シアリルオリゴ糖ペプチド固定化ビーズ
【課題】本発明はヒト型糖鎖結合タンパク質の精製、あるいはウイルスを吸着するために用いる糖ペプチド固定化ビーズを提供する。
【解決手段】下記式で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
【化１】
【解決手段】下記式で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基でビーズと結合した糖ペプチドに関する
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、ＤＮＡなどの核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。例えば、癌化した細胞においては、糖鎖に構造変化が起こっていることが知られている。また、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。そこで、疾患時における生体中の糖鎖の構造変化を検出することができれば慢性疾患や感染症の有用な診断につながるものと考えられる。
【０００３】
鶏卵卵黄から抽出精製されるシアリルオリゴ糖ペプチドは、その糖鎖構造がヒト型であること、またウイルス感染における受容体と同一の糖鎖構造を有することから、これまでサルモネラ菌やインフルエンザウイルスの感染阻害剤としての利用が検討された（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ヒト型糖鎖結合タンパクと糖鎖との特異的相互作用を活用するために、糖鎖をビーズに固定することで、このバイオデバイスをウイルスやヒト型糖鎖結合タンパクの精製や吸着に用いることが期待される。しかし、シアリルオリゴ糖ペプチドのペプチド部分のアミノ基を用いてビーズと結合したものは開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Sugita-Konishi, K. Kobayashi, S. Sakanaka, L. R. Juneja, F. Amano, J. Agric. Food. Chem., 2004, 52, 5443-5448.
【非特許文献２】M. Umemura, M. Itoh, Y. Makimura, K. Yamazaki, M. Umekawa, A. Masui, Y. Matahira, M. Shibata, H. Ashida, K. Yamamoto, J. Med. Chem., 2008, 51, 4496-4503.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、医療及び医薬品開発の分野において有効なリサーチツールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
[１]
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
[２]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（２）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。）
[３]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（３）〜（７）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（３）：
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｍは１〜８の整数を表す。）
式（４）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｎは１〜８の整数を表す。）
式（５）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（６）：
【００１８】
【化６】
【００１９】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（７）：
【００２０】
【化７】
【００２１】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
[４]
前記糖ペプチドが、下記式（８）で表される構造である、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式（８）：
【００２２】
【化８】
【００２３】
[５]
前記ビーズがアガロースまたはセルロースである[１]〜[４]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
[６]
前記ビーズと結合したリンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
[７]
[１]〜[６]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、ビーズ表面に保持されている担体。
[８]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるヒト型糖鎖結合型タンパク質精製用担体。
[９]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるウイルス吸着用担体。
【発明の効果】
【００２４】
本発明はヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために用いる糖ペプチド固定化ビーズに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】製造例１において製造された糖ペプチドの1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】製造例１において再度ＯＤＳ樹脂で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例４における糖ペプチド固定化ビーズとＳＳＡ−レクチンとの相互作用解析結果
【図５】実施例５における糖ペプチド固定化ビーズとヒトＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンとの相互作用解析結果
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態の糖ペプチドは、下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体である（以下、単に、「糖ペプチド誘導体」と記載する場合がある。）。
式（１）：
【００２７】
【化９】
【００２８】
式（１）で表される糖ペプチド（以下、単に、「糖ペプチド」と記載する場合がある。）の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖がＡｓｎを介して結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
【００２９】
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００３０】
上記式（１）で表される糖ペプチドは、ペプチド配列中に、２つのＬｙｓ残基を有する。Ｎ末端のＬｙｓ残基は、２つの遊離したアミノ基を有し、アスパラギン（Ａｓｎ）とスレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＬｙｓ残基は、１つの遊離アミノ基を有する。
【００３１】
すなわち、式（１）で表される糖ペプチドにおいて、Ｌｙｓ残基の遊離アミノ基は、下記構造における−ＮＨ2のいずれかとして存在している。
【００３２】
【化１０】
【００３３】
したがって、本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、Ｌｙｓ残基に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合している。
式（１）で表される糖ペプチドとしては、下記式（１０）で表される構造であることが好ましい。
式（１０）：
【００３４】
【化１１】
【００３５】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、下記式（１１）で表される糖ペプチド誘導体として、少なくとも一つのＲがリンカーを介したビーズであることが好ましい。
式（１１）：
【００３６】
【化１２】
【００３７】
式（１１）で表される構造において、Ｒが全てＨ（水素原子）である場合には、本実施の形態における好適な形態としての糖ペプチドを意味する。
【００３８】
上記式で示されているように、糖ペプチドの糖鎖は、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖であり、２ヶ所の非還元末端にシアル酸を有する。
【００３９】
例えば式（１１）で表される糖ペプチド誘導体において、Ｒの例として、下記に構造式を示す。（Ｂ）はビーズを表し、糖ペプチドのアミノ基がリンカーを介してビーズと結合している。
式（１２）
【００４０】
【化１３】
【００４１】
ここでＸは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１３）
【００４２】
【化１４】
【００４３】
ここでｍは１〜８の整数を表す。
式（１４）
【００４４】
【化１５】
【００４５】
ここでｎは１〜８の整数を表す。
式（１５）
【００４６】
【化１６】
【００４７】
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズとしては、Ｎ末端Ｌｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
【００４８】
【化１７】
【００４９】
上記構造中、Ｒはリンカーを介して結合するビーズを表している。
【００５０】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体としては、ペプチド鎖中で、Ａｓｎ残基とＴｈｒ残基に結合するＬｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
【００５１】
【化１８】
【００５２】
上記構造中、Ｒはリジン残基の遊離アミノ基とリンカーを介して結合するビーズを表し、Ｒが、上記式（１２）〜式（１５）で表される構造であることが好ましい。
【００５３】
各構造におけるＲは、同一であっても、異なっていてもよい。
（糖ペプチド固定化ビーズの製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、下記式（１６）〜（１１）で表される、一端がビーズに結合し、他端が活性化された官能基を含むリンカーを、活性基により糖ペプチドのリジン残基の遊離アミノ基に導入する導入工程を含む。
【００５４】
導入工程により、糖ペプチドがリンカーを介してビーズと結合した糖ペプチド誘導体を得ることができる。
（導入工程）
導入工程とは、ビーズに結合した活性化された官能基を糖ペプチドのペプチド部分に存在する３個の遊離アミノ基のうちの少なくとも１個の遊離アミノ基に導入する工程をいう。用いる活性基含有ビーズの量、反応液の種類、反応液のｐＨ、反応時間、反応温度などの反応条件を選択することにより、糖ペプチドの有する３個の遊離アミノ基に対し活性基含有リンカーを遊離アミノ基の１〜３ヶ所に導入することができる。
【００５５】
本実施の形態において、「リンカーを介してビーズと結合する」とは、糖ペプチドにおけるリジン残基中の３ヶ所の遊離アミノ基の少なくとも一つが、リンカーを介してビーズと結合していることを意味する。ここで、ビーズとしてはアガロースやセルロースなどの天然物質が好ましく、水酸基を多く含むことで親水性が高ければこれらに限定されることはない。またビーズに結合したリンカーとしては、他端が遊離アミノ基と結合し得る能力を有するリンカーである事が好ましい。ここで糖ペプチドの遊離アミノ基と結合し得る部分が、リンカー内に存在していれば特に限定されるものでないが、ビーズに結合したリンカーは、リンカー全体として、炭素数２〜２０、好ましくは、炭素数１５以下のリンカーであることが好適である。一方、遊離アミノ基と結合しうる官能基としては、下式（１６）または（１７）で示されるN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）が導入された基、下式（１８）で示されるエポキシが導入された基、更に下式（１９）で示されるブロモシアン(CNBr)で活性化されたイミド基などが好ましい。
式（１６）：
【００５６】
【化１９】
【００５７】
ここでＢはビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１７）：
【００５８】
【化２０】
【００５９】
式（１８）：
【００６０】
【化２１】
【００６１】
式（１９）：
【００６２】
【化２２】
【００６３】
例えば上記式（１６）〜式（１９）で表されるビーズに結合したリンカーの官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いればよい。
【００６４】
例えば、式（１６）又は式（１７）で表されるビーズに結合したリンカーのカルボン酸の、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなどの活性エステルを用いた場合、必要に応じて、当該活性エステルを溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒と水との混合溶媒中、あるいは水溶液中で有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液又は炭酸緩衝液などの無機塩基の存在下、氷冷下もしくは室温下で１５分〜１日、糖ペプチドと反応させてもよい。
【００６５】
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズ製造において、導入工程におけるビーズの有する官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入後、過剰の官能基を無効化するために50mMのモノエタノールアミン等を添加する工程をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのたんぱく質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態における糖ペプチド固定化ビーズはインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。また本実施の形態におけるビーズによればヒト型インフルエンザウイルス除去効果が期待される。
【実施例】
【００６７】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００６８】
［ＨＰＬＣ分析］
糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件（製造例１）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６９】
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］
糖ペプチドの分析例
Ｄ2Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００７０】
［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
【００７１】
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
【００７２】
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
【００７３】
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（４）で表される構造であることが分かった。
【００７４】
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に再度添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。
【００７５】
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。
【００７６】
［実施例１］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．４ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
【００７７】
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００７８】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。
【００７９】
[実施例２]コントロールビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを２ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
【００８０】
次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００８１】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存し比較対照ゲルとした。
【００８２】
［実施例３］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＣＮＢｒ−activated SepharoseTM 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．０ｇ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え膨潤させた後、静置しその後、上清を除去した。その後、氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え、静置し上清を除去した。この操作を繰り返すことでゲルを洗浄した。
【００８３】
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００８４】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。
【００８５】
[実施例４]レクチンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２１６ｍｇおよび比較対照ゲル２２５ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、それぞれのゲルに、１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したJ-OILMILLS製Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡ（Sambucus sieboldiana Biotin conjugated）０．５ｍＬを加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチンが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００８６】
沈殿したビーズに対し、６．２５ｘ１０-2μｇ／ｍＬとなるように希釈したStreptavidin-HRP（Peroxidase-conjugated Streptavidin, Jackson ImmunoResearch Laboratories 製）溶液を０．７５ｍL加えて室温下２時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００８７】
沈殿したビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４に示す。
【００８８】
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、比較対照群に比べて有意にＳＳＡとの結合能が高いことが確認された。このことから糖ペプチド誘導体と結合したビーズはその特異性がＮｅｕ５Ａｃ(α２−６)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ(Sambucus sieboldiana)と結合している可能性が示唆された。更にリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合する可能性が示唆された。
【００８９】
［実施例５］ヘマグルチニンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２２３ｍｇおよび比較対照ゲル２３０ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、ＰＢＳで希釈したアブカム（ａｂｃａｍ）製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｈ１ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＨＡと表記する)の５μｇ／ｍＬ溶液を５００μＬ加え４℃で終夜静置した。
【００９０】
その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９１】
沈殿したビーズに対し、アブカム（ａｂｃａｍ）製の抗ＨＡ−マウスＩｇＧモノクローナル抗体５０μｇ／ｍＬ溶液を２５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体が結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９２】
沈殿したビーズに対し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ−ウサギポリクローナル抗体０．２５μｇ／ｍＬ溶液をチューブに４５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体−抗マウス抗体ウサギ抗体−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９３】
このビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
【００９４】
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、ＨＡとの結合に関して、比較対照群に比べて有意に結合能が高いことが確認された。このことからリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の糖ペプチド誘導体は、ヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために有効な手段として産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基でビーズと結合した糖ペプチドに関する
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、ＤＮＡなどの核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。例えば、癌化した細胞においては、糖鎖に構造変化が起こっていることが知られている。また、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。そこで、疾患時における生体中の糖鎖の構造変化を検出することができれば慢性疾患や感染症の有用な診断につながるものと考えられる。
【０００３】
鶏卵卵黄から抽出精製されるシアリルオリゴ糖ペプチドは、その糖鎖構造がヒト型であること、またウイルス感染における受容体と同一の糖鎖構造を有することから、これまでサルモネラ菌やインフルエンザウイルスの感染阻害剤としての利用が検討された（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ヒト型糖鎖結合タンパクと糖鎖との特異的相互作用を活用するために、糖鎖をビーズに固定することで、このバイオデバイスをウイルスやヒト型糖鎖結合タンパクの精製や吸着に用いることが期待される。しかし、シアリルオリゴ糖ペプチドのペプチド部分のアミノ基を用いてビーズと結合したものは開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Sugita-Konishi, K. Kobayashi, S. Sakanaka, L. R. Juneja, F. Amano, J. Agric. Food. Chem., 2004, 52, 5443-5448.
【非特許文献２】M. Umemura, M. Itoh, Y. Makimura, K. Yamazaki, M. Umekawa, A. Masui, Y. Matahira, M. Shibata, H. Ashida, K. Yamamoto, J. Med. Chem., 2008, 51, 4496-4503.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、医療及び医薬品開発の分野において有効なリサーチツールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
[１]
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
[２]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（２）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。）
[３]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（３）〜（７）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（３）：
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｍは１〜８の整数を表す。）
式（４）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｎは１〜８の整数を表す。）
式（５）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（６）：
【００１８】
【化６】
【００１９】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（７）：
【００２０】
【化７】
【００２１】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
[４]
前記糖ペプチドが、下記式（８）で表される構造である、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式（８）：
【００２２】
【化８】
【００２３】
[５]
前記ビーズがアガロースまたはセルロースである[１]〜[４]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
[６]
前記ビーズと結合したリンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
[７]
[１]〜[６]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、ビーズ表面に保持されている担体。
[８]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるヒト型糖鎖結合型タンパク質精製用担体。
[９]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるウイルス吸着用担体。
【発明の効果】
【００２４】
本発明はヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために用いる糖ペプチド固定化ビーズに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】製造例１において製造された糖ペプチドの1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】製造例１において再度ＯＤＳ樹脂で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例４における糖ペプチド固定化ビーズとＳＳＡ−レクチンとの相互作用解析結果
【図５】実施例５における糖ペプチド固定化ビーズとヒトＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンとの相互作用解析結果
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態の糖ペプチドは、下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体である（以下、単に、「糖ペプチド誘導体」と記載する場合がある。）。
式（１）：
【００２７】
【化９】
【００２８】
式（１）で表される糖ペプチド（以下、単に、「糖ペプチド」と記載する場合がある。）の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖がＡｓｎを介して結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
【００２９】
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００３０】
上記式（１）で表される糖ペプチドは、ペプチド配列中に、２つのＬｙｓ残基を有する。Ｎ末端のＬｙｓ残基は、２つの遊離したアミノ基を有し、アスパラギン（Ａｓｎ）とスレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＬｙｓ残基は、１つの遊離アミノ基を有する。
【００３１】
すなわち、式（１）で表される糖ペプチドにおいて、Ｌｙｓ残基の遊離アミノ基は、下記構造における−ＮＨ2のいずれかとして存在している。
【００３２】
【化１０】
【００３３】
したがって、本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、Ｌｙｓ残基に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合している。
式（１）で表される糖ペプチドとしては、下記式（１０）で表される構造であることが好ましい。
式（１０）：
【００３４】
【化１１】
【００３５】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、下記式（１１）で表される糖ペプチド誘導体として、少なくとも一つのＲがリンカーを介したビーズであることが好ましい。
式（１１）：
【００３６】
【化１２】
【００３７】
式（１１）で表される構造において、Ｒが全てＨ（水素原子）である場合には、本実施の形態における好適な形態としての糖ペプチドを意味する。
【００３８】
上記式で示されているように、糖ペプチドの糖鎖は、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖であり、２ヶ所の非還元末端にシアル酸を有する。
【００３９】
例えば式（１１）で表される糖ペプチド誘導体において、Ｒの例として、下記に構造式を示す。（Ｂ）はビーズを表し、糖ペプチドのアミノ基がリンカーを介してビーズと結合している。
式（１２）
【００４０】
【化１３】
【００４１】
ここでＸは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１３）
【００４２】
【化１４】
【００４３】
ここでｍは１〜８の整数を表す。
式（１４）
【００４４】
【化１５】
【００４５】
ここでｎは１〜８の整数を表す。
式（１５）
【００４６】
【化１６】
【００４７】
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズとしては、Ｎ末端Ｌｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
【００４８】
【化１７】
【００４９】
上記構造中、Ｒはリンカーを介して結合するビーズを表している。
【００５０】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体としては、ペプチド鎖中で、Ａｓｎ残基とＴｈｒ残基に結合するＬｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
【００５１】
【化１８】
【００５２】
上記構造中、Ｒはリジン残基の遊離アミノ基とリンカーを介して結合するビーズを表し、Ｒが、上記式（１２）〜式（１５）で表される構造であることが好ましい。
【００５３】
各構造におけるＲは、同一であっても、異なっていてもよい。
（糖ペプチド固定化ビーズの製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、下記式（１６）〜（１１）で表される、一端がビーズに結合し、他端が活性化された官能基を含むリンカーを、活性基により糖ペプチドのリジン残基の遊離アミノ基に導入する導入工程を含む。
【００５４】
導入工程により、糖ペプチドがリンカーを介してビーズと結合した糖ペプチド誘導体を得ることができる。
（導入工程）
導入工程とは、ビーズに結合した活性化された官能基を糖ペプチドのペプチド部分に存在する３個の遊離アミノ基のうちの少なくとも１個の遊離アミノ基に導入する工程をいう。用いる活性基含有ビーズの量、反応液の種類、反応液のｐＨ、反応時間、反応温度などの反応条件を選択することにより、糖ペプチドの有する３個の遊離アミノ基に対し活性基含有リンカーを遊離アミノ基の１〜３ヶ所に導入することができる。
【００５５】
本実施の形態において、「リンカーを介してビーズと結合する」とは、糖ペプチドにおけるリジン残基中の３ヶ所の遊離アミノ基の少なくとも一つが、リンカーを介してビーズと結合していることを意味する。ここで、ビーズとしてはアガロースやセルロースなどの天然物質が好ましく、水酸基を多く含むことで親水性が高ければこれらに限定されることはない。またビーズに結合したリンカーとしては、他端が遊離アミノ基と結合し得る能力を有するリンカーである事が好ましい。ここで糖ペプチドの遊離アミノ基と結合し得る部分が、リンカー内に存在していれば特に限定されるものでないが、ビーズに結合したリンカーは、リンカー全体として、炭素数２〜２０、好ましくは、炭素数１５以下のリンカーであることが好適である。一方、遊離アミノ基と結合しうる官能基としては、下式（１６）または（１７）で示されるN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）が導入された基、下式（１８）で示されるエポキシが導入された基、更に下式（１９）で示されるブロモシアン(CNBr)で活性化されたイミド基などが好ましい。
式（１６）：
【００５６】
【化１９】
【００５７】
ここでＢはビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１７）：
【００５８】
【化２０】
【００５９】
式（１８）：
【００６０】
【化２１】
【００６１】
式（１９）：
【００６２】
【化２２】
【００６３】
例えば上記式（１６）〜式（１９）で表されるビーズに結合したリンカーの官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いればよい。
【００６４】
例えば、式（１６）又は式（１７）で表されるビーズに結合したリンカーのカルボン酸の、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなどの活性エステルを用いた場合、必要に応じて、当該活性エステルを溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒と水との混合溶媒中、あるいは水溶液中で有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液又は炭酸緩衝液などの無機塩基の存在下、氷冷下もしくは室温下で１５分〜１日、糖ペプチドと反応させてもよい。
【００６５】
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズ製造において、導入工程におけるビーズの有する官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入後、過剰の官能基を無効化するために50mMのモノエタノールアミン等を添加する工程をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのたんぱく質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態における糖ペプチド固定化ビーズはインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。また本実施の形態におけるビーズによればヒト型インフルエンザウイルス除去効果が期待される。
【実施例】
【００６７】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００６８】
［ＨＰＬＣ分析］
糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件（製造例１）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６９】
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］
糖ペプチドの分析例
Ｄ2Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００７０】
［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
【００７１】
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
【００７２】
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
【００７３】
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（４）で表される構造であることが分かった。
【００７４】
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に再度添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。
【００７５】
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。
【００７６】
［実施例１］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．４ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
【００７７】
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００７８】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。
【００７９】
[実施例２]コントロールビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを２ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
【００８０】
次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００８１】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存し比較対照ゲルとした。
【００８２】
［実施例３］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＣＮＢｒ−activated SepharoseTM 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．０ｇ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え膨潤させた後、静置しその後、上清を除去した。その後、氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え、静置し上清を除去した。この操作を繰り返すことでゲルを洗浄した。
【００８３】
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
【００８４】
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。
【００８５】
[実施例４]レクチンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２１６ｍｇおよび比較対照ゲル２２５ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、それぞれのゲルに、１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したJ-OILMILLS製Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡ（Sambucus sieboldiana Biotin conjugated）０．５ｍＬを加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチンが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００８６】
沈殿したビーズに対し、６．２５ｘ１０-2μｇ／ｍＬとなるように希釈したStreptavidin-HRP（Peroxidase-conjugated Streptavidin, Jackson ImmunoResearch Laboratories 製）溶液を０．７５ｍL加えて室温下２時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００８７】
沈殿したビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４に示す。
【００８８】
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、比較対照群に比べて有意にＳＳＡとの結合能が高いことが確認された。このことから糖ペプチド誘導体と結合したビーズはその特異性がＮｅｕ５Ａｃ(α２−６)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ(Sambucus sieboldiana)と結合している可能性が示唆された。更にリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合する可能性が示唆された。
【００８９】
［実施例５］ヘマグルチニンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２２３ｍｇおよび比較対照ゲル２３０ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、ＰＢＳで希釈したアブカム（ａｂｃａｍ）製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｈ１ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＨＡと表記する)の５μｇ／ｍＬ溶液を５００μＬ加え４℃で終夜静置した。
【００９０】
その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９１】
沈殿したビーズに対し、アブカム（ａｂｃａｍ）製の抗ＨＡ−マウスＩｇＧモノクローナル抗体５０μｇ／ｍＬ溶液を２５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体が結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９２】
沈殿したビーズに対し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ−ウサギポリクローナル抗体０．２５μｇ／ｍＬ溶液をチューブに４５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体−抗マウス抗体ウサギ抗体−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
【００９３】
このビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
【００９４】
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、ＨＡとの結合に関して、比較対照群に比べて有意に結合能が高いことが確認された。このことからリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の糖ペプチド誘導体は、ヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために有効な手段として産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
【化１】
【請求項２】
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（２）で表されるリンカーである、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
【化２】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。）
【請求項３】
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（３）〜（７）で表されるリンカーである、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
式（３）：
【化３】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｍは１〜８の整数を表す。）
式（４）：
【化４】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｎは１〜８の整数を表す。）
式（５）：
【化５】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（６）：
【化６】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（７）：
【化７】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
【請求項４】
前記糖ペプチドが、下記式（８）で表される構造である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式（８）：
【化８】
【請求項５】
前記ビーズがアガロースまたはセルロースである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項６】
前記ビーズと結合したリンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、ビーズ表面に保持されている担体。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるヒト型糖鎖結合型タンパク質精製用担体。
【請求項９】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるウイルス吸着用担体。
【請求項１】
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
【化１】
【請求項２】
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（２）で表されるリンカーである、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
【化２】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。）
【請求項３】
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（３）〜（７）で表されるリンカーである、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
式（３）：
【化３】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｍは１〜８の整数を表す。）
式（４）：
【化４】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｎは１〜８の整数を表す。）
式（５）：
【化５】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（６）：
【化６】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（７）：
【化７】
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
【請求項４】
前記糖ペプチドが、下記式（８）で表される構造である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式（８）：
【化８】
【請求項５】
前記ビーズがアガロースまたはセルロースである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項６】
前記ビーズと結合したリンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、ビーズ表面に保持されている担体。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるヒト型糖鎖結合型タンパク質精製用担体。
【請求項９】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるウイルス吸着用担体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−４０１４８（Ｐ２０１３−４０１４８Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７９６４９（Ｐ２０１１−１７９６４９）
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
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