗体を精製するために使用することができる。
【０１３４】
また、各イヌＴＳＬＰに対して産生される抗体は、抗イディオタイプ抗体を産生するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連した様々な免疫学的状態を検出または診断する際に有用である。
【０１３５】
ＲＮＡ阻害
イヌＴＳＬＰを産生する細胞内でのイヌＴＳＬＰをコードするＲＮＡとの干渉は、ＴＳＬＰの生物活性を阻害し、その結果として、アトピー性皮膚炎などの多くのＴＳＬＰ関連の障害を治療する更なる手法である。このために、化学的に合成されるか、または適切な送達ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）内でクローン化される二重鎖ＲＮＡ分子を、ＴＳＬＰをコードする内因性ｍＲＮＡ濃度を減少させる目的で、能動的にＴＳＬＰ ｍＲＮＡを産生する細胞内に導入することができる。これらＲＮＡ分子の挿入後（所望の細胞へのプラスミドまたはウイルスベクターの挿入後の、外部から送達された分子またはＲＮＡの転写の場合）、これらは、短いヌクレオチド断片（ｓｉＲＮＡと呼ばれる）へのリボヌクレアーゼＩＩＩ型タンパク質の開裂活性を通して処理される。次に、これらｓｉＲＮＡ断片は、ＲＮＡヘリカーゼの活性化によるｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しの結果として活性化されるＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるヌクレアーゼ含有多タンパク質複合体に組み込まれる。ここで、一本鎖ｓｉＲＮＡ鎖が、ＲＩＳＣ複合体をその標的のｍＲＮＡへ導いたあと、ＲＩＳＣのエンドヌクレアーゼの活性によって切断され、続いて分解される。
【０１３６】
より具体的には、ＴＳＬＰ遺伝子またはその断片を含有するプラスミドを、多くの市販の真核生物プラスミドのいずれか１つにおいてクローン化し、ここではＴＳＬＰ遺伝子またはその断片の転写が、適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）によって引き起こされる。次に、精製したプラスミドＤＮＡ（１〜１００ｕｇ）を、皮膚病変、またはアトピー性皮膚炎の特性を示す皮膚病変の周囲に注射する。次に、プラスミドＤＮＡの注射を、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡの顕著な減少を引き起こすために必要な頻度で繰り返すことができる。この減少を、患部から皮膚生検を得ることと、定量的ＰＣＲなどの方法によってＴＳＬＰ ｍＲＮＡの濃度を測定することとによって評価することができる。
【０１３７】
本発明の以下の調製例は、本発明の更なる理解を提供するために役立つものであるが、いかなる方法であれ、本発明の実効的範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１）
イヌＴＳＬＰ ＤＮＡおよびタンパク質配列
イヌＴＳＬＰを発現するイヌ遺伝子を、電子データベースでのデータマイニングおよび上記で詳述したような分子生物学方法を使用した反復的なプロセスによって同定した。
【０１３９】
結果
イヌのＴＳＬＰ遺伝子配列を、図８Ａ（配列番号１）に図示し、ＴＳＬＰタンパク質を発現する予測タンパク質を、図８Ｂ（配列番号２）に図示する。星印によって示される図８Ｂの残基１〜２８（配列番号２）は、シグナル配列を表し、残基２９〜１５５は、成熟タンパク質を表す。
【０１４０】
（実施例２）
イヌＴＳＬＰのクローニングおよび発現
イヌＴＳＬＰをコードするＤＮＡを、本明細書に記載のように同定し、ドナーベクターの当該技術分野標準法ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）にクローン化した。遺伝子の組み立ておよびドナーベクターへのクローニングを、ＤＮＡ２．０と呼ばれる受託臨床試験実施機関で実施し、この結果、同定したゲノムイヌＴＳＬＰ遺伝子を含有するｐＤＯＮＲ２２１．Ｇ０３２７６と呼ばれるプラスミドを構築した。成熟した（すなわち、シグナル配列なしで）イヌＴＳＬＰタンパク質をコードするＤＮＡを、それぞれＮｃｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖ部位を含有する２種のプライマーを使用してｐＤＯＮＲ２２１．Ｇ０３２７６からＰＣＲで増幅した。
【０１４１】
【化６】
Ｎｃｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖの消化後、ＰＣＲ生成物を、ベクターｐＩＶＥＸ １．３ ＷＧ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃３７２８８０３）のＮｃｏ ＩおよびＳｍａ Ｉ部位に挿入した。これにより、Ｃ末端で６つのＨｉｓ残基（“Ｈｉｓ６タグ”）と融合した成熟イヌＴＳＬＰをコードする遺伝子を含有するプラスミドを生じた。挿入物の正しい配列を含有するプラスミドを、プラスミド１２６５−９３．Ｄと名づけた。プラスミド１２６５−９３．Ｄを使用して、製造者の推奨に従って（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ＃３０６４８５９）、ＲＴＳ Ｐｒｏｔｅｏｍａｓｔｅｒ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでＴＳＬＰを発現させた。図１に示すように、＠１６ｋＤａのバンドがレーン２および４で明らかだった（矢印）。ウエスタンブロット試験（図２Ａおよび２Ｂ）では、このバンドが、抗Ｈｉｓタグ抗体（図２Ａ）およびヒトＴＳＬＰに特異的なラットモノクローナル抗体（図２Ｂ）と特異的に反応することを示している。
【０１４２】
（実施例３）
宿主細胞からのイヌＴＳＬＰの生成
大腸菌で組換えＴＳＬＰタンパク質を発現させるために、ｃＴＳＬＰをコードするヌクレオチド配列（すなわち、シグナル配列をコードするＴＳＬＰを欠いているヌクレオチド）を、それぞれＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーと共に、テンプレートとしてプラスミド１２６５−６６Ｃを使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０１４３】
【化７】
Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ消化後、ＰＣＲ生成物をｐＥＴ４２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入した。このプロセスにより、Ｎ末端でＧＳＴタグおよびＣ末端で６×Ｈｉｓタグと融合した成熟ｃＴＳＬＰをコードするプラスミドを生成した。挿入物の正しい配列を含有するプラスミドを、１２６５−９３Ｂと名づけた。ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓ融合タンパクの発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳにおいて実施した。プラスミド１２６５−９３Ｂを担持する大腸菌細胞を、３０℃でＯ．Ｄ．６００＝０．６まで培養したあと、タンパク質の発現を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに３０℃で２時間インキュベートすることによって誘発した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、可溶性大腸菌画分内に存在する正しい大きさ（約６１ｋＤａ）のタンパク質バンド（矢印）を示している（図３Ａ）。ウエスタンブロットは、発現したタンパク質が抗ＧＳＴ抗体と反応することを示している（図３Ｄ）。ＧＳＴ−ＴＳＬＰ−Ｈｉｓタンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂によって精製することができる（図３Ｂ）。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂による更なる精製後、大部分のＧＳＴ―ＴＳＬＰタンパク質が、カラムのフロースルー中に含有された（図３Ｃ）。
【０１４４】
（実施例４）
イヌＴＳＬＰの免疫蛍光検出
イヌの皮膚および扁桃組織におけるイヌＴＳＬＰタンパク質の発現を、ヒトＴＳＬＰタンパク質に対して産生されるウサギポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学検査（「ＩＨＣ」）によって測定した。免疫組織化学検査は、生理食塩水を注射した正常なイヌの皮膚、および様々な皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、多形性紅斑および接合部型表皮水疱症など）と診断されたイヌの皮膚から得られたパラフィン包埋組織に対して実施した。さらに、ＴＳＬＰタンパク質の発現を、２匹のイヌから得られた凍結扁桃組織において測定した。ＩＨＣによりＴＳＬＰ発現を測定する手順は以下の通りである。
【０１４５】
Ｉ．切片の調製
１．皮膚試料を埋め込まれたパラフィンブロックを、５〜７ミクロンの厚さに切断し、接着を促進するためにポリ−Ｌ−リジンで処理したスライドにのせた。
【０１４６】
２．切片を、キシレンで脱パラフィンし、連続的にエタノール溶液で再水和した。
【０１４７】
３．抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、クエン酸塩緩衝液（０．５ｍｌ／リットルの濃度でＴｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウムを、約９９〜１００℃に達するまで研究室マイクロ波を使用して、２５分間）において実施した。これは、パラフィン包埋プロセスの間マスクされる、組織切片の抗原性を回復するプロセスである。
【０１４８】
ＩＩ．免疫染色
１．切片を、抗体の非特異的結合を減少させるために、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に希釈した１０％通常のロバ血清中で１時間インキュベートした。
【０１４９】
２．過剰な血清を、静かに除去し、切片をＰＢＳに希釈した（１：１００）ウサギの抗体で覆い、湿潤チャンバーにおいて室温で１時間または４℃で終夜インキュベートした。
【０１５０】
３．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５１】
４．過剰なＰＢＳを、静かに除去し、切片を、湿潤チャンバーにおいて室温でＰＢＳに１：５０００で希釈したビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体で３０分間覆った。
【０１５２】
５．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５３】
６．過剰なＰＢＳを除去し、切片を、５マイクログラム／ｍｌの濃度で、ストレプトアビジン−フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ）結合体／ＰＢＳ中で、室温で３０分間インキュベートした。
【０１５４】
７．次に、切片を、ＰＢＳ中で穏やかに振盪させながら、５分間、２回すすいだ。
【０１５５】
８．次に、切片を、ヘモトキシリンで２〜３分間、対比染色した。
【０１５６】
９．次に、切片を蛍光顕微鏡で検査した。
【０１５７】
１０．適切な画像を撮影した。
【０１５８】
１１．実験対照は、一次抗ＴＳＬＰ抗体の除去または一次抗ＴＳＬＰ抗体と通常のウサギ抗体との交換を含んだ。
【０１５９】
下記の表１では、ＩＨＣ試験の結果を要約する。
【０１６０】
【表１】
ＴＳＬＰの発現が、ＡＤと診断されたイヌ由来の皮膚組織の８０％で検出されたが、生理食塩水を注射した正常皮膚組織ではわずか２０％で検出された。またＴＳＬＰは、多形性紅斑のイヌおよび遺伝的皮膚疾患（接合部型表皮水疱症）のイヌ由来の組織のそれぞれ６６％および１００％で検出された。皮膚エリテマトーデスのイヌ由来の皮膚組織においてＴＳＬＰタンパク質の発現は認められなかった。パラフィン包埋皮膚組織において、ＴＳＬＰの発現は、汗腺において検出された。冷凍されたイヌの扁桃組織のＴＳＬＰの発現は、重層扁平上皮および付随する唾液腺において検出された。イヌ皮膚試料の陽性ＩＨＣ染色の例を図４に示す。ここでは、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌ由来のパラフィン包埋皮膚組織試料を示す。
【０１６１】
（実施例６）
イヌＴＳＬＰの免疫ペルオキシダーゼ検出
また、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌの皮膚から調製されたパラフィン包埋組織ブロックにおけるイヌＴＳＬＰタンパク質の発現を、検出法として免疫組織化学検査を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色によって測定した。この方法においては、ヒトＴＳＬＰタンパク質に対して惹起されたエピトープ特異的ラットモノクローナル抗体を、一次抗体として使用した。免疫ペルオキシダーゼ染色によってＴＳＬＰ発現を測定するための手順は、以下の通りであった。
【０１６２】
特殊試薬
通常の新生子ウシ血清：＃Ｎ−４７６２ Ｓｉｇｍａ
パラフィン包埋皮膚組織
一次抗体：ラット抗ヒトＴＳＬＰ ｍＡｂラットＩｇＧ２ａ
二次抗体：ラビット抗ラットＩｇＧ（ビオチン化）：ＢＡ−４０００ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム
検出試薬：ストレプトアビジン−ＨＲＰ：＃４３−８３２３ Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ
ＡＥＣ基質キット：Ｂｉｏｇｅｎｅｘ ＃ＨＫ１２９−５Ｋ、米国カリフォルニア州サンラモン
１．切片試料４〜６ｕｍ。
２．空気乾燥１０分、室温。
３．アセトン中で１０分固定。
４．ＰＢＳ（０．０１リン酸緩衝生理食塩水）中で３分すすぐ。
５．０．１％アジ化ナトリウムを含む０．３％過酸化水素中での７〜１０分間のインキュベーションによってクエンチする。
６．ＰＢＳ中で５分すすぐ。
７．湿室において切片を１％通常の新生子ウシ血清で２０分ブロックする。
８．スライドを排水し、室温で、１：１００の希釈で一次抗体を２時間加える。
９．５分すすぐ。
１０．湿室において室温で二次抗体（ラビット抗ラットＩｇＧ＠１：４００）を３０分加える。
１１．５分すすぐ。
１２．排水し、室温で検出試薬（ストレプトアビジン−ＨＲＰ＠１：４００）を３０分間加える。
１３．２×５分すすぐ。
１４．ＡＥＣを２．５分加える。所望の染色強度およびバックグラウンドに従って調整する。
１５．ヘマトキシリンで対比染色し、マウントする。
【０１６３】
ＡＤのイヌ由来のイヌ皮膚組織のセットを、エピトープ特異的イヌＴＳＬＰ抗体を使用したＩＨＣによって試験した。図５に示した結果は、この抗体がヒトＴＳＬＰと抗原エピトープを共有する分子と反応することを示している。イヌのＡＤ皮膚試料の染色は、表皮が肥厚している慢性炎症の部位で強かった。このパターンは、ヒトのＡＤ皮膚病変でのＴＳＬＰ発現位置について知られることと一致しており、さらにイヌの皮膚ＡＤ病変で認められる分子がイヌＴＳＬＰであることを示唆するものである。ＰＢＳ、または異なるタンパク質（リンパ球タンパク質）に特異的な異なるラットモノクローナル抗体のいずれかで観察された染色は見られなかった。
【０１６４】
（実施例７）
イヌＴＳＬＰのエピトープマッピング
ＴＳＬＰ活性を中和することができるワクチンへの包含に有用であるイヌＴＳＬＰ上のエピトープを同定するために、イヌＴＳＬＰタンパク質配列に基づいた重複ペプチドのセットを合成し、中和する抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体と反応するこれらの能力について試験した。この目的のために、それぞれが１５アミノ酸長で、２アミノ酸ずつずれた重複ペプチドを、ＭＩＭＯＴＯＰＥＳ（米国ミネソタ州ミネアポリス）においてピン上に合成した。これらペプチドの配列を表２に列挙する。ペプチド１〜５７を、構成ＮＨ２−ＰＥＰＴＩＤＥ−ＰＩＮで、アミド化された末端で合成した。ペプチド５８〜９４（親ペプチド１〜３７の複製）を、構成ＡＣＥＴＹＬ−ＰＥＰＴＩＤＥ−ＰＩＮで、アセチル化された末端で作製した。
【０１６５】
表２に列挙されるペプチドを担持するピンを、製造業者（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）の推奨の手順に従って、ＥＬＩＳＡアッセイ形式で試験した。図６に示すように、アミノ酸配列
【０１６６】
【化８】
（配列番号３２）のペプチド＃２５（エピトープ２５）は、ＰＡＢ１００モノクローナル抗体に対して最も反応性が高かった。このペプチド配列と、対応する推定上のヒトＴＳＬＰペプチド配列との比較を図７に示す。
【０１６７】
【表２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載の実施形態に加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような変更が、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。
【０１６８】
さらに、核酸またはポリペプチドに対して示されたすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されるものであることが理解される。
【０１６９】
様々な出版物が本明細書に引用されているが、全体として、この開示を参考することにより本明細書に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−４８６３７（Ｐ２０１３−４８６３７Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２６２３２９（Ｐ２０１２−２６２３２９）
【出願日】平成２４年１１月３０日（２０１２．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５４１３４９（Ｐ２００９−５４１３４９）の分割
【原出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（５０３４４２０９７）シェーリング−プラウ・リミテッド (47)
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｙｓｔｒａｓｓｅ２０，Ｌｕｃｅｒｎｅ６，ＣＨ−６０００，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２６２３２９（Ｐ２０１２−２６２３２９）
【出願日】平成２４年１１月３０日（２０１２．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５４１３４９（Ｐ２００９−５４１３４９）の分割
【原出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（５０３４４２０９７）シェーリング−プラウ・リミテッド (47)
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｙｓｔｒａｓｓｅ２０，Ｌｕｃｅｒｎｅ６，ＣＨ−６０００，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
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