免疫調節剤
【課題】ガングリオシドＧＤ３の免疫機能に関する新規の作用機序及びそれを利用した医薬用途を見出し、種々の免疫疾患の予防剤または治療剤として有効な医薬並びにそれを配合した飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【解決手段】ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤。ガングリオシドＧＤ３は乳由来であることが好ましい。前記免疫機能調節剤を飲食品または飼料に配合する。
【解決手段】ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤。ガングリオシドＧＤ３は乳由来であることが好ましい。前記免疫機能調節剤を飲食品または飼料に配合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤、並びにそれを配合した飲食品及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、シアル酸を含有する糖脂質の総称で、生体では脳や赤血球中に多く含まれていることが知られている。また、種々の食品中にも含まれており、特に牛乳の中に多く含まれていることが知られている。また、ガングリオシドについては、種々のウイルスや毒性細菌に対する阻害活性、脳虚血障害やパーキンソン病による脳障害に対する治療効果、単球やマクロファージ系細胞の分化促進作用、上皮成長因子レセプターの機能調節作用等、様々な生理作用が報告されている。乳中には主にＧＤ３とＧＭ３の２種類のガングリオシドが含まれており、これら乳由来のガングリオシドを経口投与した場合においても、学習能の向上や、口腔内細菌叢改善作用、大腸菌の感染予防作用などが報告されている（特許文献１〜３）。また、ガングリオシド、特にＧＭ３については、乳児の腸間粘膜細胞を成熟化させることが開示されており（特許文献４）、成熟化により、アレルゲン物質が粘膜上皮細胞の間隙から通過するのを防止したり、粘膜上でアレルゲンと結合して、その侵入を防止するＩｇＡの産生を増加させることができることが開示されている。
【特許文献１】特開平１１−２４６４１８号公報
【特許文献２】特開２００５−３２０２７５号公報
【特許文献３】特開２００１−２７０４号公報
【特許文献４】特開平８−１０９１３３号公報
【０００３】
サイトカインは、主として免疫系の細胞から産生されるタンパク質性因子であり、免疫系細胞だけでなく多くの細胞に対して多彩な生理作用を及ぼすことが知られている。サイトカインの中でも、ＴＮＦ−αは、生体防御、炎症反応などにおいて中心的な役割を果たす炎症性サイトカインの代表である。ＴＮＦ−αの産生能に影響する因子は、生体防御能や炎症反応を調節する作用を有することが期待されている。また、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ-γ）は、細胞性免疫を制御するサイトカインの代表であり、Ｔｈ０タイプのＴ細胞のＴｈ１型への分化を促進することが知られている。また、ＩＬ−４は、体液性免疫を制御するサイトカインの代表であり、Ｔｈ２細胞の増殖を促進すると考えられている。したがって、免疫系の組織において、ＩＦＮ-γとＩＬ−４の産生能の変化を解析することによって、存在するＴ細胞がＴｈ１型優位、すなわち細胞性免疫が優位な状況にあるか、Ｔｈ２型優位、すなわち体液型免疫が優位な状況にあるかを推測することが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ガングリオシドＧＤ３の免疫機能に関する新規の作用機序及びそれを利用した医薬用途を見出し、種々の免疫疾患の予防剤として有効な医薬並びにそれを配合した飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、課題を解決するために、ガングリオシドＧＤ３のサイトカインに対する機能を種々検討したところ、ガングリオシドＧＤ３がＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を抑制し、またＩＬ−４の産生を促進することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤である。本発明はまた、ガングリオシドＧＤ３が乳由来であることを特徴とする前記免疫機能調節剤である。本発明はまた、前記免疫機能調節剤を配合する飲食品及び飼料である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫機能調節剤を用いることにより、ガングリオシドＧＤ３を用いてＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を抑制し、ＩＬ−４の産生を促進することにより、免疫機能を調節することができる。本発明の免疫機能調節剤は、食品アレルギーやアトピー性皮膚炎等の免疫機能に関与する疾患の予防に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において有効成分として使用されるガングリオシドＧＤ３は、いかなる方法により得られるものであってもよい。すなわち、従来法により畜獣の脳等から分離精製されたものを用いてもよく、また、牛乳から効率よく回収する方法（特開昭６３−２６９９９２号公報）を利用して得られたものを用いてもよい。同公報に記載の方法によれば、工業規模で大量に生産することも可能である。なお、同公報に記載の乳からガングリオシドを分離抽出する方法を、参考までに示すと下記の通りである。すなわち、牛乳、バターミルク、ホエー、脱脂乳等の乳原料に、塩酸や乳酸等の酸、またはトリプシン、ペプシン等のタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解し、得られたタンパク質分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法または透析法により処理し、ガングリオシドを濃縮して調製する。このようにして調製されたガングリオシドは、ＧＭ３とＧＤ３から構成されるが、本発明においては、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする。
【０００９】
本発明の免疫機能調節剤は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とするものであるが、種々の剤型を有する製剤として用いることができ、剤型は特に限定されない。したがって、有効成分であるガングリオシドＧＤ３を、種々の賦形剤や担体等とともに用いて、錠剤、カプセル剤、粉剤、液剤等種々の剤型の製剤に配合することができる。また、本発明の免疫機能調節剤は、免疫機能を調節する作用を有するほかの医薬を含むものであってもよい。また、本発明の飲食品の種類も特に限定されず、牛乳、加工乳、乳飲料、ヨーグルト、清涼飲料水、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食、さらには、栄養補給用組成物に配合することができる。また、本発明の飼料の種類も特に限定されるものではない。なお、本発明の免疫機能調節剤、飲食品及び飼料は、ガングリオシドＧＤ３を含有すること以外は、常法により製造することができる。
【００１０】
本発明において、免疫機能調節効果を発揮させるためには、ガングリオシドＧＤ３を１日当たり一般的に０．１〜５ｍｇ程度摂取できるように医薬、飲食品や飼料への配合量等を調整すればよい。なお、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする場合は、投与対象は限定されないが、消化管が十分に成熟した人に用いるとより効果的である。
【００１１】
以下、本発明を実施例および試験例によりさらに詳しく説明する。実施例及び試験例において、「％」は特に断らない限り、「重量％」を意味するものとする。
【実施例１】
【００１２】
（ガングリオシドＧＤ３の調製）
チーズを製造する際に排出されるホエー １．５ｋＬに対し、１％の蛋白質分解酵素を添加して、ｐＨ８．０、５５℃で２時間の酵素反応を行うことによりホエー中の蛋白質を加水分解した。この反応液を限外濾過膜（Cefilt 10kDaNG：フィルテック社製）で処理することにより蛋白質加水分解物及び乳糖を除去し、エバポレーターで３０％濃度となるまで濃縮した後、凍結乾燥して、ガングリオシド含有粉末１．５ｋｇを得た。なお、このガングリオシド含有粉末中のガングリオシド量は、約１％であった。次に、アニオン交換樹脂 Dowex-1 (酢酸型：ダウケミカル社製)をカラム（直径１０ｃｍ×高さ１００ｃｍ）に充填し、クロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液で平衡化した後、上記のガングリオシド含有粉末をクロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液 ３０Ｌに懸濁した懸濁液を通液して、ガングリオシド等の酸性物質をカラムに吸着させた後、クロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液２０Ｌでカラムを洗浄し、２Ｍ酢酸ナトリウムを含むクロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液２０Ｌで溶出してガングリオシドを含有する溶出液を回収した。このガングリオシドを含有する溶出液を減圧乾固して溶媒を除去した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、４０℃で２時間の反応を行うことによりリン脂質を分解した。その後、この反応液を限外濾過膜（Cefilt 10kDaNG：フィルテック社製） で処理して脱塩濃縮し、凍結乾燥した後、クロロホルム：メタノール (８５：１５) からなる溶液２００ｍＬで溶解し、シリカゲルカラム (直径５ｃｍ×高さ４０ｃｍ)に通液してガングリオシドをシリカゲルに吸着させた。そして、ガングリオシドをクロロホルム：メタノール溶液で勾配溶出し、濃縮及び凍結乾燥して、ガングリオシドＧＤ３粉末１５．２ｇを得た。なお、このガングリオシドＧＤ３の純度は、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、９７％以上であった。
【００１３】
以下、試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。試験例においては、すべてＢａｌｂ／Ｃ雄マウスを用いた。また、ガングリオシドＧＤ３は実施例１で得られたものを１０μｇ／ｍｌの濃度で１０％の牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、３０分間超音波処理することによりミセル形成させたものを使用した。
[試験例１]
（ガングリオシドＧＤ３の脾臓マクロファージのＴＮＦ−α産生能への影響）
１０週齢のＢａｌｂ／Ｃ雄マウスを屠殺し脾臓を採取した。脾臓を培養皿内で細切し、注射筒で細かく押しつぶし、メッシュを通すことにより、脾細胞を分離した。分離した脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に１０％となるよう牛胎児血清を添加した培地（１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０）で２時間培養した後、同培地で２回洗うことにより、接着したマクロファージを単離した。単離した脾臓マクロファージに実施例１のガングリオシドＧＤ３を１０μｇ／ｍｌとなるように添加した１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地、または何も添加していないＲＰＭＩ１６４０培地（対照）を加え、２時間培養した。その後ＬＰＳを１μｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに３時間培養した。培養終了後、培地を採取するとともに、細胞を０．１％ＳＤＳ溶液で可溶化した。採取した培地中のＴＮＦ−α濃度は、Ｌ９２９マウス線維芽細胞を用いたバイオアッセイ法により測定した。可溶化した細胞内のＤＮＡ量をＤＡＰＩによる蛍光光度法で測定し、ＤＮＡ量当たりのＴＮＦ−α分泌を求めた。結果を図１に示す。
【００１４】
この結果、ガングリオシドＧＤ３添加群では、対照（無添加）群に比べて、ＴＮＦ−α産生能が著明に低下していた。ガングリオシドＧＤ３を培地に直接添加することによりＴＮＦ−α産生能が抑制されたことは、ガングリオシドＧＤ３が抗炎症的に作用することを示唆するものである。
【００１５】
[試験例２]
（ガングリオシドＧＤ３の脾細胞によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生能への影響）
細胞の分離は試験例１と同様に行った。すなわち採取した脾臓は、試験例１と同様に細切後、強く押しつぶしてバラバラにした後、メッシュを通すことで細胞を分離した。細胞は、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地もしくは実施例１のガングリオシドＧＤ３を１０μｇ／ｍｌとなるように添加した１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に播種した。培養開始２日目にマイトジェンであるConcanavallinＡを５μｇ／ｍｌの濃度となるように添加し、さらに３日間培養した。培養終了後、培地を回収するとともに、細胞を溶解した。培地中のＩＬ−４、ＩＦＮ−γ濃度は、それぞれサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。細胞中のＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ量当たりのサイトカイン分泌量を求めた。結果を図２、３に示す。
【００１６】
図２、３に示されるように、脾細胞において、ＩＬ−４産生能が増加する傾向を示し、ＩＦＮ−γ産生能が著しく低下した。これらの結果は、ガングリオシドＧＤ３の添加により、脾臓内においてＴｈ１抑制が誘導されていることを示唆している。体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをみると、食品アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の初期段階においてはＴｈ１優位な状態になるといわれている。従ってＴｈ１を抑制することでアレルギー疾患の進行を抑えることができる、すなわちアレルギー疾患の予防に有効であると考えられる。本試験例において、ガングリオシドＧＤ３が、Ｔｈ１型抑制作用を示したことは、ガングリオシドＧＤ３を日常的に摂取することによって生体の免疫系においてＴｈ１型、すなわち細胞性免疫が抑制方向に誘導されることを示唆しており、ガングリオシドＧＤ３がアレルギー発症の初期段階を抑制することによりアレルギー予防作用を有する食品素材として利用できる可能性を示している。
【実施例２】
【００１７】
（ガングリオシドＧＤ３含有粉末の調製）
バターミルク粉２０ｋｇを水１８０Ｌに溶解した溶液に、０．５ｋｇの枯草菌プロテアーゼを添加し、ｐＨ７．６、温度４０℃で１５時間反応させ、タンパク質を分解した後、９０℃で１０分間加熱殺菌し、酵素を失活させた。次いで、この溶液を膜面積０．３６平方ｍの濾過膜を装着した限外濾過膜装置（ＬＡＢ-２０型モジュール：ＤＤＳ社製）を用いて、温度４０℃、流量１５Ｌ／分、平方圧力０．６ＭＰaで濾過し、ガングリオシドを濃縮した。この溶液を凍結乾燥してガングリオシドＧＤ３を約７．５ｇ含有するガングリオシドＧＤ３含有粉末１ｋｇを得た。このようにして得られたガングリオシドＧＤ３含有粉末は、そのまま本発明の免疫調節剤として利用可能である。
【実施例３】
【００１８】
（ガングリオシドＧＤ３を用いた粉乳の調製）
実施例２で調製したガングリオシドＧＤ３含有粉末２００ｇを、カゼイン６．８ｋｇ、ホエー粉７０．０ｋｇ、ビタミン及びミネラル成分１ｋｇと共に、水７００ｋｇに溶解した。さらに、植物油脂２３．０ｋｇを混合して、均質化した後、殺菌・濃縮・乾燥工程を経て、本発明の免疫機能調節剤を配合した粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳１００ｇ中のガングリオシドＧＤ３含量は約１．０ｍｇであった。
【実施例４】
【００１９】
（ガングリオシドＧＤ３を含有するドリンク剤の調製）
実施例２で調製したガングリオシドＧＤ３含有粉末を用い、表１の配合により本発明の免疫機能調節剤であるドリンク剤を調製した。表１の成分を、水に溶解して５Ｌとした。この溶液を、圧力１６０ｋｇ／ｃｍ２で均質化した後、プレート式殺菌機により、１２０℃で３秒間保持して殺菌し、次いで５℃に冷却した。得られたドリンク剤を２００ｍｌ入り紙容器に充填した。このドリンク剤は、１００ｍｌ当り約２．４ｍｇのＧＤ３を含有していた。
【００２０】
【表１】
【実施例５】
【００２１】
（ガングリオシドＧＤ３含有粉末を用いた錠剤の調製）
実施例１で調製したガングリオシド粉末を、常法により、ゼラチンよりなるソフトカプセル中に一錠当り１００ｍｇとなるように充填して、本発明の免疫機能調節剤（錠剤）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤またはそれを配合した飲食品もしくは飼料は、免疫機能に関与する種々の疾患の予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験例１の結果を示すグラフである。
【図２】試験例２の結果を示すグラフである。
【図３】試験例２の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤、並びにそれを配合した飲食品及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、シアル酸を含有する糖脂質の総称で、生体では脳や赤血球中に多く含まれていることが知られている。また、種々の食品中にも含まれており、特に牛乳の中に多く含まれていることが知られている。また、ガングリオシドについては、種々のウイルスや毒性細菌に対する阻害活性、脳虚血障害やパーキンソン病による脳障害に対する治療効果、単球やマクロファージ系細胞の分化促進作用、上皮成長因子レセプターの機能調節作用等、様々な生理作用が報告されている。乳中には主にＧＤ３とＧＭ３の２種類のガングリオシドが含まれており、これら乳由来のガングリオシドを経口投与した場合においても、学習能の向上や、口腔内細菌叢改善作用、大腸菌の感染予防作用などが報告されている（特許文献１〜３）。また、ガングリオシド、特にＧＭ３については、乳児の腸間粘膜細胞を成熟化させることが開示されており（特許文献４）、成熟化により、アレルゲン物質が粘膜上皮細胞の間隙から通過するのを防止したり、粘膜上でアレルゲンと結合して、その侵入を防止するＩｇＡの産生を増加させることができることが開示されている。
【特許文献１】特開平１１−２４６４１８号公報
【特許文献２】特開２００５−３２０２７５号公報
【特許文献３】特開２００１−２７０４号公報
【特許文献４】特開平８−１０９１３３号公報
【０００３】
サイトカインは、主として免疫系の細胞から産生されるタンパク質性因子であり、免疫系細胞だけでなく多くの細胞に対して多彩な生理作用を及ぼすことが知られている。サイトカインの中でも、ＴＮＦ−αは、生体防御、炎症反応などにおいて中心的な役割を果たす炎症性サイトカインの代表である。ＴＮＦ−αの産生能に影響する因子は、生体防御能や炎症反応を調節する作用を有することが期待されている。また、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ-γ）は、細胞性免疫を制御するサイトカインの代表であり、Ｔｈ０タイプのＴ細胞のＴｈ１型への分化を促進することが知られている。また、ＩＬ−４は、体液性免疫を制御するサイトカインの代表であり、Ｔｈ２細胞の増殖を促進すると考えられている。したがって、免疫系の組織において、ＩＦＮ-γとＩＬ−４の産生能の変化を解析することによって、存在するＴ細胞がＴｈ１型優位、すなわち細胞性免疫が優位な状況にあるか、Ｔｈ２型優位、すなわち体液型免疫が優位な状況にあるかを推測することが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ガングリオシドＧＤ３の免疫機能に関する新規の作用機序及びそれを利用した医薬用途を見出し、種々の免疫疾患の予防剤として有効な医薬並びにそれを配合した飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、課題を解決するために、ガングリオシドＧＤ３のサイトカインに対する機能を種々検討したところ、ガングリオシドＧＤ３がＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を抑制し、またＩＬ−４の産生を促進することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤である。本発明はまた、ガングリオシドＧＤ３が乳由来であることを特徴とする前記免疫機能調節剤である。本発明はまた、前記免疫機能調節剤を配合する飲食品及び飼料である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫機能調節剤を用いることにより、ガングリオシドＧＤ３を用いてＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を抑制し、ＩＬ−４の産生を促進することにより、免疫機能を調節することができる。本発明の免疫機能調節剤は、食品アレルギーやアトピー性皮膚炎等の免疫機能に関与する疾患の予防に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において有効成分として使用されるガングリオシドＧＤ３は、いかなる方法により得られるものであってもよい。すなわち、従来法により畜獣の脳等から分離精製されたものを用いてもよく、また、牛乳から効率よく回収する方法（特開昭６３−２６９９９２号公報）を利用して得られたものを用いてもよい。同公報に記載の方法によれば、工業規模で大量に生産することも可能である。なお、同公報に記載の乳からガングリオシドを分離抽出する方法を、参考までに示すと下記の通りである。すなわち、牛乳、バターミルク、ホエー、脱脂乳等の乳原料に、塩酸や乳酸等の酸、またはトリプシン、ペプシン等のタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解し、得られたタンパク質分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法または透析法により処理し、ガングリオシドを濃縮して調製する。このようにして調製されたガングリオシドは、ＧＭ３とＧＤ３から構成されるが、本発明においては、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする。
【０００９】
本発明の免疫機能調節剤は、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とするものであるが、種々の剤型を有する製剤として用いることができ、剤型は特に限定されない。したがって、有効成分であるガングリオシドＧＤ３を、種々の賦形剤や担体等とともに用いて、錠剤、カプセル剤、粉剤、液剤等種々の剤型の製剤に配合することができる。また、本発明の免疫機能調節剤は、免疫機能を調節する作用を有するほかの医薬を含むものであってもよい。また、本発明の飲食品の種類も特に限定されず、牛乳、加工乳、乳飲料、ヨーグルト、清涼飲料水、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食、さらには、栄養補給用組成物に配合することができる。また、本発明の飼料の種類も特に限定されるものではない。なお、本発明の免疫機能調節剤、飲食品及び飼料は、ガングリオシドＧＤ３を含有すること以外は、常法により製造することができる。
【００１０】
本発明において、免疫機能調節効果を発揮させるためには、ガングリオシドＧＤ３を１日当たり一般的に０．１〜５ｍｇ程度摂取できるように医薬、飲食品や飼料への配合量等を調整すればよい。なお、ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする場合は、投与対象は限定されないが、消化管が十分に成熟した人に用いるとより効果的である。
【００１１】
以下、本発明を実施例および試験例によりさらに詳しく説明する。実施例及び試験例において、「％」は特に断らない限り、「重量％」を意味するものとする。
【実施例１】
【００１２】
（ガングリオシドＧＤ３の調製）
チーズを製造する際に排出されるホエー １．５ｋＬに対し、１％の蛋白質分解酵素を添加して、ｐＨ８．０、５５℃で２時間の酵素反応を行うことによりホエー中の蛋白質を加水分解した。この反応液を限外濾過膜（Cefilt 10kDaNG：フィルテック社製）で処理することにより蛋白質加水分解物及び乳糖を除去し、エバポレーターで３０％濃度となるまで濃縮した後、凍結乾燥して、ガングリオシド含有粉末１．５ｋｇを得た。なお、このガングリオシド含有粉末中のガングリオシド量は、約１％であった。次に、アニオン交換樹脂 Dowex-1 (酢酸型：ダウケミカル社製)をカラム（直径１０ｃｍ×高さ１００ｃｍ）に充填し、クロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液で平衡化した後、上記のガングリオシド含有粉末をクロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液 ３０Ｌに懸濁した懸濁液を通液して、ガングリオシド等の酸性物質をカラムに吸着させた後、クロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液２０Ｌでカラムを洗浄し、２Ｍ酢酸ナトリウムを含むクロロホルム：メタノール：水（６０：３０：８）からなる溶液２０Ｌで溶出してガングリオシドを含有する溶出液を回収した。このガングリオシドを含有する溶出液を減圧乾固して溶媒を除去した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、４０℃で２時間の反応を行うことによりリン脂質を分解した。その後、この反応液を限外濾過膜（Cefilt 10kDaNG：フィルテック社製） で処理して脱塩濃縮し、凍結乾燥した後、クロロホルム：メタノール (８５：１５) からなる溶液２００ｍＬで溶解し、シリカゲルカラム (直径５ｃｍ×高さ４０ｃｍ)に通液してガングリオシドをシリカゲルに吸着させた。そして、ガングリオシドをクロロホルム：メタノール溶液で勾配溶出し、濃縮及び凍結乾燥して、ガングリオシドＧＤ３粉末１５．２ｇを得た。なお、このガングリオシドＧＤ３の純度は、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、９７％以上であった。
【００１３】
以下、試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。試験例においては、すべてＢａｌｂ／Ｃ雄マウスを用いた。また、ガングリオシドＧＤ３は実施例１で得られたものを１０μｇ／ｍｌの濃度で１０％の牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、３０分間超音波処理することによりミセル形成させたものを使用した。
[試験例１]
（ガングリオシドＧＤ３の脾臓マクロファージのＴＮＦ−α産生能への影響）
１０週齢のＢａｌｂ／Ｃ雄マウスを屠殺し脾臓を採取した。脾臓を培養皿内で細切し、注射筒で細かく押しつぶし、メッシュを通すことにより、脾細胞を分離した。分離した脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に１０％となるよう牛胎児血清を添加した培地（１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０）で２時間培養した後、同培地で２回洗うことにより、接着したマクロファージを単離した。単離した脾臓マクロファージに実施例１のガングリオシドＧＤ３を１０μｇ／ｍｌとなるように添加した１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地、または何も添加していないＲＰＭＩ１６４０培地（対照）を加え、２時間培養した。その後ＬＰＳを１μｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに３時間培養した。培養終了後、培地を採取するとともに、細胞を０．１％ＳＤＳ溶液で可溶化した。採取した培地中のＴＮＦ−α濃度は、Ｌ９２９マウス線維芽細胞を用いたバイオアッセイ法により測定した。可溶化した細胞内のＤＮＡ量をＤＡＰＩによる蛍光光度法で測定し、ＤＮＡ量当たりのＴＮＦ−α分泌を求めた。結果を図１に示す。
【００１４】
この結果、ガングリオシドＧＤ３添加群では、対照（無添加）群に比べて、ＴＮＦ−α産生能が著明に低下していた。ガングリオシドＧＤ３を培地に直接添加することによりＴＮＦ−α産生能が抑制されたことは、ガングリオシドＧＤ３が抗炎症的に作用することを示唆するものである。
【００１５】
[試験例２]
（ガングリオシドＧＤ３の脾細胞によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生能への影響）
細胞の分離は試験例１と同様に行った。すなわち採取した脾臓は、試験例１と同様に細切後、強く押しつぶしてバラバラにした後、メッシュを通すことで細胞を分離した。細胞は、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地もしくは実施例１のガングリオシドＧＤ３を１０μｇ／ｍｌとなるように添加した１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に播種した。培養開始２日目にマイトジェンであるConcanavallinＡを５μｇ／ｍｌの濃度となるように添加し、さらに３日間培養した。培養終了後、培地を回収するとともに、細胞を溶解した。培地中のＩＬ−４、ＩＦＮ−γ濃度は、それぞれサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。細胞中のＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ量当たりのサイトカイン分泌量を求めた。結果を図２、３に示す。
【００１６】
図２、３に示されるように、脾細胞において、ＩＬ−４産生能が増加する傾向を示し、ＩＦＮ−γ産生能が著しく低下した。これらの結果は、ガングリオシドＧＤ３の添加により、脾臓内においてＴｈ１抑制が誘導されていることを示唆している。体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをみると、食品アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の初期段階においてはＴｈ１優位な状態になるといわれている。従ってＴｈ１を抑制することでアレルギー疾患の進行を抑えることができる、すなわちアレルギー疾患の予防に有効であると考えられる。本試験例において、ガングリオシドＧＤ３が、Ｔｈ１型抑制作用を示したことは、ガングリオシドＧＤ３を日常的に摂取することによって生体の免疫系においてＴｈ１型、すなわち細胞性免疫が抑制方向に誘導されることを示唆しており、ガングリオシドＧＤ３がアレルギー発症の初期段階を抑制することによりアレルギー予防作用を有する食品素材として利用できる可能性を示している。
【実施例２】
【００１７】
（ガングリオシドＧＤ３含有粉末の調製）
バターミルク粉２０ｋｇを水１８０Ｌに溶解した溶液に、０．５ｋｇの枯草菌プロテアーゼを添加し、ｐＨ７．６、温度４０℃で１５時間反応させ、タンパク質を分解した後、９０℃で１０分間加熱殺菌し、酵素を失活させた。次いで、この溶液を膜面積０．３６平方ｍの濾過膜を装着した限外濾過膜装置（ＬＡＢ-２０型モジュール：ＤＤＳ社製）を用いて、温度４０℃、流量１５Ｌ／分、平方圧力０．６ＭＰaで濾過し、ガングリオシドを濃縮した。この溶液を凍結乾燥してガングリオシドＧＤ３を約７．５ｇ含有するガングリオシドＧＤ３含有粉末１ｋｇを得た。このようにして得られたガングリオシドＧＤ３含有粉末は、そのまま本発明の免疫調節剤として利用可能である。
【実施例３】
【００１８】
（ガングリオシドＧＤ３を用いた粉乳の調製）
実施例２で調製したガングリオシドＧＤ３含有粉末２００ｇを、カゼイン６．８ｋｇ、ホエー粉７０．０ｋｇ、ビタミン及びミネラル成分１ｋｇと共に、水７００ｋｇに溶解した。さらに、植物油脂２３．０ｋｇを混合して、均質化した後、殺菌・濃縮・乾燥工程を経て、本発明の免疫機能調節剤を配合した粉乳１００ｋｇを得た。得られた粉乳１００ｇ中のガングリオシドＧＤ３含量は約１．０ｍｇであった。
【実施例４】
【００１９】
（ガングリオシドＧＤ３を含有するドリンク剤の調製）
実施例２で調製したガングリオシドＧＤ３含有粉末を用い、表１の配合により本発明の免疫機能調節剤であるドリンク剤を調製した。表１の成分を、水に溶解して５Ｌとした。この溶液を、圧力１６０ｋｇ／ｃｍ２で均質化した後、プレート式殺菌機により、１２０℃で３秒間保持して殺菌し、次いで５℃に冷却した。得られたドリンク剤を２００ｍｌ入り紙容器に充填した。このドリンク剤は、１００ｍｌ当り約２．４ｍｇのＧＤ３を含有していた。
【００２０】
【表１】
【実施例５】
【００２１】
（ガングリオシドＧＤ３含有粉末を用いた錠剤の調製）
実施例１で調製したガングリオシド粉末を、常法により、ゼラチンよりなるソフトカプセル中に一錠当り１００ｍｇとなるように充填して、本発明の免疫機能調節剤（錠剤）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤またはそれを配合した飲食品もしくは飼料は、免疫機能に関与する種々の疾患の予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験例１の結果を示すグラフである。
【図２】試験例２の結果を示すグラフである。
【図３】試験例２の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤。
【請求項２】
ガングリオシドＧＤ３が乳由来であることを特徴とする請求項１の免疫機能調節剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の免疫機能調節剤を配合した飲食品。
【請求項４】
請求項１または２記載の免疫機能調節剤を配合した飼料。
【請求項１】
ガングリオシドＧＤ３を有効成分とする免疫機能調節剤。
【請求項２】
ガングリオシドＧＤ３が乳由来であることを特徴とする請求項１の免疫機能調節剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の免疫機能調節剤を配合した飲食品。
【請求項４】
請求項１または２記載の免疫機能調節剤を配合した飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２１４２４１（Ｐ２００８−２１４２４１Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５１９（Ｐ２００７−５２５１９）
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（０００００６６９９）雪印乳業株式会社 (155)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（０００００６６９９）雪印乳業株式会社 (155)
【Ｆターム（参考）】
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