ペプチド含有調味料
【課題】有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料を提供すること。
【解決手段】麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより発酵調味料を得る。
【解決手段】麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより発酵調味料を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを豊富に含有するにも関わらずペプチドの苦味がほとんどない、風味良好な発酵調味料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ペプチドが有する様々な機能性が明らかとなってきている。例えば、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用ならびに血圧降下作用が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。さらには、様々なペプチドにおいて、抗酸化、抗がん、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、オピオイド活性なども報告されている（例えば、非特許文献２参照）。したがって、ペプチドを摂取することにより、人々の健康に寄与する様々な生理効果が期待できる。
【０００３】
ペプチドの製造法としては、化学的に合成する方法やタンパク質を含む素材をプロテアーゼ剤により加水分解する方法が周知の方法として広く用いられているが、前者の場合は化学薬品を使用することから経口摂取に不向きであり、後者の場合は製造コストが高くなったり、ペプチドの苦味が強いために経口摂取が容易にできないという問題がある。
【０００４】
ペプチドの苦味の解決策としては、これまでにもいくつかの技術が考案されている。例えば、サイクロデキストリンを添加する方法（例えば、特許文献１参照）、オリゴ糖を添加する方法、（例えば、特許文献２参照）、有機酸類並びに糖類を添加する方法（例えば、特許文献３参照）、リン脂質類を添加する方法（例えば、特許文献４参照）、合成吸着樹脂と接触処理する方法（例えば、特許文献５参照）などが開示されている。しかしながら、マスキング剤によって新たな異味が生じたり、製造コストが著しく上昇するなど、効果の点において充分とはいえないのが現状である。
【０００５】
ところで、醤油は古来より使用されてきた調味料であるが、大豆と小麦を麹菌の産生する酵素が分解することにより、豊かな旨味が醸し出される。この旨味は、原料のタンパク質にプロテアーゼが作用してペプチドとして可溶化し、さらにこれらのペプチドにペプチダーゼが作用してグルタミン酸をはじめとしたアミノ酸に分解することにより生じる。このため、長年にわたる醤油の技術開発は、タンパク質やペプチドを極力アミノ酸まで分解し、旨味を強化することに主眼が置かれてきた。
【０００６】
醤油の醸造において、プロテアーゼによりペプチドが遊離した後、ペプチダーゼによる分解を受けなければ、醤油中にペプチドが残存すると考えられる。したがって、前述のような様々な有益な生理活性を有すると期待されるが、通常の仕込工程においてはペプチダーゼ活性を特異的に制御することは極めて困難であることから、そのような醤油あるいは発酵調味料は、これまで発明されていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−７５０６４号公報
【特許文献２】特開２００７−９７４６５号公報
【特許文献３】特開平１１−１１８１６０号公報
【特許文献４】特開平８−１７３０９３号公報
【特許文献５】特開２００３−４０９００号公報
【非特許文献１】Ｋ． Ｓｕｅｔｓｕｎａ，Ｊ． Ｎｕｔｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，（９），ｐ．４１５−４１９
【非特許文献２】Ｗｅｎｙｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ，２００５，（４），ｐ．６３−７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ（以下、ＬＡＰ−Ｉともいう）活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ（以下、ＬＡＰ−ＩＩともいう）活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料は、充分な窒素利用率でありながら、驚くべきことに通常の醤油より遥かに多いペプチドを含有し、ペプチド特有の苦味が感じられず、まろやかで豊富な旨味を有することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、
１） 麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料。
２）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性ペプチドを４０ｍｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
３）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が５５％以下である上記１）記載の発酵調味料。
４）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素１％あたりの遊離アミノ基濃度が０．３５ｍｏｌ／Ｌ以下である上記１）記載の発酵調味料。
５）ジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
６）ジペプチドＳｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発酵調味料は、麹菌培養物、もしくは、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる。
【００１３】
本発明の麹菌培養物としては、醤油醸造で広く一般的に用いられている醤油麹を使用することができ、具体的には、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５〜４５℃で、１２〜２４０時間培養して得ることができる。また、発酵調味料の製造に使用されている液体培養麹を使用することもでき、具体的には、大豆や小麦、小麦フスマ等を１〜５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５〜４５℃で、２４〜１２０時間培養して得ることができる。
【００１４】
本発明の植物由来タンパク質原料としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、調味料として好適な風味を持たせるためには、大豆、脱脂加工大豆、精製大豆タンパク質、小麦、小麦グルテン、米、精製米タンパク質を用いるのが良い。これらの原料を、そのままあるいは割砕、粉砕してから、適宜タンパク質変性処理を施し、用いることができる。タンパク質変性処理としては、工業的に広く行われている加圧蒸煮や膨化処理が好ましい。
【００１５】
仕込みの条件としては、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を５：９５〜１００：０、好ましくは１０：９０〜８０：２０の比で混合したものに、重量比で３０〜５００％、好ましくは１００〜３００％の食塩水を加える。食塩水の濃度は、諸味液汁の食塩濃度として０．１〜２０％、好ましくは６〜１８％となるよう調整するのが良い。さらに、この混合物を温度制御が可能な容器に入れ、２５〜６０℃、好ましくは３０〜５５℃で、６〜７２０時間、好ましくは１２〜２４０時間発酵させる。この間、攪拌翼や圧縮空気等によって適宜諸味を攪拌してもよい。麹菌培養物の初発のロイシンアミノペプチダーゼ（以下、ＬＡＰともいう）活性、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料の混合比、仕込み温度、仕込み時間等の影響で諸味液汁中のＬＡＰ活性は変化するが、仕込み後１０日以内に諸味液汁中のＬＡＰ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ＬＡＰ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより、目的の発酵調味料を得ることができる。
【００１６】
前記発酵調味料は醤油諸味様の形態であるが、必要に応じ固形分を除去することにより、可溶性ペプチドを含む液体状の発酵調味料を得ることもできる。固形分を除去する方法としては、ナイロンなどの合成繊維でできた濾布で諸味を包み、加圧する厚揚げ方式や、濾過板と圧搾板に張った濾布の中に諸味を入れ、圧縮空気等で加圧するフィルタープレス方式等の周知の方法を用いることができる。
【００１７】
前記発酵調味料にチゴサッカロマイセス属等の酵母を添加して、発酵させることにより、香味をさらに向上させることも可能である。具体的には、諸味に１０４個／ｍｌ〜１０８個／ｍｌ、好ましくは１０５〜１０７個／ｍｌの酵母を添加し、２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で、３日以上、好ましくは５〜１０日発酵させる。発酵を旺盛にするために、適宜攪拌や通気を行う。なお、この条件で発酵させてもペプチド量はほとんど減少しない。
【００１８】
前記発酵調味料は、ペプチドを多量に含有するにもかかわらず、従来知られているペプチド含有組成物とは著しく異なり、苦味がほとんど感じられず、まろやかで豊富な旨味・コクと、穏やかで優れた芳香を有し、調味料としておいしく摂取できるものである。
【００１９】
前記発酵調味料は、好ましい風味を有することから、醤油に添加して醤油あるいは醤油加工品としたり、各種原料と混合して、つゆ、たれ、ぽんず、ソース、ドレッシング、スープ、惣菜のもと、飲料、サプリメント等に加工して使用するにも好適である。
【００２０】
さらに、前記発酵調味料からペプチドを濃縮あるいは分離精製することもできる。その方法としては、減圧濃縮、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。これらは、一般に広く用いられている方法である。
【００２１】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
【実施例】
【００２２】
＜ペプチド含有発酵調味料の製造＞
加熱変性した大豆と小麦を等量含む固体培地に、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子を添加して、２５〜４０℃で７２時間製麹することにより醤油麹を得た。次に、加熱変性した大豆１４ｋｇ、醤油麹２ｋｇ、水１６Ｌ、食塩３ｋｇを混合し、４５℃、１００ｒｐｍで攪拌した。１０日後に、諸味液汁中のＬＡＰ−Ｉ活性が１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ＬＡＰ−ＩＩ活性が０．５Ｕ／ｍｌ以下に低下した諸味を得た。次いで、酵母チゴサッカロマイセス・ルーキシーを１．５×１０６個／ｍｌの割合で混合し、２５℃で７日間静置した。次いで、油圧式圧搾機を用いて諸味から不溶性固形分を除去し、清澄液を得た。さらに、ＨＳ殺菌機（日阪製作所社製）を用いて１１７℃で５秒間加熱することにより酵素失活と殺菌を行い、５０℃で３日間静置した後、滓成分を含まない上清のみを２０Ｌ採取した（組成物１；本発明発酵調味料）。また、大豆３．２ｋｇ、醤油麹１２．８ｋｇを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した。（組成物２；本発明発酵調味料）。さらに、仕込み時に大豆を加えず、醤油麹１６ｋｇを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した（組成物３；本発明発酵調味料）。
【００２３】
仕込後１０日目の諸味をろ過し、得られた液汁の各種ペプチダーゼ活性を測定した。ＬＡＰ−Ｉ活性は、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基質とし、特許第３７２７７８０号公報に記載の方法で測定した。ＬＡＰ−ＩＩ活性は、諸味液汁をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイサイエンス社製）に供して遊離アミノ酸を除去した後、Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシンを基質とし、特許第３７２７７８０号公報に記載の方法で測定した。酸性カルボキシペプチダーゼ（ＡＣＰ）活性は、諸味液汁をＰＤ−１０カラムに供して遊離アミノ酸を除去した後、酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定キット（キッコーマン社製）を使用し、定法に従って測定した。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）活性は、Ａｇｎｅｓ Ｄｏｕｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．１２，ｐ．４８０９−４８１５に記載の方法で測定した（表１）。ＡＣＰおよびＤＰＰ−ＩＶは４５℃で１０日間仕込んでも１５℃と活性が変化しないが、ＬＡＰは４５℃で活性が低下した（組成物３；本発明発酵調味料）。麹の比率を減じると、諸味中の各種酵素活性はさらに低下した（組成物１、２；本発明発酵調味料）。組成物１では、比較例の濃口醤油諸味（初期仕込温度１５℃、麹：大豆＝１０：０）と比べて、特にＬＡＰ活性が著しく低下していることがわかる。一方、製造ロットの異なる麹を用いて、組成物３と同様の発酵調味料を調製したところ、本発明と比較してＬＡＰ活性が高いケースも見られた（比較例１）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
次に、酵素活性以外の各種分析を行った。可溶性総窒素（ＴＮ）はケルテックオートサンプラーシステム１０３５（アクタック社製）を用い、定法に従って測定した。ペプチド量は、６Ｎ塩酸存在下で１１０℃、２４時間加熱した後、アミノ酸分析計Ｌ−８５００（日立製作所社製）によって全アミノ酸分析を行い、塩酸分解前と比較して増加した遊離アミノ酸量から求めた。アミノ化率は、ＴＮに対する全アミノ酸濃度の割合のことである。なお、ＴＮの計算には大豆タンパク質の一般的な窒素係数である６．２５を用いた。遊離アミノ基濃度は、等量のＯＰＡ試薬（アジレントテクノロジーズ社製）と反応させた後、Ｅｘ：３５０ｎｍ、Ｅｍ：４５０ｎｍの蛍光強度を測定し、既知濃度のグリシンで作成した検量線から求めた。Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ量は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム２６９５−ＱｕａｔｔｒｏＭｉｃｒｏ ＡＰＩ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、添加検量線法により求めた。ＬＡＰ活性を低下させた組成物１、２、３（本発明発酵調味料）では、濃口醤油と比較してペプチド量が多く、アミノ化率が低く、ＴＮ１％あたりの遊離アミノ基濃度が低いことが分かる（表２）。一方、製造ロットの異なる麹を用いて組成物３と同様に調製した比較例１では、ペプチド量が少なく、アミノ化率が高く、ＴＮ１％あたりの遊離アミノ酸濃度が高いことが分かる。これらのことから、本発明のペプチド高含有発酵調味料を得るためには、ＬＡＰ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、ＬＡＰ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することが必須要件であり、このことは従来知られていなかったと言える。
【００２６】
【表２】
【００２７】
組成物１（本発明発酵調味料）と、通常の濃口醤油を、Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８ カラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を接続した高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す、日本分光社製）で分析した。流速１ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む溶離液でアセトニトリル濃度０％−３０％のグラジエント溶出を行った。検出は２２０ｎｍの吸光度とした。なお、この分析条件で観察されるピークのほとんどはペプチドに由来することが一般的に知られている。図１・図２から、組成物１（本発明発酵調味料）では、通常の濃口醤油と比較して、多種多様なペプチド見られ、その量も顕著に多いことが分かる。なお、濃口醤油でも見られる１５分、１８分、２３分の大きなピーク（↓で示した）は、ペプチドではなく、それぞれアミノ酸のＴｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐであることを確認した。また、それ以外のアミノ酸はこのカラムにほとんど保持されず、５分以下で溶出することも確認した。
【００２８】
醤油麹の代わりに食品用プロテアーゼ剤であるアルカラーゼ２．４Ｌ−ＦＧ（ノボザイムズ社製）を使用して、同様の方法で発酵調味料を調製した（比較例２）。組成物１（本発明発酵調味料）と、比較例２を使用して、官能評価を行った。パネルは８名とし、「苦味の強さ」と「味の好ましさ」を１対比較法で評価した。表３の結果から、本発明の発酵調味料は、ペプチドを多く含むにもかかわらず、苦味が少なく、好ましい味を有していることが分かる。プロテアーゼ剤によるペプチド製造法はこれまでに多くが開示されているが、本発明は呈味の点で従来技術より優れていると考えられる。
【００２９】
【表３】
【００３０】
＜血圧が高めの方に対する有効性試験＞
本発明の発酵調味料を用いて、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを５４μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを３１μｇ／ｍｌ含有する醤油加工品を調製し、正常高値血圧者（男性３６名、女性３５名、計７１名）および軽症高血圧者（Ｉ度高血圧者）（男性２９名、女性３２名、計６１名）を対象に、通常の減塩しょうゆを対照食品とした二重盲検による１２週間連続摂取試験を実施した。被験者には被験食品または対照食品を１日に１回、１袋（８ｍｌ）を任意の時刻に調理に利用することで１２週間連続摂取させた（家庭における醤油の標準的な１日摂取量８ｍｌあたり、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを４３０μｇ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを２５０μｇ含有）。その結果、本発明の被験食品を摂取することにより経時的に緩やかな降圧効果が認められ（図３）、摂取前値との比較では、摂取４週間後以降に収縮期血圧が有意な低下を示した。また、対照食品群との比較では、収縮期血圧が、摂取８週間後以降に有意に低下した。この結果から、本発明の発酵調味料は、減塩醤油と比較してペプチドによる有意な降圧作用を有することが確認され、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有するときに、その効果が顕著であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により得られる発酵調味料は、ペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易であることから、有用な生理活性を発揮し、人々の健康に貢献すると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】組成物１のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】濃口醤油のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の発酵調味料を血圧が高めの方が摂取したときの収縮期血圧の変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを豊富に含有するにも関わらずペプチドの苦味がほとんどない、風味良好な発酵調味料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ペプチドが有する様々な機能性が明らかとなってきている。例えば、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用ならびに血圧降下作用が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。さらには、様々なペプチドにおいて、抗酸化、抗がん、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、オピオイド活性なども報告されている（例えば、非特許文献２参照）。したがって、ペプチドを摂取することにより、人々の健康に寄与する様々な生理効果が期待できる。
【０００３】
ペプチドの製造法としては、化学的に合成する方法やタンパク質を含む素材をプロテアーゼ剤により加水分解する方法が周知の方法として広く用いられているが、前者の場合は化学薬品を使用することから経口摂取に不向きであり、後者の場合は製造コストが高くなったり、ペプチドの苦味が強いために経口摂取が容易にできないという問題がある。
【０００４】
ペプチドの苦味の解決策としては、これまでにもいくつかの技術が考案されている。例えば、サイクロデキストリンを添加する方法（例えば、特許文献１参照）、オリゴ糖を添加する方法、（例えば、特許文献２参照）、有機酸類並びに糖類を添加する方法（例えば、特許文献３参照）、リン脂質類を添加する方法（例えば、特許文献４参照）、合成吸着樹脂と接触処理する方法（例えば、特許文献５参照）などが開示されている。しかしながら、マスキング剤によって新たな異味が生じたり、製造コストが著しく上昇するなど、効果の点において充分とはいえないのが現状である。
【０００５】
ところで、醤油は古来より使用されてきた調味料であるが、大豆と小麦を麹菌の産生する酵素が分解することにより、豊かな旨味が醸し出される。この旨味は、原料のタンパク質にプロテアーゼが作用してペプチドとして可溶化し、さらにこれらのペプチドにペプチダーゼが作用してグルタミン酸をはじめとしたアミノ酸に分解することにより生じる。このため、長年にわたる醤油の技術開発は、タンパク質やペプチドを極力アミノ酸まで分解し、旨味を強化することに主眼が置かれてきた。
【０００６】
醤油の醸造において、プロテアーゼによりペプチドが遊離した後、ペプチダーゼによる分解を受けなければ、醤油中にペプチドが残存すると考えられる。したがって、前述のような様々な有益な生理活性を有すると期待されるが、通常の仕込工程においてはペプチダーゼ活性を特異的に制御することは極めて困難であることから、そのような醤油あるいは発酵調味料は、これまで発明されていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−７５０６４号公報
【特許文献２】特開２００７−９７４６５号公報
【特許文献３】特開平１１−１１８１６０号公報
【特許文献４】特開平８−１７３０９３号公報
【特許文献５】特開２００３−４０９００号公報
【非特許文献１】Ｋ． Ｓｕｅｔｓｕｎａ，Ｊ． Ｎｕｔｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，（９），ｐ．４１５−４１９
【非特許文献２】Ｗｅｎｙｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ，２００５，（４），ｐ．６３−７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ（以下、ＬＡＰ−Ｉともいう）活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ（以下、ＬＡＰ−ＩＩともいう）活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料は、充分な窒素利用率でありながら、驚くべきことに通常の醤油より遥かに多いペプチドを含有し、ペプチド特有の苦味が感じられず、まろやかで豊富な旨味を有することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、
１） 麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料。
２）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性ペプチドを４０ｍｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
３）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が５５％以下である上記１）記載の発酵調味料。
４）可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素１％あたりの遊離アミノ基濃度が０．３５ｍｏｌ／Ｌ以下である上記１）記載の発酵調味料。
５）ジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
６）ジペプチドＳｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有する上記１）記載の発酵調味料。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発酵調味料は、麹菌培養物、もしくは、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる。
【００１３】
本発明の麹菌培養物としては、醤油醸造で広く一般的に用いられている醤油麹を使用することができ、具体的には、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５〜４５℃で、１２〜２４０時間培養して得ることができる。また、発酵調味料の製造に使用されている液体培養麹を使用することもでき、具体的には、大豆や小麦、小麦フスマ等を１〜５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５〜４５℃で、２４〜１２０時間培養して得ることができる。
【００１４】
本発明の植物由来タンパク質原料としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、調味料として好適な風味を持たせるためには、大豆、脱脂加工大豆、精製大豆タンパク質、小麦、小麦グルテン、米、精製米タンパク質を用いるのが良い。これらの原料を、そのままあるいは割砕、粉砕してから、適宜タンパク質変性処理を施し、用いることができる。タンパク質変性処理としては、工業的に広く行われている加圧蒸煮や膨化処理が好ましい。
【００１５】
仕込みの条件としては、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を５：９５〜１００：０、好ましくは１０：９０〜８０：２０の比で混合したものに、重量比で３０〜５００％、好ましくは１００〜３００％の食塩水を加える。食塩水の濃度は、諸味液汁の食塩濃度として０．１〜２０％、好ましくは６〜１８％となるよう調整するのが良い。さらに、この混合物を温度制御が可能な容器に入れ、２５〜６０℃、好ましくは３０〜５５℃で、６〜７２０時間、好ましくは１２〜２４０時間発酵させる。この間、攪拌翼や圧縮空気等によって適宜諸味を攪拌してもよい。麹菌培養物の初発のロイシンアミノペプチダーゼ（以下、ＬＡＰともいう）活性、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料の混合比、仕込み温度、仕込み時間等の影響で諸味液汁中のＬＡＰ活性は変化するが、仕込み後１０日以内に諸味液汁中のＬＡＰ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ＬＡＰ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより、目的の発酵調味料を得ることができる。
【００１６】
前記発酵調味料は醤油諸味様の形態であるが、必要に応じ固形分を除去することにより、可溶性ペプチドを含む液体状の発酵調味料を得ることもできる。固形分を除去する方法としては、ナイロンなどの合成繊維でできた濾布で諸味を包み、加圧する厚揚げ方式や、濾過板と圧搾板に張った濾布の中に諸味を入れ、圧縮空気等で加圧するフィルタープレス方式等の周知の方法を用いることができる。
【００１７】
前記発酵調味料にチゴサッカロマイセス属等の酵母を添加して、発酵させることにより、香味をさらに向上させることも可能である。具体的には、諸味に１０４個／ｍｌ〜１０８個／ｍｌ、好ましくは１０５〜１０７個／ｍｌの酵母を添加し、２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で、３日以上、好ましくは５〜１０日発酵させる。発酵を旺盛にするために、適宜攪拌や通気を行う。なお、この条件で発酵させてもペプチド量はほとんど減少しない。
【００１８】
前記発酵調味料は、ペプチドを多量に含有するにもかかわらず、従来知られているペプチド含有組成物とは著しく異なり、苦味がほとんど感じられず、まろやかで豊富な旨味・コクと、穏やかで優れた芳香を有し、調味料としておいしく摂取できるものである。
【００１９】
前記発酵調味料は、好ましい風味を有することから、醤油に添加して醤油あるいは醤油加工品としたり、各種原料と混合して、つゆ、たれ、ぽんず、ソース、ドレッシング、スープ、惣菜のもと、飲料、サプリメント等に加工して使用するにも好適である。
【００２０】
さらに、前記発酵調味料からペプチドを濃縮あるいは分離精製することもできる。その方法としては、減圧濃縮、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。これらは、一般に広く用いられている方法である。
【００２１】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
【実施例】
【００２２】
＜ペプチド含有発酵調味料の製造＞
加熱変性した大豆と小麦を等量含む固体培地に、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子を添加して、２５〜４０℃で７２時間製麹することにより醤油麹を得た。次に、加熱変性した大豆１４ｋｇ、醤油麹２ｋｇ、水１６Ｌ、食塩３ｋｇを混合し、４５℃、１００ｒｐｍで攪拌した。１０日後に、諸味液汁中のＬＡＰ−Ｉ活性が１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ＬＡＰ−ＩＩ活性が０．５Ｕ／ｍｌ以下に低下した諸味を得た。次いで、酵母チゴサッカロマイセス・ルーキシーを１．５×１０６個／ｍｌの割合で混合し、２５℃で７日間静置した。次いで、油圧式圧搾機を用いて諸味から不溶性固形分を除去し、清澄液を得た。さらに、ＨＳ殺菌機（日阪製作所社製）を用いて１１７℃で５秒間加熱することにより酵素失活と殺菌を行い、５０℃で３日間静置した後、滓成分を含まない上清のみを２０Ｌ採取した（組成物１；本発明発酵調味料）。また、大豆３．２ｋｇ、醤油麹１２．８ｋｇを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した。（組成物２；本発明発酵調味料）。さらに、仕込み時に大豆を加えず、醤油麹１６ｋｇを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した（組成物３；本発明発酵調味料）。
【００２３】
仕込後１０日目の諸味をろ過し、得られた液汁の各種ペプチダーゼ活性を測定した。ＬＡＰ−Ｉ活性は、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基質とし、特許第３７２７７８０号公報に記載の方法で測定した。ＬＡＰ−ＩＩ活性は、諸味液汁をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイサイエンス社製）に供して遊離アミノ酸を除去した後、Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシンを基質とし、特許第３７２７７８０号公報に記載の方法で測定した。酸性カルボキシペプチダーゼ（ＡＣＰ）活性は、諸味液汁をＰＤ−１０カラムに供して遊離アミノ酸を除去した後、酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定キット（キッコーマン社製）を使用し、定法に従って測定した。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）活性は、Ａｇｎｅｓ Ｄｏｕｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．１２，ｐ．４８０９−４８１５に記載の方法で測定した（表１）。ＡＣＰおよびＤＰＰ−ＩＶは４５℃で１０日間仕込んでも１５℃と活性が変化しないが、ＬＡＰは４５℃で活性が低下した（組成物３；本発明発酵調味料）。麹の比率を減じると、諸味中の各種酵素活性はさらに低下した（組成物１、２；本発明発酵調味料）。組成物１では、比較例の濃口醤油諸味（初期仕込温度１５℃、麹：大豆＝１０：０）と比べて、特にＬＡＰ活性が著しく低下していることがわかる。一方、製造ロットの異なる麹を用いて、組成物３と同様の発酵調味料を調製したところ、本発明と比較してＬＡＰ活性が高いケースも見られた（比較例１）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
次に、酵素活性以外の各種分析を行った。可溶性総窒素（ＴＮ）はケルテックオートサンプラーシステム１０３５（アクタック社製）を用い、定法に従って測定した。ペプチド量は、６Ｎ塩酸存在下で１１０℃、２４時間加熱した後、アミノ酸分析計Ｌ−８５００（日立製作所社製）によって全アミノ酸分析を行い、塩酸分解前と比較して増加した遊離アミノ酸量から求めた。アミノ化率は、ＴＮに対する全アミノ酸濃度の割合のことである。なお、ＴＮの計算には大豆タンパク質の一般的な窒素係数である６．２５を用いた。遊離アミノ基濃度は、等量のＯＰＡ試薬（アジレントテクノロジーズ社製）と反応させた後、Ｅｘ：３５０ｎｍ、Ｅｍ：４５０ｎｍの蛍光強度を測定し、既知濃度のグリシンで作成した検量線から求めた。Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ量は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム２６９５−ＱｕａｔｔｒｏＭｉｃｒｏ ＡＰＩ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、添加検量線法により求めた。ＬＡＰ活性を低下させた組成物１、２、３（本発明発酵調味料）では、濃口醤油と比較してペプチド量が多く、アミノ化率が低く、ＴＮ１％あたりの遊離アミノ基濃度が低いことが分かる（表２）。一方、製造ロットの異なる麹を用いて組成物３と同様に調製した比較例１では、ペプチド量が少なく、アミノ化率が高く、ＴＮ１％あたりの遊離アミノ酸濃度が高いことが分かる。これらのことから、本発明のペプチド高含有発酵調味料を得るためには、ＬＡＰ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、ＬＡＰ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することが必須要件であり、このことは従来知られていなかったと言える。
【００２６】
【表２】
【００２７】
組成物１（本発明発酵調味料）と、通常の濃口醤油を、Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８ カラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を接続した高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す、日本分光社製）で分析した。流速１ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む溶離液でアセトニトリル濃度０％−３０％のグラジエント溶出を行った。検出は２２０ｎｍの吸光度とした。なお、この分析条件で観察されるピークのほとんどはペプチドに由来することが一般的に知られている。図１・図２から、組成物１（本発明発酵調味料）では、通常の濃口醤油と比較して、多種多様なペプチド見られ、その量も顕著に多いことが分かる。なお、濃口醤油でも見られる１５分、１８分、２３分の大きなピーク（↓で示した）は、ペプチドではなく、それぞれアミノ酸のＴｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐであることを確認した。また、それ以外のアミノ酸はこのカラムにほとんど保持されず、５分以下で溶出することも確認した。
【００２８】
醤油麹の代わりに食品用プロテアーゼ剤であるアルカラーゼ２．４Ｌ−ＦＧ（ノボザイムズ社製）を使用して、同様の方法で発酵調味料を調製した（比較例２）。組成物１（本発明発酵調味料）と、比較例２を使用して、官能評価を行った。パネルは８名とし、「苦味の強さ」と「味の好ましさ」を１対比較法で評価した。表３の結果から、本発明の発酵調味料は、ペプチドを多く含むにもかかわらず、苦味が少なく、好ましい味を有していることが分かる。プロテアーゼ剤によるペプチド製造法はこれまでに多くが開示されているが、本発明は呈味の点で従来技術より優れていると考えられる。
【００２９】
【表３】
【００３０】
＜血圧が高めの方に対する有効性試験＞
本発明の発酵調味料を用いて、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを５４μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを３１μｇ／ｍｌ含有する醤油加工品を調製し、正常高値血圧者（男性３６名、女性３５名、計７１名）および軽症高血圧者（Ｉ度高血圧者）（男性２９名、女性３２名、計６１名）を対象に、通常の減塩しょうゆを対照食品とした二重盲検による１２週間連続摂取試験を実施した。被験者には被験食品または対照食品を１日に１回、１袋（８ｍｌ）を任意の時刻に調理に利用することで１２週間連続摂取させた（家庭における醤油の標準的な１日摂取量８ｍｌあたり、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを４３０μｇ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを２５０μｇ含有）。その結果、本発明の被験食品を摂取することにより経時的に緩やかな降圧効果が認められ（図３）、摂取前値との比較では、摂取４週間後以降に収縮期血圧が有意な低下を示した。また、対照食品群との比較では、収縮期血圧が、摂取８週間後以降に有意に低下した。この結果から、本発明の発酵調味料は、減塩醤油と比較してペプチドによる有意な降圧作用を有することが確認され、Ｇｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上、Ｓｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有するときに、その効果が顕著であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により得られる発酵調味料は、ペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易であることから、有用な生理活性を発揮し、人々の健康に貢献すると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】組成物１のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】濃口醤油のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の発酵調味料を血圧が高めの方が摂取したときの収縮期血圧の変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料。
【請求項２】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性ペプチドを４０ｍｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【請求項３】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が５５％以下である請求項１記載の発酵調味料。
【請求項４】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素１％あたりの遊離アミノ基濃度が０．３５ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１記載の発酵調味料。
【請求項５】
ジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【請求項６】
ジペプチドＳｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【請求項１】
麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後１０日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ−Ｉ活性を１．０Ｕ／ｍｌ以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ−ＩＩ活性を０．５Ｕ／ｍｌ以下に制御することにより得られる発酵調味料。
【請求項２】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性ペプチドを４０ｍｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【請求項３】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が５５％以下である請求項１記載の発酵調味料。
【請求項４】
可溶性総窒素が１．２％以上、かつ、可溶性総窒素１％あたりの遊離アミノ基濃度が０．３５ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１記載の発酵調味料。
【請求項５】
ジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒを４０μｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【請求項６】
ジペプチドＳｅｒ−Ｔｙｒを２０μｇ／ｍｌ以上含有する請求項１記載の発酵調味料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２９１８３（Ｐ２０１０−２９１８３Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５３２３９（Ｐ２００９−１５３２３９）
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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