トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を配位子とした生物活性常磁性を有する金属錯塩
【課題】
生物活性を有する金属錯塩を与えるトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を提供すること。
【解決手段】
下記式のトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物。
【化１】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n − ｎ＝２
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m − ｍ＝３
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）X − ｘ＝２
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）
生物活性を有する金属錯塩を与えるトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を提供すること。
【解決手段】
下記式のトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物。
【化１】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n − ｎ＝２
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m − ｍ＝３
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）X − ｘ＝２
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物、および中心金属イオンと反応して合成された常磁性を有する金属錯塩に関する。本発明は特に、この種類の常磁性金属錯塩を利用して磁気共鳴造影剤とすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
文献には、ガドリニウム金属錯塩を高分子量の物質に結合させる方法が多く記載されている。その中で、非特許文献１は、アシル化反応、アルキレーション反応、ウレア形成法およびアミノ化による還元などの方法を比較的常用される方法として開示している。
【０００３】
本発明者はかつて、３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］の誘導体、３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリス（カルボキシメチル）［ＴＴＤＡ］を合成し、それらの配位子の、ガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、カルシウムイオン（Ｃａ2+）および銅イオン（Ｃｕ2+）などの金属錯塩についての物性および化学的性質を研究したところ、ガドリニウム−３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＴＴＤＡ）］2-1 ）が、ガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）よりもすぐれた物性および化学的性質を有することを示した。また、非特許文献２に記載されているように、この項の改良は、該錯塩に磁気共鳴造影剤としての潜在能力を備えさせた。
【０００４】
近年、磁気共鳴画像法のソフトウエアとハードウエアの発展により映像学的診断が以前に比べて大幅に向上している。そしてより進んだ磁気共鳴画像法診断の感受性および正確性を向上させるために安全性と安定性の発展に目標を有する磁気共鳴造影剤が目下磁気共鳴画像法研究の重要な方向のひとつとなっている。一般の磁気共鳴造影剤に使用される金属イオンには、マンガンイオン（Ｍｎ2+）、鉄イオン（Ｆｅ3+）およびガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）があり、その中でガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）の使用が最も多く、このガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）の磁気モーメントが最大なので、該金属イオンが体内に滞留するとその毒性も最大となる。したがって、有機配位子を利用して安定な錯塩を形成させることによりその毒性を抑制しなければならない。
【０００５】
目下、アメリカ食品薬品管理局（ＦＤＡ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に認可され、臨床の使用に供する静脈注射の磁気共鳴造影剤にはガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）、ガトテル酸メグルミン（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］-1）、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］ビス−メチルアミドガドジアミド注入物、１，４，７−トリキス（カルボキシメチル）−１０−（２−ヒドロキシルプロパン）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、［Ｇｄ（ＨＰ−Ｄ０３Ａ）］ガドテリドール、加えて、マンガン、ジピリドキシル、ジホスファイト、ＭｎＤＰＤＰ、テスラスキャンなどの５種がある。この５種は細胞外造影剤であり、その中で、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］および［Ｇｄ（ＨＰ−Ｄ０３Ａ）］は非イオン性造影剤、そして［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-、［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- およびＭｎＤＰＤＰはイオン性造影剤である。［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- および［Ｇｄ（Ｈｐ−Ｄ０３Ａ）］は大環構造（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）を有し、そしてＭｎＤＰＤＰ、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）2-］および［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］は直鎖構造である。本発明は直鎖構造を有し、かつ生物活性を有する金属錯塩を発展させて磁気共鳴造影剤とするものである。
【非特許文献１】Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍら、１９９２年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第３巻第２ページ
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｙ．Ｍら、１９９８年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ 第４１１３〜４１１８ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物に関し、かつ、この化合物を用いて中心金属イオンと反応させて合成された、生物活性を有する金属錯塩に関する。特に、本発明は、この種類の常磁性金属錯塩を利用して磁気共鳴画像法の造影剤とすることに関する。
【０００７】
磁気共鳴画像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＭＲＩ）技術の速やかな発展により、近年ではすでに疾病診断の重要技術の１つとなり、そして一歩進んで磁気共鳴画像法診断の感受性および正確性を向上させるために、安全性、安定性の発展に目標を有する磁気共鳴造影剤が目下磁気共鳴画像法の研究の重要な方向となっている。したがって、本技術に必要な造影剤の研究も主要な積極的発展の対象となっている。
【０００８】
新しい磁気共鳴造影用の造影剤を設計する場合、金属錯塩の安定性は重要な考慮要素であり、造影剤金属錯塩の生物体内における安定性は、それが体外に排出される前に体内に滞留した時間の安定性を意味する。Ｃａｃｈｅｒｉｓらは１９９０年Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇ．，第８巻第４６７ページ中に、ガドリニウム金属錯塩の生物体内における安定性は次の３種の要素を考慮しなければならないと開示している。即ち：（１）ガドリニウム金属錯塩の熱力学安定定数、すなわち有機配位子が完全に脱陽子化された状態下でのガドリニウム金属イオンとの親和力；（２）ガドリニウム錯塩の条件化安定定数、すなわちガドリニウム錯塩の生物体内における生理的ｐＨ条件下での安定定数；（３）有機配位子のガドリニウム金属イオンに対する選択定数。生物体内にはカルシウム、亜鉛、銅および鉄などの金属イオンが存在しているので、これらの金属イオンはガドリニウム金属イオンと互いに有機配位について競合し、有機配位子のガドリニウム金属イオンに対する選択性が比較的劣る場合であれば、金属イオンはガドリニウム金属錯塩中から解離する可能性がある。
【０００９】
金属錯塩の弛緩率も磁気共鳴造影剤にとって必要な条件の１つである。一般に、弛緩率に影響する要素は次の式（１）で表される。
【数１】
【００１０】
その中のｑは内層水分子（ｉｎｎｅｒ ｓｐａｃｅ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）数、μeff は金属イオンの有効磁気モーメント（ガドリニウム金属錯塩に対するμeff ＝０．９４Ｂｏｈｒ Ｍａｇｎｅｔｏｎ、例えばＣｏｔｔｏｎ，Ｆ．Ａ．Ｗ．らが１９８２年Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ニューヨーク：Ｗｉｌｅｙ．）第４巻第２３章に開示した）、τc は固定磁界下における常磁性物質の関連時間、γは金属イオンから内層水分子の陽子までの距離（γ＝２．５０±０．０４Å、水酸化ガドリニウム（Ｇｄ3+（ＯＨ）2 ）系統に対して；Ｓｃｈａｕｅｒ Ｃ．Ｋ．Ａ．らが１９８９年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ第１８５ページ中に開示した）。相似官能基を有するガドリニウム金属錯塩に対して言えば、μeff およびγ値は定数とみなすことができるのでｑ値およびτc は弛緩率に影響する主要要素である。
【００１１】
関連時間（τc ）は主として次の３要素の影響を受ける。（１）分子回転関連時間（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，τr ）；（２）電子縦方向および横方向スピン弛緩時間（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｓｐｉｎ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，Ｔ1,2e）；（３）内層水分子存在時間またはその交換速度（ｗａｔｅｒ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｏｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒａｔｅ，τm -1＝κex）。例えば、Ｔｏｔｈ，Ｅ．Ｂ．，Ｌ．らは２００１年Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．第２１６〜２１７巻第３６３ページに次の関係式（２）を開示した。
【００１２】
τc ＝τr -1＋Ｔie-1＋τm -1 ｉ＝１，２ （２）
関連時間τc の値が陽子ラム（Ｌａｒｍｏｒ）周波数の逆数の値に等しいとき、その弛緩率は極大値に達するようになる。したがって、磁界が０．５Ｔ（２１ＭＨｚ、 1Ｈ 周波数）の場合、τc の最適値は７．４ｎｓ、そして磁界が１．５Ｔ（６４．５ＭＨｚ）の場合、τc の最適値は２．５ｎｓと推定することができる。Ｌｕｚ Ｚ．Ｍ．らは１９６４年Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ．第４０巻第２６８６ページ中に、縦方向弛緩率は主として結合溶媒分子の縦方向弛緩時間（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｕｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｔ1m）およびτm と関係することを開示した。その関係は次の式（３）に表される。
【００１３】
γ1 ＝１／Ｔ1 ＝ｑＰm ／（Ｔ1m＋Ｔm ） （３）
式中、Ｐm は結合溶媒分子のモル分率である。この公式から、もし水分子の交換速度が非常に速い、つまりτm ＜＜Ｔimである場合、γ1 は主として結合溶媒分子の弛緩率（１／Ｔ1m）と関係することがわかる。しかしながら、τm 値が非常に短いと、Ｔ1mはτm の影響を受けるので、τm 値を無制限に短縮してもその弛緩率をそれに応じて高くさせることができない。Ｃａｒａｖａｎ，Ｐ．Ｅ．らは、１９９９年Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．第９９巻第２２９３ページ中に、模擬的にｑ＝１およびγ＝３．１Åの条件下において、Ｔ1e、τr およびτm は２つの臨床上最も常用される磁界（０．５Ｔおよび１．５Ｔ）下で弛緩率に影響を及ぼし、その結果τm の理論的最適値は１０ｎｓと推定できると開示した。
【００１４】
一般に、磁界の増加はそのＴ1eを増加させ、Ｃａｒａｖａｎ，Ｐ．Ｅ．らにより１９９９年Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．第９９巻第２２９３ページ中に開示された研究では、磁界強度０．５下においてはその弛緩率に対して非常に大きな影響があるが、磁界１．５Ｔにおいてはその弛緩率に対してはっきりした影響がなく、つまり比較的高い磁界下においては弛緩率はτr およびτm のみの影響を受けることを発見した。目下、あらゆる市販の磁気共鳴造影剤では、その縦方向弛緩率はいずれも理論最高値と大きな差で離れており、これは主としてこれら造影剤の分子回転があまりにも高速であることに起因する。
【００１５】
Ｍｉｃｓｋｅｉ Ｋ．Ｈ．らは、１９９３年Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．第３２巻第３８４４ページに、含水ガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）（Ｈ2 Ｏ）］2-）のτm 値は３０３ｎｓであって、τm の最適値よりもはるかに大きく、かつそのτr 値は５９ｐｓであり、Ｌａｕｒｅｎｔ Ｓ． Ｅ．らが２０００年にＨｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ第８３巻第３９４ページに開示したように、τr の最適値よりもはるかに小さいので、目下この分野の科学者たちはいずれも積極的に高速水分子交換速度および低い回転速度を有する金属錯塩を探索し、金属錯塩の弛緩率（ｒ1 ）を高め得るように努力していることを開示した。
【００１６】
新世代の磁気共鳴造影剤は、低分子量の金属錯塩、例えば、Ｂｒａｓｃｈ Ｒ．Ｃ．が１９９１年Ｍａｇａｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．第２２巻第２８２ページに開示したガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカンジオイック酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）またはガドテル酸メクルミン錯塩（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- ）を、生物物理学的および薬理学的特性を改変できるように、高分子量の物質と共役させている。生物物理学の観点から、小分子のガドリニウム金属錯塩がもし高分子物質と共役すれば、分子全体の旋回を遅くさせ、弛緩率を増加させることができる。またほかに、もし金属錯塩を組織に特異的な標的の部分（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と共役させることができれば、この高分子の結合対象は、多くのキャリアを介してガドリニウム金属錯塩を低濃度のレセプターに送り、レセプターを核磁気共鳴下において現像させるようにできる。この他に、高分子量の結合対象は分子が比較的大きいので、血管中に比較的長時間停留でき、血池造影に適切に用いられる。
【００１７】
１９８５年当時、科学者たちは造影剤分子旋回の速度を努めて降下させて弛緩率を増加させることを開始し、例えば、Ｌａｕｆｆｅｒ Ｒ．Ｂ．らは１９８７年Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．第８７巻第９０１ページ、およびＡｉｍｅ Ｓ．Ａ．らは１９９２年Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ第３１巻第２４２２ページ中に、含ベンゼン環またはヒドロキシ基が比較的多い巨大官能基を利用して、１，４，７，１０−テトラキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＡ）構造の中のカルボキシル基に取って代わり、それをガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）と結合させて金属錯塩を形成させることを開示した。そのγ1 値はそれぞれ４．０３、４．３３、４．４９および５．１９ｍＭ-1Ｓ-1であり、いずれもガドリニウム−１，４，７，１０−テトラキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- 、３．５６ｍＭ-1Ｓ-1）よりも高い。この結果から、有機配位子の分子量が大きければ大きいほど、そのτr 値が増加して該γ1 値を上昇させることがわかる。
【００１８】
文献にはガドリニウム金属錯塩を高分子量の物質に結合させる方法が数多く記載されている。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ Ｍ．は、１９９２年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第３巻第２ページ中に、比較的常用される方法として、アシル化反応、アルキル化反応、ウレア形成方法およびアミノ化による還元などの方法を開示している。目下、文献において高分子量物質と結合する最も常用される試薬は、３，６，９−トリアザウンデカンジオイック酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］自体またはその誘導体、およびＤＴＰＡ−ジアンヒドリドが含まれる。高分子量物質の１級アミンを利用して３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］自体またはその誘導体もしくはＤＴＰＡ−ジアンヒドリドと反応させ、アミド結合を形成させることにより、有機配位子を高分子量物質と結合させることができる。Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｐ．Ｆ．Ｗ．らは、１９９０年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１巻第６５ページに、さまざまの分子量のポリリシンを利用してＤＴＰＡ−ジアンヒドリドおよびＤＴＰＡの誘導体と反応させることを開示した。しかしながら、ＤＴＰＡ−ジアンヒドリドを利用してたんぱく質と結合させると容易に架橋の状況が発生するので、Ｓｐａｎｏｇｈｅ Ｍ．Ｌ．らは１９９２年Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ第１０巻第９１３ページに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを利用してＤＴＰＡと反応させてＮ−ヒドロキシコハク酸エステルを形成させると、架橋の状況を回避できると開示した。ＤＴＰＡ−（Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル）は、たんぱく質と共有結合を形成するばかりでなく、Ｐａｘｔｏｎ Ｒ．Ｊ．Ｊ．らが１９８５年Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４５巻第５６９４ページに開示したように、さらにＤＴＰＡ−（Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル）を利用してモノクローナル抗体と共有結合を形成し、キャリアにより対比剤を抗がん腫胚芽（ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｍｂｒｙｏ）の抗原上に載置することができる。ところが、この合成方法はアミド結合を形成させる、つまりこの有機配位子とガドリニウム金属イオンとの結合能力を弱めてしまう。この問題を解決するために、Ａｉｍｅ Ｓ．Ｂ．らは、１９９９年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１０巻１９２ページに、３，４−ジエトキシシクロブタン−３−エン−１，２−ジケトン（スクアレート）をリンカーとして１，４，７−トリキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［Ｄ０３Ａ］をたんぱく質と、共有結合を形成させ、その金属錯塩の安定性を増幅できるように所望するとともに、たんぱく質と共有結合させることにより特殊生物活性を有する効果を達成することを開示している。
【００１９】
大部分の磁気共鳴造影剤は病巣（例えば受容体または抗原）の濃度をナノモル並みの量に目標化でき、この濃度は、受容体誘発磁化量増加（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＲＩＭＥ）状況での運用において、磁気共鳴造影方面では低すぎるので、近年来科学者たちは、連続酵素群を利用してガドリニウム金属錯塩を活性化させている。この方法は弛緩率を増加できるほか、さらに目標位置−背景値（ｔａｒｇｅｔ−ｔｏ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の比値を向上させることができる。Ｍｏａｔｓ Ｒ．Ａ．Ｆ．らは１９９７年Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．第３６巻第７２６ページに、大環状有機配位子の中の一官能基をガラクトピラノースに接合させて４，７，１０−トリ（酢酸）−１−（２−β−ガラクトピラノシルエトキシ）−１，４，７，１０−（テトラアザシクロドデカン）（ガドリニウム（ＩＩＩ）［ＥＧａｄ］）を合成し、この場合、ＥＧａｄは９配位子の形式でガドリニウム金属イオンと結合するのでＥＧａｄの内層分子数は０．７となり、このＥＧａｄが生物体に入ってβ−ガラクトシダーゼ酵素［β−ｇａｌ］に遭遇すると、ＥＧａｄのガラクトピラノース結合水を解離させることができるとともに、１．２個の内層水分子をリンクさせて、その磁気共鳴造影信号を増幅させると開示している。
【００２０】
Ｎｉｖｏｒｏｚｈｋｉｎ Ａ．Ｌ．Ｋ．らは、２００１年Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．第１５巻第２９０３ページに、受容体誘発磁化量増加亢進化合物（Ｐｒｏ−ＲＩＭＥ）を合成し、この試薬は主として４部位、即ち、１）３分子リシンからなるマスキング基、２）ＨＳＡ結合部位、３）グリシン結合部位および４）信号発生基より構成されていると開示している。その作用機構は、最外層のリシンが容易に一種のヒトカルボキシペプチダーゼＢ凝血繊維たんぱく質溶解阻害剤（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＡＦＩ）により分解されることにある。いったん三分子リシンが分解されると、露出した脂溶性芳香族はＨＳＡと強力な結合力を生じ、比較的高い弛緩率を得る。
【００２１】
本発明者はかつて、ＤＴＰＡの誘導体ＴＴＤＡ（３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリ（カルボキシメチル）エステル）を合成して、この一配位子のガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、カルシウムイオン（Ｃａ2+）および銅イオン（Ｃｕ2+）などに対する金属錯塩の物理的性質および化学的性質を研究したところ、［Ｇｄ（ＴＴＤＡ）］2-が［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-よりも良好な物理的性質および化学的性質を具備していることを示した。従って、磁気共鳴造影剤（例えば、Ｙ．Ｍ．Ｗａｎｇらは１９９８年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．第４１１３〜４１１８ページに開示した）としての潜在的効力を有する。
【００２２】
したがって本発明者は、ＴＴＤＡを基礎としてＴＴＤＡの誘導体（例えば、Ｔ．Ｈ．Ｃｈｅｎｇらが２００１年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ ｔｒａｎｓ．第３３５７〜３３６６ページに開示した誘導体）を合成した。この研究において我々はＴＴＤＡのガドリニウム金属錯塩およびその誘導体がいずれも高速な内層水分子交換速度を有するとともに、そのτm 値はすでに最高弛緩率（γ1 ）の理論的最適値に接近していることを発見した。この特性は小分子のガドリニウム金属錯塩の弛緩率に対して明らかな影響はないが、もしＴＴＤＡのガドリニウム金属錯塩を大分子の物質（例えばたんぱく質）と結合すれば、全体分子量の増大により、その分子旋回の関連時間を弛緩できるほか、ＴＴＤＡガドリニウム金属錯塩が有する高速内層水分子交換速度の特性は弛緩率の増加に寄与することができる。したがって、本研究は、ＴＴＤＡをガラクトピラノースと結合させて、生物活性を有するガドリニウム金属錯塩の配位子を合成するものである。上記動力学パラメータの探索を利用すると、これら化合物が生物活性を有する磁気共鳴対比剤としての必要条件を具備しているか否かが了解され、得られたデータは将来一歩進んで磁気共鳴画像法研究を行う上での根拠を提供することができる。
【００２３】
本発明の主たる目的は、トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を提供することにある。
【００２４】
本発明の次の目的は、磁気共鳴造影対比材用の常磁性を有する金属錯塩を提供することに有る。
【００２５】
上記結論を総合すれば、生物活性を有し、かつ高安定性および高弛緩率を有する金属錯塩は近年の研究の重要点であり、現在にいたるまで、各分野ではなお継続してよりすぐれた磁気共鳴造影剤を探索している。したがって、本発明の目的は、新規のおよび潜在力がありかつ安定性が高い、生物活性を有する金属錯塩を合成して磁気共鳴造影剤とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の上記目的を達成するために、本発明は、下記の化学式（Ｉ）を有するトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を合成した。
【化５】
【００２７】
式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中、ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中、ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）C −または−（ＣＨ2 ）c −Ｘ−（ＣＨ2 ）c −、式中、ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、単糖類または多糖類。
【００２８】
本発明は、また、磁気共鳴造影剤用とするための、常磁性を有する金属錯塩を提供する。この金属錯塩はＭＬの化学構造を有し、Ｍは中心金属イオンであって、ランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、およびクロム金属イオンからなる群より選択され、そしてＬは式（１）で示される有機配位子である。
【００２９】
本発明の以下の実施例に示すように、本発明は以下のＣｈａｒｔ１．に示すトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物を合成した。
【化６】
【００３０】
式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）−n ｎ＝２
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）−m ｍ＝３
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）−x ｘ＝２
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース
本発明者は、合成されたトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物が以下の特性を有するものと思料する。
【００３１】
１．ガドリニウム金属錯塩に対して比較的高い選択性を有する。
【００３２】
２．酵素を利用することにより、ガドリニウム金属錯塩を活性化して、造影剤の目標位置における濃度を高める。
【００３３】
３．ガラクトピラノースを含有させることにより目標とするガドリニウム錯塩の合成を達成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明によるトリアミノテトラカルボキシルカラクトピラノース化合物は、配位子として金属イオンと配位して常磁性を有する金属錯塩を形成する。この常磁性金属錯塩は磁気共鳴造影剤とすることができ、かつＭＬの化学構造を有する。その中のＭは中心金属イオンであって、ランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群の中より選択され、そしてＬは有機配位子であり上記式（１）に示された化学式を有する。
【００３５】
金属イオンは、好適にはガドリニウム（＋３価）、鉄（＋３価）、またはマンガン（＋２価）である。その中ではガドリニウム（＋３価）がさらに好適である。
【００３６】
図１を参照すると、化学式（１）のトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物の合成方法において、０．１１モルのガラクトース（Ｄ−ガラクトース，１）を採取し、無水ピリジンとともにフラスコ中に入れ、等圧管を用いて徐々に酢酸無水物を添加し、室温下で攪拌する。反応終了後、トリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水などの液体で抽出し、有機層を収集する。この有機層にさらに硫酸ナトリウムを加えてろ過することにより、１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２を得た。
【００３７】
０．０６モルの１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２を採取し、氷酢酸とともにフラスコに入れる。等圧管を用いてゆっくり臭化水素（ＨＢｒ）を添加し、室温下で攪拌反応後トリクロロメタンを加えて、順に脱イオン水で抽出して有機層を収集する。この有機層にさらに硫酸ナトリウムを添加し、ろ過抽出乾燥して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、生成物を収集して、２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３を得た。
【００３８】
２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３および４Å分子ふるいを３首フラスコ中に入れ、真空中で抽出した後窒素ガスを注入する。適量のジクロロエタンを添加して溶剤とし、さらに２−ブロモエタノールを添加して５分間攪拌する。さらに炭酸銀を添加して室温下で反応させた後ろ過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、生成物２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を収集した。
【００３９】
０．１７１モルのＮ−アミノエチル−１，３−プロパンジアミン，５をフラスコ中に入れ、シアノメタンを添加して、十分に混合した後、炭酸カリウムを加え、室温下で攪拌してさらにｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート，６を添加し、加熱還流反応後ろ過して順に脱イオン水などの溶液で抽出し、有機層を収集した。そして抽出乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、黄色油状物３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７を得た。
【００４０】
３．１３×１０-3モルの３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカン二酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７をフラスコに入れて、シアノメタンに溶解し、テトラメチルグアニジンを添加して攪拌した後、さらに２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を加えて加熱還流する。しかる後、溶液を抽出乾燥して、順に脱イオン水などの溶液として抽出して有機層を収集し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、黄色油状物を得た。これを円底フラスコ中に入れ、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して攪拌した後、陰イオン交換樹脂で精製を行い、トリアミノテトラカルボン酸ガラクトピラノース生成物を得た。
【００４１】
０．１８ミリモルのトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ）を０．２７ミリモルの塩化ガドリニウムと混合した後、脱イオン水を添加して順に脱イオン水などの溶液として抽出する。即ち、脱イオン水およびエチルアセテートを使用して抽出するか、または脱イオン水およびトリクロロメタンを使用して抽出するか、もしくは脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出するか、生成物の性質に応じて選択して使用する。溶液ｐＨを段階的に調整する、即ち、まず溶液ｐＨを８に調整した後、固体を析出状態にさせ、さらにｐＨを７に調整する。加熱還流反応後、溶液ｐＨを段階的に調整してろ過し、溶液を注出して乾燥すると、無色結晶のジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）を析出させることができる。
【００４２】
生物活性常磁性金属錯塩の評価
本発明の配位子トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物は金属イオンと配位して生物活性を有する金属錯塩を形成することができる。この種類の生物活性を具備した金属錯塩は磁気共鳴造影剤とすることができる。
【００４３】
内層水分子数の検討：17Ｏ−ＮＭＲを利用してジスプロシウム（ＤｙＩＩＩ）金属イオン誘導水17Ｏ核種の化学変位変化（ｄ．ｉ．ｓ．）を測定し、ジスプロシウム（ＤｙＩＩＩ）錯塩度対ｄ．ｉ．ｓ．の作図をすれば、式（９）に示されるように線形関係を得ることができる。
【００４４】
ｄ．ｉ．ｓ．＝ｑΔ［Ｄｙ（配位子）n （Ｈ2 Ｏ）q ］／［Ｈ2 Ｏ］ （９）
勾配はｑΔ／［Ｈ2 Ｏ］であり、ｑは求める内層水分子数であり、ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩［Ｄｙ（ＣＧＰ）］-1と、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を添加して（図２）１４日後得られた勾配は図３に示すようにそれぞれ−３５．６ｐｐｍ／ｍＭ（γ2 ＝０．９９８１）および−５４．６ｐｐｍ／ｍＭ（γ2 ＝０．９９６８）であり、そしてジスプロシウム（ＩＩＩ）誘導17Ｏの勾配は−３５８．１ｐｐｍ／ｍＭ（γ＝０．９９９８）である。ジスプロシウム（ＩＩＩ）水和物は８個の水分子を結合でき、かつ勾配と正比例関係をなすので、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）と反応していないジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）およびβ−ガラクトシダーゼを添加して反応した１４日後のプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）のｑ値はそれぞれ０．８および１．２を得ることができ、このｑ値の増加により、図３に示すように、その磁気共鳴造影信号を増強させる。
【００４５】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析：ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）にβ−ガラクトシダーゼを添加して３７±０．１℃の下で反応させ、それぞれ０日および５日後、高性能液体クロマトグラフィーを利用して酵素添加前後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）を分析した。図４は経時的に高性能液体クロマトグラフィーにより分析されたスペクトログラムである。
【００４６】
図４中、横軸は滞留時間、縦軸は吸収強度である。図４に示されるように、時間ｔ＝０日の場合、滞留時間約６分に一本のピークがあり、このピークはまだβ−ガラクトシダーゼと反応していないガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＧＰ）］- ）である。そして時間ｔ＝５日の場合、滞留時間６分にやはり一本のピークがあるが、その吸収強度は明らかに減少している。また、滞留時間約９分に別の一本のピークが出現しており、このピークはβ−ガラクトシダーゼと反応したガドリニウム金属錯塩であり、すなわち、ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）内のガラクトピラノースを除去したもので、このガドリニウム金属錯塩を（［Ｇｄ（ＣＨＥ）］- ）と称する。
【００４７】
弛緩時間の研究：３つの異なる濃度のβ−ガラクトシダーゼを用意し、かつ３７±０．１℃下での反応後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）サンプルを利用して、４００ＭＨｚ核磁気共鳴装置で２５±０．１℃下かつ異なる時間のその縦方向弛緩時間（Ｔ1 ）の変化を計測した。まだβ−ガラクトシダーゼを添加していないガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）の縦方向弛緩時間を分母とし、得られたサンプルの縦方向弛緩時間を分子とすれば、Ｔ1 変化の百分率を求めることができる。
【００４８】
表１において、３つの等しくない濃度のβ−ガラクトシダーゼでのガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）サンプルが、経時的に得られた縦方向弛緩時間（Ｔ1 ）の変化百分率を示す。
【００４９】
表１の結果から、三組の異なるサンプルに酵素を添加した直後にＴ1 を計測したとき、そのＴ1 値はほとんど変化していないが、１４日反応させた後再度そのＴ1 値を計量したときには、濃度が比較的低い（２．４ｎＭ）酵素を添加したガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は、そのＴ1 値が約１５％低下し、濃度が比較的高い（７．２ｎＭ）酵素を添加したガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は、そのＴ1 値が約２５％低下し、そして他のもう１つの対照では酵素濃度を比較的高くして（７．２ｎＭ）かつ８０℃下で３０分間（酵素を失活させる）反応させた後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）- ］）は、そのＴ1 値はほとんど変化していないことを発見した。この結果から、添加された酵素の濃度が高ければ高いほど、反応時間が長く、β−ガラクトシダーゼのカッティングが多いことを表す。したがって、そのＴ1 値の低下が大きければ大きいほど、Ｔ1 値の減少のためにその磁気共鳴造影信号を増強させることができる。
【００５０】
磁気共鳴画像の研究：ｐＨ７．３で０．１Ｍ（Ｔｒｉｓ）緩衝液を混合した酵素溶液（７．２ｎＭ）の添加前後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）を、３７．０±０．１℃下で１４日反応させた後、磁気共鳴画像法を利用して映像を走査した。図５から、酵素と反応する前（左）、その映像は比較的暗く、そして酵素と反応した後は（右）、その映像は明らかに信号強度を増強しており、二者に顕著な対比効果を呈させている。以上の結果からガドリニウムトリアミノカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は生物活性（酵素活性）を有している磁気共鳴造影対比剤であることを示す。
【００５１】
以下、複数の実施例をあげてより詳細に本発明の方法、特徴および有利な点を説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためにあって、決して本発明の技術的思想を限定するものではなく、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲に準ずる。
【実施例】
【００５２】
トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物有機配位子の合成
実施例１：１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２の合成方法
２０グラム（０．１１モル）のＤ−ガラクトース，１および１００ミリリットルの無水ピリジンをフラスコ中に入れて、等圧管でゆっくり５０ミリリットルの酢酸無水物を添加し、室温下で８時間攪拌する。反応終了後、吸引乾燥し、３００ミリリットルのトリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出して有機層を収集した。この有機層にさらに５グラムの硫酸ナトリウムを添加して３０分後にろ過し、吸引乾燥して３４．２３グラムの生成物を得た。その収率は７９％である（さらなる精製はしない）。
【００５３】
実施例２：２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３の合成方法
２３．４グラム（０．０６モル）の１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２および１００ミリリットルの氷酢酸を単首フラスコ中に入れ、アルミ箔を用いて該フラスコを包み、光を遮断した。さらに等圧管で徐々に１２０ミリリットルの３３％臭化水素（ＨＢｒ）を添加して、室温で８時間攪拌した。反応終了後、８００ミリリットルのトリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出し、有機層を収集した。有機層にさらに１０グラムの硫酸ナトリウムを添加して、３０分後ろ過して吸引乾燥した。しかる後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：ヘキサン＝１：２）で精製を行い、ＴＬＣで第３画分を収集し、吸引乾燥して１６．５６グラムの生成物を得た。収率は６７．１８％である。１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝６．６５（ｄ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ），５．３５（ｄｄ，１Ｈ），４．９９（ｄｄ，１Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝２０．３７，２０．４１，２０．５３，６０．７０，６６．９３，６７．６９，６７．９０，７１．００，８８．０６，１６９．５，１６９．６，１６９．８，１７０．０．
実施例３：２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４の合成方法
９．５６グラム（２．３２×１０-3モル）の２，３，４，６−アセト−α−ブロモガラクトピラノース，３および０．５グラムの４Å分子ふるいを三つ首フラスコ中に入れ、真空吸引してその後窒素ガスを注入する。適量のジクロロエタンを溶剤として添加し、さらに、３．４６６ミリリットル（４．８８×１０-3モル）の２−ブロモエタノールを添加して５分間攪拌した。さらに、６．４グラム（２．３２×１０-3モル）の炭酸銀を添加して、室温下で２．５時間反応させた。反応終了後、吸気ろ過するとともにろ液を引き出し、乾燥させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：ヘキサン＝１：２）で精製を行い、ＴＬＣで第２画分を収集し、吸引乾燥して生成物３．１２グラムを得た。収率は２９．４９％である。
【００５４】
1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝５．４０（ｄ，１Ｈ），５．１９（ｄｄ，１Ｈ），５．０６（ｄｄ，１Ｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ），４．１７（ｍ，４Ｈ），４．００（ｔ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｔ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝２０．０４，２０．０９，２０．１２，２０．３１，６０．８２，６６．５９，６８．０９，６９．１９，７０．２３，７０．２７，１００．８，１６８．９，１６９．５，１６９．６，１６９．７．
実施例４：３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７の合成方法
２０グラム（０．１７１モル）のＮ−アミノエチル−１，３−プロパンジアミン，５をフラスコ中に入れ、１００ミリリットルのシアノメタンを添加して十分に混合した後２５グラムの炭酸カリウムを添加し、室温下において１時間攪拌した。次に８８．２０ミリリットル（０．１４９ミリモル）のｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート，６を添加して２４時間加熱還流した。反応終了後、吸気ろ過するとともにろ液を吸引乾燥させた。吸引乾燥した油状物を２００ミリリットルの脱イオン水および１００ミリリットルのトリクロロメタンで抽出し、有機層を収集して吸引乾燥すると、油状物を得ることができる。この油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート→エチルアセテート：アセトン＝１：１）で精製を行った。エチルアセテート：アセトン＝１：１の部分を収集して吸引乾燥後黄色油状物を得た。さらに適量のエチルアセテートを添加してこの油状物を溶解させて室温下に放置して再結晶させ、３日後透明結晶２９．３２グラムを得た。結晶収率は３０％で、融点は１０５．１〜１０６．４℃である。 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，４００ＭＨｚ）：δ＝３．５６（ｓ，４Ｈ），３．５１（ｓ，４Ｈ），３．２７（ｔ，２Ｈ），３．２２（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），２．０７（ｐ，２Ｈ），１．４５（ｓ，３６Ｈ）．13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，１００ＭＨｚ）：δ＝１７１．１，１７０．８，８１．６，８１．３，５５．２，５４．９，５２．１，５０．３，４９．２，４５．９，２８．１，２２．９．
実施例５：トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ）
１．８グラム（３．１３×１０-3モル）の３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７をフラスコに入れてシアノメタン中に溶解する。３．９６２ミリリットル（３．１３×１０-2モル）のテトラメチルグアニジンを添加して１０分間攪拌する。さらに１．７１グラム（３．７６×１０-3モル）の２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を添加して２４時間加熱還流させた。溶液を吸引乾燥し、脱イオン水およびエチルアセテートで抽出し、有機層を収集した。吸引乾燥後、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン：ヘキサン＝３：７→アセトン：ヘキサン＝１：１）で精製を行い、アセトン：ヘキサン＝１：１部分を収集し、吸引乾燥して黄色油状物を得た。これを円底フラスコ中に入れ、１００ミリリットルの２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して４０度まで加熱し、２４時間攪拌した。次に、陰イオン交換樹脂で精製を行い、不等濃度のギ酸抽出で０．０４〜０．０５Ｎのギ酸抽出液を収集し、吸引乾燥後生成物０，４７グラムを得た。収率は４５．０６％である。
【００５５】
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝４．３１（ｄ，１Ｈ），４．１８（ｂｒ，１Ｈ），３．９５（ｂｒ，１Ｈ），３．８１（ｓ，４Ｈ），３．８０（ｓ，１Ｈ），３．６３（ｓ，４Ｈ），３．６２（ｓ，１Ｈ），３．４５（ｍ，８Ｈ），３．３１（ｍ，６Ｈ），２．１１（ｂｒ，２Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝１８．９７，４９．６１，５０．４９，５１．１４，５２．８４，５２．９１，５６．３９，５６．９０，６０．９８，６２．９７，６８．５３，７０．５１，７２．５５，７５．２１，１０２．６，１６９．８，１７３．２．
ガドリニウム金属錯塩の合成
実施例６：ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノースの調製
０．１グラム（０．１８ミリモル）のトリアミノテトラカルボン酸ガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ，実施例５により製造されたもの）を１．２６グラム（０．２７ミリモル）塩化ガドリニウムと混合し、５ミリリットルの脱イオン水を添加して２４時間加熱還流した。反応終了後、溶液ｐＨを８まで調整した後、固体が析出した。さらにｐＨを７に調整した後ろ過し、再度溶液を吸引乾燥したところ、無色結晶０．０７３グラムが析出した。収率は５７．０３％である。
【００５６】
表１
サンプル 酵素を添加した時点 反応後１４日
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９５．７４±１．４７％ ８５．９１±０．１１％
２．４ｎＭ β−ｇａｌ
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９３．２６±０．２５％ ７６．６３±１．１１％
７．２ｎＭ β−ｇａｌ
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９９．６０±１．７８％ １０２．７２±０．５８％
７．２ｎＭ加熱失活
β−ｇａｌ
表１はガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩［Ｇｄ（ＣＧＰ）］-1に不等濃度の酵素を添加した後、経時的に測定されたＴ1 値の変化を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース（ＣＧＰ）の合成フローチャートである。
【図２】β−ガラクトシダーゼが存在した場合の［Ｇｄ（ＣＧＰ）- ］の反応式である。
【図３】Ｄｙ（ＩＩＩ）−誘導Ｈ2 Ｏ 17Ｏ−ＮＭＲ変位対塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ3 ）、ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）の濃度作図である。
【００５８】
（◆）塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ3 ）がβ−ガラクトシダーゼと反応していない場合の濃度。
【００５９】
（■）ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）がβ−ガラクトシダーゼと反応した場合の濃度。
【００６０】
（▲）ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）がβ−ガラクトシダーゼと１４日反応した後の濃度。
【図４】ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）に酵素を添加した後５日目に得られた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトログラムである。
【００６１】
ガドリニウムテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）の濃度は２ｍＭであり、β−ガラクトシダーゼの濃度は２．４ｎＭである。
【図５】ガドリニウムテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）に酵素を添加した前後の磁気共鳴画像である。
【００６２】
（左）ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）（０．６ｍＭ）にβ−ガラクトシダーゼを添加していない場合の磁気共鳴画像。
【００６３】
（右）β−ガラクトシダーゼ（７．２ｎＭ）をｐＨ７．３の０．１Ｍトリヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液に添加して３７．０±０．１℃下で１４日反応させた後の磁気共鳴画像。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物、および中心金属イオンと反応して合成された常磁性を有する金属錯塩に関する。本発明は特に、この種類の常磁性金属錯塩を利用して磁気共鳴造影剤とすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
文献には、ガドリニウム金属錯塩を高分子量の物質に結合させる方法が多く記載されている。その中で、非特許文献１は、アシル化反応、アルキレーション反応、ウレア形成法およびアミノ化による還元などの方法を比較的常用される方法として開示している。
【０００３】
本発明者はかつて、３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］の誘導体、３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリス（カルボキシメチル）［ＴＴＤＡ］を合成し、それらの配位子の、ガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、カルシウムイオン（Ｃａ2+）および銅イオン（Ｃｕ2+）などの金属錯塩についての物性および化学的性質を研究したところ、ガドリニウム−３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＴＴＤＡ）］2-1 ）が、ガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）よりもすぐれた物性および化学的性質を有することを示した。また、非特許文献２に記載されているように、この項の改良は、該錯塩に磁気共鳴造影剤としての潜在能力を備えさせた。
【０００４】
近年、磁気共鳴画像法のソフトウエアとハードウエアの発展により映像学的診断が以前に比べて大幅に向上している。そしてより進んだ磁気共鳴画像法診断の感受性および正確性を向上させるために安全性と安定性の発展に目標を有する磁気共鳴造影剤が目下磁気共鳴画像法研究の重要な方向のひとつとなっている。一般の磁気共鳴造影剤に使用される金属イオンには、マンガンイオン（Ｍｎ2+）、鉄イオン（Ｆｅ3+）およびガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）があり、その中でガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）の使用が最も多く、このガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）の磁気モーメントが最大なので、該金属イオンが体内に滞留するとその毒性も最大となる。したがって、有機配位子を利用して安定な錯塩を形成させることによりその毒性を抑制しなければならない。
【０００５】
目下、アメリカ食品薬品管理局（ＦＤＡ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に認可され、臨床の使用に供する静脈注射の磁気共鳴造影剤にはガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）、ガトテル酸メグルミン（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］-1）、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］ビス−メチルアミドガドジアミド注入物、１，４，７−トリキス（カルボキシメチル）−１０−（２−ヒドロキシルプロパン）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、［Ｇｄ（ＨＰ−Ｄ０３Ａ）］ガドテリドール、加えて、マンガン、ジピリドキシル、ジホスファイト、ＭｎＤＰＤＰ、テスラスキャンなどの５種がある。この５種は細胞外造影剤であり、その中で、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］および［Ｇｄ（ＨＰ−Ｄ０３Ａ）］は非イオン性造影剤、そして［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-、［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- およびＭｎＤＰＤＰはイオン性造影剤である。［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- および［Ｇｄ（Ｈｐ−Ｄ０３Ａ）］は大環構造（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）を有し、そしてＭｎＤＰＤＰ、［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）2-］および［Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）］は直鎖構造である。本発明は直鎖構造を有し、かつ生物活性を有する金属錯塩を発展させて磁気共鳴造影剤とするものである。
【非特許文献１】Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍら、１９９２年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第３巻第２ページ
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｙ．Ｍら、１９９８年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ 第４１１３〜４１１８ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物に関し、かつ、この化合物を用いて中心金属イオンと反応させて合成された、生物活性を有する金属錯塩に関する。特に、本発明は、この種類の常磁性金属錯塩を利用して磁気共鳴画像法の造影剤とすることに関する。
【０００７】
磁気共鳴画像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＭＲＩ）技術の速やかな発展により、近年ではすでに疾病診断の重要技術の１つとなり、そして一歩進んで磁気共鳴画像法診断の感受性および正確性を向上させるために、安全性、安定性の発展に目標を有する磁気共鳴造影剤が目下磁気共鳴画像法の研究の重要な方向となっている。したがって、本技術に必要な造影剤の研究も主要な積極的発展の対象となっている。
【０００８】
新しい磁気共鳴造影用の造影剤を設計する場合、金属錯塩の安定性は重要な考慮要素であり、造影剤金属錯塩の生物体内における安定性は、それが体外に排出される前に体内に滞留した時間の安定性を意味する。Ｃａｃｈｅｒｉｓらは１９９０年Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇ．，第８巻第４６７ページ中に、ガドリニウム金属錯塩の生物体内における安定性は次の３種の要素を考慮しなければならないと開示している。即ち：（１）ガドリニウム金属錯塩の熱力学安定定数、すなわち有機配位子が完全に脱陽子化された状態下でのガドリニウム金属イオンとの親和力；（２）ガドリニウム錯塩の条件化安定定数、すなわちガドリニウム錯塩の生物体内における生理的ｐＨ条件下での安定定数；（３）有機配位子のガドリニウム金属イオンに対する選択定数。生物体内にはカルシウム、亜鉛、銅および鉄などの金属イオンが存在しているので、これらの金属イオンはガドリニウム金属イオンと互いに有機配位について競合し、有機配位子のガドリニウム金属イオンに対する選択性が比較的劣る場合であれば、金属イオンはガドリニウム金属錯塩中から解離する可能性がある。
【０００９】
金属錯塩の弛緩率も磁気共鳴造影剤にとって必要な条件の１つである。一般に、弛緩率に影響する要素は次の式（１）で表される。
【数１】
【００１０】
その中のｑは内層水分子（ｉｎｎｅｒ ｓｐａｃｅ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）数、μeff は金属イオンの有効磁気モーメント（ガドリニウム金属錯塩に対するμeff ＝０．９４Ｂｏｈｒ Ｍａｇｎｅｔｏｎ、例えばＣｏｔｔｏｎ，Ｆ．Ａ．Ｗ．らが１９８２年Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ニューヨーク：Ｗｉｌｅｙ．）第４巻第２３章に開示した）、τc は固定磁界下における常磁性物質の関連時間、γは金属イオンから内層水分子の陽子までの距離（γ＝２．５０±０．０４Å、水酸化ガドリニウム（Ｇｄ3+（ＯＨ）2 ）系統に対して；Ｓｃｈａｕｅｒ Ｃ．Ｋ．Ａ．らが１９８９年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ第１８５ページ中に開示した）。相似官能基を有するガドリニウム金属錯塩に対して言えば、μeff およびγ値は定数とみなすことができるのでｑ値およびτc は弛緩率に影響する主要要素である。
【００１１】
関連時間（τc ）は主として次の３要素の影響を受ける。（１）分子回転関連時間（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，τr ）；（２）電子縦方向および横方向スピン弛緩時間（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｓｐｉｎ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，Ｔ1,2e）；（３）内層水分子存在時間またはその交換速度（ｗａｔｅｒ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｏｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒａｔｅ，τm -1＝κex）。例えば、Ｔｏｔｈ，Ｅ．Ｂ．，Ｌ．らは２００１年Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．第２１６〜２１７巻第３６３ページに次の関係式（２）を開示した。
【００１２】
τc ＝τr -1＋Ｔie-1＋τm -1 ｉ＝１，２ （２）
関連時間τc の値が陽子ラム（Ｌａｒｍｏｒ）周波数の逆数の値に等しいとき、その弛緩率は極大値に達するようになる。したがって、磁界が０．５Ｔ（２１ＭＨｚ、 1Ｈ 周波数）の場合、τc の最適値は７．４ｎｓ、そして磁界が１．５Ｔ（６４．５ＭＨｚ）の場合、τc の最適値は２．５ｎｓと推定することができる。Ｌｕｚ Ｚ．Ｍ．らは１９６４年Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ．第４０巻第２６８６ページ中に、縦方向弛緩率は主として結合溶媒分子の縦方向弛緩時間（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｕｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｔ1m）およびτm と関係することを開示した。その関係は次の式（３）に表される。
【００１３】
γ1 ＝１／Ｔ1 ＝ｑＰm ／（Ｔ1m＋Ｔm ） （３）
式中、Ｐm は結合溶媒分子のモル分率である。この公式から、もし水分子の交換速度が非常に速い、つまりτm ＜＜Ｔimである場合、γ1 は主として結合溶媒分子の弛緩率（１／Ｔ1m）と関係することがわかる。しかしながら、τm 値が非常に短いと、Ｔ1mはτm の影響を受けるので、τm 値を無制限に短縮してもその弛緩率をそれに応じて高くさせることができない。Ｃａｒａｖａｎ，Ｐ．Ｅ．らは、１９９９年Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．第９９巻第２２９３ページ中に、模擬的にｑ＝１およびγ＝３．１Åの条件下において、Ｔ1e、τr およびτm は２つの臨床上最も常用される磁界（０．５Ｔおよび１．５Ｔ）下で弛緩率に影響を及ぼし、その結果τm の理論的最適値は１０ｎｓと推定できると開示した。
【００１４】
一般に、磁界の増加はそのＴ1eを増加させ、Ｃａｒａｖａｎ，Ｐ．Ｅ．らにより１９９９年Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．第９９巻第２２９３ページ中に開示された研究では、磁界強度０．５下においてはその弛緩率に対して非常に大きな影響があるが、磁界１．５Ｔにおいてはその弛緩率に対してはっきりした影響がなく、つまり比較的高い磁界下においては弛緩率はτr およびτm のみの影響を受けることを発見した。目下、あらゆる市販の磁気共鳴造影剤では、その縦方向弛緩率はいずれも理論最高値と大きな差で離れており、これは主としてこれら造影剤の分子回転があまりにも高速であることに起因する。
【００１５】
Ｍｉｃｓｋｅｉ Ｋ．Ｈ．らは、１９９３年Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．第３２巻第３８４４ページに、含水ガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）（Ｈ2 Ｏ）］2-）のτm 値は３０３ｎｓであって、τm の最適値よりもはるかに大きく、かつそのτr 値は５９ｐｓであり、Ｌａｕｒｅｎｔ Ｓ． Ｅ．らが２０００年にＨｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ第８３巻第３９４ページに開示したように、τr の最適値よりもはるかに小さいので、目下この分野の科学者たちはいずれも積極的に高速水分子交換速度および低い回転速度を有する金属錯塩を探索し、金属錯塩の弛緩率（ｒ1 ）を高め得るように努力していることを開示した。
【００１６】
新世代の磁気共鳴造影剤は、低分子量の金属錯塩、例えば、Ｂｒａｓｃｈ Ｒ．Ｃ．が１９９１年Ｍａｇａｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．第２２巻第２８２ページに開示したガドリニウム−３，６，９−トリアザウンデカンジオイック酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）錯塩（［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-）またはガドテル酸メクルミン錯塩（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- ）を、生物物理学的および薬理学的特性を改変できるように、高分子量の物質と共役させている。生物物理学の観点から、小分子のガドリニウム金属錯塩がもし高分子物質と共役すれば、分子全体の旋回を遅くさせ、弛緩率を増加させることができる。またほかに、もし金属錯塩を組織に特異的な標的の部分（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と共役させることができれば、この高分子の結合対象は、多くのキャリアを介してガドリニウム金属錯塩を低濃度のレセプターに送り、レセプターを核磁気共鳴下において現像させるようにできる。この他に、高分子量の結合対象は分子が比較的大きいので、血管中に比較的長時間停留でき、血池造影に適切に用いられる。
【００１７】
１９８５年当時、科学者たちは造影剤分子旋回の速度を努めて降下させて弛緩率を増加させることを開始し、例えば、Ｌａｕｆｆｅｒ Ｒ．Ｂ．らは１９８７年Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．第８７巻第９０１ページ、およびＡｉｍｅ Ｓ．Ａ．らは１９９２年Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ第３１巻第２４２２ページ中に、含ベンゼン環またはヒドロキシ基が比較的多い巨大官能基を利用して、１，４，７，１０−テトラキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＡ）構造の中のカルボキシル基に取って代わり、それをガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）と結合させて金属錯塩を形成させることを開示した。そのγ1 値はそれぞれ４．０３、４．３３、４．４９および５．１９ｍＭ-1Ｓ-1であり、いずれもガドリニウム−１，４，７，１０−テトラキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（［Ｇｄ（ＤＯＴＡ）］- 、３．５６ｍＭ-1Ｓ-1）よりも高い。この結果から、有機配位子の分子量が大きければ大きいほど、そのτr 値が増加して該γ1 値を上昇させることがわかる。
【００１８】
文献にはガドリニウム金属錯塩を高分子量の物質に結合させる方法が数多く記載されている。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ Ｍ．は、１９９２年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第３巻第２ページ中に、比較的常用される方法として、アシル化反応、アルキル化反応、ウレア形成方法およびアミノ化による還元などの方法を開示している。目下、文献において高分子量物質と結合する最も常用される試薬は、３，６，９−トリアザウンデカンジオイック酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］自体またはその誘導体、およびＤＴＰＡ−ジアンヒドリドが含まれる。高分子量物質の１級アミンを利用して３，６，９−トリアザウンデカン二酸３，６，９−トリス（カルボキシメチル）［ＤＴＰＡ］自体またはその誘導体もしくはＤＴＰＡ−ジアンヒドリドと反応させ、アミド結合を形成させることにより、有機配位子を高分子量物質と結合させることができる。Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｐ．Ｆ．Ｗ．らは、１９９０年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１巻第６５ページに、さまざまの分子量のポリリシンを利用してＤＴＰＡ−ジアンヒドリドおよびＤＴＰＡの誘導体と反応させることを開示した。しかしながら、ＤＴＰＡ−ジアンヒドリドを利用してたんぱく質と結合させると容易に架橋の状況が発生するので、Ｓｐａｎｏｇｈｅ Ｍ．Ｌ．らは１９９２年Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ第１０巻第９１３ページに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを利用してＤＴＰＡと反応させてＮ−ヒドロキシコハク酸エステルを形成させると、架橋の状況を回避できると開示した。ＤＴＰＡ−（Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル）は、たんぱく質と共有結合を形成するばかりでなく、Ｐａｘｔｏｎ Ｒ．Ｊ．Ｊ．らが１９８５年Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４５巻第５６９４ページに開示したように、さらにＤＴＰＡ−（Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル）を利用してモノクローナル抗体と共有結合を形成し、キャリアにより対比剤を抗がん腫胚芽（ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｍｂｒｙｏ）の抗原上に載置することができる。ところが、この合成方法はアミド結合を形成させる、つまりこの有機配位子とガドリニウム金属イオンとの結合能力を弱めてしまう。この問題を解決するために、Ａｉｍｅ Ｓ．Ｂ．らは、１９９９年Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第１０巻１９２ページに、３，４−ジエトキシシクロブタン−３−エン−１，２−ジケトン（スクアレート）をリンカーとして１，４，７−トリキス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［Ｄ０３Ａ］をたんぱく質と、共有結合を形成させ、その金属錯塩の安定性を増幅できるように所望するとともに、たんぱく質と共有結合させることにより特殊生物活性を有する効果を達成することを開示している。
【００１９】
大部分の磁気共鳴造影剤は病巣（例えば受容体または抗原）の濃度をナノモル並みの量に目標化でき、この濃度は、受容体誘発磁化量増加（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＲＩＭＥ）状況での運用において、磁気共鳴造影方面では低すぎるので、近年来科学者たちは、連続酵素群を利用してガドリニウム金属錯塩を活性化させている。この方法は弛緩率を増加できるほか、さらに目標位置−背景値（ｔａｒｇｅｔ−ｔｏ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の比値を向上させることができる。Ｍｏａｔｓ Ｒ．Ａ．Ｆ．らは１９９７年Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．第３６巻第７２６ページに、大環状有機配位子の中の一官能基をガラクトピラノースに接合させて４，７，１０−トリ（酢酸）−１−（２−β−ガラクトピラノシルエトキシ）−１，４，７，１０−（テトラアザシクロドデカン）（ガドリニウム（ＩＩＩ）［ＥＧａｄ］）を合成し、この場合、ＥＧａｄは９配位子の形式でガドリニウム金属イオンと結合するのでＥＧａｄの内層分子数は０．７となり、このＥＧａｄが生物体に入ってβ−ガラクトシダーゼ酵素［β−ｇａｌ］に遭遇すると、ＥＧａｄのガラクトピラノース結合水を解離させることができるとともに、１．２個の内層水分子をリンクさせて、その磁気共鳴造影信号を増幅させると開示している。
【００２０】
Ｎｉｖｏｒｏｚｈｋｉｎ Ａ．Ｌ．Ｋ．らは、２００１年Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．第１５巻第２９０３ページに、受容体誘発磁化量増加亢進化合物（Ｐｒｏ−ＲＩＭＥ）を合成し、この試薬は主として４部位、即ち、１）３分子リシンからなるマスキング基、２）ＨＳＡ結合部位、３）グリシン結合部位および４）信号発生基より構成されていると開示している。その作用機構は、最外層のリシンが容易に一種のヒトカルボキシペプチダーゼＢ凝血繊維たんぱく質溶解阻害剤（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＡＦＩ）により分解されることにある。いったん三分子リシンが分解されると、露出した脂溶性芳香族はＨＳＡと強力な結合力を生じ、比較的高い弛緩率を得る。
【００２１】
本発明者はかつて、ＤＴＰＡの誘導体ＴＴＤＡ（３，６，１０−トリアザドデカン二酸３，６，１０−トリ（カルボキシメチル）エステル）を合成して、この一配位子のガドリニウムイオン（Ｇｄ3+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、カルシウムイオン（Ｃａ2+）および銅イオン（Ｃｕ2+）などに対する金属錯塩の物理的性質および化学的性質を研究したところ、［Ｇｄ（ＴＴＤＡ）］2-が［Ｇｄ（ＤＴＰＡ）］2-よりも良好な物理的性質および化学的性質を具備していることを示した。従って、磁気共鳴造影剤（例えば、Ｙ．Ｍ．Ｗａｎｇらは１９９８年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．第４１１３〜４１１８ページに開示した）としての潜在的効力を有する。
【００２２】
したがって本発明者は、ＴＴＤＡを基礎としてＴＴＤＡの誘導体（例えば、Ｔ．Ｈ．Ｃｈｅｎｇらが２００１年Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄａｌｔｏｎ ｔｒａｎｓ．第３３５７〜３３６６ページに開示した誘導体）を合成した。この研究において我々はＴＴＤＡのガドリニウム金属錯塩およびその誘導体がいずれも高速な内層水分子交換速度を有するとともに、そのτm 値はすでに最高弛緩率（γ1 ）の理論的最適値に接近していることを発見した。この特性は小分子のガドリニウム金属錯塩の弛緩率に対して明らかな影響はないが、もしＴＴＤＡのガドリニウム金属錯塩を大分子の物質（例えばたんぱく質）と結合すれば、全体分子量の増大により、その分子旋回の関連時間を弛緩できるほか、ＴＴＤＡガドリニウム金属錯塩が有する高速内層水分子交換速度の特性は弛緩率の増加に寄与することができる。したがって、本研究は、ＴＴＤＡをガラクトピラノースと結合させて、生物活性を有するガドリニウム金属錯塩の配位子を合成するものである。上記動力学パラメータの探索を利用すると、これら化合物が生物活性を有する磁気共鳴対比剤としての必要条件を具備しているか否かが了解され、得られたデータは将来一歩進んで磁気共鳴画像法研究を行う上での根拠を提供することができる。
【００２３】
本発明の主たる目的は、トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を提供することにある。
【００２４】
本発明の次の目的は、磁気共鳴造影対比材用の常磁性を有する金属錯塩を提供することに有る。
【００２５】
上記結論を総合すれば、生物活性を有し、かつ高安定性および高弛緩率を有する金属錯塩は近年の研究の重要点であり、現在にいたるまで、各分野ではなお継続してよりすぐれた磁気共鳴造影剤を探索している。したがって、本発明の目的は、新規のおよび潜在力がありかつ安定性が高い、生物活性を有する金属錯塩を合成して磁気共鳴造影剤とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の上記目的を達成するために、本発明は、下記の化学式（Ｉ）を有するトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物を合成した。
【化５】
【００２７】
式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中、ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中、ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）C −または−（ＣＨ2 ）c −Ｘ−（ＣＨ2 ）c −、式中、ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、単糖類または多糖類。
【００２８】
本発明は、また、磁気共鳴造影剤用とするための、常磁性を有する金属錯塩を提供する。この金属錯塩はＭＬの化学構造を有し、Ｍは中心金属イオンであって、ランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、およびクロム金属イオンからなる群より選択され、そしてＬは式（１）で示される有機配位子である。
【００２９】
本発明の以下の実施例に示すように、本発明は以下のＣｈａｒｔ１．に示すトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物を合成した。
【化６】
【００３０】
式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）−n ｎ＝２
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）−m ｍ＝３
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）−x ｘ＝２
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース
本発明者は、合成されたトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物が以下の特性を有するものと思料する。
【００３１】
１．ガドリニウム金属錯塩に対して比較的高い選択性を有する。
【００３２】
２．酵素を利用することにより、ガドリニウム金属錯塩を活性化して、造影剤の目標位置における濃度を高める。
【００３３】
３．ガラクトピラノースを含有させることにより目標とするガドリニウム錯塩の合成を達成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明によるトリアミノテトラカルボキシルカラクトピラノース化合物は、配位子として金属イオンと配位して常磁性を有する金属錯塩を形成する。この常磁性金属錯塩は磁気共鳴造影剤とすることができ、かつＭＬの化学構造を有する。その中のＭは中心金属イオンであって、ランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群の中より選択され、そしてＬは有機配位子であり上記式（１）に示された化学式を有する。
【００３５】
金属イオンは、好適にはガドリニウム（＋３価）、鉄（＋３価）、またはマンガン（＋２価）である。その中ではガドリニウム（＋３価）がさらに好適である。
【００３６】
図１を参照すると、化学式（１）のトリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物の合成方法において、０．１１モルのガラクトース（Ｄ−ガラクトース，１）を採取し、無水ピリジンとともにフラスコ中に入れ、等圧管を用いて徐々に酢酸無水物を添加し、室温下で攪拌する。反応終了後、トリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水などの液体で抽出し、有機層を収集する。この有機層にさらに硫酸ナトリウムを加えてろ過することにより、１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２を得た。
【００３７】
０．０６モルの１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２を採取し、氷酢酸とともにフラスコに入れる。等圧管を用いてゆっくり臭化水素（ＨＢｒ）を添加し、室温下で攪拌反応後トリクロロメタンを加えて、順に脱イオン水で抽出して有機層を収集する。この有機層にさらに硫酸ナトリウムを添加し、ろ過抽出乾燥して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、生成物を収集して、２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３を得た。
【００３８】
２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３および４Å分子ふるいを３首フラスコ中に入れ、真空中で抽出した後窒素ガスを注入する。適量のジクロロエタンを添加して溶剤とし、さらに２−ブロモエタノールを添加して５分間攪拌する。さらに炭酸銀を添加して室温下で反応させた後ろ過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、生成物２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を収集した。
【００３９】
０．１７１モルのＮ−アミノエチル−１，３−プロパンジアミン，５をフラスコ中に入れ、シアノメタンを添加して、十分に混合した後、炭酸カリウムを加え、室温下で攪拌してさらにｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート，６を添加し、加熱還流反応後ろ過して順に脱イオン水などの溶液で抽出し、有機層を収集した。そして抽出乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、黄色油状物３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７を得た。
【００４０】
３．１３×１０-3モルの３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカン二酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７をフラスコに入れて、シアノメタンに溶解し、テトラメチルグアニジンを添加して攪拌した後、さらに２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を加えて加熱還流する。しかる後、溶液を抽出乾燥して、順に脱イオン水などの溶液として抽出して有機層を収集し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、黄色油状物を得た。これを円底フラスコ中に入れ、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して攪拌した後、陰イオン交換樹脂で精製を行い、トリアミノテトラカルボン酸ガラクトピラノース生成物を得た。
【００４１】
０．１８ミリモルのトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ）を０．２７ミリモルの塩化ガドリニウムと混合した後、脱イオン水を添加して順に脱イオン水などの溶液として抽出する。即ち、脱イオン水およびエチルアセテートを使用して抽出するか、または脱イオン水およびトリクロロメタンを使用して抽出するか、もしくは脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出するか、生成物の性質に応じて選択して使用する。溶液ｐＨを段階的に調整する、即ち、まず溶液ｐＨを８に調整した後、固体を析出状態にさせ、さらにｐＨを７に調整する。加熱還流反応後、溶液ｐＨを段階的に調整してろ過し、溶液を注出して乾燥すると、無色結晶のジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）を析出させることができる。
【００４２】
生物活性常磁性金属錯塩の評価
本発明の配位子トリアミノテトラカルボキシルサッカリド化合物は金属イオンと配位して生物活性を有する金属錯塩を形成することができる。この種類の生物活性を具備した金属錯塩は磁気共鳴造影剤とすることができる。
【００４３】
内層水分子数の検討：17Ｏ−ＮＭＲを利用してジスプロシウム（ＤｙＩＩＩ）金属イオン誘導水17Ｏ核種の化学変位変化（ｄ．ｉ．ｓ．）を測定し、ジスプロシウム（ＤｙＩＩＩ）錯塩度対ｄ．ｉ．ｓ．の作図をすれば、式（９）に示されるように線形関係を得ることができる。
【００４４】
ｄ．ｉ．ｓ．＝ｑΔ［Ｄｙ（配位子）n （Ｈ2 Ｏ）q ］／［Ｈ2 Ｏ］ （９）
勾配はｑΔ／［Ｈ2 Ｏ］であり、ｑは求める内層水分子数であり、ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩［Ｄｙ（ＣＧＰ）］-1と、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を添加して（図２）１４日後得られた勾配は図３に示すようにそれぞれ−３５．６ｐｐｍ／ｍＭ（γ2 ＝０．９９８１）および−５４．６ｐｐｍ／ｍＭ（γ2 ＝０．９９６８）であり、そしてジスプロシウム（ＩＩＩ）誘導17Ｏの勾配は−３５８．１ｐｐｍ／ｍＭ（γ＝０．９９９８）である。ジスプロシウム（ＩＩＩ）水和物は８個の水分子を結合でき、かつ勾配と正比例関係をなすので、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）と反応していないジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）およびβ−ガラクトシダーゼを添加して反応した１４日後のプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）のｑ値はそれぞれ０．８および１．２を得ることができ、このｑ値の増加により、図３に示すように、その磁気共鳴造影信号を増強させる。
【００４５】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析：ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）にβ−ガラクトシダーゼを添加して３７±０．１℃の下で反応させ、それぞれ０日および５日後、高性能液体クロマトグラフィーを利用して酵素添加前後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）を分析した。図４は経時的に高性能液体クロマトグラフィーにより分析されたスペクトログラムである。
【００４６】
図４中、横軸は滞留時間、縦軸は吸収強度である。図４に示されるように、時間ｔ＝０日の場合、滞留時間約６分に一本のピークがあり、このピークはまだβ−ガラクトシダーゼと反応していないガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＧＰ）］- ）である。そして時間ｔ＝５日の場合、滞留時間６分にやはり一本のピークがあるが、その吸収強度は明らかに減少している。また、滞留時間約９分に別の一本のピークが出現しており、このピークはβ−ガラクトシダーゼと反応したガドリニウム金属錯塩であり、すなわち、ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）内のガラクトピラノースを除去したもので、このガドリニウム金属錯塩を（［Ｇｄ（ＣＨＥ）］- ）と称する。
【００４７】
弛緩時間の研究：３つの異なる濃度のβ−ガラクトシダーゼを用意し、かつ３７±０．１℃下での反応後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）サンプルを利用して、４００ＭＨｚ核磁気共鳴装置で２５±０．１℃下かつ異なる時間のその縦方向弛緩時間（Ｔ1 ）の変化を計測した。まだβ−ガラクトシダーゼを添加していないガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）の縦方向弛緩時間を分母とし、得られたサンプルの縦方向弛緩時間を分子とすれば、Ｔ1 変化の百分率を求めることができる。
【００４８】
表１において、３つの等しくない濃度のβ−ガラクトシダーゼでのガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）サンプルが、経時的に得られた縦方向弛緩時間（Ｔ1 ）の変化百分率を示す。
【００４９】
表１の結果から、三組の異なるサンプルに酵素を添加した直後にＴ1 を計測したとき、そのＴ1 値はほとんど変化していないが、１４日反応させた後再度そのＴ1 値を計量したときには、濃度が比較的低い（２．４ｎＭ）酵素を添加したガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は、そのＴ1 値が約１５％低下し、濃度が比較的高い（７．２ｎＭ）酵素を添加したガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は、そのＴ1 値が約２５％低下し、そして他のもう１つの対照では酵素濃度を比較的高くして（７．２ｎＭ）かつ８０℃下で３０分間（酵素を失活させる）反応させた後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）- ］）は、そのＴ1 値はほとんど変化していないことを発見した。この結果から、添加された酵素の濃度が高ければ高いほど、反応時間が長く、β−ガラクトシダーゼのカッティングが多いことを表す。したがって、そのＴ1 値の低下が大きければ大きいほど、Ｔ1 値の減少のためにその磁気共鳴造影信号を増強させることができる。
【００５０】
磁気共鳴画像の研究：ｐＨ７．３で０．１Ｍ（Ｔｒｉｓ）緩衝液を混合した酵素溶液（７．２ｎＭ）の添加前後のガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）を、３７．０±０．１℃下で１４日反応させた後、磁気共鳴画像法を利用して映像を走査した。図５から、酵素と反応する前（左）、その映像は比較的暗く、そして酵素と反応した後は（右）、その映像は明らかに信号強度を増強しており、二者に顕著な対比効果を呈させている。以上の結果からガドリニウムトリアミノカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）は生物活性（酵素活性）を有している磁気共鳴造影対比剤であることを示す。
【００５１】
以下、複数の実施例をあげてより詳細に本発明の方法、特徴および有利な点を説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためにあって、決して本発明の技術的思想を限定するものではなく、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲に準ずる。
【実施例】
【００５２】
トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物有機配位子の合成
実施例１：１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２の合成方法
２０グラム（０．１１モル）のＤ−ガラクトース，１および１００ミリリットルの無水ピリジンをフラスコ中に入れて、等圧管でゆっくり５０ミリリットルの酢酸無水物を添加し、室温下で８時間攪拌する。反応終了後、吸引乾燥し、３００ミリリットルのトリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出して有機層を収集した。この有機層にさらに５グラムの硫酸ナトリウムを添加して３０分後にろ過し、吸引乾燥して３４．２３グラムの生成物を得た。その収率は７９％である（さらなる精製はしない）。
【００５３】
実施例２：２，３，４，６−アセト−α−Ｄ−ブロモガラクトピラノース，３の合成方法
２３．４グラム（０．０６モル）の１，２，３，４，６−ペンタアセテート−Ｄ−ガラクトース，２および１００ミリリットルの氷酢酸を単首フラスコ中に入れ、アルミ箔を用いて該フラスコを包み、光を遮断した。さらに等圧管で徐々に１２０ミリリットルの３３％臭化水素（ＨＢｒ）を添加して、室温で８時間攪拌した。反応終了後、８００ミリリットルのトリクロロメタンを添加して、順に脱イオン水、炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水を用いて抽出し、有機層を収集した。有機層にさらに１０グラムの硫酸ナトリウムを添加して、３０分後ろ過して吸引乾燥した。しかる後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：ヘキサン＝１：２）で精製を行い、ＴＬＣで第３画分を収集し、吸引乾燥して１６．５６グラムの生成物を得た。収率は６７．１８％である。１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝６．６５（ｄ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ），５．３５（ｄｄ，１Ｈ），４．９９（ｄｄ，１Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝２０．３７，２０．４１，２０．５３，６０．７０，６６．９３，６７．６９，６７．９０，７１．００，８８．０６，１６９．５，１６９．６，１６９．８，１７０．０．
実施例３：２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４の合成方法
９．５６グラム（２．３２×１０-3モル）の２，３，４，６−アセト−α−ブロモガラクトピラノース，３および０．５グラムの４Å分子ふるいを三つ首フラスコ中に入れ、真空吸引してその後窒素ガスを注入する。適量のジクロロエタンを溶剤として添加し、さらに、３．４６６ミリリットル（４．８８×１０-3モル）の２−ブロモエタノールを添加して５分間攪拌した。さらに、６．４グラム（２．３２×１０-3モル）の炭酸銀を添加して、室温下で２．５時間反応させた。反応終了後、吸気ろ過するとともにろ液を引き出し、乾燥させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：ヘキサン＝１：２）で精製を行い、ＴＬＣで第２画分を収集し、吸引乾燥して生成物３．１２グラムを得た。収率は２９．４９％である。
【００５４】
1Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝５．４０（ｄ，１Ｈ），５．１９（ｄｄ，１Ｈ），５．０６（ｄｄ，１Ｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ），４．１７（ｍ，４Ｈ），４．００（ｔ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｔ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝２０．０４，２０．０９，２０．１２，２０．３１，６０．８２，６６．５９，６８．０９，６９．１９，７０．２３，７０．２７，１００．８，１６８．９，１６９．５，１６９．６，１６９．７．
実施例４：３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７の合成方法
２０グラム（０．１７１モル）のＮ−アミノエチル−１，３−プロパンジアミン，５をフラスコ中に入れ、１００ミリリットルのシアノメタンを添加して十分に混合した後２５グラムの炭酸カリウムを添加し、室温下において１時間攪拌した。次に８８．２０ミリリットル（０．１４９ミリモル）のｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート，６を添加して２４時間加熱還流した。反応終了後、吸気ろ過するとともにろ液を吸引乾燥させた。吸引乾燥した油状物を２００ミリリットルの脱イオン水および１００ミリリットルのトリクロロメタンで抽出し、有機層を収集して吸引乾燥すると、油状物を得ることができる。この油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート→エチルアセテート：アセトン＝１：１）で精製を行った。エチルアセテート：アセトン＝１：１の部分を収集して吸引乾燥後黄色油状物を得た。さらに適量のエチルアセテートを添加してこの油状物を溶解させて室温下に放置して再結晶させ、３日後透明結晶２９．３２グラムを得た。結晶収率は３０％で、融点は１０５．１〜１０６．４℃である。 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，４００ＭＨｚ）：δ＝３．５６（ｓ，４Ｈ），３．５１（ｓ，４Ｈ），３．２７（ｔ，２Ｈ），３．２２（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），２．０７（ｐ，２Ｈ），１．４５（ｓ，３６Ｈ）．13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，１００ＭＨｚ）：δ＝１７１．１，１７０．８，８１．６，８１．３，５５．２，５４．９，５２．１，５０．３，４９．２，４５．９，２８．１，２２．９．
実施例５：トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ）
１．８グラム（３．１３×１０-3モル）の３，１０−ジ（カルボキシメチル）−３，６，１０−トリアザドデカンジオイック酸（テトラ）−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，７をフラスコに入れてシアノメタン中に溶解する。３．９６２ミリリットル（３．１３×１０-2モル）のテトラメチルグアニジンを添加して１０分間攪拌する。さらに１．７１グラム（３．７６×１０-3モル）の２，３，４，６−アセト−１−エチルブロモガラクトピラノース，４を添加して２４時間加熱還流させた。溶液を吸引乾燥し、脱イオン水およびエチルアセテートで抽出し、有機層を収集した。吸引乾燥後、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン：ヘキサン＝３：７→アセトン：ヘキサン＝１：１）で精製を行い、アセトン：ヘキサン＝１：１部分を収集し、吸引乾燥して黄色油状物を得た。これを円底フラスコ中に入れ、１００ミリリットルの２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して４０度まで加熱し、２４時間攪拌した。次に、陰イオン交換樹脂で精製を行い、不等濃度のギ酸抽出で０．０４〜０．０５Ｎのギ酸抽出液を収集し、吸引乾燥後生成物０，４７グラムを得た。収率は４５．０６％である。
【００５５】
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝４．３１（ｄ，１Ｈ），４．１８（ｂｒ，１Ｈ），３．９５（ｂｒ，１Ｈ），３．８１（ｓ，４Ｈ），３．８０（ｓ，１Ｈ），３．６３（ｓ，４Ｈ），３．６２（ｓ，１Ｈ），３．４５（ｍ，８Ｈ），３．３１（ｍ，６Ｈ），２．１１（ｂｒ，２Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）：δ＝１８．９７，４９．６１，５０．４９，５１．１４，５２．８４，５２．９１，５６．３９，５６．９０，６０．９８，６２．９７，６８．５３，７０．５１，７２．５５，７５．２１，１０２．６，１６９．８，１７３．２．
ガドリニウム金属錯塩の合成
実施例６：ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノースの調製
０．１グラム（０．１８ミリモル）のトリアミノテトラカルボン酸ガラクトピラノース化合物（ＣＧＰ，実施例５により製造されたもの）を１．２６グラム（０．２７ミリモル）塩化ガドリニウムと混合し、５ミリリットルの脱イオン水を添加して２４時間加熱還流した。反応終了後、溶液ｐＨを８まで調整した後、固体が析出した。さらにｐＨを７に調整した後ろ過し、再度溶液を吸引乾燥したところ、無色結晶０．０７３グラムが析出した。収率は５７．０３％である。
【００５６】
表１
サンプル 酵素を添加した時点 反応後１４日
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９５．７４±１．４７％ ８５．９１±０．１１％
２．４ｎＭ β−ｇａｌ
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９３．２６±０．２５％ ７６．６３±１．１１％
７．２ｎＭ β−ｇａｌ
［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ＋ ９９．６０±１．７８％ １０２．７２±０．５８％
７．２ｎＭ加熱失活
β−ｇａｌ
表１はガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩［Ｇｄ（ＣＧＰ）］-1に不等濃度の酵素を添加した後、経時的に測定されたＴ1 値の変化を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】トリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース（ＣＧＰ）の合成フローチャートである。
【図２】β−ガラクトシダーゼが存在した場合の［Ｇｄ（ＣＧＰ）- ］の反応式である。
【図３】Ｄｙ（ＩＩＩ）−誘導Ｈ2 Ｏ 17Ｏ−ＮＭＲ変位対塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ3 ）、ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）の濃度作図である。
【００５８】
（◆）塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ3 ）がβ−ガラクトシダーゼと反応していない場合の濃度。
【００５９】
（■）ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）がβ−ガラクトシダーゼと反応した場合の濃度。
【００６０】
（▲）ジスプロシウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｄｙ（ＣＧＰ）］- ）がβ−ガラクトシダーゼと１４日反応した後の濃度。
【図４】ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）に酵素を添加した後５日目に得られた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトログラムである。
【００６１】
ガドリニウムテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）の濃度は２ｍＭであり、β−ガラクトシダーゼの濃度は２．４ｎＭである。
【図５】ガドリニウムテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）に酵素を添加した前後の磁気共鳴画像である。
【００６２】
（左）ガドリニウムトリアミノテトラカルボキシルガラクトピラノース錯塩（［Ｇｄ（ＣＧＰ）］- ）（０．６ｍＭ）にβ−ガラクトシダーゼを添加していない場合の磁気共鳴画像。
【００６３】
（右）β−ガラクトシダーゼ（７．２ｎＭ）をｐＨ７．３の０．１Ｍトリヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液に添加して３７．０±０．１℃下で１４日反応させた後の磁気共鳴画像。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中、ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中、ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）c −または−（ＣＨ2 ）c −Ｘ−（ＣＨ2 ）c −、式中、ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、モノサッカリド、またはポリサッカリド）
で示される化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）
【化２】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n 、式中ｎ＝２、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m 、式中ｍ＝３、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）x 、式中ｘ＝２、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）
で示される化合物。
【請求項３】
ＭＬの化学構造を有する金属錯塩であって、Ｍはランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群より選択された中心金属イオン、Ｌは式（Ｉ）
【化３】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）C −または−（ＣＨ2 ）C −Ｘ−（ＣＨ2 ）C −、式中ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、モノサッカリドまたはポリサッカリド）で示される有機配位子である金属錯塩。
【請求項４】
ＭＬの化学構造を有する金属錯塩であって、Ｍはランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群より選択された中心金属イオン、Ｌは式（Ｉ）
【化４】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n 、式中ｎ＝２、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m 、式中ｍ＝３、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）x 、式中ｘ＝２、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）で示される有機配位子である金属錯塩。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中、ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中、ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）c −または−（ＣＨ2 ）c −Ｘ−（ＣＨ2 ）c −、式中、ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、モノサッカリド、またはポリサッカリド）
で示される化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）
【化２】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n 、式中ｎ＝２、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m 、式中ｍ＝３、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）x 、式中ｘ＝２、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）
で示される化合物。
【請求項３】
ＭＬの化学構造を有する金属錯塩であって、Ｍはランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群より選択された中心金属イオン、Ｌは式（Ｉ）
【化３】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）a −または−（ＣＨ2 ）a −Ｘ−（ＣＨ2 ）a −、式中ａ＝２〜４、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）b −または−（ＣＨ2 ）b −Ｘ−（ＣＨ2 ）b −、式中ｂ＝２〜４、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）C −または−（ＣＨ2 ）C −Ｘ−（ＣＨ2 ）C −、式中ｃ＝２〜４、
Ｘ＝−Ｏ−または−Ｓ−、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース、モノサッカリドまたはポリサッカリド）で示される有機配位子である金属錯塩。
【請求項４】
ＭＬの化学構造を有する金属錯塩であって、Ｍはランタノイド系金属、マンガン、鉄、コバルト、銅、ニッケルおよびクロム金属イオンからなる群より選択された中心金属イオン、Ｌは式（Ｉ）
【化４】
（式中、
Ｒ1 ＝−（ＣＨ2 ）n 、式中ｎ＝２、
Ｒ2 ＝−（ＣＨ2 ）m 、式中ｍ＝３、
Ｒ3 ＝−（ＣＨ2 ）x 、式中ｘ＝２、
Ｒ4 ＝ガラクトピラノース）で示される有機配位子である金属錯塩。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−５２２２２（Ｐ２００６−５２２２２Ａ）
【公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３１６４３（Ｐ２００５−２３１６４３）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（５０５３０２３６２）高雄醫學大學 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（５０５３０２３６２）高雄醫學大學 (11)
【Ｆターム（参考）】
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