【課題】会合制御によるポリペプチド製造方法を提供する。
【解決手段】ポリペプチドの会合が制御されるようにポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基に変異を有するポリペプチドの製造方法であって、（ａ）ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド内の会合が阻害されるように元の核酸から改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチド変異体の製造方法。二重特異性抗体の作製の際に好適に利用することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの会合が制御されるようにポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基に変異を有するポリペプチドの製造方法であって、（ａ）ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド内の会合が阻害されるように元の核酸から改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチド変異体の製造方法。
【請求項２】
異種多量体の会合が制御されるようにポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基に変異を有する異種多量体の製造方法であって、（ａ）ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド間の会合が阻害されるように元の核酸から改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から該異種多量体を回収することを含む異種多量体の製造方法。
【請求項３】
２種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、１種以上の構造異性体を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の改変が、界面を形成する２残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように、元の核酸を改変することである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように、元の核酸を改変することである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖可変領域により形成される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成される請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖定常領域により形成される請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが、２つ以上の重鎖可変領域と２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
異種多量体が、２種以上の重鎖可変領域と２種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体である請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
異種多量体が、二重特異性抗体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の方法により製造されるポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項２５】
ポリペプチド変異体であって、元のポリペプチド内の会合が阻害されるように、該ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有するポリペプチド変異体。
【請求項２６】
異種多量体であって、元のポリペプチド間の会合が阻害されるように、該ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有する異種多量体。
【請求項２７】
元のポリペプチドが２種以上の構造異性体を形成し得る、請求項２５に記載のポリペプチド変異体。
【請求項２８】
元のポリペプチドが２種以上の多量体を形成し得る、請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項２９】
前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面を形成する２残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入することである、請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項３０】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項２９に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３１】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項２９に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３２】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項２９に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３３】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項２９に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３４】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項２９に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３５】
前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入することである請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項３６】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項３５に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３７】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項３５に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３８】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項３５に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項３９】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項３５に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項４０】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項３５に記載のポリペプチド変異体または異種多量体。
【請求項４１】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成される請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項４２】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖可変領域により形成される請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項４３】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成される請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項４４】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖定常領域により形成される請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項４５】
ポリペプチドが、２つ以上の重鎖可変領域と２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドである請求項２５に記載のポリペプチド変異体。
【請求項４６】
異種多量体が、２種以上の重鎖可変領域と２種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体である請求項２６に記載の異種多量体。
【請求項４７】
異種多量体が、二重特異性抗体である請求項４６に記載の異種多量体。
【請求項４８】
請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体、および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項４９】
請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体をコードする核酸。
【請求項５０】
請求項４９に記載の核酸を有する宿主細胞。
【請求項５１】
請求項５０に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む請求項２５に記載のポリペプチド変異体または請求項２６に記載の異種多量体の製造方法。
【請求項５２】
ポリペプチドの会合制御方法であって、ポリペプチド内の会合が阻害されるように、元のポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含むポリペプチドの会合制御方法。
【請求項５３】
異種多量体の会合制御方法であって、ポリペプチド間の会合が阻害されるように、元のポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含む異種多量体の会合制御方法。
【請求項５４】
２種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、１種以上の構造異性体を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基を改変する請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
２種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変する請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面を形成する２残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入することである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５７】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入することである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項６３】
導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸（E）である請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
導入されるアミノ酸残基がアスパラギン酸（D）である請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
導入されるアミノ酸残基がリジン（K）である請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
導入されるアミノ酸残基がアルギニン（R）である請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
導入されるアミノ酸残基がヒスチジン（H）である請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成される請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項６９】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖可変領域により形成される請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項７０】
ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成される請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項７１】
ポリペプチドの界面が、２種以上の重鎖定常領域により形成される請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項７２】
ポリペプチドが、２つ以上の重鎖可変領域と２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドである請求項５２に記載の方法。
【請求項７３】
異種多量体が、２種以上の重鎖可変領域と２種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体である請求項５３に記載の方法。
【請求項７４】
異種多量体が、二重特異性抗体である請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（１）および（２）のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
（１）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：６に記載のアミノ酸配列における39位に相当するアミノ酸残基
（２）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：８に記載のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
【請求項７６】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（１）および（２）のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
（１）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：６に記載のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（２）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：８に記載のアミノ酸配列における50位に相当するアミノ酸残基
【請求項７７】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（１）または（２）のいずれか一方が電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
（１）重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：６に記載のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（２）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号：８に記載のアミノ酸配列における50位に相当するアミノ酸残基
【請求項７８】
前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択される請求項７５または７６に記載の抗体：
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）；
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
【請求項７９】
前記電荷を有するアミノ酸残基が、グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、リジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）である請求項７７に記載の抗体。
【請求項８０】
ポリペプチドが、２つ以上の重鎖可変領域と２つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合した一本鎖ポリペプチドである請求項７５〜７７のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項８１】
ポリペプチドが、２種以上の重鎖可変領域と２種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体である請求項７５〜７７のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項８２】
ポリペプチドが、二重特異性抗体である請求項８１に記載の抗体。
【請求項８３】
請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項８４】
請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８５】
請求項８４に記載の核酸を有する宿主細胞。
【請求項８６】
請求項８５に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項８７】
２種以上の重鎖ＣＨ３領域を含む抗体であって、第１の重鎖ＣＨ３領域における以下の（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択される１組ないし３組のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体。
（１）重鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基であって、ＥＵナンバーリングによる356位および439位のアミノ酸残基
（２）重鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基であって、ＥＵナンバーリングによる357位および370位のアミノ酸残基
（３）重鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基であって、ＥＵナンバーリングによる399位および409位のアミノ酸残基
【請求項８８】
第２の重鎖ＣＨ３領域における前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択されるアミノ酸残基の組であって、前記第１の重鎖ＣＨ３領域において同種の電荷を有する前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組に対応する１組ないし３組のアミノ酸残基が、前記第１の重鎖ＣＨ３領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する請求項８７に記載の抗体。
【請求項８９】
前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択される請求項８７に記載の抗体：
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）；
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
【請求項９０】
前記第１の重鎖ＣＨ３領域と第２の重鎖ＣＨ３領域がジスルフィド結合により架橋している請求項８７に記載の抗体。
【請求項９１】
２種以上の重鎖定常領域を有する抗体である請求項８７に記載の抗体。
【請求項９２】
２種以上の重鎖可変領域と２種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体である請求項８７に記載の抗体。
【請求項９３】
二重特異性抗体である請求項９２に記載の抗体。
【請求項９４】
請求項８７に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項９５】
請求項８７に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９６】
請求項９５に記載の核酸を有する宿主細胞。
【請求項９７】
請求項９６に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む請求項８７に記載の抗体の製造方法。

【図３】

【図４】

【図５】

【図７】

【図８】

【図１１】

【図１３】

【図１４】

【図１８】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図１】

【図２】

【図６】

【図９】

【図１０】

【図１２】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２７】

【公開番号】特開２０１３−９６７５（Ｐ２０１３−９６７５Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７１６１４（Ｐ２０１２−１７１６１４）
【出願日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【分割の表示】特願２００７−５１１１５５（Ｐ２００７−５１１１５５）の分割
【原出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】