サイレージ調製用乳酸菌製剤
【構成】 構成乳酸菌としてラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピシーズ・サリバリウス及びラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスの少なくとも１種を含むサイレージ調製用乳酸菌製剤。
【効果】 従来のサイレージ調製用乳酸菌にくらべて極めて短時間で増殖しサイレージのｐＨを下げることができる。従って酪酸菌の増殖を抑え良質のサイレージを調製でき、しかも比較的高温環境下でも有効に作用する。
【効果】 従来のサイレージ調製用乳酸菌にくらべて極めて短時間で増殖しサイレージのｐＨを下げることができる。従って酪酸菌の増殖を抑え良質のサイレージを調製でき、しかも比較的高温環境下でも有効に作用する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、牧草、飼料作物のサイレージ調製用新規乳酸菌製剤に関する。更に詳しくは、ラクトバチルス属細菌からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイレージとは牧草、飼料作物を嫌気的条件下で乳酸発酵させたもので、牧草、飼料作物の貯蔵のために利用されている。良質のサイレージを調製する上で重要なことは、好気発酵を抑制すること及び酪酸発酵を阻止することである。前者を達成するには、サイレージ原料をサイロに詰めたとき早期に嫌気状態にすればよく、これはサイロの密封を素早く完全に行うことによってある程度解決できる。後者の酪酸発酵の抑制は、酪酸発酵菌の増殖を抑制することによって行うことができる。酪酸菌はサイレージのｐＨが４．２以下ではその活動が抑制されることから、サイレージの乳酸発酵が速やかに進行しその生産する乳酸によってｐＨが速やかに下がることが重要である。サイレージの乳酸発酵に与る乳酸菌としては、トウモロコシサイレージから単離された例としてラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）などのラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）やストレプトコッカス・ボビス（Storeptococcus bovis）などのストレプトコッカス属細菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属細菌、ペディオコッカス(Pediococcus) 属細菌などが知られている（ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology)第６０巻、８３−９２頁、１９８６年）。これらの中でも、乳酸菌発酵を優勢にし良質のサイレージを調製するには、乳酸菌はホモ型発酵菌であることが好ましい。従来、酪酸菌をはじめ、カビ、酵母など良質サイレージ調製に好ましくない菌の増殖を阻止し、速やかに効率のよい乳酸発酵を促すために、サイレージ調製時に種々の乳酸菌を添加することが行われている。例えば、特開平1-211487号公報にはラクトバチルス・カゼイの添加が、特公平1-18716号公報にはラクトバチルス・プランタルム類縁菌が、特公平3-34909号公報にはラクトバチルス・キシローサス（Lactobacillus xylosus）が、それぞれサイレージ調製用乳酸菌として開示されている。また、ラクトバチルス属菌としては、特開平2-257875号、特開平3-285674号および特開平3-285675号公報にも開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの乳酸菌を使用しても、原料草の状態やサイロの密封状態などによっては他の微生物を抑えられず必ずしも良質なサイレージ調製がなされていない場合があり、もっと強力でより速やかに増殖しｐＨを急速に下げるサイレージ調製用乳酸菌が望まれていた。また、九州地方など夏場気温の高い酪農地帯では現在の乳酸菌製剤ではその作用が十分発揮されない場合もあり、高温でも活性を維持している乳酸菌の添加が望まれている。本発明は、従来の乳酸菌よりも非常に短時間で増殖し、しかも比較的高温環境下でも有効に働くサイレージ用乳酸菌を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の問題点を克服するべく鋭意研究を行った結果、ラクトバチルス属桿菌でホモ型乳酸発酵を行う細菌の中でも発酵乳などに含まれているラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、消化管中などに見いだされるラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）および発酵乳などに見いだされるラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）の添加によって意外にも上記の目的が達成されることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば、ラクトバチルス属のホモ型乳酸発酵桿菌であるラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei sub-sp. rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）及びラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii sub-sp. lactis) の少なくとも１種からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤が提供される。本発明では、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノサス、ラクトバチルス・サリバリウスは各々単独で使用してもよいし、併用してもよい。本発明で使用できるラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスの菌株については特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2300株（微工研菌寄第１３２４５号）が挙げられる。また、本発明で使用できるラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスの菌株についても特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2670株（微工研菌寄第１３２４７号）が挙げられる。また、本発明で使用できるラクトバチルス・デルブロッキー・サブスペシーズ・ラクチスの菌株についても特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2664株（微工研菌寄第１３２４６号）が挙げられる。これらの菌株は、発酵乳及び乳児糞便から単離されたものであって、いずれも次の形態的性状を示す。
(1) 巾０．５〜１．１μm 、長さ２〜７μm の桿菌(2) グラム染色性；陽性(3) 芽胞の形成；なし(4) 運 動 性；なし(5) 好気性生育能及び嫌気性生育能を有するまた、これらの菌株は、次の培地でよく生育し、ＢＬ寒天培地で３５℃で、３日間嫌気培養するとコロニーを形成する。また、これらの菌株の生理的性質を表１に示す。
【０００５】
【表１】
【０００６】本発明の乳酸菌製剤は次のようにして製造することができる。上記の乳酸菌の培養増殖は、通常の乳酸菌用の培地を用いて行うことができる。培地としては、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＹＰ培地（小崎道雄ら(1992)、乳酸菌実験マニュアル、朝倉書店刊）、ＭＲＳ培地（de Man, J.C. et al.(1960), Journal of Applied Bacteriology, Vol.23, 130-135）や特公平4-49382号公報に記載のルーサン煮汁培地を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常２５〜４５℃で培養することができる。培養時間は増殖スケールによって左右されるが、本発明の乳酸菌は非常に増殖速度が速く、通常１２〜２４時間で定常期に達するので、他の乳酸菌製剤よりも比較的短時間で製造することができる。培養増殖した乳酸菌は、基材とともに凍結乾燥あるいは基材に吸着乾燥して製剤化することができる。凍結乾燥用基材としては、例えば、デキストリン、デンプン、脱脂粉乳や炭酸カルシウムなどが挙げられ、吸着乾燥用基材としてはブドウ糖などの糖類や炭酸カルシウム、ゼオライト、小麦粉、ふすま、脱脂粉乳、ホエー、デンプン、コーングリッツなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。基材の量については特に限定的ではないが、製剤中の菌数が極端に少ないとサイレージ原料草に添加すべき製剤の量が多くなりすぎるし乳酸菌の安定性の面からも好ましくない。通常、製剤１ｇあたり１０7 以上の乳酸菌を含有するようにするのが好ましい。菌数の上限は限定されないが、製造上吸着乾燥では通常１０9 個／ｇ、凍結乾燥では１０11個／ｇくらいである。
【０００７】本発明の乳酸菌製剤は、種々の牧草、飼料作物のサイレージ調製に使用することができる。適用できる牧草、飼料作物の種類は特に限定されないが、オーチャードグラス、チモシー、クローバ、アルファルファ、イタリアンライグラスなどの牧草、トウモロコシ、ソルガムなどの飼料作物、稲わら、麦わらなどの藁類、ビール粕、豆腐粕、酢粕などの食品製造残渣などが挙げられる。本発明の乳酸菌製剤は、これらのサイレージ材料１ｇあたり菌数１０4 〜１０7 個になるように添加する。上述のように製剤１ｇあたり１０7 〜１０11個の乳酸菌を含有するので、材料に添加する場合は上記の添加量になるように加減して材料に散布すればよい。材料に添加する場合は、粉状で、あるいは適当な容量の水に溶解して散布することができる。必要に応じて、セルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素と併用することもできる。
【０００８】
【実施例】
製造例１ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株及びラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株それぞれブリックス リバー ブロス培地（以下、ＢＬＢ培地と略す）に接種し、３５℃で１６時間培養を行った。得られた培養物のそれぞれ０．２ｍｌを２０ｍｌのルーサン煮汁培地（特開昭６４−１０９８１号公報に記載の方法により調製）に接種し、２４時間、３５℃で培養後、更にその全量を２ｌのルーサン煮汁培地に接種し同じ条件で培養した。これに同量の２４％ショ糖溶液を混合後、流動乾燥機（大河原製作所製、ＦＢＳ−５型）でコーングリッツ又は小麦粉に吸着させて乾燥し、各々の乳酸菌製剤を得た。
【０００９】製造例２製造例１で得られる培養物を更に３０ｌのルーサン煮汁培地に接種して培養後、限外ろ過膜（アミコン社製、限外分子量１０万）で３ｌまで濃縮し、同量の２４％ショ糖溶液を混合後、製造例１と同様の方法でコーングリッツ又は小麦粉に吸着乾燥させた。
製造例３製造例１で得られた培養物を特開昭６４−１０９８１号公報記載の方法で乾燥させた。すなわち、製造例１で得られた培養物を流動乾燥機を用い、吸入温度５０℃、排気温度２５〜２８℃で５分間乾燥し、水分６．４％の乾燥粉末を得た。
【００１０】
【実施例１】
培養試験ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株、ラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスSBT-2664株それぞれブリックス リバー ブロス培地（以下、ＢＬＢ培地と略す）に接種し、３５℃で１６時間培養を行った。培養物を特開昭６４−１０９８１号公報に記載の２％ブドウ糖添加ルーサン培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３８℃で１６時間前培養した。得られた培養物を更に２％ブドウ糖添加ルーサン培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３８℃で培養した。接種直後（０時間後）、４、８、１２、１６、２０及び２４時間後に培養試料を採取しｐＨ、酸度、生菌数を測定した。ｐＨは１０℃下でガラス電極ｐＨメーターにより測定した。酸度（％）は各試料９．０ｇを蒸留水で３倍に希釈し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８．０（ｐＨメーターによる確認）に滴定した量から乳酸等量（％）を求めた。生菌数は生理食塩水を希釈液に用い、平板希釈法により測定した。対照として市販のサイレージ添加用乳酸菌スノーラクトＬ（雪印種苗株式会社製）の成分であるラクトバチルス・カゼイSBT-2232株を使用して同様に行った。結果を表２及び図１〜３に示す。これらの結果から明らかなように本発明の乳酸菌はいずれも従来のサイレージ用乳酸菌であるラクトバチルス・カゼイよりも初期の増殖速度が早く、ｐＨの低下及び乳酸の生成が速いことが判明した。
【００１１】
【表２】
【００１２】
【実施例２】
培養試験実施例１と同様の方法で前培養したラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスペシーズ・サリバリウスSBT-2670株、ラクトバチルス・デブロッキー・サブスペシーズ・ラクチスSBT-2664株それぞれを、培養温度を３５℃及び４５℃の２つの条件に設定する以外は実施例１と同様の方法で培養し、８、１６及び３２時間後に培養物試料を採取しｐＨと酸度（％）を測定した。対照として実施例１と同じラクトバチルス・カゼイSBT-2232株を使用した。結果を表３に示す。結果から明らかなように本発明の乳酸菌は４５℃の高温環境下でも菌の活性は高く、従来のラクトバチルス・カゼイよりもｐＨが速やかに低下し乳酸量（酸度）が増加した。
【００１３】
【表３】
【００１４】
【実施例３】
サイレージ添加試験（アルファルファ）
収穫したアルファルファ材料草を軽く予乾し、マウントカッターで１５〜２５ｍｍに切断後、製造例２で製造した乳酸菌製剤をそれぞれ下記の量添加しブドウ糖を０．５５％加えて良く混合し、１ｌの実験ポリサイロに詰め込んだ。同じサイレージ調製を複数行い、各乳酸菌製剤について１５、２５、３５、４５℃の温度条件で３２日間貯蔵した。貯蔵期間中、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株の製剤を貯蔵温度３５℃の条件で使用したものについては貯蔵１、２、４、８、１６日後に試料を採取しｐＨを測定した。また、全ての試料について３２日後にｐＨを測定した。対照として市販のサイレージ用乳酸菌製剤スノーラクトＬ（雪印種苗株式会社製）を添加したもの（SBT-2232区）、乳酸菌を吸着させていない基材とブドウ糖のみを添加したもの（無接種区）および何も添加しないもの（無添加区）を調製し同様の試験を行った。
乳酸菌製剤添加量 SBT-2300株 ６．９×１０5 ｃｆｕ／材料草ｇSBT-2232株 ２×１０5 ｃｆｕ／材料草ｇ結果を表４及び５に示す。表４の結果から明らかなように本発明の各乳酸菌製剤は１５℃の低温から４５℃の高温まで広い温度域で有効に働く。また表４から明らかなように本発明の乳酸菌製剤は従来の乳酸菌製剤に比較してサイレージ調製後速やかにｐＨを下げるものである。
【００１５】
【表４】
【００１６】
【表５】
【００１７】
【実施例４】
サイレージ添加試験（イタリアンライグラス）
材料草としてイタリアンライグラスを用い、乳酸菌製剤として製造例１で調製したものを使用し、ブドウ糖は添加しない以外は実施例３と同様の方法で材料草を実験ポリサイロに詰めた。それぞれの生菌数は１０5 ｃｆｕ／材料草ｇに調製した。各ポリサイロを３０℃で貯蔵し貯蔵直後（０日後）、１、３、３０日後に一部試料を採取してｐＨを測定した。結果を表６に示す。表６から明らかなように本発明の乳酸菌製剤を用いると貯蔵後、速やかにサイレージのｐＨを下げることができた。
【００１８】
【表６】
【００１９】
【実施例５】
併用効果（培地試験）
実施例２と同様の方法でラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株及びラクトバチルス・デブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスSBT-2664株を２種あるいは３種併用して培養を行い、貯蔵温度３５℃及び４５℃において貯蔵し、貯蔵中のｐＨと酸度（乳酸等量％）を経時的に測定した。結果を表７及び図４〜７に示す。結果から明らかなように本発明の乳酸菌ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスおよびラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスを併用することにより、３５℃及び４５℃のいずれの貯蔵温度でもｐＨの低下と酸度の上昇に関し単独使用と同等あるいはそれ以上の効果を示した。
【００２０】
【表７】
【００２１】
【発明の効果】本発明のサイレージ調製用乳酸菌製剤は、従来の乳酸菌に比較して非常に増殖が速く従来の乳酸菌よりも速やかにサイレージのｐＨを下げて他の好ましくない菌の増殖を抑えることができ、それによって良質のサイレージを調製することができる。また、この増殖活性は環境温度が４５℃の高温でもほとんど変わらず、寒冷地から高温地まで広い範囲でサイレージ調製に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の乳酸菌株SBT-2300株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図２】本発明の乳酸菌株SBT-2670株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図３】本発明の乳酸菌株SBT-2664株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図４】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2670株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図５】本発明の乳酸菌株SBT-2670株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図６】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図７】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2670株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、牧草、飼料作物のサイレージ調製用新規乳酸菌製剤に関する。更に詳しくは、ラクトバチルス属細菌からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイレージとは牧草、飼料作物を嫌気的条件下で乳酸発酵させたもので、牧草、飼料作物の貯蔵のために利用されている。良質のサイレージを調製する上で重要なことは、好気発酵を抑制すること及び酪酸発酵を阻止することである。前者を達成するには、サイレージ原料をサイロに詰めたとき早期に嫌気状態にすればよく、これはサイロの密封を素早く完全に行うことによってある程度解決できる。後者の酪酸発酵の抑制は、酪酸発酵菌の増殖を抑制することによって行うことができる。酪酸菌はサイレージのｐＨが４．２以下ではその活動が抑制されることから、サイレージの乳酸発酵が速やかに進行しその生産する乳酸によってｐＨが速やかに下がることが重要である。サイレージの乳酸発酵に与る乳酸菌としては、トウモロコシサイレージから単離された例としてラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）などのラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）やストレプトコッカス・ボビス（Storeptococcus bovis）などのストレプトコッカス属細菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属細菌、ペディオコッカス(Pediococcus) 属細菌などが知られている（ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology)第６０巻、８３−９２頁、１９８６年）。これらの中でも、乳酸菌発酵を優勢にし良質のサイレージを調製するには、乳酸菌はホモ型発酵菌であることが好ましい。従来、酪酸菌をはじめ、カビ、酵母など良質サイレージ調製に好ましくない菌の増殖を阻止し、速やかに効率のよい乳酸発酵を促すために、サイレージ調製時に種々の乳酸菌を添加することが行われている。例えば、特開平1-211487号公報にはラクトバチルス・カゼイの添加が、特公平1-18716号公報にはラクトバチルス・プランタルム類縁菌が、特公平3-34909号公報にはラクトバチルス・キシローサス（Lactobacillus xylosus）が、それぞれサイレージ調製用乳酸菌として開示されている。また、ラクトバチルス属菌としては、特開平2-257875号、特開平3-285674号および特開平3-285675号公報にも開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの乳酸菌を使用しても、原料草の状態やサイロの密封状態などによっては他の微生物を抑えられず必ずしも良質なサイレージ調製がなされていない場合があり、もっと強力でより速やかに増殖しｐＨを急速に下げるサイレージ調製用乳酸菌が望まれていた。また、九州地方など夏場気温の高い酪農地帯では現在の乳酸菌製剤ではその作用が十分発揮されない場合もあり、高温でも活性を維持している乳酸菌の添加が望まれている。本発明は、従来の乳酸菌よりも非常に短時間で増殖し、しかも比較的高温環境下でも有効に働くサイレージ用乳酸菌を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の問題点を克服するべく鋭意研究を行った結果、ラクトバチルス属桿菌でホモ型乳酸発酵を行う細菌の中でも発酵乳などに含まれているラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、消化管中などに見いだされるラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）および発酵乳などに見いだされるラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）の添加によって意外にも上記の目的が達成されることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば、ラクトバチルス属のホモ型乳酸発酵桿菌であるラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei sub-sp. rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）及びラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii sub-sp. lactis) の少なくとも１種からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤が提供される。本発明では、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノサス、ラクトバチルス・サリバリウスは各々単独で使用してもよいし、併用してもよい。本発明で使用できるラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスの菌株については特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2300株（微工研菌寄第１３２４５号）が挙げられる。また、本発明で使用できるラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスの菌株についても特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2670株（微工研菌寄第１３２４７号）が挙げられる。また、本発明で使用できるラクトバチルス・デルブロッキー・サブスペシーズ・ラクチスの菌株についても特に限定されないが、好ましい例としてSBT-2664株（微工研菌寄第１３２４６号）が挙げられる。これらの菌株は、発酵乳及び乳児糞便から単離されたものであって、いずれも次の形態的性状を示す。
(1) 巾０．５〜１．１μm 、長さ２〜７μm の桿菌(2) グラム染色性；陽性(3) 芽胞の形成；なし(4) 運 動 性；なし(5) 好気性生育能及び嫌気性生育能を有するまた、これらの菌株は、次の培地でよく生育し、ＢＬ寒天培地で３５℃で、３日間嫌気培養するとコロニーを形成する。また、これらの菌株の生理的性質を表１に示す。
【０００５】
【表１】
【０００６】本発明の乳酸菌製剤は次のようにして製造することができる。上記の乳酸菌の培養増殖は、通常の乳酸菌用の培地を用いて行うことができる。培地としては、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＹＰ培地（小崎道雄ら(1992)、乳酸菌実験マニュアル、朝倉書店刊）、ＭＲＳ培地（de Man, J.C. et al.(1960), Journal of Applied Bacteriology, Vol.23, 130-135）や特公平4-49382号公報に記載のルーサン煮汁培地を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常２５〜４５℃で培養することができる。培養時間は増殖スケールによって左右されるが、本発明の乳酸菌は非常に増殖速度が速く、通常１２〜２４時間で定常期に達するので、他の乳酸菌製剤よりも比較的短時間で製造することができる。培養増殖した乳酸菌は、基材とともに凍結乾燥あるいは基材に吸着乾燥して製剤化することができる。凍結乾燥用基材としては、例えば、デキストリン、デンプン、脱脂粉乳や炭酸カルシウムなどが挙げられ、吸着乾燥用基材としてはブドウ糖などの糖類や炭酸カルシウム、ゼオライト、小麦粉、ふすま、脱脂粉乳、ホエー、デンプン、コーングリッツなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。基材の量については特に限定的ではないが、製剤中の菌数が極端に少ないとサイレージ原料草に添加すべき製剤の量が多くなりすぎるし乳酸菌の安定性の面からも好ましくない。通常、製剤１ｇあたり１０7 以上の乳酸菌を含有するようにするのが好ましい。菌数の上限は限定されないが、製造上吸着乾燥では通常１０9 個／ｇ、凍結乾燥では１０11個／ｇくらいである。
【０００７】本発明の乳酸菌製剤は、種々の牧草、飼料作物のサイレージ調製に使用することができる。適用できる牧草、飼料作物の種類は特に限定されないが、オーチャードグラス、チモシー、クローバ、アルファルファ、イタリアンライグラスなどの牧草、トウモロコシ、ソルガムなどの飼料作物、稲わら、麦わらなどの藁類、ビール粕、豆腐粕、酢粕などの食品製造残渣などが挙げられる。本発明の乳酸菌製剤は、これらのサイレージ材料１ｇあたり菌数１０4 〜１０7 個になるように添加する。上述のように製剤１ｇあたり１０7 〜１０11個の乳酸菌を含有するので、材料に添加する場合は上記の添加量になるように加減して材料に散布すればよい。材料に添加する場合は、粉状で、あるいは適当な容量の水に溶解して散布することができる。必要に応じて、セルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素と併用することもできる。
【０００８】
【実施例】
製造例１ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株及びラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株それぞれブリックス リバー ブロス培地（以下、ＢＬＢ培地と略す）に接種し、３５℃で１６時間培養を行った。得られた培養物のそれぞれ０．２ｍｌを２０ｍｌのルーサン煮汁培地（特開昭６４−１０９８１号公報に記載の方法により調製）に接種し、２４時間、３５℃で培養後、更にその全量を２ｌのルーサン煮汁培地に接種し同じ条件で培養した。これに同量の２４％ショ糖溶液を混合後、流動乾燥機（大河原製作所製、ＦＢＳ−５型）でコーングリッツ又は小麦粉に吸着させて乾燥し、各々の乳酸菌製剤を得た。
【０００９】製造例２製造例１で得られる培養物を更に３０ｌのルーサン煮汁培地に接種して培養後、限外ろ過膜（アミコン社製、限外分子量１０万）で３ｌまで濃縮し、同量の２４％ショ糖溶液を混合後、製造例１と同様の方法でコーングリッツ又は小麦粉に吸着乾燥させた。
製造例３製造例１で得られた培養物を特開昭６４−１０９８１号公報記載の方法で乾燥させた。すなわち、製造例１で得られた培養物を流動乾燥機を用い、吸入温度５０℃、排気温度２５〜２８℃で５分間乾燥し、水分６．４％の乾燥粉末を得た。
【００１０】
【実施例１】
培養試験ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株、ラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスSBT-2664株それぞれブリックス リバー ブロス培地（以下、ＢＬＢ培地と略す）に接種し、３５℃で１６時間培養を行った。培養物を特開昭６４−１０９８１号公報に記載の２％ブドウ糖添加ルーサン培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３８℃で１６時間前培養した。得られた培養物を更に２％ブドウ糖添加ルーサン培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３８℃で培養した。接種直後（０時間後）、４、８、１２、１６、２０及び２４時間後に培養試料を採取しｐＨ、酸度、生菌数を測定した。ｐＨは１０℃下でガラス電極ｐＨメーターにより測定した。酸度（％）は各試料９．０ｇを蒸留水で３倍に希釈し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８．０（ｐＨメーターによる確認）に滴定した量から乳酸等量（％）を求めた。生菌数は生理食塩水を希釈液に用い、平板希釈法により測定した。対照として市販のサイレージ添加用乳酸菌スノーラクトＬ（雪印種苗株式会社製）の成分であるラクトバチルス・カゼイSBT-2232株を使用して同様に行った。結果を表２及び図１〜３に示す。これらの結果から明らかなように本発明の乳酸菌はいずれも従来のサイレージ用乳酸菌であるラクトバチルス・カゼイよりも初期の増殖速度が早く、ｐＨの低下及び乳酸の生成が速いことが判明した。
【００１１】
【表２】
【００１２】
【実施例２】
培養試験実施例１と同様の方法で前培養したラクトバチルス・カゼイ・サブスペシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスペシーズ・サリバリウスSBT-2670株、ラクトバチルス・デブロッキー・サブスペシーズ・ラクチスSBT-2664株それぞれを、培養温度を３５℃及び４５℃の２つの条件に設定する以外は実施例１と同様の方法で培養し、８、１６及び３２時間後に培養物試料を採取しｐＨと酸度（％）を測定した。対照として実施例１と同じラクトバチルス・カゼイSBT-2232株を使用した。結果を表３に示す。結果から明らかなように本発明の乳酸菌は４５℃の高温環境下でも菌の活性は高く、従来のラクトバチルス・カゼイよりもｐＨが速やかに低下し乳酸量（酸度）が増加した。
【００１３】
【表３】
【００１４】
【実施例３】
サイレージ添加試験（アルファルファ）
収穫したアルファルファ材料草を軽く予乾し、マウントカッターで１５〜２５ｍｍに切断後、製造例２で製造した乳酸菌製剤をそれぞれ下記の量添加しブドウ糖を０．５５％加えて良く混合し、１ｌの実験ポリサイロに詰め込んだ。同じサイレージ調製を複数行い、各乳酸菌製剤について１５、２５、３５、４５℃の温度条件で３２日間貯蔵した。貯蔵期間中、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株の製剤を貯蔵温度３５℃の条件で使用したものについては貯蔵１、２、４、８、１６日後に試料を採取しｐＨを測定した。また、全ての試料について３２日後にｐＨを測定した。対照として市販のサイレージ用乳酸菌製剤スノーラクトＬ（雪印種苗株式会社製）を添加したもの（SBT-2232区）、乳酸菌を吸着させていない基材とブドウ糖のみを添加したもの（無接種区）および何も添加しないもの（無添加区）を調製し同様の試験を行った。
乳酸菌製剤添加量 SBT-2300株 ６．９×１０5 ｃｆｕ／材料草ｇSBT-2232株 ２×１０5 ｃｆｕ／材料草ｇ結果を表４及び５に示す。表４の結果から明らかなように本発明の各乳酸菌製剤は１５℃の低温から４５℃の高温まで広い温度域で有効に働く。また表４から明らかなように本発明の乳酸菌製剤は従来の乳酸菌製剤に比較してサイレージ調製後速やかにｐＨを下げるものである。
【００１５】
【表４】
【００１６】
【表５】
【００１７】
【実施例４】
サイレージ添加試験（イタリアンライグラス）
材料草としてイタリアンライグラスを用い、乳酸菌製剤として製造例１で調製したものを使用し、ブドウ糖は添加しない以外は実施例３と同様の方法で材料草を実験ポリサイロに詰めた。それぞれの生菌数は１０5 ｃｆｕ／材料草ｇに調製した。各ポリサイロを３０℃で貯蔵し貯蔵直後（０日後）、１、３、３０日後に一部試料を採取してｐＨを測定した。結果を表６に示す。表６から明らかなように本発明の乳酸菌製剤を用いると貯蔵後、速やかにサイレージのｐＨを下げることができた。
【００１８】
【表６】
【００１９】
【実施例５】
併用効果（培地試験）
実施例２と同様の方法でラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサスSBT-2300株、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスSBT-2670株及びラクトバチルス・デブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスSBT-2664株を２種あるいは３種併用して培養を行い、貯蔵温度３５℃及び４５℃において貯蔵し、貯蔵中のｐＨと酸度（乳酸等量％）を経時的に測定した。結果を表７及び図４〜７に示す。結果から明らかなように本発明の乳酸菌ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスおよびラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスを併用することにより、３５℃及び４５℃のいずれの貯蔵温度でもｐＨの低下と酸度の上昇に関し単独使用と同等あるいはそれ以上の効果を示した。
【００２０】
【表７】
【００２１】
【発明の効果】本発明のサイレージ調製用乳酸菌製剤は、従来の乳酸菌に比較して非常に増殖が速く従来の乳酸菌よりも速やかにサイレージのｐＨを下げて他の好ましくない菌の増殖を抑えることができ、それによって良質のサイレージを調製することができる。また、この増殖活性は環境温度が４５℃の高温でもほとんど変わらず、寒冷地から高温地まで広い範囲でサイレージ調製に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の乳酸菌株SBT-2300株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図２】本発明の乳酸菌株SBT-2670株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図３】本発明の乳酸菌株SBT-2664株の３８℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図４】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2670株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図５】本発明の乳酸菌株SBT-2670株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図６】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【図７】本発明の乳酸菌株SBT-2300株とSBT-2670株とSBT-2664株とを併用し４５℃での培養によるｐＨの経時的変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）及びラクトバチルス・デルブロッキー・サブスペシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)の少なくとも１種からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤。
【請求項２】 ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノサスがSBT-2300株（微工研菌寄第１３２４５号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【請求項３】 ラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスがSBT-2664株（微工研菌寄第１３２４６号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【請求項４】 ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスがSBT-2670株（微工研菌寄第１３２４７号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【請求項１】 ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウス（Lactobacillus salivalius subsp. salivarius）及びラクトバチルス・デルブロッキー・サブスペシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)の少なくとも１種からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤。
【請求項２】 ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノサスがSBT-2300株（微工研菌寄第１３２４５号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【請求項３】 ラクトバチルス・デルブロッキー・サブスピーシーズ・ラクチスがSBT-2664株（微工研菌寄第１３２４６号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【請求項４】 ラクトバチルス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サリバリウスがSBT-2670株（微工研菌寄第１３２４７号）である請求項１記載の乳酸菌製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開平６−２１７７１３
【公開日】平成６年（１９９４）８月９日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−３５５８５７
【出願日】平成４年（１９９２）１２月１８日
【出願人】（０００００６６９９）雪印乳業株式会社 (155)
【出願人】（３９１００９８７７）雪印種苗株式会社 (19)
【公開日】平成６年（１９９４）８月９日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）１２月１８日
【出願人】（０００００６６９９）雪印乳業株式会社 (155)
【出願人】（３９１００９８７７）雪印種苗株式会社 (19)
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