スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）の耐熱化方法
【課題】天然のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を改変して得られる耐熱化ＳＰおよびこの耐熱化ＳＰの調製方法を提供さすること。
【解決手段】この耐熱化ＳＰは、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；モチーフ配列２中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびにモチーフ配列３中の１９位に相当する位置；からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化ＳＰを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化ＳＰの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化ＳＰの３７℃における酵素活性の２０％以上である。
【解決手段】この耐熱化ＳＰは、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；モチーフ配列２中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびにモチーフ配列３中の１９位に相当する位置；からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化ＳＰを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化ＳＰの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化ＳＰの３７℃における酵素活性の２０％以上である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列１：ＡＶＧＧＶＨＬＬＰＦＦＰＳＴＧＤＲＧＦＡＰＩＤＹＨＥＶＤＳＡＦＧＤＷＤＤＶＫＲＬＧＥＫＹＹＬＭＦＤＦＭＩＮＨＩＳ中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；
モチーフ配列２：ＲＰＴＱＥＤＶＤＬＩＹＫＲＫＤＲＡＰＫＱＥＩＱＦＡＤＧＳＶＥＨＬＷＮＴＦＧＥＥＱＩＤ中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列３：ＩＬＰＥＩＨＥＨＹＴＩＱＦＫＩＡＤＨＤＹＹＶＹＤＦＡＬＰＭＶＴＬＹＳＬＹＳＧ中の１９位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化スクロースホスホリラーゼ；
ただし、該モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基はセリンではなく、かつ該モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基はグリシンではない、耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項３】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項４】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項５】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項６】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項７】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓに由来する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項８】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項９】
前記モチーフ配列１中の１４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、セリンまたはイソロイシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１０】
前記モチーフ配列１中の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、プロリン、アラニンまたはリジンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１１】
前記モチーフ配列１中の４４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ヒスチジン、アルギニンまたはトリプトファンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１２】
前記モチーフ配列１中の４４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、アルギニンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１３】
前記モチーフ配列２中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ロイシンまたはイソロイシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１４】
前記モチーフ配列２中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリンまたはチロシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１５】
前記モチーフ配列２中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、バリンまたはチロシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１６】
前記モチーフ配列２中の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１７】
前記モチーフ配列２中の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ヒスチジンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１８】
前記モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がトレオニンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１９】
前記モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、システイン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニンまたはセリンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２０】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２１】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２２】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２３】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２４】
少なくとも、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２５】
少なくとも、モチーフ配列３中の１９位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２６】
耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現させる工程；
および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列１：ＡＶＧＧＶＨＬＬＰＦＦＰＳＴＧＤＲＧＦＡＰＩＤＹＨＥＶＤＳＡＦＧＤＷＤＤＶＫＲＬＧＥＫＹＹＬＭＦＤＦＭＩＮＨＩＳ中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；
モチーフ配列２：ＲＰＴＱＥＤＶＤＬＩＹＫＲＫＤＲＡＰＫＱＥＩＱＦＡＤＧＳＶＥＨＬＷＮＴＦＧＥＥＱＩＤ中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列３：ＩＬＰＥＩＨＥＨＹＴＩＱＦＫＩＡＤＨＤＹＹＶＹＤＦＡＬＰＭＶＴＬＹＳＬＹＳＧ中の１９位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
ただし、該モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基はセリンではなく、かつ該モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基はグリシンではない、方法。
【請求項２７】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼが、少なくとも、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼが、少なくとも、モチーフ配列３中の１９位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む、核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項４１】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記反応が、５０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
グルコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、α−グルコース−１−リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記グルコース重合体がα−グルカンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第二のホスホリラーゼが、α−グルカンホスホリラーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、ラミナリデキストリンホスホリラーゼ、β−１，３−グルカンホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記反応が、５０℃〜７０℃の温度で行なわれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の４７位トレオニン（Ｔ４７）に相当する位置、６２位セリン（Ｓ６２）に相当する位置、７７位チロシン（Ｙ７７）に相当する位置、１２８位バリン（Ｖ１２８）に相当する位置、１４０位リジン（Ｋ１４０）に相当する位置、１４４位グルタミン（Ｑ１４４）に相当する位置、１５５位アスパラギン（Ｎ１５５）に相当する位置および２４９位アスパラギン酸（Ｄ２４９）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項４９】
耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現させる工程；
および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の４７位トレオニン（Ｔ４７）に相当する位置、６２位セリン（Ｓ６２）に相当する位置、７７位チロシン（Ｙ７７）に相当する位置、１２８位バリン（Ｖ１２８）に相当する位置、１４０位リジン（Ｋ１４０）に相当する位置、１４４位グルタミン（Ｑ１４４）に相当する位置、１５５位アスパラギン（Ｎ１５５）に相当する位置および２４９位アスパラギン酸（Ｄ２４９）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
方法。
【請求項５０】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項４８に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
グルコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項４８に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、α−グルコース−１−リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
【請求項１】
天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列１：ＡＶＧＧＶＨＬＬＰＦＦＰＳＴＧＤＲＧＦＡＰＩＤＹＨＥＶＤＳＡＦＧＤＷＤＤＶＫＲＬＧＥＫＹＹＬＭＦＤＦＭＩＮＨＩＳ中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；
モチーフ配列２：ＲＰＴＱＥＤＶＤＬＩＹＫＲＫＤＲＡＰＫＱＥＩＱＦＡＤＧＳＶＥＨＬＷＮＴＦＧＥＥＱＩＤ中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列３：ＩＬＰＥＩＨＥＨＹＴＩＱＦＫＩＡＤＨＤＹＹＶＹＤＦＡＬＰＭＶＴＬＹＳＬＹＳＧ中の１９位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化スクロースホスホリラーゼ；
ただし、該モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基はセリンではなく、かつ該モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基はグリシンではない、耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項３】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項４】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項５】
前記天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項６】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項７】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓに由来する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項８】
前記天然のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項９】
前記モチーフ配列１中の１４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、セリンまたはイソロイシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１０】
前記モチーフ配列１中の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、プロリン、アラニンまたはリジンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１１】
前記モチーフ配列１中の４４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ヒスチジン、アルギニンまたはトリプトファンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１２】
前記モチーフ配列１中の４４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、アルギニンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１３】
前記モチーフ配列２中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ロイシンまたはイソロイシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１４】
前記モチーフ配列２中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリンまたはチロシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１５】
前記モチーフ配列２中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、バリンまたはチロシンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１６】
前記モチーフ配列２中の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジンまたはバリンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１７】
前記モチーフ配列２中の２３位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ヒスチジンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１８】
前記モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がトレオニンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項１９】
前記モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、システイン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニンまたはセリンである、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２０】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２１】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２２】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２３】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２４】
少なくとも、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２５】
少なくとも、モチーフ配列３中の１９位に相当する位置において、前記天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項２６】
耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現させる工程；
および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、
モチーフ配列１：ＡＶＧＧＶＨＬＬＰＦＦＰＳＴＧＤＲＧＦＡＰＩＤＹＨＥＶＤＳＡＦＧＤＷＤＤＶＫＲＬＧＥＫＹＹＬＭＦＤＦＭＩＮＨＩＳ中の１４位に相当する位置、２９位に相当する位置、および４４位に相当する位置；
モチーフ配列２：ＲＰＴＱＥＤＶＤＬＩＹＫＲＫＤＲＡＰＫＱＥＩＱＦＡＤＧＳＶＥＨＬＷＮＴＦＧＥＥＱＩＤ中の７位に相当する位置、１９位に相当する位置、２３位に相当する位置および３４位に相当する位置；ならびに
モチーフ配列３：ＩＬＰＥＩＨＥＨＹＴＩＱＦＫＩＡＤＨＤＹＹＶＹＤＦＡＬＰＭＶＴＬＹＳＬＹＳＧ中の１９位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
ただし、該モチーフ配列２中の３４位に相当する位置におけるアミノ酸残基はセリンではなく、かつ該モチーフ配列３中の１９位に相当する位置におけるアミノ酸残基はグリシンではない、方法。
【請求項２７】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｒｂｉｎｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記第一のスクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５７℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼが、少なくとも、モチーフ配列１中の１４位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記耐熱化スクロースホスホリラーゼが、少なくとも、モチーフ配列３中の１９位に相当する位置において、前記第一のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む、核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項４１】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記反応が、５０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
グルコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、α−グルコース−１−リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記グルコース重合体がα−グルカンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第二のホスホリラーゼが、α−グルカンホスホリラーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、ラミナリデキストリンホスホリラーゼ、β−１，３−グルカンホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記反応が、５０℃〜７０℃の温度で行なわれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
天然のスクロースホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化スクロースホスホリラーゼであって、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の４７位トレオニン（Ｔ４７）に相当する位置、６２位セリン（Ｓ６２）に相当する位置、７７位チロシン（Ｙ７７）に相当する位置、１２８位バリン（Ｖ１２８）に相当する位置、１４０位リジン（Ｋ１４０）に相当する位置、１４４位グルタミン（Ｑ１４４）に相当する位置、１５５位アスパラギン（Ｎ１５５）に相当する位置および２４９位アスパラギン酸（Ｄ２４９）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のスクロースホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化スクロースホスホリラーゼ。
【請求項４９】
耐熱化スクロースホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化スクロースホスホリラーゼを発現させる工程；
および
該発現された耐熱化スクロースホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該耐熱化スクロースホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の４７位トレオニン（Ｔ４７）に相当する位置、６２位セリン（Ｓ６２）に相当する位置、７７位チロシン（Ｙ７７）に相当する位置、１２８位バリン（Ｖ１２８）に相当する位置、１４０位リジン（Ｋ１４０）に相当する位置、１４４位グルタミン（Ｑ１４４）に相当する位置、１５５位アスパラギン（Ｎ１５５）に相当する位置および２４９位アスパラギン酸（Ｄ２４９）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化スクロースホスホリラーゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５５℃で２０分間加熱した後の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化スクロースホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
方法。
【請求項５０】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項４８に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼ、スクロースおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
グルコース重合体の合成方法であって、該方法は、請求項４８に記載の耐熱化スクロースホスホリラーゼと、α−グルコース−１−リン酸を基質とする第二のホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応液を反応させて、グルコース重合体を生産する工程を包含する、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１９５２５５（Ｐ２００９−１９５２５５Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３９４８６（Ｐ２００９−１３９４８６）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【分割の表示】特願２００５−５１３６３３（Ｐ２００５−５１３６３３）の分割
【原出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【分割の表示】特願２００５−５１３６３３（Ｐ２００５−５１３６３３）の分割
【原出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
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