プレプロVIC遺伝子

電子出願以前の出願であるので要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、マウスのプレプロVICポリペプチドの遺伝情報を担うDNA断片、該DNA断片が組み込まれたプラスミドベクター、該プラスミドベクターにより形質転換された形質転換微生物及び該形質転換微生物を用いてプレプロVICを生産する方法に関する。
〔従来の技術〕
VICはVasoactive intestinal contractor(血管作動性腸管収縮因子)の略で、従来エンドセリンβ(ETβ)(特願昭63-228839号)と呼ばれていたものであるが、その後の研究で、VICは血管内皮細胞(エンドセリアル セル)が産生する物質ではなく、腸組織が産生する物質であることがわかり、エンドセリンβ(ETβ)はVICと改名されたものである(J.B.C.264,14613〜14616,1989)。
このVICは血管収縮作用及び腸を収縮させる作用を有しており、本発明者等は先にこのVICの成熟ペプチド、及びその前駆体ペプチド並びにこれらをコードするDNAについて特許出願し (特願昭63-228839号)、また、VICを有効成分とする整腸剤について特許出願している(特願平1-109797号)。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、上記VICの前駆体ペプチドは、その前駆体部分の一部の構造を有するものであり、VIC前駆体の全構造を有するポリペプチドをコードするDNAは得られていなかった。そこで本願発明の課題は、VIC前駆体のポリペプチドの全構造をコードするDNAを取得し、さらに遺伝子組換え手段を用いてプレプロVICを大量生産することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者等は、マウス腸のcDNAライブラリーを作成し、これを用いて初めてマウスのプレプロVICポリペプチドの遺伝情報を担い、VIC前駆体ポリペプチドの全構造をコードするDNA(以下、単にプレプロVIC遺伝子という。)
を単離することに成功し、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、1.マウスのプレプロVICポリペプチドの遺伝 子情報を担い、かつ1.4kbの塩基対を有するD NA断片。
2.下記の制限酵素切断地図を有する上記1記載 のDNA断片。


(EはEcoRI、XはXbaI、PはPstI、BはBamHI、 HindIIIを示す。)
3.下記の塩基配列を含有する上記2記載のDN A断片。
AAGCGTTGTGAGTGCTCTACTGCGGGGGAC TCTGCCTGTGCTACCTTCTGCCATCGAAGA4.下記のアミノ酸配列をコードするマウスのプ レプロVIC遺伝子。




5.下記のDNA配列を含むマウスのプレプロV IC遺伝子。




6.下記1〜5いずれか記載のDNA断片を連結 せしめたプラスミドベクター。
7.宿主微生物を上記4記載のプラスミドベクタ ーにより形質転換して得られた形質転換微生物。
8.宿主微生物が大腸菌である上記5記載の形質 転換微生物。
9.上記7又は8記載の形質転換微生物を培養す ることを特徴とするプレプロVICペプチドの 生産方法。
に関するものである。
以下、本発明を詳述する。
(1)cDNAライブラリーの作成 まず、本発明においては、cDNAライブラ リーを作成する。すなわちマウスの腸から抽出 したmRNA(Chirgwin et al.,Biochemistry, 18,5291-5299(1979))を鋳型と常法に従 い作成する(Maniatis et al.,In:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,p230-241, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982))。本発明で用いる mRNAは、Poly(A)+RNA(Poly(A)+を含 むmRNA)と同一の意味である。
mRNAを抽出する採取源としては、一般的 に生きたマウスから分離した腸或いは分離直後 に凍結して保存しておいたものであればいずれ のものでもよく、特に限定するものではない。
又、cDNAライブラリー作成にあたっては、 一般的に行われている方向に準拠して行えばよ く、mRNAの調製に関しては、例えばキィル グウィン(Chirgwin)らの方法(Biochemistry, 18,5291-5299(1979))又、mRNAからcD NAライブラリー作成方法に関してはマニア ティス(Maniatis)らの方法(In:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,p230-241, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harver,New York(1982))やオカヤマ−バー クの方法(Okayama et al.,Mol.Cell.Biol., 2,161(1982))がその例となる。
その1例を具体的に説明すると、前記マウス の腸からmRNA(Poly(A)+RNA)を得た後、 このmRNAを鋳型とし、オリゴ(dT)をプライ マーとして、cDNAを合成する。
次いで、このcDNAを、例えばファージの DNA、λgt10等のベクターに組み込み、こ れをインビトロパッケージングしてcDNAラ イブラリーを作成するものである。
(2)スクリーニング 次いで、上記ファージライブラリーを大腸菌 とともに適当な培地プレートにまき、プラーク を形成せしめた後、VIC遺伝子の少なくとも 1部分の配列を有するプローブを使用してプラ ークハイブリダイゼーションによりポジデイブ なファージを単離する。
本発明の場合、このようなスクリーニングの 結果、得られたファージ10個あり、これらファ ージのうち1.4kb程度フラグメントを有するフ ァージ(pmVIC cDNA)から目的のプレプロVI CcDNAを得た。このプレプロVIC遺伝子 をベクターpUC18に連結したプラスミド(pmVIC cDNA)の制限酵素地図を第1図に示す。
該プラスミドは、大腸菌HB101を形質転換し (Escherichia coli HB101/pm VIC cDNA)、微工 研菌寄第11209号として寄託している。
(3)DNAの塩基配列決定 スクリーニングされたcDNAの塩基配列の 分析は、常法によって分析が可能である。例え ば、得られたcDNAからいくつかのcDNA フラグメントを作成し、一般に広く利用されて いるジデオキシ法(Sanger et al.,Proc.Natl. Acad.Sel.USA.,73,5463(1977))やマキサム ギルバート法(Maxma et al.,Methods Enzymol., 85,499-580(1980)等によって各々の塩基配列 を解析し、総合的に分析することで全配列を決 定することができる。
この構造解析によって、プレプロVIC中に VICとともにVICと類似する新しいペプチ ドVLP(VIC-like peptide)存在すること が明らかとなった。第5図に、マウス染色体V IC遺伝子と転写されたプレプロVICmRN AにおけるVICとVLPの位置を示す。
(4)形質転換及びプレプロVICの生産 更に、本発明においては、得られたプレプロ VIC遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、 これを用いて宿主微生物を形質転換する。宿主 としては、例えば大腸菌HB101等を挙げること ができ、その形質転換手段自体には特に限定さ れず、常法により行えば良い。
得られた形質転換微生物は適当な培地で培養 して、プレプロVICポリペプチドを産生せし めることができる。
〔発明の効果〕
本発明により、プレプロVICの遺伝情報を担 う、VIC前駆体ポリペプチドの全構造をコード するDNAを単離し、かつその構造を決定したこ とにより、遺伝子工学的手段を適用し、プレプロ VICの大量生産が可能となるほか、VIC遺伝 子と類似の塩基配列を有するDNA、例えばエン ドセリン遺伝子と明確に区別できる遺伝子プロー ブを作成することも可能となる。また、さらにプ レプロエンドセリン蛋白質などと明確に区別でき る抗体を作成することも可能となり、平滑筋収縮 の分子レベルで研究等にも利用できる。
したがって本発明は、医療、医薬品産業等にお いて大いに貢献するものである。
〔実施例〕
実施例1(1)mRNAの調製 摘出後すぐに液体窒素中で凍結させ、−80℃ で保存しておいたマウスの腸(10g)をワーリ ングブレンダーを用いて液体窒素の中で粉砕し た。得られた組織粉末を80mlのグアニジンチオ シアネート(4Mグアニジンチオシアネート、 63mM クエン酸ナトリウム、1.27% N−ラウ ロイルサルコシン、0.1M 2−メルカプトエタ ノールを含むpH7.0)に加えて激しく撹拌し、 ポッターのホモジナイザーでホモジナイズした 後、1000×g、10分間遠心分離した。
上清に塩化セシウムを2.5ml当り1gの割合 で添加して溶解し、更にホモジナイズし、19G 注射針を通してDNAを短く切断した。次いで 0.1M EDTAを含む5.7M塩化セシウム溶液pH 7.0を10mlずつ4本の遠心チューブ(日立 40PA)
に分注し、この溶液の上に得られたホジネート を重層し、日立スウィングローターSRP28に遠 心チューブをセットし、日立製遠心機にて27,0 00rpm、20℃で20時間遠心分離を行った。得ら れた沈澱を75%エタノール溶液で2回洗浄した 後、少量の水に溶解して回収し、1/20容の3M 酢酸ナトリウムpH5.2と2倍容のエタノールを 添加して−20℃で1時間放置しRNAを沈澱さ せた。再び少量の水に溶解して同様にしてエタ ノール沈澱を行いtotalRNAを得た。total RNA(2.5mg)を約6mlの0.5M KClを含む10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5に溶解し、同じ緩衝液 で平衡化されたオリゴ(dT)セルロースカラム (1×4cm)に流してPoly(A)+RNAをカラム に吸着させ、10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5にて溶出させた。その後Poly(A)+RNAを含む画分 を集めてエタノール沈澱を行い、70%エタノー ル溶液中−20℃で保存した。この場合、1.0mg のtotalRNAより約100μgのPoly(A)+RN Aが得られた。
(2)DNAライブラリーの作製 このようにして得たPoly(A)+RNA(mRN A)を鋳型(テンプレート)とし、オリゴ(dT)12- 18(ファルマシア)をプライマーとしてcDN Aを合成させ、これをベクターλgt10に組み 込みcDNAライブラリーを作製した。λgt10 (アマシャムから購入)は制限酵素EcoRIによ る切断サイトを1カ所もつ43.34kbのDNAで ある。これに上記のcDNAをT4ファージ由 来のDNAリガーゼ(宝酒造社製)によって10 ℃、24時間DNA鎖の連結反応を行い、組み込 んでインビトロパッケージング法(インビトロ ・パッケージング キット(アマシャム・イン ターナショナル社製)を使用により得られた形 質導入ファージ粒子を調整した。40μgのcD NAより約1000万個のファージが得られた。
(3)プレプロVIC遺伝子の単離 (2)のようにして作製したcDNAライブラ リーを大腸菌NM514と培養し、プラークを形成 せしめ、それからニトロセルロースフィルター にレプリカをとり、フィルターを0.5N NaOH/1.5 M NaClでしめらせてアルカリ処理(5分間、2 回)した後、1M Tris-HCl pH7.4、更に0.5M Tris-HCl pH7.4/1.5M NaClで処理し、風乾さ せた後、80℃で2時間ベーキングし、DNAを ニトロセルロースに固定した。
固定化されたニトロセルロースフィルターは、 3×SSC/0.1%SDS溶液中で70℃、30分間2回 処理し、細胞残査を十分に取り除き、4×SSC/ 10×Denhardt溶液/0.1mg/mlサケ精子DNAを 含む溶液中で60℃、1時間プレハイブリダイゼ ーションを行った。
既に得ているVIC遺伝子の一部 mVIC PstI-BamHI 0.4kbをニックトランスレーショ ン法(ベーリンガー マンハイム社製,ニックト ランスレーションキット使用)を用いて、α− 32P-dCTPで標識し、1ml当り1.2×106cpmに なるようにハイブリダイゼーション液を調製し、 60℃で10分間インキュベートした後、室温で18 時間ハイブリダイゼーションを行った。ニトロ セルロースフィルターは、4×SSC/0.1%SDS/ 0.2%ピロリン酸ナトリウム溶液で室温10分間 2回洗浄し、更に30℃で15分間2回洗浄後、 フィルターを風乾させ、オートラジオグラフィ ーを行った。
このようにしてスクリーニングした結果、目 的のプレプロVIC遺伝子を得た。
このようなスクリーニングにより、上記プ ローブにポジティブなファージを10コ単離した。
そのファージを5ml培養し、DNAを抽出して EcoRIで消化し、電気泳動してVICのcDN A断片を切り出した。10種のDNAのうち1.4 kbの長さを有する断片をpUC18ベクターのEcoR Iサイトに連結した後、この組換えプラスミド により大腸菌HB101を形質転換した。
次いで、この大腸菌の培養後、プラスミドを 抽出し制限酵素EcoRIで切断し、得られたDN A断片を電気泳動にかけ1.4kbpの目的とするプ レプロVIC遺伝子を大量に得た。該プレプロ VIC遺伝子を有するプラスミド(pmVIC cDNA)
を有する形質転換体は、Esherichia coli HB101 /pmVIC cDNA(微工研菌寄第11209号)として寄託 されている。
(cDNA塩基配列決定)
上記工程で得られたプレプロVIC遺伝子の 構造解析をジデオキシ法により行った。この塩 基配列及びアミノ酸配列を第5図に示す。
【図面の簡単な説明】
第1図は、ベクターpUC18にクローニングされ
ている挿入cDNA(1.4kb)の制限酵素地図、第
2図は、マウスの腸管収縮ペプチドVICのプレ
プロ体のcDNAをクローニングした分離のスキ

ーム、第3図は、マウスの染色体のVIC遺伝子
と転写されたmRNA中のVIC及びVLPVIC-
Like Peptide)の位置を示す図、第4図は、VL
Pをコードする塩基配列及び対応するアミノ酸配
列を示す図、第5図は、マウスのプレプロVIC
遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す図である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】 マウスのプレプロVICポリペプチドの遺伝子情報を担い、かつ1.4kbの塩基対を有するDNA断片。
【請求項2】 下記の制限酵素切断地図を有する請求項1記載のDNA断片。


(EはEcoRI、XはXbaI、PはPstI、BはBamHI、HindIIIを示す。)
【請求項3】 下記の塩基配列を含有する請求項2記載のDNA断片。
AAGCGTTGTGAGTGCTCTACTGCGGGGGAC TCTGCCTGTGCTACCTTCTGCCATCGAAGA
【請求項4】 下記のアミノ酸配列をコードするマウスのプレプロVIC遺伝子。




【請求項5】 下記のDNA配列を含むマウスのプレプロVIC遺伝子。




【請求項6】 請求項1〜5いずれか記載のDNA断片を連結せしめたプラスミドベクター。
【請求項7】 宿主微生物を請求項4記載のプラスミドベクターにより形質転換して得られた形質転換微生物。
【請求項8】 宿主微生物が大腸菌である請求項5記載の形質転換微生物。
【請求項9】 請求項7又は8記載の形質転換微生物を培養することを特徴とするプレプロVICペプチドの生産方法。

【公開番号】特開平6−169774
【公開日】平成6年(1994)6月21日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平2−168535
【出願日】平成2年(1990)6月28日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 平成1年11月29日、日本分子生物学会開催の「第12回日本分子生物学会年会」において文書をもって発表
【出願人】(000000114)工業技術院長 (4)
【指定代理人】
【氏名又は名称】工業技術院生命工学工業技術研究所長