ユーカリ属植物の組織培養方法及びクローン苗生産方法
【課題】定芽形成工程における定芽の形成率、不定芽増殖工程における不定芽の増殖性、及び、発根工程における発根性のいずれをも向上させることができる、ユーカリ属植物の組織培養方法を提供し、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高める。
【解決手段】ユーカリ属植物の組織培養にあたり、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウム濃度は、定芽形成工程においては５〜２５０ｍＭ、不定芽増殖工程においては５〜９０ｍＭ、発根工程においては５〜４００ｍＭの培地の提供。
【解決手段】ユーカリ属植物の組織培養にあたり、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウム濃度は、定芽形成工程においては５〜２５０ｍＭ、不定芽増殖工程においては５〜９０ｍＭ、発根工程においては５〜４００ｍＭの培地の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織培養により、ユーカリ属植物のクローン苗を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を生産する組織培養技術は、栄養繁殖性の花卉、作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量生産する方法として近年盛んに用いられており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらす一方、木本植物、即ち樹木においても、挿し木等が困難な種を中心として、その適用によるクローン苗の生産・大量増殖が期待されている。これは、パルプ用材等として有用な樹種を含むユーカリ属（Eucalyputus）においても例外ではない。
【０００３】
一般に、木本植物の組織培養によるクローン苗の生産は、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程を経て行われる。即ち、まず、屋外や温室等に生育している個体より採取された枝等を、適当な定芽形成用の培地を用いて培養し、頂芽や腋芽等の定芽を形成させた後、これらの定芽を、不定芽増殖用の培地を用いて培養することで不定芽を誘導し、増殖させる。次いで、増殖した不定芽を、今度は発根用培地に移植して培養することで発根させ、クローン苗を得るのである。
【０００４】
しかしながら、ユーカリ属植物は、上記定芽形成工程における定芽の形成率、不定芽増殖工程における不定芽の増殖性（不定芽の増殖率や成長）、及び／又は発根工程における発根性（不定芽からの発根率や、発根した不定芽一本あたりの根数）等に関し、劣っている樹種が多い。そこで、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めることを目的として、これまでに、例えば、不定芽の増殖性、発根性等を向上させるために、組織培養に用いる培地組成の改変（例えば、特許文献１）、組織培養時の光条件の制御（例えば、特許文献２）、炭酸ガス濃度の制御（例えば、特許文献３）等が検討されてきた。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１３３６５７
【特許文献２】特開２０００−６０３３２
【特許文献３】特開平８−２５２０３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めるための上記検討は、一定の成果を挙げてきている。しかし、大規模な植林等の用途に、これらのクローン苗を適用することを想定した場合に、その生産性は、まだ十分ではない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めることを目的とし、定芽形成工程における定芽の形成率、不定芽増殖工程における不定芽の増殖性、及び、発根工程における発根性のいずれをも向上させることができる、ユーカリ属植物の組織培養方法を提供するべく、研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記研究の結果、本発明者らは、上記目的が、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程を、それぞれ、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行った場合に達成されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法、又は、ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法に関し、あるいは、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を含むことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ユーカリ属植物の組織培養の定芽形成工程において、定芽形成率を向上させることができる。
【００１１】
また、本発明によれば、ユーカリ属植物の組織培養の不定芽増殖工程において、不定芽の増殖率及び成長を向上させることができる。
【００１２】
さらに、本発明によれば、ユーカリ属植物の発根工程において、発根率及び根数を向上させることができる。
【００１３】
従って、本発明によれば、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高め、これらのクローン苗を、大規模な植林等の用途に適用することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係る組織培養方法又はクローン苗生産方法の対象となる植物は、ユーカリ属に属する植物であれば、その種類を問わない。ユーカリ属に属する植物としては、例えば、ユーカリプタス・ビコスタータ（Eucalyptus bicostata）、ユーカリプタス・カマルドレンシス（E.camaldulensis）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（E.citriodora）、ユーカリプタス・グロブルス（E.globulus）、ユーカリプタス・グランディス（E.grandis）、ユーカリプタス・マイデニー（E.maidenii）、ユーカリプタス・ニテンス（E.nitens）、ユーカリプタス・ユーロフィラ（E.urophylla）等を挙げることができる。
【００１６】
本発明に係る組織培養方法の一態様では、このユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。ここで定芽とは、頂芽や腋芽等、植物において普通に形成される芽のことをいう。
【００１７】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させるには、例えば、屋外や温室等に生育しているユーカリ属植物の個体から、頂芽や腋芽の原基を含む枝を採取し、その表面を殺菌した後、無菌条件下、これを定芽形成用培地に挿し付けて培養を行えばよい。約２〜４週間で、その原基から頂芽や腋芽が形成され、伸長してくる。
【００１８】
表面殺菌は、有効塩素濃度０．５〜４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液又は有効塩素濃度５〜１５％の過酸化水素水溶液に、採取した枝を１０〜２０分間浸漬して行うことができる。定芽形成用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシン及び／又はサイトカイニン、更に培地固形剤を含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。
【００１９】
なお、定芽形成用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜２５０ｍＭが好ましく、特に１０〜２００ｍＭが好ましい。ここで、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、２５０ｍＭより多くても、定芽の形成率向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはベンジルアデニン（ＢＡＰ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ、培地固形剤としてはゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％又は寒天０．５〜１．０ｗ／ｖ％が好ましい。植物組織培養用培地としては、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２０】
また、本発明に係る組織培養方法の他の一態様では、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。ここで不定芽とは、通常は芽が形成されない部位に形成される芽のことをいい、枝、茎、葉、根、カルス等から分化してくる芽の他、苗状原基や多芽体から分化してくる芽も、不定芽と総称する。また、多芽体とは、多数の不定芽を分化させた組織であり、適当な条件下で、定芽や不定芽を培養して誘導することができる。
【００２１】
従って、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させるには、例えば、上記定芽形成工程に準じて（定芽形成用培地として、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いる必要はない。）、ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させた後、この定芽を、不定芽増殖用培地に置床して培養を行い、多芽体を誘導して、これを増殖すればよい。多芽体は、不定芽増殖用培地に定芽を置床した後、約２〜４週間で誘導される。誘導された多芽体を増殖するには、これを適当な大きさに分割して、その誘導に用いたのと同じ組成の不定芽増殖用培地に置床して培養するだけでよい。不定芽増殖用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシン及び／又はサイトカイニン、更に培地固形剤を含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。
【００２２】
なお、不定芽増殖用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜９０ｍＭが好ましく、特に１０〜８０ｍＭが好ましい。ここで、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、前記と同様、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、９０ｍＭより多くても、不定芽の増殖性の向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはベンジルアデニン（ＢＡＰ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ又はカイネチン（Ｋｉｎ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ、培地固形剤としてはゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％又は寒天０．５〜１．０ｗ／ｖ％が好ましい。植物組織培養用培地としてはＭＳ培地、又は、このＭＳ培地を２倍程度にまで希釈した培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２３】
また、本発明に係る組織培養方法の更に他の一態様では、ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。
【００２４】
ユーカリ属植物の組織を発根させるには、例えば、上記定芽形成工程にて形成させた定芽、又は、不定芽増殖工程にて誘導・増殖させた不定芽を切取り、これを発根用培地に挿し付けて培養を行えばよい。発根用培地に挿し付けられた定芽又は不定芽は約２〜４週間で発根し、クローン苗を得ることができる。発根用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシンを含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。この場合において、培地固化剤は使用しても良いが、使用せずに、フェノール樹脂やロックウール等を材料とする適当な空隙を有する支持体を、発根用液体培地で湿潤させ、これに定芽又は不定芽を挿し付けて発根させる方が、健全な根を得ることができる。
【００２５】
なお、発根用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜３５０ｍＭが好ましく、特に１０〜３００ｍＭが好ましい。ここでも、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、３５０ｍＭより多くても、発根性の向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはインドール酪酸（ＩＢＡ）０．５〜５ｍｇ／ｌ又はナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．５〜５ｍｇ／ｌが好ましい。炭素源としてショ糖を用いる代わりに、炭酸ガスを培養環境中に供給してもよい。植物組織培養用培地としては、ＭＳ培地又はＢ５培地を２〜８倍に希釈した培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２６】
本発明において、ユーカリ属植物のクローン苗は、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を経て生産される。生産されたクローン苗は、順化の後、育苗容器又は苗畑等に移植して育成することで、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、そのユーカリ属植物に適するように適宜設定すればよい。
【００２７】
［作用］
本発明においては、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用い、ユーカリ属植物の組織を培養するが、公知の植物組織培養用培地の中で、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムをその組成に含んでいるものはない。
【００２８】
そもそも、塩生植物として知られている植物を除き、通常の植物は、耐塩性がかなり強いとされているものであっても、塩素イオン濃度が３００ｍＭ程度の培養液を用いて栽培した場合に、せいぜい約７０％の相対成長量を維持できる程度の耐塩性しか備えていない。また、塩素イオン濃度３００ｍＭ未満の培養液を用いて栽培した場合に、このような「耐塩性が強い」植物の生育が、塩素イオン濃度の存在下、促進されることもない（『植物栄養・肥料学』第１５０〜１５１頁、１９９３年、（株）朝倉書店発行）。ユーカリ属植物も塩生植物ではなく、耐塩性に関しては、通常の植物と変わりはないと考えられている。
【００２９】
ところが、本発明者らは、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地が、ユーカリ属植物の組織培養において、定芽の形成率、不定芽の増殖性、そして発根性の全てを向上させる効果を有することを見出した。かかる効果が、どのようにしてもたらされるのか明らかではないが、ユーカリ属植物に共通する、何らかの生理学的性質（例えば、細胞内浸透圧等）に起因するものと推察される。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００３１】
［実施例１］
定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００もしくは３００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは１００ｍＭ、ショ糖１．５ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００３２】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して表面殺菌した後、滅菌水で洗浄し、無菌条件下、これを上記定芽形成用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記定芽形成用培地と同組成の対照培地（定芽形成用）に挿し付け、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００３３】
培養開始から４週間後、培養に供した枝に形成された腋芽の数を調査し、結果を表１に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１より明らかなように、定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００もしくは２００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは１００ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、５０％を超える腋芽の形成率、即ち定芽形成率を示した。これに対して、対照培地（定芽形成用）を用いた場合の定芽形成率は３６％に過ぎず、上記定芽形成用培地が、定芽の形成率を向上させたことを示していた。
【００３６】
［実施例２］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、８０もしくは１００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは８０ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００３７】
一方、実施例１で形成された腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００３８】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表２に示した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、もしくは８０ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは８０ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００４１】
［実施例３］
発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００、３００もしくは５００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム１００もしくは３００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００４２】
一方、実施例２で誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００４３】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表３に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００もしくは３００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム１００もしくは３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【００４６】
［実施例４］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０又は１００ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００４７】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、実施例１と同様にして、表面殺菌等を行った後、対照培地（定芽形成用）に挿し付けて培養し、腋芽を形成させた。本実施例においては、こうして形成させた腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００４８】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表４に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
表４より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０又は５０ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、本実施例においても不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００５１】
［実施例５］
発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００、３００又は５００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００５２】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、実施例１と同様にして、表面殺菌等を行い、対照培地（定芽形成用）に挿し付けて培養し、腋芽を形成させた。次いで、この腋芽を枝から切取り、これを実施例２と同様にして、対照培地（不定芽増殖用）に置床して培養し、多芽体を誘導・増殖した。本実施例においては、こうして誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００５３】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表５に示した。
【００５４】
【表５】
【００５５】
表５より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００又は３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が、本実施例においても不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【００５６】
［実施例６］
定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、１００又は２００ｍＭ、ショ糖１．５ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００５７】
一方、６年生のユーカリプタス・シトリオドーラの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して表面殺菌した後、滅菌水で洗浄し、無菌条件下、これを上記定芽形成用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記定芽形成用培地と同組成の対照培地（定芽形成用）に挿し付け、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００５８】
培養開始から４週間後、培養に供した枝に形成された腋芽の数を調査し、結果を表６に示した。
【００５９】
【表６】
【００６０】
表６より明らかなように、定芽形成用培地として、塩化ナトリウムを含むものを用いた場合には、いずれも、４０％を超える腋芽の形成率、即ち定芽形成率を示した。これに対して、対照培地（定芽形成用）を用いた場合の定芽形成率は２４％に過ぎず、上記定芽形成用培地が、定芽の形成率を向上させたことを示していた。
【００６１】
［実施例７］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０又は８０ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００６２】
一方、実施例６で形成された腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００６３】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表７に示した。
【００６４】
【表７】
【００６５】
表７より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウムを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００６６】
［実施例８］
発根用培地として、塩化ナトリウム５０、２００、３００又は５００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００６７】
一方、実施例７で誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００６８】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【００７０】
表８より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム５０、２００又は３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織培養により、ユーカリ属植物のクローン苗を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を生産する組織培養技術は、栄養繁殖性の花卉、作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量生産する方法として近年盛んに用いられており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらす一方、木本植物、即ち樹木においても、挿し木等が困難な種を中心として、その適用によるクローン苗の生産・大量増殖が期待されている。これは、パルプ用材等として有用な樹種を含むユーカリ属（Eucalyputus）においても例外ではない。
【０００３】
一般に、木本植物の組織培養によるクローン苗の生産は、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程を経て行われる。即ち、まず、屋外や温室等に生育している個体より採取された枝等を、適当な定芽形成用の培地を用いて培養し、頂芽や腋芽等の定芽を形成させた後、これらの定芽を、不定芽増殖用の培地を用いて培養することで不定芽を誘導し、増殖させる。次いで、増殖した不定芽を、今度は発根用培地に移植して培養することで発根させ、クローン苗を得るのである。
【０００４】
しかしながら、ユーカリ属植物は、上記定芽形成工程における定芽の形成率、不定芽増殖工程における不定芽の増殖性（不定芽の増殖率や成長）、及び／又は発根工程における発根性（不定芽からの発根率や、発根した不定芽一本あたりの根数）等に関し、劣っている樹種が多い。そこで、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めることを目的として、これまでに、例えば、不定芽の増殖性、発根性等を向上させるために、組織培養に用いる培地組成の改変（例えば、特許文献１）、組織培養時の光条件の制御（例えば、特許文献２）、炭酸ガス濃度の制御（例えば、特許文献３）等が検討されてきた。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１３３６５７
【特許文献２】特開２０００−６０３３２
【特許文献３】特開平８−２５２０３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めるための上記検討は、一定の成果を挙げてきている。しかし、大規模な植林等の用途に、これらのクローン苗を適用することを想定した場合に、その生産性は、まだ十分ではない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高めることを目的とし、定芽形成工程における定芽の形成率、不定芽増殖工程における不定芽の増殖性、及び、発根工程における発根性のいずれをも向上させることができる、ユーカリ属植物の組織培養方法を提供するべく、研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記研究の結果、本発明者らは、上記目的が、定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程を、それぞれ、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行った場合に達成されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法、又は、ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法に関し、あるいは、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を含むことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ユーカリ属植物の組織培養の定芽形成工程において、定芽形成率を向上させることができる。
【００１１】
また、本発明によれば、ユーカリ属植物の組織培養の不定芽増殖工程において、不定芽の増殖率及び成長を向上させることができる。
【００１２】
さらに、本発明によれば、ユーカリ属植物の発根工程において、発根率及び根数を向上させることができる。
【００１３】
従って、本発明によれば、ユーカリ属植物のクローン苗の生産性を高め、これらのクローン苗を、大規模な植林等の用途に適用することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係る組織培養方法又はクローン苗生産方法の対象となる植物は、ユーカリ属に属する植物であれば、その種類を問わない。ユーカリ属に属する植物としては、例えば、ユーカリプタス・ビコスタータ（Eucalyptus bicostata）、ユーカリプタス・カマルドレンシス（E.camaldulensis）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（E.citriodora）、ユーカリプタス・グロブルス（E.globulus）、ユーカリプタス・グランディス（E.grandis）、ユーカリプタス・マイデニー（E.maidenii）、ユーカリプタス・ニテンス（E.nitens）、ユーカリプタス・ユーロフィラ（E.urophylla）等を挙げることができる。
【００１６】
本発明に係る組織培養方法の一態様では、このユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。ここで定芽とは、頂芽や腋芽等、植物において普通に形成される芽のことをいう。
【００１７】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させるには、例えば、屋外や温室等に生育しているユーカリ属植物の個体から、頂芽や腋芽の原基を含む枝を採取し、その表面を殺菌した後、無菌条件下、これを定芽形成用培地に挿し付けて培養を行えばよい。約２〜４週間で、その原基から頂芽や腋芽が形成され、伸長してくる。
【００１８】
表面殺菌は、有効塩素濃度０．５〜４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液又は有効塩素濃度５〜１５％の過酸化水素水溶液に、採取した枝を１０〜２０分間浸漬して行うことができる。定芽形成用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシン及び／又はサイトカイニン、更に培地固形剤を含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。
【００１９】
なお、定芽形成用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜２５０ｍＭが好ましく、特に１０〜２００ｍＭが好ましい。ここで、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、２５０ｍＭより多くても、定芽の形成率向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはベンジルアデニン（ＢＡＰ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ、培地固形剤としてはゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％又は寒天０．５〜１．０ｗ／ｖ％が好ましい。植物組織培養用培地としては、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２０】
また、本発明に係る組織培養方法の他の一態様では、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。ここで不定芽とは、通常は芽が形成されない部位に形成される芽のことをいい、枝、茎、葉、根、カルス等から分化してくる芽の他、苗状原基や多芽体から分化してくる芽も、不定芽と総称する。また、多芽体とは、多数の不定芽を分化させた組織であり、適当な条件下で、定芽や不定芽を培養して誘導することができる。
【００２１】
従って、ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させるには、例えば、上記定芽形成工程に準じて（定芽形成用培地として、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いる必要はない。）、ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させた後、この定芽を、不定芽増殖用培地に置床して培養を行い、多芽体を誘導して、これを増殖すればよい。多芽体は、不定芽増殖用培地に定芽を置床した後、約２〜４週間で誘導される。誘導された多芽体を増殖するには、これを適当な大きさに分割して、その誘導に用いたのと同じ組成の不定芽増殖用培地に置床して培養するだけでよい。不定芽増殖用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシン及び／又はサイトカイニン、更に培地固形剤を含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。
【００２２】
なお、不定芽増殖用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜９０ｍＭが好ましく、特に１０〜８０ｍＭが好ましい。ここで、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、前記と同様、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、９０ｍＭより多くても、不定芽の増殖性の向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはベンジルアデニン（ＢＡＰ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ又はカイネチン（Ｋｉｎ）０．０２〜１ｍｇ／ｌ、培地固形剤としてはゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％又は寒天０．５〜１．０ｗ／ｖ％が好ましい。植物組織培養用培地としてはＭＳ培地、又は、このＭＳ培地を２倍程度にまで希釈した培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２３】
また、本発明に係る組織培養方法の更に他の一態様では、ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行う。
【００２４】
ユーカリ属植物の組織を発根させるには、例えば、上記定芽形成工程にて形成させた定芽、又は、不定芽増殖工程にて誘導・増殖させた不定芽を切取り、これを発根用培地に挿し付けて培養を行えばよい。発根用培地に挿し付けられた定芽又は不定芽は約２〜４週間で発根し、クローン苗を得ることができる。発根用培地は、本発明の必須成分である塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む他、炭素源、植物ホルモンとしてオーキシンを含む、公知の植物組織培養用培地を用いることができる。この場合において、培地固化剤は使用しても良いが、使用せずに、フェノール樹脂やロックウール等を材料とする適当な空隙を有する支持体を、発根用液体培地で湿潤させ、これに定芽又は不定芽を挿し付けて発根させる方が、健全な根を得ることができる。
【００２５】
なお、発根用培地中の塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量は、５〜３５０ｍＭが好ましく、特に１０〜３００ｍＭが好ましい。ここでも、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量とは、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムを単独で含む場合には、その塩化ナトリウム又は塩化マグネシウム単独の量のことであり、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムの両者を含む場合には、その両者を合計した量のことである。塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムの量が５ｍＭ未満でも、３５０ｍＭより多くても、発根性の向上に対する効果は見込めない。炭素源としてはショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてはインドール酪酸（ＩＢＡ）０．５〜５ｍｇ／ｌ又はナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．５〜５ｍｇ／ｌが好ましい。炭素源としてショ糖を用いる代わりに、炭酸ガスを培養環境中に供給してもよい。植物組織培養用培地としては、ＭＳ培地又はＢ５培地を２〜８倍に希釈した培地を好適に使用することができる。光条件や温度等の環境条件は、そのユーカリ属植物の生育に好適な条件として、公知の環境条件を採用できる。
【００２６】
本発明において、ユーカリ属植物のクローン苗は、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程及び発根工程のうち、１以上の工程を経て生産される。生産されたクローン苗は、順化の後、育苗容器又は苗畑等に移植して育成することで、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、そのユーカリ属植物に適するように適宜設定すればよい。
【００２７】
［作用］
本発明においては、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用い、ユーカリ属植物の組織を培養するが、公知の植物組織培養用培地の中で、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムをその組成に含んでいるものはない。
【００２８】
そもそも、塩生植物として知られている植物を除き、通常の植物は、耐塩性がかなり強いとされているものであっても、塩素イオン濃度が３００ｍＭ程度の培養液を用いて栽培した場合に、せいぜい約７０％の相対成長量を維持できる程度の耐塩性しか備えていない。また、塩素イオン濃度３００ｍＭ未満の培養液を用いて栽培した場合に、このような「耐塩性が強い」植物の生育が、塩素イオン濃度の存在下、促進されることもない（『植物栄養・肥料学』第１５０〜１５１頁、１９９３年、（株）朝倉書店発行）。ユーカリ属植物も塩生植物ではなく、耐塩性に関しては、通常の植物と変わりはないと考えられている。
【００２９】
ところが、本発明者らは、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地が、ユーカリ属植物の組織培養において、定芽の形成率、不定芽の増殖性、そして発根性の全てを向上させる効果を有することを見出した。かかる効果が、どのようにしてもたらされるのか明らかではないが、ユーカリ属植物に共通する、何らかの生理学的性質（例えば、細胞内浸透圧等）に起因するものと推察される。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００３１】
［実施例１］
定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００もしくは３００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは１００ｍＭ、ショ糖１．５ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００３２】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して表面殺菌した後、滅菌水で洗浄し、無菌条件下、これを上記定芽形成用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記定芽形成用培地と同組成の対照培地（定芽形成用）に挿し付け、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００３３】
培養開始から４週間後、培養に供した枝に形成された腋芽の数を調査し、結果を表１に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１より明らかなように、定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００もしくは２００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは１００ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、５０％を超える腋芽の形成率、即ち定芽形成率を示した。これに対して、対照培地（定芽形成用）を用いた場合の定芽形成率は３６％に過ぎず、上記定芽形成用培地が、定芽の形成率を向上させたことを示していた。
【００３６】
［実施例２］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、８０もしくは１００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは８０ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００３７】
一方、実施例１で形成された腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００３８】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表２に示した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、もしくは８０ｍＭ、又は、塩化マグネシウム５０もしくは８０ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００４１】
［実施例３］
発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００、３００もしくは５００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム１００もしくは３００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００４２】
一方、実施例２で誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム及び／もしくは塩化マグネシウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００４３】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表３に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００もしくは３００ｍＭ、又は、塩化マグネシウム１００もしくは３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【００４６】
［実施例４］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０又は１００ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００４７】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、実施例１と同様にして、表面殺菌等を行った後、対照培地（定芽形成用）に挿し付けて培養し、腋芽を形成させた。本実施例においては、こうして形成させた腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００４８】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表４に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
表４より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０又は５０ｍＭを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、本実施例においても不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００５１】
［実施例５］
発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００、３００又は５００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００５２】
一方、１０年生のユーカリプタス・グロブルスの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、実施例１と同様にして、表面殺菌等を行い、対照培地（定芽形成用）に挿し付けて培養し、腋芽を形成させた。次いで、この腋芽を枝から切取り、これを実施例２と同様にして、対照培地（不定芽増殖用）に置床して培養し、多芽体を誘導・増殖した。本実施例においては、こうして誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００５３】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表５に示した。
【００５４】
【表５】
【００５５】
表５より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム１０、５０、１００、２００又は３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が、本実施例においても不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【００５６】
［実施例６］
定芽形成用培地として、塩化ナトリウム１０、１００又は２００ｍＭ、ショ糖１．５ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００５７】
一方、６年生のユーカリプタス・シトリオドーラの当年生枝から、腋芽の原基を含む枝を採取し、有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して表面殺菌した後、滅菌水で洗浄し、無菌条件下、これを上記定芽形成用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記定芽形成用培地と同組成の対照培地（定芽形成用）に挿し付け、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００５８】
培養開始から４週間後、培養に供した枝に形成された腋芽の数を調査し、結果を表６に示した。
【００５９】
【表６】
【００６０】
表６より明らかなように、定芽形成用培地として、塩化ナトリウムを含むものを用いた場合には、いずれも、４０％を超える腋芽の形成率、即ち定芽形成率を示した。これに対して、対照培地（定芽形成用）を用いた場合の定芽形成率は２４％に過ぎず、上記定芽形成用培地が、定芽の形成率を向上させたことを示していた。
【００６１】
［実施例７］
不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウム１０、５０又は８０ｍＭ、ショ糖２．０ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．０２ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガム０．２５ｗ／ｖ%を含むＭＳ培地を用意した。
【００６２】
一方、実施例６で形成された腋芽を枝から切取り、これを上記不定芽増殖用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記不定芽増殖用培地と同組成の対照培地（不定芽増殖用）に置床し、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行い、多芽体を誘導・増殖した。
【００６３】
培養開始から４週間後、誘導・増殖された多芽体の生重量、及び、この多芽体から分化してきている不定芽の長さを調査し、結果を表７に示した。
【００６４】
【表７】
【００６５】
表７より明らかなように、不定芽増殖用培地として、塩化ナトリウムを含むものを用いた場合には、いずれも、対照培地（不定芽増殖用）を用いた場合と比べて、生重量が重く、しかも、不定芽の伸長もよい多芽体が得られ、上記不定芽増殖用培地が、不定芽の増殖性を向上させたことを示していた。
【００６６】
［実施例８］
発根用培地として、塩化ナトリウム５０、２００、３００又は５００ｍＭ、ＩＢＡ２．０ｍｇ／ｌを含む、４倍希釈ＭＳ培地を用意した。
【００６７】
一方、実施例７で誘導・増殖させた多芽体から不定芽を切取り、これを上記発根用培地、又は、塩化ナトリウム無添加とした他は、上記発根用培地と同組成の対照培地（発根用）で湿潤させた、発泡フェノール樹脂（スミザーオアシス社製『オアシス（登録商標）』）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００±２００ｐｐｍ、２５±１℃、１６時間日長、光強度４０μｍｏｌ／ｃｍ２／ｓで培養を行った。
【００６８】
培養開始から３週間後、発根が認められた不定芽の数、及び、発根が認められた不定芽について、その１本あたりの根数を調査し、結果を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【００７０】
表８より明らかなように、発根用培地として、塩化ナトリウム５０、２００又は３００ｍＭを含むものを用いた場合、発根率に関しては、対照培地（発根用）を用いた場合と同等程度か、若干劣る結果が得られたが、このとき発根した不定芽一本あたりに形成されている根数は、対照培地（発根用）を用いた場合と比べて大きく増加し、上記発根用培地が不定芽の発根性を向上させたことを示していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項２】
ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項３】
ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項４】
請求項１に記載の定芽形成工程、請求項２に記載の不定芽増殖工程及び請求項３に記載の発根工程のうち、１以上の工程を含むことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項５】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程、定芽形成工程で得られた定芽から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程、不定芽増殖工程で得られた不定芽を発根させる発根工程からなる、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法であって、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程、及び、発根工程のうちの１以上の工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項６】
濃度５〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて定芽形成工程を行うことを特徴とする、請求項１、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項７】
濃度５〜９０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて不定芽増殖工程を行うことを特徴とする、請求項２、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項８】
濃度５〜４００ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて発根工程を行うことを特徴とする、請求項３、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項１】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項２】
ユーカリ属植物の組織から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項３】
ユーカリ属植物の組織を発根させる発根工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物の組織培養方法。
【請求項４】
請求項１に記載の定芽形成工程、請求項２に記載の不定芽増殖工程及び請求項３に記載の発根工程のうち、１以上の工程を含むことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項５】
ユーカリ属植物の組織から定芽を形成させる定芽形成工程、定芽形成工程で得られた定芽から不定芽を誘導して増殖させる不定芽増殖工程、不定芽増殖工程で得られた不定芽を発根させる発根工程からなる、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法であって、上記定芽形成工程、不定芽増殖工程、及び、発根工程のうちの１以上の工程を、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて行うことを特徴とする、ユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項６】
濃度５〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて定芽形成工程を行うことを特徴とする、請求項１、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項７】
濃度５〜９０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて不定芽増殖工程を行うことを特徴とする、請求項２、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【請求項８】
濃度５〜４００ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含む培地を用いて発根工程を行うことを特徴とする、請求項３、４又は５に記載のユーカリ属植物のクローン苗生産方法。
【公開番号】特開２００７−５７（Ｐ２００７−５７Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８２６７１（Ｐ２００５−１８２６７１）
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]