システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質、および当該タンパク質を利用した吸着剤
【課題】 Ｆｃ結合性タンパク質を担体に固定化させる際、その方向性を有した状態で固定化させることが可能なタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を担体に固定化して得られる吸着剤を提供すること。
【解決手段】 システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を担体に固定化して得られる吸着剤により、前記課題を解決する。
【解決手段】 システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を担体に固定化して得られる吸着剤により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率に担体へ固定化可能なＦｃ結合性タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記タンパク質の製造方法、および前記タンパク質を担体に固定化することで得られる吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造する。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質に対し特異的に結合可能な物質（リガンド）を不溶性の担体に固定化することで得られる吸着剤を用いたクロマトグラフィーであり、抗体と特異的に結合可能な物質をリガンドにすることで、培養液から抗体を特異的に吸着させることができ、結果として抗体の高純度な精製を可能としている。特に抗体製造の分野では、プロテインＡをリガンドとした吸着剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーが多用されている。一方で、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子であるＦｃ受容体やＦｃ領域結合能を有したＦｃ受容体の部分領域（以下、合わせてＦｃ結合性タンパク質という）もプロテインＡと同様、抗体を特異的に吸着可能なリガンドとして用いることができる（特許文献１）。
【０００４】
リガンドを担体に固定化する際、リガンド表面に存在する反応性の高い側鎖、例えばリジン残基が有するε−アミノ基を、担体に導入したエポキシ基等の活性基を介して共有結合により担体に固定化する方法が一般的に用いられている。しかしながら、リガンドを担体に固定化する際、リガンドの方向性を無視しランダムに固定化すると、当該リガンドが有する抗体結合領域の一部が担体表面側に固定化されるため、その分吸着剤が有する抗体結合性が損なわれる問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１２６４３６号公報
【特許文献２】特開２０１１−０９７８９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（１０），ｅ４３，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を担体に固定化させる際、その方向性を有した状態で固定化させることが可能なタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を担体に固定化して得られる吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にシステインを含むオリゴペプチドを付加することで、担体へ固定化させる際、該タンパク質に方向性を付与した状態で固定化させることができ、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
第一の態様は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質である。
【０００９】
第二の態様は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドが配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、前記第一の態様に記載のタンパク質である。
【００１０】
第三の態様は、Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
前記第一または第二の態様に記載のタンパク質である。
【００１１】
第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１２】
第五の態様は、前記第四の態様に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１３】
第六の態様は、前記第五の態様に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体である。
【００１４】
第七の態様は、前記第六の態様に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法である。
【００１５】
第八の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤である。
【００１６】
第九の態様は、担体が、その表面に活性基を有しており、かつ前記活性基が、エポキシ基、マレイミド基、クロロアセチル基、ブロモヒドリン基、ブロモメチル基、ヨードアセチル基のいずれかである、前記第八の態様に記載の抗体吸着剤である。
【００１７】
第十の態様は、前記第八または第九の態様に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法である。
【００１８】
第十一の態様は、タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加することで、前記タンパク質に方向性を付与した状態で担体へ固定化可能な、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド（以下、システインタグという）を付加するＦｃ結合性タンパク質とは、Ｆｃ領域を含む抗体（ＩｇＧ）と結合可能なタンパク質のことをいい、Ｆｃ受容体およびその部分領域を例示することができる。Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体の場合、構造と機能からヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂおよびヒトＦｃγＲＩＩＩに分類され、その中でもヒトＦｃγＲＩは抗体との親和性が高い点で、システインタグを付加するＦｃ結合性タンパク質として好ましい。
【００２１】
ヒトＦｃγＲＩは、抗体と結合するα鎖と、α鎖と作用し免疫信号を細胞質内に伝達するγ鎖からなり、α鎖の構造の概略を図１に示す。ヒトＦｃγＲＩのα鎖は、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド（ＳＳ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。本発明におけるシステインタグを付加するＦｃ結合性タンパク質として、前記ＦｃγＲＩの全領域を用いてもよいが、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域を含むタンパク質とすると、Ｆｃ領域結合能を有しつつ遺伝子工学的手法により細胞外にタンパク質を発現させることができるため、好ましい。なお、Ｆｃ結合性タンパク質の熱、酸およびアルカリに対する安定性をさらに向上させることを目的に、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域にあるアミノ酸の一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質であってもよい。さらに、ポリヒスチジンタグといった、精製等を行なうためのタグペプチドをＮ末端側またはＣ末端側に付加してもよい。配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域にあるアミノ酸の一つ以上を他のアミノ酸に置換したポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質の例として、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含む、タンパク質があげられる（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号５３の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号５３の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号５３の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号５３の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号５３の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号５３の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号５３の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号５３の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号５３の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号５３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号５３の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号５３の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号５３の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号５３の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号５３の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号５３の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号５３の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号５３の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号５３の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号５３の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号５３の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号５３の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号５３の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号５３の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号５３の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号５３の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号５３の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号５３の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号５３の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号５３の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号５３の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号５３の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号５３の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号５３の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号５３の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号５３の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号５３の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号５３の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号５３の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号５３の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号５３の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号５３の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号５３の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号５３の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号５３の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号５３の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号５３の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号５３の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号５３の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号５３の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号５３の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号５３の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号５３の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号５３の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号５３の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号５３の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号５３の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号５３の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号５３の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号５３の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号５３の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号５３の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号５３の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号５３の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号５３の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号５３の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号５３の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号５３の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号５３の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号５３の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号５３の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号５３の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号５３の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号５３の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号５３の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号５３の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号５３の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号５３の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号５３の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号５３の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号５３の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号５３の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号５３の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号５３の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号５３の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号５３の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号５３の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号５３の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号５３の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号５３の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号５３の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号５３の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号５３の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号５３の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号５３の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号５３の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号５３の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号５３の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号５３の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号５３の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号５３の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号５３の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号５３の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号５３の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号５３の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号５３の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号５３の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号５３の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号５３の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号５３の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号５３の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号５３の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号５３の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号５３の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号５３の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号５３の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号５３の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号５３の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号５３の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号５３の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号５３の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号５３の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号５３の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号５３の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号５３の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号５３の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号５３の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号５３の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号５３の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号５３の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号５３の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号５３の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号５３の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号５３の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号５３の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号５３の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号５３の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号５３の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号５３の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号５３の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号５３の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号５３の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号５３の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号５３の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号５３の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号５３の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号５３の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号５３の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号５３の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号５３の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号５３の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号５３の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号５３の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号５３の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号５３の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号５３の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号５３の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号５３の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号５３の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号５３の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号５３の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号５３の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号５３の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号５３の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号５３の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号５３の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１６７）配列番号５３の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号５３の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
本発明において、システインタグの長さは当該タグを付加するＦｃ結合性タンパク質が有する抗体（Ｆｃ領域）結合能を損なわない限り、１残基から１００残基の範囲の中から任意に設定でき、特に５残基から２０残基の範囲に設定するとよい。システインタグに含まれるシステイン残基は１つ以上あればよいが、２つ以上含む場合はシステインタグ内でＳ−Ｓ結合が形成されないよう設計する必要がある。システインタグを構成するシステイン以外のアミノ酸残基の種類は、担体表面の物性を考慮の上、担体表面と相互作用しやすい物性を有したアミノ酸残基を適宜選択すればよい。本発明におけるシステインタグの一例として配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドがあげられる。
【００２２】
Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にシステインタグを付加して得られる本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドという）の作製方法としては、
（Ｉ）本発明のタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）本発明のタンパク質のうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製後、当該調製したポリヌクレオチドの５’末端側または３’末端側に遺伝子工学的手法によりシステインタグをコードするオリゴヌクレオチドを付加する方法、が例示できる。
【００２３】
なお、アミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することによっても可能である。また、前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特許文献２）。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクター等を例示することができる。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造することができる。具体的には、当該形質転換体を培養し、その培養物から本発明のタンパク質を何らかの方法で回収すればよい。なお、本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの導入の有無によって選択的に形質転換体を増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに、グリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本実施形態のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２７】
本発明のタンパク質を回収するには、培養物から何らかの方法でＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。本発明の形質転換体の培養液から、本発明のタンパク質を抽出するには、当該タンパク質の発現の形態により適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、本発明のタンパク質を抽出すればよい。抽出した本発明のタンパク質を含む溶液から本発明のタンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のタンパク質を高純度に調製することができる。調製した高純度な本発明のタンパク質は、還元剤存在下で保存すると安定に保存できるため好ましく、還元剤としてはジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンまたはトリカルボキシエチルフォスフィンを例示することができる。還元剤の濃度は、１ｎＭから１００ｍＭの範囲の中から使用する還元剤の還元力より判断し適宜設定すればよく、１μＭから１０ｍＭの範囲とすると好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させることで、本発明の抗体吸着剤を作製することができる。本発明の抗体吸着剤の作製に用いる不溶性の担体は特に限定はないが、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質ゲル、またはポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子ゲルが好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００２９】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化する際は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、マレイミド基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を介して担体と共有結合により固定化すればよい。活性基を有した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件にて担体表面に活性基を導入し調製してもよい。表面に活性基を有した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を例示できる。担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例として、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。また前記化合物により担体表面に導入したエポキシ基にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００３０】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としてはＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−[α―マレイミドアセトキシ]コハク酸イミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（コハク酸イミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（コハク酸イミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを例示できる。
【００３１】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを例示できる。
【００３２】
また、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω―アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω―アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω―アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロコハク酸イミド、Ｎ−ブロモコハク酸イミド、Ｎ−ヨードコハク酸イミドを例示できる。
【００３３】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面にあるカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法もある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールが例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３４】
担体への活性基導入量は担体１ｍＬあたり１ｎｍｏｌから１ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１μｍｏｌから１００μｍｏｌである。
【００３５】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させる際は、本発明のタンパク質を緩衝液に溶解し、担体が有する活性基と反応させればよく、緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示することができる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃の範囲の中から活性基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮の上適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００３６】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させる方法の具体例として、本発明のタンパク質に含まれるカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを作用させてＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基に変換し、アミノ基を有する担体に固定化させる方法があげられる。
【００３７】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化して得られる抗体吸着剤（以下、単に本発明の抗体吸着剤という）で精製可能な抗体は、Ｆｃ領域を有する抗体（ＩｇＧ）であれば特に制限はなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、ウサギ抗体を例示することができる。
【００３８】
本発明の抗体吸着剤を用いた、抗体の精製方法に特に制限はないが、空カラムに本発明の抗体吸着剤を充填して得られるカラムを用いたクロマトグラフィーによる精製方法が抗体を高純度に精製できる点で好ましい。本発明の抗体吸着剤により精製する、抗体を含む溶液としては、抗体を生産する宿主の培養液や、当該培養液を遠心分離等により細胞を除去した培養上清を例示できる。カラムの大きさ（本発明の抗体吸着剤の充填量）は精製原料の処理量を考慮の上、適宜決定すればよい。
【００３９】
本発明の抗体吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加する際は、送液量を考慮しポンプ等の送液手段を用いて添加すればよい。なお、本発明の抗体吸着剤を充填したカラムは、抗体を添加する前に、あらかじめ適切な緩衝液を用いて平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。前記抗体吸着剤に吸着させた抗体を溶出させるには、前記抗体吸着剤と抗体との相互作用を弱める緩衝液を用いればよく、具体的には、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示することができる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ３から６、より好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のタンパク質は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド（システインタグ）をＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質であり、前記Ｆｃ結合性タンパク質に方向性を付与した状態で担体に固定化させることができる。その結果、担体に固定化したＦｃ結合性タンパク質のうち抗体への結合能を保持しているタンパク質の割合（有効固定化率）を向上させることができる。よって、本発明のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤は、システインタグを付加しないＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤と比較し、ゲル当たりの抗体吸着量を向上させることができ、抗体精製コストを低減させることができる。
【００４１】
なお、本発明のタンパク質を得る際、Ｆｃ結合性タンパク質に付加したシステインタグ（例えば、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド）は、Ｆｃ結合性タンパク質以外のタンパク質に対しても、本発明のタンパク質と同様、Ｎ末端側またはＣ末端側に付加することで、方向性を付与した状態で担体に固定化することができる。このため、前記システインタグはタンパク質を効率的に担体に固定化させるのに有効といえる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｆｃ結合性タンパク質の概略構造を示す図である。
【図２】ｐＥＴＭａｌＥの概略構造を示す図である。
【図３】ｐＥＴＦｃＲｍ３２発現ベクターの概略構造を示す図である。
【図４】ｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃ発現ベクターの概略構造を示す図である。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質をコードする発現ベクターの作製
配列番号１に示す、Ｆｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドを発現可能なベクターを以下の方法により作製した。配列番号１のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）、３０８番目から３１３番目までのヒスチジンがＦｃ結合タンパク質の定量または精製のために導入したポリヒスチジンタグである。なおＦｃＲｍ３２は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。またＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置に、それぞれある。
（１）ＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチド（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡＫＩＥＥＭ、配列番号５４）をコードするポリヌクレオチドを作製するために、下記に示す２段階のＰＣＲを行なった。
（１−１）１段階目のＰＣＲ反応を、表１に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうことで実施した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
なお表１に示す反応液の組成のうち、オリゴヌクレオチドミックスは、
配列番号２（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、
配列番号３（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、
配列番号４（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、および
配列番号５（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）
に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチド（本明細書の実施例で用いたオリゴヌクレオチドはいずれもＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ社製である）溶液（濃度：５０ｐｍｏＬ／μＬ）を、それぞれ等量ずつ採取し混合した溶液である。
（１−２）２段階目のＰＣＲ反応を、表２に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうことで実施し、ＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
なお、表２に示す反応液の組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲ反応液を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号２および５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
（２）（１）で調製したＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥの構造を図２に示す。
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでの領域からなるポリペプチド（ＦｃＲｍ３２、２７４アミノ酸）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、下記に示すＰＣＲを用いてアッセンブリーする方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（１０），ｅ４３，２００２：非特許文献１）により作製した。
（４−１）１段階目のＰＣＲ反応は、表３に示す反応液を用いて、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００４９】
【表３】
【００５０】
なお、表３に示す反応液の組成のうち、オリゴヌクレオチドミックスは、設計した配列番号７から配列番号４４に記載の配列からなる、３８種類のオリゴヌクレオチド溶液（濃度：５０ｐｍｏＬ／μＬ）をそれぞれ等量ずつ採取し混合した溶液である。
（４−２）２段階目のＰＣＲ反応は、表４に示す反応液を用いて、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００５１】
【表４】
【００５２】
なお、表４に示す反応液の組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲの反応液を用い、ＰＣＲプライマーは、
配列番号４５（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）および
配列番号４６（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドはＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のＣ末端側に精製を容易にするためのポリヒスチジンタグ（ヒスチジン６残基からなる）が付加されるよう設計したオリゴヌクレオチドである。
（４−３）２段階目のＰＣＲの反応液をアガロースゲルから抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社製）することで、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（５）（３）で作製したベクターｐＥＴＭａｌＥ（図２）と、（４）で作製したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養し、定法に従いプラスミドを抽出後（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ：キアゲン社製）、発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２を得た。図３に概略構造を示す。
（７）ＦｃＲｍ３２を発現させるために、ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
【００５３】
実施例２ ポリヌクレオチドの塩基配列の解析
前述したベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）に挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、
配列番号４７（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および、
配列番号４８（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。解析の結果、ｐＥＴＦｃＲｍ３２に挿入されたポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００５４】
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質へのシステインタグの導入
（１）表４に示す反応液の組成のうち、鋳型を実施例１で作製したベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）に、ＰＣＲプライマーを、
配列番号４９（５’−ＡＡＣＡＴＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）、および
配列番号５０（５’−ＴＴＣＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドに、それぞれ変更した他は実施例１（４−２）と同様な方法でＰＣＲ反応を行なった。
（２）実施例１（５）から（６）と同様な方法により、Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のＣ末端側にシステインタグ（ＧＧＳＧＧＣＧ、配列番号５５）を付加したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ３２Ｃ）を発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃを調製した。
（３）ＦｃＲｍ３２Ｃを発現させるために、ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃにより大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（４）ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃに挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列を実施例２と同様な方法で確認した。
【００５５】
ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃの構造概略を図４に示す。また、ＦｃＲｍ３２Ｃをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号５２に、ＦｃＲｍ３２Ｃのアミノ酸配列を配列番号５１にそれぞれ示す。なお、配列番号５１のうち１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。
【００５６】
実施例４ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の調製
（１）実施例３で作製したＦｃＲｍ３２Ｃを発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃ（図４）を導入した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とうすることで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（２Ｌ）に添加し３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換え、さらにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加して、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離操作（１００００×ｇで２０分間）により得られた湿菌体を、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）とを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、４℃に冷却しながら超音波破砕処理を行なった。
（５）遠心分離操作（４℃、１００００×ｇで２０分間）により、ＦｃＲｍ３２Ｃを含む溶液を遠心上清として回収した。
（６）（５）の遠心上清に１１４ｇ／Ｌとなるように硫酸アンモニウムを添加し、生成した沈殿を遠心分離操作（４℃、１２０００×ｇで２０分間）により除去した。
（７）（６）の遠心上清を、あらかじめ１１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ６ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、２０％のグリセロールを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。
（８）（７）の溶出液に純水を添加して導電率を１０ｍＳ／ｃｍ以下まで低下させた後、終濃度１Ｍとなるように尿素を添加した。この溶液を、あらかじめ１Ｍの尿素を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍゲル（東ソー株式会社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１Ｍの尿素と２ＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。
（９）（８）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ３ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と１０％のグリセリンとを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。なお溶出の際は、溶出液を中性付近に戻すため、溶出量に対し約１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した試験管に溶出液を集めた。
（１０）溶出されたＦｃＲｍ３２Ｃの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認し、均一なタンパク質であることを確認した。
（１１）精製したＦｃＲｍ３２Ｃを、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質：キット添付の抗体）を用いて定量した。
【００５７】
結果、ＦｃＲｍ３２Ｃは大腸菌培養液１Ｌあたり約５ｍｇ調製することができた。
【００５８】
比較例１ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の調製
（１）実施例１で作製したＦｃＲｍ３２を発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）により形質転換された形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とうすることで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（２Ｌ）に添加し３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換えて、さらにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加して、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離操作（１００００×ｇ、２０分間）により得られた湿菌体を、５００ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、和光純薬社製）および２０ｍＭ イミダゾール（和光純薬社製）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、４℃に冷却しながら超音波破砕処理を行なった。
（５）遠心分離操作（４℃、１００００×ｇで２０分間）により、ＦｃＲｍ３２を含む溶液を遠心上清として回収した。
（６）（５）の遠心上清を、あらかじめ５００ｍＭのＮａＣｌと０．１％のＴｗｅｅｎ２０と２０ｍＭのイミダゾールとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートゲル（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ３ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、５００ｍＭのＮａＣｌと０．１％のＴｗｅｅｎ２０と５００ｍＭのイミダゾールとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ゲルに吸着したＦｃＲｍ３２を溶出した。
（７）（６）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と１０％のグリセリンとを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃＲｍ３２を溶出した。なお溶出の際は、溶出液を中性付近に戻すため、溶出量に対して約１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した試験管に溶出液を集めた。
（８）溶出されたＦｃＲｍ３２の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認し、均一なタンパク質であることを確認した。
（９）精製したＦｃＲｍ３２を、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質：キット添付の抗体）を用いて定量した。
【００５９】
結果、ＦｃＲｍ３２は大腸菌培養液１Ｌから約２１ｍｇ調製することができた。
【００６０】
実施例５ ポリメタクリレートゲルへのエポキシ基の導入
ポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））約２ｍＬをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥して得られたゲル２．０ｇに水１．０ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬ、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）２．０ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（２０ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）で４回、水（２０ｍＬ）で４回洗浄することでエポキシ基を導入したゲル（以下、エポキシトヨパールとする）を作製した。
【００６１】
実施例６ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の固定化（その１）
（１）実施例４で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２Ｃ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ３２Ｃを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、あらかじめ５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ３２Ｃ溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加し、１時間静置後、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベッドボリューム）および３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲルを調製した。
【００６２】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ３２Ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２Ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２Ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２Ｃの固定化率は５４．７％であり、ゲル１ｍＬあたり２．９ｍｇのＦｃＲｍ３２Ｃが固定化されていた。
【００６３】
実施例７ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の固定化（その２）
（１）カルボキシル基を導入したトヨパール（登録商標）（以下、単にカルボキシトヨパールとする）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を用いて活性エステルへと誘導し、２０ｍＭのＮ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジドを添加することでマレイミド基を導入した。
（２）マレイミド基を導入した担体に、２５０ｍＭのエタノールアミンと０．２５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２５℃で３０分反応させることで残存するＮＨＳ活性基を不活化した。
（３）ＮＨＳ活性基を不活化させた後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて洗浄することで、マレイミド基を導入したゲルＡ（以下、マレイミドトヨパールＡ）を調製した。
（４）（３）で得られたマレイミドトヨパールＡ０．１ｍＬ（ベットボリューム）に、ＦｃＲｍ３２Ｃ溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置後、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（５）反応終了後、ゲルを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて洗浄することで、ＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲルを調製した。
【００６４】
マレイミドトヨパールＡへのＦｃＲｍ３２Ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２Ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２Ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２Ｃの固定化率は２６．４％であり、マレイミドトヨパールＡ１ｍＬあたり１．４ｍｇのＦｃＲｍ３２Ｃが固定化されていた。
【００６５】
比較例２ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の固定化（その１）
（１）実施例６（１）から（２）と同様な方法で、参考例１で調製したＦｃＲｍ３２の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）濃縮脱塩処理後のＦｃＲｍ３２溶液０．１ｍＬ（濃度８．５ｍｇ／ｍＬ）に０．１ｍＬのエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベットボリューム）および３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例６（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ３２固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００６６】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ３２の固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２の量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２の量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２の固定化率は４９．４％であり、ゲル１ｍＬ当たり４．２ｍｇのＦｃＲｍ３２が固定化されていた。
【００６７】
比較例３ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の固定化（その２）
（１）実施例７（１）から（３）の方法で得られたマレイミドトヨパールＡを０．１ｍＬ（ベットボリューム）分取し、ＦｃＲｍ３２溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置後、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（２）反応終了後、実施例７（５）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ３２固定化ゲルを調製した。
【００６８】
マレイミドトヨパールＡへのＦｃＲｍ３２の固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２の量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２の量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算したが、ＦｃＲｍ３２の固定化を確認することはできなかった。
【００６９】
実施例８ 抗体結合量と有効固定化率の算出
（１）実施例６および７で作製したＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲル、ならびに比較例２で作製したＦｃＲｍ３２固定化ゲル（比較例３で作製したゲルはＦｃＲｍ３２の固定化が確認できなかったため除外）、各５０μＬをそれぞれ１ｍＬ容量のカラムに充填した。
（２）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１５０μＬ添加することでゲルを平衡化後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）１０ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（３）１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄することで未吸着のヒト抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することでゲルに吸着したヒト抗体を溶出させた。
（４）溶出液の中の抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することで算出した。なお、１％濃度の抗体溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）を１４．０として算出している。
【００７０】
結果を表５に示す。システインタグを付加したＦｃ結合性タンパクであるＦｃＲｍ３２Ｃをエポキシトヨパールに固定化したゲル（実施例６）では１ｍＬあたり６．４ｍｇの抗体が吸着され、ＦｃＲｍ３２ＣをマレイミドトヨパールＡに固定化したゲル（実施例７）では１ｍＬあたり４．８ｍｇの抗体が吸着された。一方、システインタグを付加しないＦｃ結合性タンパクであるＦｃＲｍ３２をエポキシトヨパールに固定化したゲル（比較例２）では１ｍＬあたりの抗体吸着量は４．９ｍｇにとどまった。
【００７１】
またゲルに固定したＦｃ結合性タンパク質が機能している割合（有効固定化率）を計算した。なお、抗体およびＦｃ結合性タンパク質の分子量はそれぞれ約１５万、約３万であり、抗体とＦｃ結合性タンパク質とは１対１結合する前提の下、計算している。表５に示すように、ＦｃＲｍ３２Ｃをエポキシトヨパールに固定化したゲル（実施例６）の有効固定化率は４４％であり、ＦｃＲｍ３２ＣをマレイミドトヨパールＡに固定化したゲル（実施例７）の有効固定化率は６９％である一方、ＦｃＲｍ３２をエポキシトヨパールに固定化したゲル（比較例２）の有効固定化率は２３％であった。
【００７２】
【表５】
実施例９ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂおよびＦｃＲｍ５６ｂＣ）の調製
（１）前述したＦｃＲｍ３２とは異なるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂを含むポリペプチドを発現可能なベクターを、特開２０１１−２０６０４６号公報に記載の方法に従い調製した。なお、ＦｃＲｍ５６ｂは配列番号５３に記載のアミノ酸のうち、１６番目から２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。
（２）（１）で調製した発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、比較例１に記載の方法に従ってＦｃＲｍ５６ｂを調製した。結果、ＦｃＲｍ５６ｂは大腸菌培養液１Ｌあたり約２１ｍｇ調製することができた。
（３）ＦｃＲｍ５６ｂにシステインタグ（配列番号５５）を付与したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ５６ｂＣ）を実施例３および４の方法に従って調製した。結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣは大腸菌培養液１Ｌあたり約１３ｍｇ調製することができた。
【００７３】
実施例１０ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃおよびＦｃＲｍ６０ｃＣ）の調製
（１）前述したＦｃＲｍ３２とは異なるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃを含むポリペプチドを発現可能なベクターを、特開２０１１−２０６０４６号公報に記載の方法に従い調製した。なお、ＦｃＲｍ６０ｃは配列番号５３に記載のアミノ酸のうち、１６番目から２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。
（２）（１）で調製した発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、比較例１に記載の方法に従ってＦｃＲｍ６０ｃを調製した。結果、ＦｃＲｍ６０ｃは大腸菌培養液１Ｌあたり約１２ｍｇ調製することができた。
（３）ＦｃＲｍ６０ｃにシステインタグ（配列番号５５）を付与したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ６０ｃＣ）を実施例３および４の方法に従って調製した。結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣは大腸菌培養液１Ｌあたり約５ｍｇ調製することができた。
【００７４】
実施例１１ ポリメタクリレートゲルへのマレイミド基の導入（その１）
（１）ポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））約２０ｍＬをグラスフィルター上で吸引ろ過し、そのまま吸引乾燥して得られたゲル１７ｇに水２４．７ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８．５ｍＬ、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ）０．１７ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（１００ｍＬ）で５回、１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）で５回、水（１００ｍＬ）で５回洗浄し、エポキシ基を導入したゲルを作製した。
（２）（１）で作製したゲル１２ｇに水２４ｍＬ、エチレンジアミン６．５ｇを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（５０ｍＬ）で４回、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍＬ）で４回洗浄した。
（３）洗浄後、吸引乾燥して得られたゲル５ｇにＤＭＦ１０ｍＬを加えて０℃に冷却後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−コハク酸イミジル４０ｍｇを加えた。
（４）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／ＤＭＦ＝１：４の混合液（０．７５ｍＬ）を加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、ゲルをＤＭＦ（１５ｍＬ）で４回、水（１５ｍＬ）で４回洗浄することで、マレイミド基を導入したゲル（以下、マレイミドトヨパールＢとする）を作製した。
【００７５】
実施例１２ ポリメタクリレートゲルへのマレイミド基の導入（その２）
（１）グラスフィルター上で吸引乾燥して得られたポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））３ｇに０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３ｍＬ、ＨＤＧＥ３ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）で４回、水（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄したゲルに０．５Ｍの２−メルカプト酢酸ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウムでｐＨ ８．０に調整）９ｍＬを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（３）洗浄後吸引乾燥により得られたゲルに０．１Ｍの硫酸３ｍＬ加え、７０℃で１時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回、ＤＭＦ（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（４）洗浄したゲル０．５ｇにＤＭＦ０．６５ｍＬを加え０℃に冷却後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−コハク酸イミジルのＤＭＦ溶液（３４．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＦ））０．０５ｍＬを加えた。
（５）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン：ＤＭＦ＝１：４の混合液０．１５ｍＬを加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、ゲルをＤＭＦ（５ｍＬ）で４回、水（５ｍＬ）で４回で洗浄することで、マレイミド基を導入したゲル（以下、マレイミドトヨパールＣとする）を作製した。
【００７６】
実施例１３ ポリメタクリレートゲルへのクロロアセチル基の導入
（１）実施例５で作製したエポキシトヨパール１ｇに水０．５ｍＬ、２８％アンモニア水２ｍＬを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（５０ｍＬ）で４回、アセトニトリル（５０ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄後吸引乾燥により得られたエポキシトヨパール１ｇにアセトニトリル２ｍＬを加え０℃に冷却後、２−クロロ酢酸クロリド（８０μＬ）を加えた。
（３）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）を加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、エポキシトヨパールをアセトニトリル（１０ｍＬ）で４回、水（１０ｍＬ）で４回洗浄することで、クロロアセチル基を導入したゲル（以下、クロロアセチルトヨパールとする）を作製した。
【００７７】
実施例１４ ポリメタクリレートゲルへの３−ブロモ−２−ヒドロキシル基の導入
（１）グラスフィルター上で吸引乾燥して得られたポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））１．５ｇに水１．９５ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．７５ｍＬ、アリルグリシジルエーテル０．７５ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（１５ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）で４回、水（１５ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄後のゲルに水４．２ｍＬ、ＤＭＳＯ１．４ｍＬ、Ｎ―ブロモコハク酸イミド４１４ｍｇを添加し、水浴上、常温で１時間撹拌振とうした。反応終了後、溶液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（２０ｍＬ）で４回洗浄することで、ブロモヒドリン基を導入したゲル（以下、ブロモヒドリントヨパールとする）を作製した。
【００７８】
実施例１５ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析後、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加した。同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてＦｃＲｍ５６ｂＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．５ｍＬ（濃度４．０ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置した。静置後の溶液に、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬと、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１８μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてエポキシトヨパールを洗浄した。
【００７９】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化率は６５．３％であり、エポキシトヨパール１ｍＬあたり１３．０ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量は２４．７ｍｇ、有効固定化率は３７．８％であった。
【００８０】
実施例１６ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のマレイミド基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ５６ｂＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）実施例１１で調製したマレイミドトヨパールＢ０．１ｍＬにＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．２ｍＬ（濃度８．１ｍｇ／ｍＬ）およびトリカルボキシエチルフォスフィン（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置した。静置後の溶液に、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６３μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、マレイミドトヨパールＢを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いて洗浄した。
【００８１】
マレイミドトヨパールＢへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化率は６０．３％であり、マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたり１９．４ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたりの抗体結合量は４９．７ｍｇ、有効固定化率は５１．２％であった。
【００８２】
実施例１７ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．３ｍＬ（濃度２．１ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、４℃で１時間静置後、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．０５ｍＬ（ベッドボリューム）添加し、３５℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次ゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００８３】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は７６．３％であり、エポキシトヨパール１ｍＬあたり９．７ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量は１６．８ｍｇ、有効固定化率は３４．７％であった。
【００８４】
実施例１８ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のマレイミド基を導入したゲルへの固定化（その１）
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）実施例１１で調製したマレイミドトヨパールＢ０．０３ｍＬにＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．２ｍＬ（濃度２．７ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４℃で１時間静置後、３５℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、マレイミドトヨパールＢを１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＢを調製した。
【００８５】
マレイミドトヨパールＢへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は２６．０％であり、マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたり４．６ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたりの抗体結合量は２１．２ｍｇ、有効固定化率は９１．１％であった。
【００８６】
比較例４ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５の（１）から（２）と同様な方法で、実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂの濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）濃縮脱塩処理後のＦｃＲｍ５６ｂ溶液０．３ｍＬ（濃度６．６ｍｇ／ｍＬ）に、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベットボリューム）と、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１４６μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例１５（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ５６ｂ固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００８７】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂの固定化率は５６．６％であり、ゲル１ｍＬ当たり１１．２ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂが固定化されていた。また、ＦｃＲｍ５６ｂ固定化エポキシトヨパールについて、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が１６．２ｍｇ、有効固定化率が２８．９％となった。
【００８８】
比較例５ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）から（２）と同様な方法で、実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃの濃縮およびバッファー交換操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ６０ｃ溶液０．３ｍＬ（濃度２．４ｍｇ／ｍＬ）に実施例５で作製したエポキシトヨパール０．０５ｍＬ（ベットボリューム）を添加し、３５℃で２時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例１７（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ６０ｃ固定化ゲルを調製した。
【００８９】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃの固定化率は５９．４％であり、エポキシトヨパール１ｍＬ当たり８．６ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃが固定化されていた。また、ＦｃＲ６０ｃ固定化エポキシトヨパールについて、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が９．７ｍｇ、有効固定化率が２２．５％となった。
【００９０】
実施例１９ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のクロロアセチル基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５（１）から（２）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．１２ｍＬ（濃度１２．８ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１３で作製したクロロアセチルトヨパール０．０５ｍＬ（ベッドボリューム）、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４３μＬおよび１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いてクロロアセチルトヨパールを洗浄した。
【００９１】
クロロアセチルトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、反応残渣中にＦｃＲｍ５６ｂＣは検出されず（すなわち固定率１００％）、クロロアセチルトヨパール１ｍＬあたり３０．７ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲ固定化クロロアセチルトヨパールの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、クロロアセチルトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が２０．５ｍｇ、有効固定化率が１３．４％であった。
【００９２】
実施例２０ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のブロモヒドリン基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５の（１）から（２）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．１５ｍＬ（濃度１２．３ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１４で作製したブロモヒドリントヨパールを０．０５ｍＬ、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬ、および１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬ添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化ブロモヒドリントヨパールを調製した。
【００９３】
ゲルへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定率は５３．６％、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたり１９．８ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲルの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ゲル１ｍＬあたりの抗体結合量が３３．３ｍｇ、有効固定化率が３３．４％であった。
【００９４】
実施例２１ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のブロモメチル基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液の濃縮を行なった。
（２）（１）の濃縮溶液を、６００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．２ｍＬ（濃度３．５ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１４で作製したブロモヒドリントヨパール０．０３ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ブロモヒドリントヨパールを調製した。
【００９５】
ブロモヒドリントヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定率は４３．９％、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたり１０．１ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ブロモヒドリントヨパールの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が１４．１ｍｇ、有効固定化率が２７．８％であった。
【００９６】
実施例２２ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のヨードアセチル基を有したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液の濃縮を行なった。
（２）（１）の濃縮溶液を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．１５ｍＬ（濃度６．１ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（活性基：ヨードアセチル基、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．０５ｍＬ添加し、２５℃で１時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ゲルを調製した。
【００９７】
ゲルへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は４９．９％であり、ゲル１ｍＬあたり９．１ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ゲルの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ゲル１ｍＬあたりの抗体結合量が１４．４ｍｇ、有効固定化率が３１．７％であった。
【００９８】
実施例２３ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のマレイミド修飾ゲルへの固定化（その２）
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、２００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）実施例１２で作製したマレイミドトヨパールＣ０．０３ｍＬ（ベットボリューム）に、ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．３３ｍＬ（濃度５．５ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４℃で１時間静置後、３５℃で０．５時間反応させた。
（４）反応終了後、ゲルを１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＣを調製した。
【００９９】
マレイミドトヨパールＣへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は２７．２％であり、マレイミドトヨパールＣ１ｍＬあたり１６．５ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＣの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、マレイミドトヨパールＣ１ｍＬあたりの抗体結合量が５１．６ｍｇ、有効固定化率が６２．７％であった。
【０１００】
反応に供したゲル基材、リガンドＦｃＲおよび有効固定化率について、表５（前述）および６にまとめた。以上の結果をまとめると、システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質は、担体表面における方向性が著しく向上するため、抗体への結合能を保持した状態で担体に固定化することができ、結果としてゲルあたりの抗体吸着量を向上させることができることが分かる。
【０１０１】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率に担体へ固定化可能なＦｃ結合性タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記タンパク質の製造方法、および前記タンパク質を担体に固定化することで得られる吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造する。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質に対し特異的に結合可能な物質（リガンド）を不溶性の担体に固定化することで得られる吸着剤を用いたクロマトグラフィーであり、抗体と特異的に結合可能な物質をリガンドにすることで、培養液から抗体を特異的に吸着させることができ、結果として抗体の高純度な精製を可能としている。特に抗体製造の分野では、プロテインＡをリガンドとした吸着剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーが多用されている。一方で、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子であるＦｃ受容体やＦｃ領域結合能を有したＦｃ受容体の部分領域（以下、合わせてＦｃ結合性タンパク質という）もプロテインＡと同様、抗体を特異的に吸着可能なリガンドとして用いることができる（特許文献１）。
【０００４】
リガンドを担体に固定化する際、リガンド表面に存在する反応性の高い側鎖、例えばリジン残基が有するε−アミノ基を、担体に導入したエポキシ基等の活性基を介して共有結合により担体に固定化する方法が一般的に用いられている。しかしながら、リガンドを担体に固定化する際、リガンドの方向性を無視しランダムに固定化すると、当該リガンドが有する抗体結合領域の一部が担体表面側に固定化されるため、その分吸着剤が有する抗体結合性が損なわれる問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１２６４３６号公報
【特許文献２】特開２０１１−０９７８９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（１０），ｅ４３，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を担体に固定化させる際、その方向性を有した状態で固定化させることが可能なタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を担体に固定化して得られる吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にシステインを含むオリゴペプチドを付加することで、担体へ固定化させる際、該タンパク質に方向性を付与した状態で固定化させることができ、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
第一の態様は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質である。
【０００９】
第二の態様は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドが配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、前記第一の態様に記載のタンパク質である。
【００１０】
第三の態様は、Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
前記第一または第二の態様に記載のタンパク質である。
【００１１】
第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１２】
第五の態様は、前記第四の態様に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１３】
第六の態様は、前記第五の態様に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体である。
【００１４】
第七の態様は、前記第六の態様に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法である。
【００１５】
第八の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤である。
【００１６】
第九の態様は、担体が、その表面に活性基を有しており、かつ前記活性基が、エポキシ基、マレイミド基、クロロアセチル基、ブロモヒドリン基、ブロモメチル基、ヨードアセチル基のいずれかである、前記第八の態様に記載の抗体吸着剤である。
【００１７】
第十の態様は、前記第八または第九の態様に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法である。
【００１８】
第十一の態様は、タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加することで、前記タンパク質に方向性を付与した状態で担体へ固定化可能な、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド（以下、システインタグという）を付加するＦｃ結合性タンパク質とは、Ｆｃ領域を含む抗体（ＩｇＧ）と結合可能なタンパク質のことをいい、Ｆｃ受容体およびその部分領域を例示することができる。Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体の場合、構造と機能からヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂおよびヒトＦｃγＲＩＩＩに分類され、その中でもヒトＦｃγＲＩは抗体との親和性が高い点で、システインタグを付加するＦｃ結合性タンパク質として好ましい。
【００２１】
ヒトＦｃγＲＩは、抗体と結合するα鎖と、α鎖と作用し免疫信号を細胞質内に伝達するγ鎖からなり、α鎖の構造の概略を図１に示す。ヒトＦｃγＲＩのα鎖は、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド（ＳＳ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。本発明におけるシステインタグを付加するＦｃ結合性タンパク質として、前記ＦｃγＲＩの全領域を用いてもよいが、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域を含むタンパク質とすると、Ｆｃ領域結合能を有しつつ遺伝子工学的手法により細胞外にタンパク質を発現させることができるため、好ましい。なお、Ｆｃ結合性タンパク質の熱、酸およびアルカリに対する安定性をさらに向上させることを目的に、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域にあるアミノ酸の一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質であってもよい。さらに、ポリヒスチジンタグといった、精製等を行なうためのタグペプチドをＮ末端側またはＣ末端側に付加してもよい。配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域にあるアミノ酸の一つ以上を他のアミノ酸に置換したポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質の例として、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含む、タンパク質があげられる（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号５３の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号５３の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号５３の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号５３の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号５３の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号５３の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号５３の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号５３の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号５３の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号５３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号５３の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号５３の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号５３の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号５３の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号５３の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号５３の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号５３の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号５３の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号５３の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号５３の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号５３の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号５３の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号５３の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号５３の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号５３の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号５３の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号５３の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号５３の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号５３の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号５３の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号５３の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号５３の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号５３の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号５３の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号５３の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号５３の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号５３の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号５３の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号５３の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号５３の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号５３の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号５３の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号５３の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号５３の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号５３の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号５３の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号５３の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号５３の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号５３の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号５３の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号５３の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号５３の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号５３の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号５３の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号５３の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号５３の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号５３の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号５３の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号５３の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号５３の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号５３の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号５３の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号５３の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号５３の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号５３の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号５３の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号５３の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号５３の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号５３の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号５３の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号５３の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号５３の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号５３の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号５３の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号５３の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号５３の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号５３の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号５３の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号５３の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号５３の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号５３の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号５３の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号５３の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号５３の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号５３の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号５３の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号５３の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号５３の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号５３の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号５３の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号５３の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号５３の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号５３の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号５３の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号５３の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号５３の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号５３の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号５３の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号５３の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号５３の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号５３の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号５３の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号５３の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号５３の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号５３の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号５３の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号５３の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号５３の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号５３の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号５３の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号５３の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号５３の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号５３の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号５３の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号５３の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号５３の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号５３の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号５３の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号５３の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号５３の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号５３の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号５３の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号５３の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号５３の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号５３の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号５３の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号５３の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号５３の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号５３の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号５３の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号５３の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号５３の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号５３の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号５３の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号５３の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号５３の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号５３の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号５３の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号５３の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号５３の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号５３の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号５３の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号５３の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号５３の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号５３の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号５３の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号５３の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号５３の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号５３の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号５３の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号５３の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号５３の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号５３の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号５３の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号５３の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号５３の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号５３の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号５３の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号５３の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号５３の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号５３の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号５３の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号５３の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号５３の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号５３の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号５３の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１６７）配列番号５３の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号５３の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
本発明において、システインタグの長さは当該タグを付加するＦｃ結合性タンパク質が有する抗体（Ｆｃ領域）結合能を損なわない限り、１残基から１００残基の範囲の中から任意に設定でき、特に５残基から２０残基の範囲に設定するとよい。システインタグに含まれるシステイン残基は１つ以上あればよいが、２つ以上含む場合はシステインタグ内でＳ−Ｓ結合が形成されないよう設計する必要がある。システインタグを構成するシステイン以外のアミノ酸残基の種類は、担体表面の物性を考慮の上、担体表面と相互作用しやすい物性を有したアミノ酸残基を適宜選択すればよい。本発明におけるシステインタグの一例として配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドがあげられる。
【００２２】
Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にシステインタグを付加して得られる本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドという）の作製方法としては、
（Ｉ）本発明のタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）本発明のタンパク質のうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製後、当該調製したポリヌクレオチドの５’末端側または３’末端側に遺伝子工学的手法によりシステインタグをコードするオリゴヌクレオチドを付加する方法、が例示できる。
【００２３】
なお、アミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することによっても可能である。また、前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特許文献２）。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクター等を例示することができる。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造することができる。具体的には、当該形質転換体を培養し、その培養物から本発明のタンパク質を何らかの方法で回収すればよい。なお、本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの導入の有無によって選択的に形質転換体を増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに、グリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本実施形態のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２７】
本発明のタンパク質を回収するには、培養物から何らかの方法でＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。本発明の形質転換体の培養液から、本発明のタンパク質を抽出するには、当該タンパク質の発現の形態により適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、本発明のタンパク質を抽出すればよい。抽出した本発明のタンパク質を含む溶液から本発明のタンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のタンパク質を高純度に調製することができる。調製した高純度な本発明のタンパク質は、還元剤存在下で保存すると安定に保存できるため好ましく、還元剤としてはジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンまたはトリカルボキシエチルフォスフィンを例示することができる。還元剤の濃度は、１ｎＭから１００ｍＭの範囲の中から使用する還元剤の還元力より判断し適宜設定すればよく、１μＭから１０ｍＭの範囲とすると好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させることで、本発明の抗体吸着剤を作製することができる。本発明の抗体吸着剤の作製に用いる不溶性の担体は特に限定はないが、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質ゲル、またはポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子ゲルが好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００２９】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化する際は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、マレイミド基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を介して担体と共有結合により固定化すればよい。活性基を有した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件にて担体表面に活性基を導入し調製してもよい。表面に活性基を有した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を例示できる。担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例として、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。また前記化合物により担体表面に導入したエポキシ基にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００３０】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としてはＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−[α―マレイミドアセトキシ]コハク酸イミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（コハク酸イミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（コハク酸イミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを例示できる。
【００３１】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを例示できる。
【００３２】
また、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω―アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω―アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω―アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロコハク酸イミド、Ｎ−ブロモコハク酸イミド、Ｎ−ヨードコハク酸イミドを例示できる。
【００３３】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面にあるカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法もある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールが例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３４】
担体への活性基導入量は担体１ｍＬあたり１ｎｍｏｌから１ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１μｍｏｌから１００μｍｏｌである。
【００３５】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させる際は、本発明のタンパク質を緩衝液に溶解し、担体が有する活性基と反応させればよく、緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示することができる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃の範囲の中から活性基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮の上適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００３６】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化させる方法の具体例として、本発明のタンパク質に含まれるカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを作用させてＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基に変換し、アミノ基を有する担体に固定化させる方法があげられる。
【００３７】
本発明のタンパク質を不溶性の担体に固定化して得られる抗体吸着剤（以下、単に本発明の抗体吸着剤という）で精製可能な抗体は、Ｆｃ領域を有する抗体（ＩｇＧ）であれば特に制限はなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、ウサギ抗体を例示することができる。
【００３８】
本発明の抗体吸着剤を用いた、抗体の精製方法に特に制限はないが、空カラムに本発明の抗体吸着剤を充填して得られるカラムを用いたクロマトグラフィーによる精製方法が抗体を高純度に精製できる点で好ましい。本発明の抗体吸着剤により精製する、抗体を含む溶液としては、抗体を生産する宿主の培養液や、当該培養液を遠心分離等により細胞を除去した培養上清を例示できる。カラムの大きさ（本発明の抗体吸着剤の充填量）は精製原料の処理量を考慮の上、適宜決定すればよい。
【００３９】
本発明の抗体吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加する際は、送液量を考慮しポンプ等の送液手段を用いて添加すればよい。なお、本発明の抗体吸着剤を充填したカラムは、抗体を添加する前に、あらかじめ適切な緩衝液を用いて平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。前記抗体吸着剤に吸着させた抗体を溶出させるには、前記抗体吸着剤と抗体との相互作用を弱める緩衝液を用いればよく、具体的には、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示することができる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ３から６、より好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のタンパク質は、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド（システインタグ）をＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質であり、前記Ｆｃ結合性タンパク質に方向性を付与した状態で担体に固定化させることができる。その結果、担体に固定化したＦｃ結合性タンパク質のうち抗体への結合能を保持しているタンパク質の割合（有効固定化率）を向上させることができる。よって、本発明のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤は、システインタグを付加しないＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤と比較し、ゲル当たりの抗体吸着量を向上させることができ、抗体精製コストを低減させることができる。
【００４１】
なお、本発明のタンパク質を得る際、Ｆｃ結合性タンパク質に付加したシステインタグ（例えば、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド）は、Ｆｃ結合性タンパク質以外のタンパク質に対しても、本発明のタンパク質と同様、Ｎ末端側またはＣ末端側に付加することで、方向性を付与した状態で担体に固定化することができる。このため、前記システインタグはタンパク質を効率的に担体に固定化させるのに有効といえる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｆｃ結合性タンパク質の概略構造を示す図である。
【図２】ｐＥＴＭａｌＥの概略構造を示す図である。
【図３】ｐＥＴＦｃＲｍ３２発現ベクターの概略構造を示す図である。
【図４】ｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃ発現ベクターの概略構造を示す図である。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質をコードする発現ベクターの作製
配列番号１に示す、Ｆｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドを発現可能なベクターを以下の方法により作製した。配列番号１のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）、３０８番目から３１３番目までのヒスチジンがＦｃ結合タンパク質の定量または精製のために導入したポリヒスチジンタグである。なおＦｃＲｍ３２は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。またＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置に、それぞれある。
（１）ＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチド（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡＫＩＥＥＭ、配列番号５４）をコードするポリヌクレオチドを作製するために、下記に示す２段階のＰＣＲを行なった。
（１−１）１段階目のＰＣＲ反応を、表１に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうことで実施した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
なお表１に示す反応液の組成のうち、オリゴヌクレオチドミックスは、
配列番号２（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、
配列番号３（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、
配列番号４（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、および
配列番号５（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）
に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチド（本明細書の実施例で用いたオリゴヌクレオチドはいずれもＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ社製である）溶液（濃度：５０ｐｍｏＬ／μＬ）を、それぞれ等量ずつ採取し混合した溶液である。
（１−２）２段階目のＰＣＲ反応を、表２に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうことで実施し、ＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
なお、表２に示す反応液の組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲ反応液を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号２および５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
（２）（１）で調製したＭａｌＥシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥの構造を図２に示す。
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでの領域からなるポリペプチド（ＦｃＲｍ３２、２７４アミノ酸）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、下記に示すＰＣＲを用いてアッセンブリーする方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（１０），ｅ４３，２００２：非特許文献１）により作製した。
（４−１）１段階目のＰＣＲ反応は、表３に示す反応液を用いて、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００４９】
【表３】
【００５０】
なお、表３に示す反応液の組成のうち、オリゴヌクレオチドミックスは、設計した配列番号７から配列番号４４に記載の配列からなる、３８種類のオリゴヌクレオチド溶液（濃度：５０ｐｍｏＬ／μＬ）をそれぞれ等量ずつ採取し混合した溶液である。
（４−２）２段階目のＰＣＲ反応は、表４に示す反応液を用いて、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００５１】
【表４】
【００５２】
なお、表４に示す反応液の組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲの反応液を用い、ＰＣＲプライマーは、
配列番号４５（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）および
配列番号４６（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドはＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のＣ末端側に精製を容易にするためのポリヒスチジンタグ（ヒスチジン６残基からなる）が付加されるよう設計したオリゴヌクレオチドである。
（４−３）２段階目のＰＣＲの反応液をアガロースゲルから抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社製）することで、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（５）（３）で作製したベクターｐＥＴＭａｌＥ（図２）と、（４）で作製したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養し、定法に従いプラスミドを抽出後（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ：キアゲン社製）、発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２を得た。図３に概略構造を示す。
（７）ＦｃＲｍ３２を発現させるために、ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
【００５３】
実施例２ ポリヌクレオチドの塩基配列の解析
前述したベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）に挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、
配列番号４７（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および、
配列番号４８（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。解析の結果、ｐＥＴＦｃＲｍ３２に挿入されたポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００５４】
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質へのシステインタグの導入
（１）表４に示す反応液の組成のうち、鋳型を実施例１で作製したベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）に、ＰＣＲプライマーを、
配列番号４９（５’−ＡＡＣＡＴＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）、および
配列番号５０（５’−ＴＴＣＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドに、それぞれ変更した他は実施例１（４−２）と同様な方法でＰＣＲ反応を行なった。
（２）実施例１（５）から（６）と同様な方法により、Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のＣ末端側にシステインタグ（ＧＧＳＧＧＣＧ、配列番号５５）を付加したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ３２Ｃ）を発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃを調製した。
（３）ＦｃＲｍ３２Ｃを発現させるために、ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃにより大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社製）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換した。
（４）ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃに挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列を実施例２と同様な方法で確認した。
【００５５】
ベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃの構造概略を図４に示す。また、ＦｃＲｍ３２Ｃをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号５２に、ＦｃＲｍ３２Ｃのアミノ酸配列を配列番号５１にそれぞれ示す。なお、配列番号５１のうち１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。
【００５６】
実施例４ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の調製
（１）実施例３で作製したＦｃＲｍ３２Ｃを発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２Ｃ（図４）を導入した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とうすることで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（２Ｌ）に添加し３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換え、さらにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加して、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離操作（１００００×ｇで２０分間）により得られた湿菌体を、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）とを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、４℃に冷却しながら超音波破砕処理を行なった。
（５）遠心分離操作（４℃、１００００×ｇで２０分間）により、ＦｃＲｍ３２Ｃを含む溶液を遠心上清として回収した。
（６）（５）の遠心上清に１１４ｇ／Ｌとなるように硫酸アンモニウムを添加し、生成した沈殿を遠心分離操作（４℃、１２０００×ｇで２０分間）により除去した。
（７）（６）の遠心上清を、あらかじめ１１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ６ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、２０％のグリセロールを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。
（８）（７）の溶出液に純水を添加して導電率を１０ｍＳ／ｃｍ以下まで低下させた後、終濃度１Ｍとなるように尿素を添加した。この溶液を、あらかじめ１Ｍの尿素を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍゲル（東ソー株式会社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１Ｍの尿素と２ＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。
（９）（８）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ３ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と１０％のグリセリンとを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着したＦｃＲｍ３２Ｃを溶出した。なお溶出の際は、溶出液を中性付近に戻すため、溶出量に対し約１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した試験管に溶出液を集めた。
（１０）溶出されたＦｃＲｍ３２Ｃの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認し、均一なタンパク質であることを確認した。
（１１）精製したＦｃＲｍ３２Ｃを、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質：キット添付の抗体）を用いて定量した。
【００５７】
結果、ＦｃＲｍ３２Ｃは大腸菌培養液１Ｌあたり約５ｍｇ調製することができた。
【００５８】
比較例１ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の調製
（１）実施例１で作製したＦｃＲｍ３２を発現可能なベクターｐＥＴＦｃＲｍ３２（図３）により形質転換された形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とうすることで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（２Ｌ）に添加し３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換えて、さらにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加して、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離操作（１００００×ｇ、２０分間）により得られた湿菌体を、５００ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、和光純薬社製）および２０ｍＭ イミダゾール（和光純薬社製）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、４℃に冷却しながら超音波破砕処理を行なった。
（５）遠心分離操作（４℃、１００００×ｇで２０分間）により、ＦｃＲｍ３２を含む溶液を遠心上清として回収した。
（６）（５）の遠心上清を、あらかじめ５００ｍＭのＮａＣｌと０．１％のＴｗｅｅｎ２０と２０ｍＭのイミダゾールとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートゲル（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ３ｃｍ）に添加し、同緩衝液で洗浄後、５００ｍＭのＮａＣｌと０．１％のＴｗｅｅｎ２０と５００ｍＭのイミダゾールとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ゲルに吸着したＦｃＲｍ３２を溶出した。
（７）（６）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と１０％のグリセリンとを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃＲｍ３２を溶出した。なお溶出の際は、溶出液を中性付近に戻すため、溶出量に対して約１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した試験管に溶出液を集めた。
（８）溶出されたＦｃＲｍ３２の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認し、均一なタンパク質であることを確認した。
（９）精製したＦｃＲｍ３２を、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質：キット添付の抗体）を用いて定量した。
【００５９】
結果、ＦｃＲｍ３２は大腸菌培養液１Ｌから約２１ｍｇ調製することができた。
【００６０】
実施例５ ポリメタクリレートゲルへのエポキシ基の導入
ポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））約２ｍＬをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥して得られたゲル２．０ｇに水１．０ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬ、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）２．０ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（２０ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）で４回、水（２０ｍＬ）で４回洗浄することでエポキシ基を導入したゲル（以下、エポキシトヨパールとする）を作製した。
【００６１】
実施例６ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の固定化（その１）
（１）実施例４で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２Ｃ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ３２Ｃを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、あらかじめ５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ３２Ｃ溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加し、１時間静置後、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベッドボリューム）および３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲルを調製した。
【００６２】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ３２Ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２Ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２Ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２Ｃの固定化率は５４．７％であり、ゲル１ｍＬあたり２．９ｍｇのＦｃＲｍ３２Ｃが固定化されていた。
【００６３】
実施例７ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２Ｃ）の固定化（その２）
（１）カルボキシル基を導入したトヨパール（登録商標）（以下、単にカルボキシトヨパールとする）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を用いて活性エステルへと誘導し、２０ｍＭのＮ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジドを添加することでマレイミド基を導入した。
（２）マレイミド基を導入した担体に、２５０ｍＭのエタノールアミンと０．２５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２５℃で３０分反応させることで残存するＮＨＳ活性基を不活化した。
（３）ＮＨＳ活性基を不活化させた後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて洗浄することで、マレイミド基を導入したゲルＡ（以下、マレイミドトヨパールＡ）を調製した。
（４）（３）で得られたマレイミドトヨパールＡ０．１ｍＬ（ベットボリューム）に、ＦｃＲｍ３２Ｃ溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置後、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（５）反応終了後、ゲルを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて洗浄することで、ＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲルを調製した。
【００６４】
マレイミドトヨパールＡへのＦｃＲｍ３２Ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２Ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２Ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２Ｃの固定化率は２６．４％であり、マレイミドトヨパールＡ１ｍＬあたり１．４ｍｇのＦｃＲｍ３２Ｃが固定化されていた。
【００６５】
比較例２ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の固定化（その１）
（１）実施例６（１）から（２）と同様な方法で、参考例１で調製したＦｃＲｍ３２の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）濃縮脱塩処理後のＦｃＲｍ３２溶液０．１ｍＬ（濃度８．５ｍｇ／ｍＬ）に０．１ｍＬのエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベットボリューム）および３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例６（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ３２固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００６６】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ３２の固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２の量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２の量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ３２の固定化率は４９．４％であり、ゲル１ｍＬ当たり４．２ｍｇのＦｃＲｍ３２が固定化されていた。
【００６７】
比較例３ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の固定化（その２）
（１）実施例７（１）から（３）の方法で得られたマレイミドトヨパールＡを０．１ｍＬ（ベットボリューム）分取し、ＦｃＲｍ３２溶液０．１ｍＬ（濃度５．３ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置後、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７３μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。
（２）反応終了後、実施例７（５）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ３２固定化ゲルを調製した。
【００６８】
マレイミドトヨパールＡへのＦｃＲｍ３２の固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ３２の量から反応液に残存したＦｃＲｍ３２の量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算したが、ＦｃＲｍ３２の固定化を確認することはできなかった。
【００６９】
実施例８ 抗体結合量と有効固定化率の算出
（１）実施例６および７で作製したＦｃＲｍ３２Ｃ固定化ゲル、ならびに比較例２で作製したＦｃＲｍ３２固定化ゲル（比較例３で作製したゲルはＦｃＲｍ３２の固定化が確認できなかったため除外）、各５０μＬをそれぞれ１ｍＬ容量のカラムに充填した。
（２）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１５０μＬ添加することでゲルを平衡化後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）１０ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（３）１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄することで未吸着のヒト抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することでゲルに吸着したヒト抗体を溶出させた。
（４）溶出液の中の抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することで算出した。なお、１％濃度の抗体溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）を１４．０として算出している。
【００７０】
結果を表５に示す。システインタグを付加したＦｃ結合性タンパクであるＦｃＲｍ３２Ｃをエポキシトヨパールに固定化したゲル（実施例６）では１ｍＬあたり６．４ｍｇの抗体が吸着され、ＦｃＲｍ３２ＣをマレイミドトヨパールＡに固定化したゲル（実施例７）では１ｍＬあたり４．８ｍｇの抗体が吸着された。一方、システインタグを付加しないＦｃ結合性タンパクであるＦｃＲｍ３２をエポキシトヨパールに固定化したゲル（比較例２）では１ｍＬあたりの抗体吸着量は４．９ｍｇにとどまった。
【００７１】
またゲルに固定したＦｃ結合性タンパク質が機能している割合（有効固定化率）を計算した。なお、抗体およびＦｃ結合性タンパク質の分子量はそれぞれ約１５万、約３万であり、抗体とＦｃ結合性タンパク質とは１対１結合する前提の下、計算している。表５に示すように、ＦｃＲｍ３２Ｃをエポキシトヨパールに固定化したゲル（実施例６）の有効固定化率は４４％であり、ＦｃＲｍ３２ＣをマレイミドトヨパールＡに固定化したゲル（実施例７）の有効固定化率は６９％である一方、ＦｃＲｍ３２をエポキシトヨパールに固定化したゲル（比較例２）の有効固定化率は２３％であった。
【００７２】
【表５】
実施例９ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂおよびＦｃＲｍ５６ｂＣ）の調製
（１）前述したＦｃＲｍ３２とは異なるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂを含むポリペプチドを発現可能なベクターを、特開２０１１−２０６０４６号公報に記載の方法に従い調製した。なお、ＦｃＲｍ５６ｂは配列番号５３に記載のアミノ酸のうち、１６番目から２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。
（２）（１）で調製した発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、比較例１に記載の方法に従ってＦｃＲｍ５６ｂを調製した。結果、ＦｃＲｍ５６ｂは大腸菌培養液１Ｌあたり約２１ｍｇ調製することができた。
（３）ＦｃＲｍ５６ｂにシステインタグ（配列番号５５）を付与したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ５６ｂＣ）を実施例３および４の方法に従って調製した。結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣは大腸菌培養液１Ｌあたり約１３ｍｇ調製することができた。
【００７３】
実施例１０ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃおよびＦｃＲｍ６０ｃＣ）の調製
（１）前述したＦｃＲｍ３２とは異なるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃを含むポリペプチドを発現可能なベクターを、特開２０１１−２０６０４６号公報に記載の方法に従い調製した。なお、ＦｃＲｍ６０ｃは配列番号５３に記載のアミノ酸のうち、１６番目から２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつＴｈｒ２０Ｐｒｏ（配列番号５３の２０番目のスレオニンをプロリンに置換、以下同じ）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐの置換を導入したＦｃ結合性タンパク質である。
（２）（１）で調製した発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、比較例１に記載の方法に従ってＦｃＲｍ６０ｃを調製した。結果、ＦｃＲｍ６０ｃは大腸菌培養液１Ｌあたり約１２ｍｇ調製することができた。
（３）ＦｃＲｍ６０ｃにシステインタグ（配列番号５５）を付与したポリペプチド（以下、ＦｃＲｍ６０ｃＣ）を実施例３および４の方法に従って調製した。結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣは大腸菌培養液１Ｌあたり約５ｍｇ調製することができた。
【００７４】
実施例１１ ポリメタクリレートゲルへのマレイミド基の導入（その１）
（１）ポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））約２０ｍＬをグラスフィルター上で吸引ろ過し、そのまま吸引乾燥して得られたゲル１７ｇに水２４．７ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８．５ｍＬ、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ）０．１７ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（１００ｍＬ）で５回、１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）で５回、水（１００ｍＬ）で５回洗浄し、エポキシ基を導入したゲルを作製した。
（２）（１）で作製したゲル１２ｇに水２４ｍＬ、エチレンジアミン６．５ｇを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（５０ｍＬ）で４回、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍＬ）で４回洗浄した。
（３）洗浄後、吸引乾燥して得られたゲル５ｇにＤＭＦ１０ｍＬを加えて０℃に冷却後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−コハク酸イミジル４０ｍｇを加えた。
（４）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／ＤＭＦ＝１：４の混合液（０．７５ｍＬ）を加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、ゲルをＤＭＦ（１５ｍＬ）で４回、水（１５ｍＬ）で４回洗浄することで、マレイミド基を導入したゲル（以下、マレイミドトヨパールＢとする）を作製した。
【００７５】
実施例１２ ポリメタクリレートゲルへのマレイミド基の導入（その２）
（１）グラスフィルター上で吸引乾燥して得られたポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））３ｇに０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３ｍＬ、ＨＤＧＥ３ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）で４回、水（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄したゲルに０．５Ｍの２−メルカプト酢酸ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウムでｐＨ ８．０に調整）９ｍＬを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（３）洗浄後吸引乾燥により得られたゲルに０．１Ｍの硫酸３ｍＬ加え、７０℃で１時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（３０ｍＬ）で４回、ＤＭＦ（３０ｍＬ）で４回洗浄した。
（４）洗浄したゲル０．５ｇにＤＭＦ０．６５ｍＬを加え０℃に冷却後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−コハク酸イミジルのＤＭＦ溶液（３４．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＦ））０．０５ｍＬを加えた。
（５）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン：ＤＭＦ＝１：４の混合液０．１５ｍＬを加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、ゲルをＤＭＦ（５ｍＬ）で４回、水（５ｍＬ）で４回で洗浄することで、マレイミド基を導入したゲル（以下、マレイミドトヨパールＣとする）を作製した。
【００７６】
実施例１３ ポリメタクリレートゲルへのクロロアセチル基の導入
（１）実施例５で作製したエポキシトヨパール１ｇに水０．５ｍＬ、２８％アンモニア水２ｍＬを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（５０ｍＬ）で４回、アセトニトリル（５０ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄後吸引乾燥により得られたエポキシトヨパール１ｇにアセトニトリル２ｍＬを加え０℃に冷却後、２−クロロ酢酸クロリド（８０μＬ）を加えた。
（３）さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）を加え、２５℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、エポキシトヨパールをアセトニトリル（１０ｍＬ）で４回、水（１０ｍＬ）で４回洗浄することで、クロロアセチル基を導入したゲル（以下、クロロアセチルトヨパールとする）を作製した。
【００７７】
実施例１４ ポリメタクリレートゲルへの３−ブロモ−２−ヒドロキシル基の導入
（１）グラスフィルター上で吸引乾燥して得られたポリメタクリレートゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５（東ソー社製））１．５ｇに水１．９５ｍＬ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．７５ｍＬ、アリルグリシジルエーテル０．７５ｇを添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とうした。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（１５ｍＬ）で４回、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）で４回、水（１５ｍＬ）で４回洗浄した。
（２）洗浄後のゲルに水４．２ｍＬ、ＤＭＳＯ１．４ｍＬ、Ｎ―ブロモコハク酸イミド４１４ｍｇを添加し、水浴上、常温で１時間撹拌振とうした。反応終了後、溶液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水（２０ｍＬ）で４回洗浄することで、ブロモヒドリン基を導入したゲル（以下、ブロモヒドリントヨパールとする）を作製した。
【００７８】
実施例１５ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析後、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加した。同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてＦｃＲｍ５６ｂＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．５ｍＬ（濃度４．０ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置した。静置後の溶液に、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬと、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１８μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてエポキシトヨパールを洗浄した。
【００７９】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化率は６５．３％であり、エポキシトヨパール１ｍＬあたり１３．０ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量は２４．７ｍｇ、有効固定化率は３７．８％であった。
【００８０】
実施例１６ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のマレイミド基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ５６ｂＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）実施例１１で調製したマレイミドトヨパールＢ０．１ｍＬにＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．２ｍＬ（濃度８．１ｍｇ／ｍＬ）およびトリカルボキシエチルフォスフィン（終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間静置した。静置後の溶液に、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６３μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、マレイミドトヨパールＢを１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いて洗浄した。
【００８１】
マレイミドトヨパールＢへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化率は６０．３％であり、マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたり１９．４ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたりの抗体結合量は４９．７ｍｇ、有効固定化率は５１．２％であった。
【００８２】
実施例１７ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．３ｍＬ（濃度２．１ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、４℃で１時間静置後、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．０５ｍＬ（ベッドボリューム）添加し、３５℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次ゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００８３】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は７６．３％であり、エポキシトヨパール１ｍＬあたり９．７ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量は１６．８ｍｇ、有効固定化率は３４．７％であった。
【００８４】
実施例１８ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のマレイミド基を導入したゲルへの固定化（その１）
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）実施例１１で調製したマレイミドトヨパールＢ０．０３ｍＬにＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．２ｍＬ（濃度２．７ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４℃で１時間静置後、３５℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、マレイミドトヨパールＢを１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＢを調製した。
【００８５】
マレイミドトヨパールＢへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は２６．０％であり、マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたり４．６ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＢ１ｍＬあたりの抗体結合量は２１．２ｍｇ、有効固定化率は９１．１％であった。
【００８６】
比較例４ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５の（１）から（２）と同様な方法で、実施例９で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂの濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）濃縮脱塩処理後のＦｃＲｍ５６ｂ溶液０．３ｍＬ（濃度６．６ｍｇ／ｍＬ）に、実施例５で作製したエポキシトヨパール０．１ｍＬ（ベットボリューム）と、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１４６μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例１５（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ５６ｂ固定化エポキシトヨパールを調製した。
【００８７】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂの固定化率は５６．６％であり、ゲル１ｍＬ当たり１１．２ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂが固定化されていた。また、ＦｃＲｍ５６ｂ固定化エポキシトヨパールについて、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が１６．２ｍｇ、有効固定化率が２８．９％となった。
【００８８】
比較例５ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ）のエポキシ基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）から（２）と同様な方法で、実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃの濃縮およびバッファー交換操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ６０ｃ溶液０．３ｍＬ（濃度２．４ｍｇ／ｍＬ）に実施例５で作製したエポキシトヨパール０．０５ｍＬ（ベットボリューム）を添加し、３５℃で２時間反応させた。
（３）反応終了後、実施例１７（４）と同様な方法で洗浄処理することで、ＦｃＲｍ６０ｃ固定化ゲルを調製した。
【００８９】
エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃの固定化率は５９．４％であり、エポキシトヨパール１ｍＬ当たり８．６ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃが固定化されていた。また、ＦｃＲ６０ｃ固定化エポキシトヨパールについて、実施例８と同様の手法にて抗体結合量と有効固定化率の算出を行なったところ、エポキシトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が９．７ｍｇ、有効固定化率が２２．５％となった。
【００９０】
実施例１９ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のクロロアセチル基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５（１）から（２）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．１２ｍＬ（濃度１２．８ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１３で作製したクロロアセチルトヨパール０．０５ｍＬ（ベッドボリューム）、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４３μＬおよび１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いてクロロアセチルトヨパールを洗浄した。
【００９１】
クロロアセチルトヨパールへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、反応残渣中にＦｃＲｍ５６ｂＣは検出されず（すなわち固定率１００％）、クロロアセチルトヨパール１ｍＬあたり３０．７ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲ固定化クロロアセチルトヨパールの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、クロロアセチルトヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が２０．５ｍｇ、有効固定化率が１３．４％であった。
【００９２】
実施例２０ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂＣ）のブロモヒドリン基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１５の（１）から（２）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液の濃縮および脱塩操作を行なった。
（２）得られたＦｃＲｍ５６ｂＣ溶液０．１５ｍＬ（濃度１２．３ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１４で作製したブロモヒドリントヨパールを０．０５ｍＬ、３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬ、および１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬ添加し、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ５６ｂＣ固定化ブロモヒドリントヨパールを調製した。
【００９３】
ゲルへのＦｃＲｍ５６ｂＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ５６ｂＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ５６ｂＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ５６ｂＣの固定率は５３．６％、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたり１９．８ｍｇのＦｃＲｍ５６ｂＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲルの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ゲル１ｍＬあたりの抗体結合量が３３．３ｍｇ、有効固定化率が３３．４％であった。
【００９４】
実施例２１ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のブロモメチル基を導入したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液の濃縮を行なった。
（２）（１）の濃縮溶液を、６００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．２ｍＬ（濃度３．５ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、実施例１４で作製したブロモヒドリントヨパール０．０３ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬのヨウ化カリウム１．５μＬを添加し、３５℃で５時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ブロモヒドリントヨパールを調製した。
【００９５】
ブロモヒドリントヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定率は４３．９％、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたり１０．１ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ブロモヒドリントヨパールの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ブロモヒドリントヨパール１ｍＬあたりの抗体結合量が１４．１ｍｇ、有効固定化率が２７．８％であった。
【００９６】
実施例２２ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のヨードアセチル基を有したゲルへの固定化
（１）実施例１７（１）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液の濃縮を行なった。
（２）（１）の濃縮溶液を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、脱塩処理を行なった。
（３）得られたＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．１５ｍＬ（濃度６．１ｍｇ／ｍＬ）に終濃度１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、１時間静置後、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（活性基：ヨードアセチル基、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．０５ｍＬ添加し、２５℃で１時間反応させた。
（４）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてゲルを洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ゲルを調製した。
【００９７】
ゲルへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は４９．９％であり、ゲル１ｍＬあたり９．１ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化ゲルの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、ゲル１ｍＬあたりの抗体結合量が１４．４ｍｇ、有効固定化率が３１．７％であった。
【００９８】
実施例２３ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃＣ）のマレイミド修飾ゲルへの固定化（その２）
（１）実施例１０で調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液を、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｍゲル（東ソー社製）を充填したカラム（内径９ｍｍ×長さ１５ｃｍ）に添加し、同緩衝液にて洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりＦｃＲｍ６０ｃＣを濃縮溶液として溶出させた。
（２）（１）の濃縮溶液を、２００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）に通液し、バッファー交換処理を行なった。
（３）実施例１２で作製したマレイミドトヨパールＣ０．０３ｍＬ（ベットボリューム）に、ＦｃＲｍ６０ｃＣ溶液０．３３ｍＬ（濃度５．５ｍｇ／ｍＬ）およびＴＣＥＰ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４℃で１時間静置後、３５℃で０．５時間反応させた。
（４）反応終了後、ゲルを１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にて順次洗浄することで、ＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＣを調製した。
【００９９】
マレイミドトヨパールＣへのＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化量を、反応に供したＦｃＲｍ６０ｃＣの量から反応液に残存したＦｃＲｍ６０ｃＣの量（前述のプロテインアッセイキットを用いて定量）を差し引いて計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃＣの固定化率は２７．２％であり、マレイミドトヨパールＣ１ｍＬあたり１６．５ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃＣが固定化されていた。また、調製したＦｃＲｍ６０ｃＣ固定化マレイミドトヨパールＣの抗体結合量と有効固定化率を、実施例８と同様に算出したところ、マレイミドトヨパールＣ１ｍＬあたりの抗体結合量が５１．６ｍｇ、有効固定化率が６２．７％であった。
【０１００】
反応に供したゲル基材、リガンドＦｃＲおよび有効固定化率について、表５（前述）および６にまとめた。以上の結果をまとめると、システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質は、担体表面における方向性が著しく向上するため、抗体への結合能を保持した状態で担体に固定化することができ、結果としてゲルあたりの抗体吸着量を向上させることができることが分かる。
【０１０１】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質。
【請求項２】
システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドが配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤。
【請求項９】
担体が、その表面に活性基を有しており、かつ前記活性基が、エポキシ基、マレイミド基、クロロアセチル基、ブロモヒドリン基、ブロモメチル基、ヨードアセチル基のいずれかである、請求項８に記載の抗体吸着剤。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【請求項１１】
タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加することで、前記タンパク質に方向性を付与した状態で担体へ固定化可能な、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項１】
システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質。
【請求項２】
システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドが配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号５３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することでタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を担体に固定化して得られる抗体吸着剤。
【請求項９】
担体が、その表面に活性基を有しており、かつ前記活性基が、エポキシ基、マレイミド基、クロロアセチル基、ブロモヒドリン基、ブロモメチル基、ヨードアセチル基のいずれかである、請求項８に記載の抗体吸着剤。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【請求項１１】
タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加することで、前記タンパク質に方向性を付与した状態で担体へ固定化可能な、配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−５９３１３（Ｐ２０１３−５９３１３Ａ）
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７０２７２（Ｐ２０１１−２７０２７２）
【出願日】平成２３年１２月９日（２０１１．１２．９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月９日（２０１１．１２．９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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