塩基配列検出方法
【目的】本発明は、操作性、定量性、感度等に優れる塩基配列の検出方法の提供を目的としている。
【構成】ＤＭＳＯのような反応促進剤の存在下、標的配列と２本鎖を形成したプローブＤＮＡをエクソヌクレアーゼＩＩＩの作用により３’側から分解させ、生成する分解産物を検出することによる塩基配列検出方法。
【効果】本発明は、標的配列の増幅、ならびに検出において次のような利点を持つ。
１．温度制御が不要である２．反応が直線的で定量性や感度に優れる３．増幅時のコンタミネーションの影響を受けにくい４．プローブＤＮＡの合成が容易
【構成】ＤＭＳＯのような反応促進剤の存在下、標的配列と２本鎖を形成したプローブＤＮＡをエクソヌクレアーゼＩＩＩの作用により３’側から分解させ、生成する分解産物を検出することによる塩基配列検出方法。
【効果】本発明は、標的配列の増幅、ならびに検出において次のような利点を持つ。
１．温度制御が不要である２．反応が直線的で定量性や感度に優れる３．増幅時のコンタミネーションの影響を受けにくい４．プローブＤＮＡの合成が容易
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、試料中に存在する特定の塩基配列（以下標的配列という）の検出方法に関するものである。プローブＤＮＡを用いた遺伝子診断法は、遺伝的疾患や感染症の診断に有効である。検体中に目的の遺伝子が存在するか否かを見るために、検体より抽出した核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）と標識したプローブＤＮＡとを混合し、特異的にハイブリダイズした標識体の量を測定することにより目的の遺伝子を検出する事が行われている。
【０００２】
【従来技術の問題点】核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することができるため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には有力な手段である。また遺伝子を検出対象とするために、培養のような時間のかかる操作を省略できる場合も有る。しかし、検体中に目的の遺伝子量が少ない場合の検出は容易ではなく、標的遺伝子そのものあるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する方法のひとつにＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が知られている。ＰＣＲ法はin vitroにおける核酸の増幅技術としてもっとも一般的な方法であるが、次のような問題点が指摘されている。すなわち、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと、増幅反応が対数的に進むことから定量性に問題があること、増幅した産物によるコンタミネーションが起こり易いこと等の問題点が知られている。コンタミネーションとは以前の反応で生じた増幅産物がつぎの反応液に誤って混入する事をいい、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍にまで増幅させる反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増幅されるため誤った結果を与える。これは特に多数の検体を同時に扱う場合には重大な問題となる。
【０００３】他方、検出シグナルを増幅する方法としてはＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法（Bio/Technology,6,1197-1202(1988)P.M.Lizardietal.）が報告されている。しかしこの方法は増幅させる配列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必要があり、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列が制限される等の問題がある。これらの方法は検出対象となる塩基配列を増幅するものであるが、以下に述べるような分解産物を検出するシグナル増幅法も考案されている。たとえば、標的核酸にオリゴプローブＤＮＡをハイブリダイズさせた後制限酵素処理し、切断されたプローブ断片を検出するシグナル増幅法が知られている（ＥＰ−０４５５５１７／Ａ１）。この方法は検出感度も比較的良く、定量性があり、特別な装置を必要としない等の利点がある。しかし、この方法を遂行するにはプローブＤＮＡ以外に反応が繰り返し起こるようにするための特異的な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを共存させる必要がある。また検出する部位に制限酵素切断部位が必要であるために検出部位が制限される等の欠点も持つ。
【０００４】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断するλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法も開発されている（BioTechniques Vol.13,No.6(1992)）。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された２本鎖ＤＮＡにλエクソヌクレアーゼを作用させ、プローブＤＮＡが２本鎖を維持出来ない程度まで分解されると新たなプローブＤＮＡと置き替わり、続いてこの新たなプローブも分解されることによりサイクリング反応が起こるというものである。この分解産物を検出する事により特定のＤＮＡ配列の有無を判定できる。この方法は原理がシンプルであり、また検出部位の配列が制限されないという点では制限酵素を用いる方法よりも有利である。しかしλエクソヌクレアーゼは、基質として５’末端がリン酸化されたプローブＤＮＡを要求する。ＤＮＡ合成機を用いてプローブＤＮＡを化学合成した場合５’末端はリン酸化されておらず、そのため合成後改めて末端をリン酸化する必要がある。しかし、５’末端が完全にリン酸化されているのかどうかを確認することが難しいためプローブ調製の再現性の点で問題が残る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置が要求される複雑な温度制御によらず、シンプルな反応系でコンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検出技術の提供を目的としている。また本発明は、これらの目的を達成するために検出対象となる塩基配列の制限やプローブＤＮＡ合成時の付加的な作業等をともなわない、汎用性に優れる検出技術を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため、一本鎖ＤＮＡには作用せずハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを切断し、かつ塩基配列には限定されないヌクレアーゼ活性を利用したシグナル増幅法を開発し、本発明を完成した。すなわち本発明は、次の工程ＡとＢを反応促進剤の存在下で繰り返すことによって産生されるプローブＤＮＡ分解産物を検出することを特徴とする塩基配列検出方法である。
Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼＩＩＩ（以下ＥＸＯと省略する）を作用させてプローブＤＮＡを３’側から分解する工程
【０００７】本発明において利用する標的ＤＮＡと相補性を持つプローブＤＮＡは、核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。また微生物やＰＣＲ法を利用して生物学的に増幅したＤＮＡをプローブＤＮＡとすることも可能である。本発明のプローブＤＮＡの鎖長は、標的配列に対する特異性と反応時間等を考慮して約１０〜１００の間で設定する。プローブＤＮＡの鎖長が短すぎると特異性やＥＸＯの作用で断片化されたものと分離の点で問題を生じ易く、他方不必要に長いプローブＤＮＡを用いるとＥＸＯによる分解に時間がかかり反応のサイクル数を減らす結果につながりかねない。標的配列とホモロジーの高い配列が検体中で共存しているというような特殊な条件でなければ、１５〜４０塩基程度の鎖長とすれば十分な特異性で必要な反応サイクルを維持することができる。本発明で用いるプローブＤＮＡは、たとえば５’末端のリン酸化というような特殊な処理は不要であるが、検出を容易にするためにあらかじめ標識しておくとよい。標識には、一般に核酸の標識技術として知られている方法を利用する。具体的には、ラジオアイソトープ、ビオチン、発光成分、蛍光成分、酵素、ハプテン等を例示することができる。プローブＤＮＡは必ずしも標識される必要はなく、たとえばＥＸＯの作用で分解され反応系に蓄積する特定の鎖長の断片の増加を追跡すれば塩基配列の検出は可能である。
【０００８】これらの標識はプローブＤＮＡの任意の位置に導入することができるが、導入位置によって検出対象が違ってくる。つまり３’側のＥＸＯの作用でモノヌクレオチドに分解される部分を標識したときには、モノヌクレオチドが検出の対象となる。他方５’付近の短くなって標的配列から外れる部分を標識したときには、プローブＤＮＡの断片を検出する必要が有る。ＥＸＯの酵素活性が標識によって立体障害を受ける可能性、またＥＸＯの作用を受け２本鎖を維持できなくなって外れてくるプローブ断片のみを確実に検出することを考慮すると５’末端の標識が好ましい。
【０００９】プローブＤＮＡとしてアプリン酸、アピリミジン酸等のアベイシック部位を含むものを使用した場合は、ＥＸＯは上記の３’末端からの分解と共にこれらの部位をエンドヌクレオテックに切断する。この特性を利用すればプローブＤＮＡの分解が３’末端のみならず複数位置で生じることになる。標識の検出にあたっては、ＥＸＯの作用を受けていない完全長のプローブＤＮＡに由来する標識の信号と、ハイブリダイズ〜ＥＸＯによる分解を受けた産物に由来する標識の信号とを区別する必要がある。もっとも単純な方法は、両者を分子量の差に基づいて物理的に分離してしまう方法である。具体的には、液体クロマトグラフィーや電気泳動等の手法が応用できる。この他にもアポ酵素で標識しておきプローブＤＮＡがＥＸＯの作用で短くなったときにだけ立体障害が除去されて液相中のホロ酵素と複合化し酵素活性を発現するというＣＥＤＩＡ法（Clinica Chimica Acta, vol.185, 231-240 (1989)）等の検出系の応用も可能と考えられる。その他、前記アベイシック部位を導入した時にはアベイシック部位を挟んで特定の組み合せからなる標識を結合させておけば更に簡便な分析系を構成することができる。標識の組み合せとしては、発光−消光標識の組み合せ、蛍光−偏光標識の組み合せ等を例示することができる。このような標識の組み合せを利用すれば、両者の物理的な距離の変化を信号の変化として追跡することができるので、均一系での分析が可能となる。
【００１０】他方、本発明におけるＥＸＯは、ＥＸＯ活性を持つものであればその由来は問わない。現在のところ大腸菌由来のものが市販されているが、これに限定されるものではなく、他の微生物やあるいは遺伝子組み換えによって得られたものであっても利用することができる。
【００１１】つづいて標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズについて説明する。両者はハイブリダイズ可能な条件下で接触させる。この時の条件は特に限定されないが、ＥＸＯの存在下で全ての反応を進行させることに注意を向ける必要が有る。ＥＸＯはＰＣＲ法で用いられるＴａｑポリメラーゼのような高い耐熱性を持たないので、ＥＸＯの活性を維持できる条件を採用しなければならない。また温度以外の緩衝液の選択やｐＨの設定等も、ハイブリダイズのみならずＥＸＯの活性が十分に発現できる条件を選択すべきである。具体的な条件を例示すれば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液等を用いたとき、ｐＨは約７〜９とし、２０〜４５℃で反応を行わせる。特に好ましい条件としては、ｐＨ７．５〜８．５、温度は３０〜４０℃を示すことができる。
【００１２】本発明においては、プローブＤＮＡの使用量も反応の結果を左右する要素となる。すなわち、標的配列に対してあまりにも少量のプローブＤＮＡしか存在しない時には十分な感度を得られなくなるおそれがある。標的配列の量をあらかじめ予想することは困難であるが、少なくとも希望する検出範囲の量に対して１０倍を越える量を、好ましくは１００倍以上の大過剰量でプローブＤＮＡを用いることが高い感度を確保するうえで重要な条件となる。
【００１３】本発明による塩基配列の検出方法においては、ハイブリダイズ〜ＥＸＯによる分解にいたる反応を反応促進剤の存在下で行うことが必須条件である。本発明における反応促進剤とは、標的配列とプローブＤＮＡとのハイブリダイズを促進ししかもＥＸＯの活性を阻害しない化合物と定義することができる。好ましい反応促進剤としては、ジメチルスルフォキシド（以下ＤＭＳＯと省略する）、エチレングリコール（以下ＥＧと省略する）、およびプロピレングリコール（以下ＰＧと省略する）等を示すことができる。これらの反応促進剤は、反応液中で５〜５０%(W/V)、好ましくは１０〜３０%(W/V)の濃度で用いる。
【００１４】なお、実施例で反応液に添加されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）はＥＸＯ蛋白質の安定化剤として用いるものであるのでＢＳＡ以外の蛋白であってもよく、１０−５００／mlの濃度で使用すればよい。またメルカプトエタノールは酸化防止剤として用いるものであるので、これ以外にジチオスレオトール（ＤＴＴ）等も使用できる。
【００１５】以上のような本発明に必要な各種成分は、あらかじめ組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、更に標識の検出に必要な資材や反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
本発明による塩基配列検出用試薬の構成：・標的配列に相補的なプローブＤＮＡ・ＥＸＯ・反応促進剤
【００１６】次に本発明の反応原理を述べる。本発明による反応は図１に示すようなサイクルで進行する。すなわち、まずプローブＤＮＡが標的配列にハイブリダイズして２本鎖を形成する。このとき一般的には標的配列を含むＤＮＡが、プローブＤＮＡの５’末端と３’末端の方向につきでた構造となる。（もちろん標的配列がＤＮＡの５’末端に位置している時には３’側のみがつきでた構造となる。）ついでこの２本鎖となった部分の３’側からＥＸＯによる分解が開始され、プローブＤＮＡがモノヌクレオチドに分解される。ＥＸＯはＤＮＡの２本鎖部分の３’末端からしか作用できないので、標的配列を含むＤＮＡやハイブリダイズしていない遊離のプローブＤＮＡはＥＸＯによる分解を受けない。ＥＸＯによるプローブＤＮＡの分解が進行すると、標的配列とプローブＤＮＡの間に形成された塩基対が減少し、やがて２本鎖構造を維持できなくなってプローブＤＮＡが外れ標的配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖にもどる。こうして標的配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖となって新たなプローブＤＮＡとハイブリダイズし、他方ＥＸＯの作用で断片化されたプローブＤＮＡが反応液中に遊離し蓄積されるのである。この反応原理からわかるように、標的配列はＤＮＡの３’末端に位置しないように設定しなければならない。標的配列が３’末端に位置すると、プローブＤＮＡと同様ＥＸＯの作用によって分解されてしまい以降のハイブリダイズが不可能になってしまうためである。
【００１７】本発明は特定の塩基配列が分析対象となるＤＮＡの中に存在するかどうかを高い精度と感度で検出するための技術を提供する。本発明の分析対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものにおよぶ。またＤＮＡとしては、ゲノミックＤＮＡはもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを分析対象とすることも可能である。
【００１８】
【作用】本発明におけるＥＸＯは、標的配列とハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを特異的に加水分解する作用を持つ。標的配列が存在しない時にはプローブＤＮＡの分解は起こらず、またたとえ標的配列が存在していてもプローブＤＮＡがハイブリダイズしない限り加水分解されることはない。ＥＸＯのこのような特性により、本発明における反応液中に蓄積するプローブＤＮＡの分解産物は直線的に増加し、定量性の高い分析が可能となるのである。本発明の反応促進剤は、標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズを促進する作用を持つ。本発明は、この反応促進剤の存在によって迅速で定量性に優れた反応系を提供することができるのである。以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【００１９】
【実施例】
１．ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子のＥＸＯによる検出を試みた。ＥＸＯには大腸菌由来のものを、反応促進剤にはＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを、またプローブＤＮＡには以下示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成して用いた。
塩基配列１：5'-AATGCCCCTATCTTATCAACACTTC-OH
【００２０】１−ａ．プローブＤＮＡの調整プローブＤＮＡに用いたオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイド法によりCyclone plus DNA synthesizer（Milligen/Biosearch製、登録商標）にて合成した。合成したオリゴヌクレオチドはOligo-pakカートリッジカラム（Milligen/Biosearch製、登録商標）により精製した。得られたオリゴヌクレオチドは、γ-32PATPとT4キナーゼを用いて５’末端を32Pラベルした。ここで作成した32P標識オリゴヌクレオチドを未標識オリゴヌクレオチドと混合し、以下の実験の32P標識プローブＤＮＡとした。なお、検出はオートラジオグラムにより行うのでその都合上 32P標識オリゴヌクレオチド量は一反応あたり約１０４cpmになるように添加した。
【００２１】１−ｂ．標的配列の検出32P標識したプローブＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ・ＤＮＡを一部にもつＭ１３ファージＤＮＡと混合し、実際に本発明による反応を行わせた。具体的な反応液の組成は次に示すとおりである。
反応液の組成：標的配列（Ｍ１３ファージＤＮＡ上にＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ、１０fmol）
32P標識したプローブＤＮＡ、１pmol５０mM Tris/HCl（ｐＨ８．０）
５mM MgCl2１０mM ２メルカプトエタノール５０mM NaCl１００μg/ml牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）
２０% ＤＭＳＯ（あるいはＥＧ、ＰＧ）
この反応液を３７℃で１０分間プレインキュベート後、ＥＸＯ５U（宝酒造製）を添加し３７℃で６０分間反応させた。反応後１０μlの停止液を添加し、６５℃で５分間処理して反応を停止させた。続いて１９%ポリアクリルアミドゲル（７M尿素含有）で電気泳動し、オートラジオグラフィーにより断片化したプローブＤＮＡを検出した。結果は図２に示した。
停止液：８０ %ホルムアミド１５mM Tris/HCl （ｐＨ７．６）
５mMＥＤＴＡ０．１%W/V ＢＰＢ（Bromophenol Blue）
０．１%W/V ＸＣ−ＦＦ（Xylene Cyanol FF）
【００２２】図２から明らかなように、２０%のＤＭＳＯ、ＥＧ、或いはＰＧ存在下ではサイクリング反応が起こり易くなる事が分かった（レーン４，６，８）。従って、この条件下では鋳型となる標的配列の量以上のプローブＤＮＡが分解され、その結果シグナルの増幅が起こる事が明らかとなった。なお、同様の条件でハイブリダイズ促進剤として知られているラクトース、レハロース、グルコース、サッカロース、マルトース、α-メチル−Ｄ-グルコシド、硫化ジメチル、ジメチルスルホン、硫酸ジメチル、アセトアミド、チオアセトアミド、尿素、チオ尿素、ホルムアミド、アセトン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、硫安、スペルミジン、スペルミン、グリセリン、ジメチルホルムアミド、デンハルト溶液（０．０２%フィコール、０．０２%ポリビニルピロリドン、０．０１%ＢＳＡ）、フィコールについての実験も行ったが、反応促進効果はほとんど認められなかった。
【００２３】２．ＤＭＳＯの至適濃度１．と同じ条件でＤＭＳＯの濃度のみを１０〜５０%に変えてＤＭＳＯの至適濃度を調査した。結果は図３に示した。ＤＭＳＯの濃度が１０〜３０%では反応の進行が認められるが、４０%以上では無添加のときと同様にほとんど反応が進行しなくなることが分かった。従って、至適濃度は２０%程度であることが明らかとなった。（レーン３）
【００２４】３．反応促進剤の作用反応促進剤の作用を確認するために次の実験を行った。反応促進剤には２０%のＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを用い、その他の条件は１．にしたがった。なおハイブリダイズしたＤＮＡを同時に検出するため、反応停止液を添加後の６５℃で５分間の熱処理を除き、直接ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動をおこなった。
【００２５】３−ａ．標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡと32P標識プローブＤＮＡを混合し、６５℃で１０分加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行いハイブリダイズさせた。続いてＥＸＯを添加し３７℃で６０分間分解反応をおこなった。
【００２６】３ーｂ．始めにハイブリダイズしていたプローブが分解された後、フリーとなった標的配列に新たなプローブが再びハイブリダイズして起こるサイクリング反応（図１の２ラウンド目以降の反応）を見るため、３−ｂの実験を行った。標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡと標識していないプローブＤＮＡとを混合し６５℃１０分間加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行いハイブリダイズさせた。続いてＥＸＯ、32P標識プローブＤＮＡを添加し、３７℃で６０分間分解反応をおこなった。
【００２７】いずれの場合も分解反応の終了後に１．と同じ様に反応液をオートラジオグラフィーにより分析した。結果を図４に示す。レーン１〜３が３−ａ．に、レーン４〜６が３−ｂ．に対応している。なお図４にはＤＭＳＯの結果しか示さないが、他の反応促進剤においてもほぼ同様の実験結果を得た。反応促進剤非存在下ではアニール処理によってハイブリダイズしていたプローブＤＮＡは分解されるが（レーン２）、２ラウンド目以降の３７℃でのハイブリダイゼーションと分解反応からなるサイクリング反応が起こりにくいことがわかった（レーン５）。
【００２８】３−ｃ（実験結果は示さない）．反応促進剤の作用を確認するために単にハイブリダイズに対する促進効果のみを調査した。実験として次に示す温度条件で等量の32P標識プローブＤＮＡと標的配列のハイブリダイズに及ぼす反応促進剤の影響を観察した。反応後は１．と同様にオートラジオグラフィーにより分析した。温度条件として次の３点を調べた。
条件Ａ：煮沸２分／６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｂ：６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｃ：３７℃で１０分反応液はハイブリダイゼーションの効率のみを見るため、32P標識プローブ５０fmol、標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡ（５０fmol）を使用し、反応促進剤２０%（ＤＭＳＯ、ＰＧ、またはＥＧ）を添加した。その他の反応液の組成は実験１．と同様である。その結果、反応促進剤が存在する場合はいずれの温度条件でも十分にハイブリダイズしていたが、反応促進剤が存在しない時には温度条件にはかかわらずわずかのハイブリダイズしか確認されなかった。特に条件Ｃ（３７℃で１０分）では反応促進剤が無ければ痕跡程度のハイブリダイズしか観察されず、反応促進剤がハイブリダイズを促進していることが明らかとなった。以上の実験により、一定温度（３７℃）の条件下での標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズの効率を添加剤が促進していることがわかった。またＥＸＯに対しては少なくともプローブＤＮＡ分解活性を阻害しないため、図１のサイクリング反応が進行すると考えられる。
【００２９】４．ＤＭＳＯ存在下での検出感度１．と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１pmolに変化させて本発明による検出方法の感度を確認した。結果を図５に示す。１０fmol程度のＤＮＡを検出可能なことが確認された。本発明による検出方法の感度がきわめて高いことがわかる。
【００３０】５．反応特異性本発明による検出方法の反応特異性を確認した。検出対象として次のようなＤＮＡを用い、操作は１．にしたがった。結果を図６に示す。
検出対象としたＤＮＡ：・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ（レーン３）
・プローブＤＮＡと同じ配列（方向性が同一であるため相補的ではない）を持つＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ（レーン４）
・挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環状ＤＮＡ（レーン５）
・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３直鎖状ＤＮＡ（ＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つＭ１３ＲＦ・ＤＮＡを制限酵素EcoRIで切断して直鎖状とし９５℃で加熱処理して変性させたもの、レーン６）
・対照として、プローブＤＮＡのみを泳動した（レーン１）、・標的配列の無い状態でＥＸＯを反応させた（レーン２）。
図から明らかなように、プローブＤＮＡの分解は検出対象となるＤＮＡが標的配列を含む場合にのみ観察され（レーン３、６）、本発明による検出方法が特異的であることが確認された。データは示さないが、この他にもサケ精子ＤＮＡを対象とした場合にもプローブＤＮＡの分解が起きないことを確認した。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、特別な温度制御操作をすることなく塩基配列の増幅と検出を行うことができるので自動化が容易である。また本発明による反応では、生成物の増加が直線的に進むので標的核酸の定量性に優れる。ＰＣＲ法では生成物が指数的に増加するため増幅率には優れるものの反応条件を厳しく管理しても定量性には限界があるが、本発明では反応条件の管理が容易なうえ十分な定量性を維持することが可能である。本発明の利点の一つに、コンタミネーションの影響を受け難いことがあげられる。すなわち本発明ではＥＸＯによって分解したプローブを検出するので、たとえ増幅後の核酸がコンタミネーションを起こしても増幅につながるおそれはない。ＰＣＲ法では誤って増幅された配列が新たな鋳型として機能するため、特に反応初期のクロスコンタミネーションは結果に重大な影響をおよぼす。このような特性から見ても本発明の定量性が優れているということができる。更に本発明の付随的な効果として変異位置の特定に応用可能なことがあげられる。標的核酸に変異部位が存在する時は、プローブＤＮＡとのミスマッチの位置でＥＸＯによる分解が起こりにくくなる。したがって、分解後のプローブＤＮＡの長さを測定する事により標的核酸上の変異の位置が限定出来得る。以上のようにこの本発明による塩基配列の検出方法は種々の利点を有するものであり、遺伝子の分析において有効な方法となることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の反応原理を示す模式図である。
【図２】図２は本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出方法によって得られたオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１，３，５，７： 標的配列非存在下に反応させた。
レーン２，４，６，８： 標的配列（１０fmol）存在下反応させた。
レーン１，２： 添加剤を加えない条件下反応させた。
レーン３，４： 添加剤としてＤＭＳＯ(20%)を加えて反応させた。
レーン５，６： 添加剤としてＰＧ(20%)を加えて反応させた。
レーン７，８： 添加剤としてＥＧ(20%)を加えて反応させた。
【図３】図３はＤＭＳＯ濃度を変化させて至適濃度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：ＤＭＳＯを添加せず反応させた。
レーン２：１０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン３：２０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン４：３０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン５：４０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン６：５０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
【図４】図４は、反応促進剤の作用を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。レーン１〜３が３−ａ．に、レーン４〜６が３−ｂ．に対応している。
レーン１，４：プローブＤＮＡのみ。
レーン２，５：ＤＭＳＯを添加しない。
レーン３，６：２０%ＤＭＳＯを添加した。
レーン１，２，３：32P標識プローブをはじめから添加しＥＸＯ処理した。
レーン４，５，６：未標識プローブをハイブリダイズさせた後、ＥＸＯと32P標識プローブを添加した。
【図５】図５は標的配列の濃度を変化させて感度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：標的配列を含むＤＮＡを添加せず、反応させた。
レーン２：標的配列を含むＤＮＡを１pmol添加し反応させた。
レーン３：標的配列を含むＤＮＡを１００fmol添加し反応させた。
レーン４：標的配列を含むＤＮＡを１０fmol添加し反応させた。
レーン５：標的配列を含むＤＮＡを１fmol添加し反応させた。
【図６】図６は検出対象となるＤＮＡを変化させて特異性を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：プローブＤＮＡのみ。
レーン２：標的配列を含むＤＮＡを添加せず反応させた。
レーン３：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。
レーン４：プローブＤＮＡと同じ配列（相補的ではない）をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。
レーン５：挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環状ＤＮＡ。
レーン６：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつ二本鎖直鎖状のＤＮＡ。
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、試料中に存在する特定の塩基配列（以下標的配列という）の検出方法に関するものである。プローブＤＮＡを用いた遺伝子診断法は、遺伝的疾患や感染症の診断に有効である。検体中に目的の遺伝子が存在するか否かを見るために、検体より抽出した核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）と標識したプローブＤＮＡとを混合し、特異的にハイブリダイズした標識体の量を測定することにより目的の遺伝子を検出する事が行われている。
【０００２】
【従来技術の問題点】核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することができるため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には有力な手段である。また遺伝子を検出対象とするために、培養のような時間のかかる操作を省略できる場合も有る。しかし、検体中に目的の遺伝子量が少ない場合の検出は容易ではなく、標的遺伝子そのものあるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する方法のひとつにＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が知られている。ＰＣＲ法はin vitroにおける核酸の増幅技術としてもっとも一般的な方法であるが、次のような問題点が指摘されている。すなわち、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと、増幅反応が対数的に進むことから定量性に問題があること、増幅した産物によるコンタミネーションが起こり易いこと等の問題点が知られている。コンタミネーションとは以前の反応で生じた増幅産物がつぎの反応液に誤って混入する事をいい、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍にまで増幅させる反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増幅されるため誤った結果を与える。これは特に多数の検体を同時に扱う場合には重大な問題となる。
【０００３】他方、検出シグナルを増幅する方法としてはＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法（Bio/Technology,6,1197-1202(1988)P.M.Lizardietal.）が報告されている。しかしこの方法は増幅させる配列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必要があり、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列が制限される等の問題がある。これらの方法は検出対象となる塩基配列を増幅するものであるが、以下に述べるような分解産物を検出するシグナル増幅法も考案されている。たとえば、標的核酸にオリゴプローブＤＮＡをハイブリダイズさせた後制限酵素処理し、切断されたプローブ断片を検出するシグナル増幅法が知られている（ＥＰ−０４５５５１７／Ａ１）。この方法は検出感度も比較的良く、定量性があり、特別な装置を必要としない等の利点がある。しかし、この方法を遂行するにはプローブＤＮＡ以外に反応が繰り返し起こるようにするための特異的な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを共存させる必要がある。また検出する部位に制限酵素切断部位が必要であるために検出部位が制限される等の欠点も持つ。
【０００４】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断するλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法も開発されている（BioTechniques Vol.13,No.6(1992)）。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された２本鎖ＤＮＡにλエクソヌクレアーゼを作用させ、プローブＤＮＡが２本鎖を維持出来ない程度まで分解されると新たなプローブＤＮＡと置き替わり、続いてこの新たなプローブも分解されることによりサイクリング反応が起こるというものである。この分解産物を検出する事により特定のＤＮＡ配列の有無を判定できる。この方法は原理がシンプルであり、また検出部位の配列が制限されないという点では制限酵素を用いる方法よりも有利である。しかしλエクソヌクレアーゼは、基質として５’末端がリン酸化されたプローブＤＮＡを要求する。ＤＮＡ合成機を用いてプローブＤＮＡを化学合成した場合５’末端はリン酸化されておらず、そのため合成後改めて末端をリン酸化する必要がある。しかし、５’末端が完全にリン酸化されているのかどうかを確認することが難しいためプローブ調製の再現性の点で問題が残る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置が要求される複雑な温度制御によらず、シンプルな反応系でコンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検出技術の提供を目的としている。また本発明は、これらの目的を達成するために検出対象となる塩基配列の制限やプローブＤＮＡ合成時の付加的な作業等をともなわない、汎用性に優れる検出技術を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため、一本鎖ＤＮＡには作用せずハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを切断し、かつ塩基配列には限定されないヌクレアーゼ活性を利用したシグナル増幅法を開発し、本発明を完成した。すなわち本発明は、次の工程ＡとＢを反応促進剤の存在下で繰り返すことによって産生されるプローブＤＮＡ分解産物を検出することを特徴とする塩基配列検出方法である。
Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼＩＩＩ（以下ＥＸＯと省略する）を作用させてプローブＤＮＡを３’側から分解する工程
【０００７】本発明において利用する標的ＤＮＡと相補性を持つプローブＤＮＡは、核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。また微生物やＰＣＲ法を利用して生物学的に増幅したＤＮＡをプローブＤＮＡとすることも可能である。本発明のプローブＤＮＡの鎖長は、標的配列に対する特異性と反応時間等を考慮して約１０〜１００の間で設定する。プローブＤＮＡの鎖長が短すぎると特異性やＥＸＯの作用で断片化されたものと分離の点で問題を生じ易く、他方不必要に長いプローブＤＮＡを用いるとＥＸＯによる分解に時間がかかり反応のサイクル数を減らす結果につながりかねない。標的配列とホモロジーの高い配列が検体中で共存しているというような特殊な条件でなければ、１５〜４０塩基程度の鎖長とすれば十分な特異性で必要な反応サイクルを維持することができる。本発明で用いるプローブＤＮＡは、たとえば５’末端のリン酸化というような特殊な処理は不要であるが、検出を容易にするためにあらかじめ標識しておくとよい。標識には、一般に核酸の標識技術として知られている方法を利用する。具体的には、ラジオアイソトープ、ビオチン、発光成分、蛍光成分、酵素、ハプテン等を例示することができる。プローブＤＮＡは必ずしも標識される必要はなく、たとえばＥＸＯの作用で分解され反応系に蓄積する特定の鎖長の断片の増加を追跡すれば塩基配列の検出は可能である。
【０００８】これらの標識はプローブＤＮＡの任意の位置に導入することができるが、導入位置によって検出対象が違ってくる。つまり３’側のＥＸＯの作用でモノヌクレオチドに分解される部分を標識したときには、モノヌクレオチドが検出の対象となる。他方５’付近の短くなって標的配列から外れる部分を標識したときには、プローブＤＮＡの断片を検出する必要が有る。ＥＸＯの酵素活性が標識によって立体障害を受ける可能性、またＥＸＯの作用を受け２本鎖を維持できなくなって外れてくるプローブ断片のみを確実に検出することを考慮すると５’末端の標識が好ましい。
【０００９】プローブＤＮＡとしてアプリン酸、アピリミジン酸等のアベイシック部位を含むものを使用した場合は、ＥＸＯは上記の３’末端からの分解と共にこれらの部位をエンドヌクレオテックに切断する。この特性を利用すればプローブＤＮＡの分解が３’末端のみならず複数位置で生じることになる。標識の検出にあたっては、ＥＸＯの作用を受けていない完全長のプローブＤＮＡに由来する標識の信号と、ハイブリダイズ〜ＥＸＯによる分解を受けた産物に由来する標識の信号とを区別する必要がある。もっとも単純な方法は、両者を分子量の差に基づいて物理的に分離してしまう方法である。具体的には、液体クロマトグラフィーや電気泳動等の手法が応用できる。この他にもアポ酵素で標識しておきプローブＤＮＡがＥＸＯの作用で短くなったときにだけ立体障害が除去されて液相中のホロ酵素と複合化し酵素活性を発現するというＣＥＤＩＡ法（Clinica Chimica Acta, vol.185, 231-240 (1989)）等の検出系の応用も可能と考えられる。その他、前記アベイシック部位を導入した時にはアベイシック部位を挟んで特定の組み合せからなる標識を結合させておけば更に簡便な分析系を構成することができる。標識の組み合せとしては、発光−消光標識の組み合せ、蛍光−偏光標識の組み合せ等を例示することができる。このような標識の組み合せを利用すれば、両者の物理的な距離の変化を信号の変化として追跡することができるので、均一系での分析が可能となる。
【００１０】他方、本発明におけるＥＸＯは、ＥＸＯ活性を持つものであればその由来は問わない。現在のところ大腸菌由来のものが市販されているが、これに限定されるものではなく、他の微生物やあるいは遺伝子組み換えによって得られたものであっても利用することができる。
【００１１】つづいて標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズについて説明する。両者はハイブリダイズ可能な条件下で接触させる。この時の条件は特に限定されないが、ＥＸＯの存在下で全ての反応を進行させることに注意を向ける必要が有る。ＥＸＯはＰＣＲ法で用いられるＴａｑポリメラーゼのような高い耐熱性を持たないので、ＥＸＯの活性を維持できる条件を採用しなければならない。また温度以外の緩衝液の選択やｐＨの設定等も、ハイブリダイズのみならずＥＸＯの活性が十分に発現できる条件を選択すべきである。具体的な条件を例示すれば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液等を用いたとき、ｐＨは約７〜９とし、２０〜４５℃で反応を行わせる。特に好ましい条件としては、ｐＨ７．５〜８．５、温度は３０〜４０℃を示すことができる。
【００１２】本発明においては、プローブＤＮＡの使用量も反応の結果を左右する要素となる。すなわち、標的配列に対してあまりにも少量のプローブＤＮＡしか存在しない時には十分な感度を得られなくなるおそれがある。標的配列の量をあらかじめ予想することは困難であるが、少なくとも希望する検出範囲の量に対して１０倍を越える量を、好ましくは１００倍以上の大過剰量でプローブＤＮＡを用いることが高い感度を確保するうえで重要な条件となる。
【００１３】本発明による塩基配列の検出方法においては、ハイブリダイズ〜ＥＸＯによる分解にいたる反応を反応促進剤の存在下で行うことが必須条件である。本発明における反応促進剤とは、標的配列とプローブＤＮＡとのハイブリダイズを促進ししかもＥＸＯの活性を阻害しない化合物と定義することができる。好ましい反応促進剤としては、ジメチルスルフォキシド（以下ＤＭＳＯと省略する）、エチレングリコール（以下ＥＧと省略する）、およびプロピレングリコール（以下ＰＧと省略する）等を示すことができる。これらの反応促進剤は、反応液中で５〜５０%(W/V)、好ましくは１０〜３０%(W/V)の濃度で用いる。
【００１４】なお、実施例で反応液に添加されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）はＥＸＯ蛋白質の安定化剤として用いるものであるのでＢＳＡ以外の蛋白であってもよく、１０−５００／mlの濃度で使用すればよい。またメルカプトエタノールは酸化防止剤として用いるものであるので、これ以外にジチオスレオトール（ＤＴＴ）等も使用できる。
【００１５】以上のような本発明に必要な各種成分は、あらかじめ組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、更に標識の検出に必要な資材や反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
本発明による塩基配列検出用試薬の構成：・標的配列に相補的なプローブＤＮＡ・ＥＸＯ・反応促進剤
【００１６】次に本発明の反応原理を述べる。本発明による反応は図１に示すようなサイクルで進行する。すなわち、まずプローブＤＮＡが標的配列にハイブリダイズして２本鎖を形成する。このとき一般的には標的配列を含むＤＮＡが、プローブＤＮＡの５’末端と３’末端の方向につきでた構造となる。（もちろん標的配列がＤＮＡの５’末端に位置している時には３’側のみがつきでた構造となる。）ついでこの２本鎖となった部分の３’側からＥＸＯによる分解が開始され、プローブＤＮＡがモノヌクレオチドに分解される。ＥＸＯはＤＮＡの２本鎖部分の３’末端からしか作用できないので、標的配列を含むＤＮＡやハイブリダイズしていない遊離のプローブＤＮＡはＥＸＯによる分解を受けない。ＥＸＯによるプローブＤＮＡの分解が進行すると、標的配列とプローブＤＮＡの間に形成された塩基対が減少し、やがて２本鎖構造を維持できなくなってプローブＤＮＡが外れ標的配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖にもどる。こうして標的配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖となって新たなプローブＤＮＡとハイブリダイズし、他方ＥＸＯの作用で断片化されたプローブＤＮＡが反応液中に遊離し蓄積されるのである。この反応原理からわかるように、標的配列はＤＮＡの３’末端に位置しないように設定しなければならない。標的配列が３’末端に位置すると、プローブＤＮＡと同様ＥＸＯの作用によって分解されてしまい以降のハイブリダイズが不可能になってしまうためである。
【００１７】本発明は特定の塩基配列が分析対象となるＤＮＡの中に存在するかどうかを高い精度と感度で検出するための技術を提供する。本発明の分析対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものにおよぶ。またＤＮＡとしては、ゲノミックＤＮＡはもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを分析対象とすることも可能である。
【００１８】
【作用】本発明におけるＥＸＯは、標的配列とハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを特異的に加水分解する作用を持つ。標的配列が存在しない時にはプローブＤＮＡの分解は起こらず、またたとえ標的配列が存在していてもプローブＤＮＡがハイブリダイズしない限り加水分解されることはない。ＥＸＯのこのような特性により、本発明における反応液中に蓄積するプローブＤＮＡの分解産物は直線的に増加し、定量性の高い分析が可能となるのである。本発明の反応促進剤は、標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズを促進する作用を持つ。本発明は、この反応促進剤の存在によって迅速で定量性に優れた反応系を提供することができるのである。以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【００１９】
【実施例】
１．ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子のＥＸＯによる検出を試みた。ＥＸＯには大腸菌由来のものを、反応促進剤にはＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを、またプローブＤＮＡには以下示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成して用いた。
塩基配列１：5'-AATGCCCCTATCTTATCAACACTTC-OH
【００２０】１−ａ．プローブＤＮＡの調整プローブＤＮＡに用いたオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイド法によりCyclone plus DNA synthesizer（Milligen/Biosearch製、登録商標）にて合成した。合成したオリゴヌクレオチドはOligo-pakカートリッジカラム（Milligen/Biosearch製、登録商標）により精製した。得られたオリゴヌクレオチドは、γ-32PATPとT4キナーゼを用いて５’末端を32Pラベルした。ここで作成した32P標識オリゴヌクレオチドを未標識オリゴヌクレオチドと混合し、以下の実験の32P標識プローブＤＮＡとした。なお、検出はオートラジオグラムにより行うのでその都合上 32P標識オリゴヌクレオチド量は一反応あたり約１０４cpmになるように添加した。
【００２１】１−ｂ．標的配列の検出32P標識したプローブＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ・ＤＮＡを一部にもつＭ１３ファージＤＮＡと混合し、実際に本発明による反応を行わせた。具体的な反応液の組成は次に示すとおりである。
反応液の組成：標的配列（Ｍ１３ファージＤＮＡ上にＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ、１０fmol）
32P標識したプローブＤＮＡ、１pmol５０mM Tris/HCl（ｐＨ８．０）
５mM MgCl2１０mM ２メルカプトエタノール５０mM NaCl１００μg/ml牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）
２０% ＤＭＳＯ（あるいはＥＧ、ＰＧ）
この反応液を３７℃で１０分間プレインキュベート後、ＥＸＯ５U（宝酒造製）を添加し３７℃で６０分間反応させた。反応後１０μlの停止液を添加し、６５℃で５分間処理して反応を停止させた。続いて１９%ポリアクリルアミドゲル（７M尿素含有）で電気泳動し、オートラジオグラフィーにより断片化したプローブＤＮＡを検出した。結果は図２に示した。
停止液：８０ %ホルムアミド１５mM Tris/HCl （ｐＨ７．６）
５mMＥＤＴＡ０．１%W/V ＢＰＢ（Bromophenol Blue）
０．１%W/V ＸＣ−ＦＦ（Xylene Cyanol FF）
【００２２】図２から明らかなように、２０%のＤＭＳＯ、ＥＧ、或いはＰＧ存在下ではサイクリング反応が起こり易くなる事が分かった（レーン４，６，８）。従って、この条件下では鋳型となる標的配列の量以上のプローブＤＮＡが分解され、その結果シグナルの増幅が起こる事が明らかとなった。なお、同様の条件でハイブリダイズ促進剤として知られているラクトース、レハロース、グルコース、サッカロース、マルトース、α-メチル−Ｄ-グルコシド、硫化ジメチル、ジメチルスルホン、硫酸ジメチル、アセトアミド、チオアセトアミド、尿素、チオ尿素、ホルムアミド、アセトン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、硫安、スペルミジン、スペルミン、グリセリン、ジメチルホルムアミド、デンハルト溶液（０．０２%フィコール、０．０２%ポリビニルピロリドン、０．０１%ＢＳＡ）、フィコールについての実験も行ったが、反応促進効果はほとんど認められなかった。
【００２３】２．ＤＭＳＯの至適濃度１．と同じ条件でＤＭＳＯの濃度のみを１０〜５０%に変えてＤＭＳＯの至適濃度を調査した。結果は図３に示した。ＤＭＳＯの濃度が１０〜３０%では反応の進行が認められるが、４０%以上では無添加のときと同様にほとんど反応が進行しなくなることが分かった。従って、至適濃度は２０%程度であることが明らかとなった。（レーン３）
【００２４】３．反応促進剤の作用反応促進剤の作用を確認するために次の実験を行った。反応促進剤には２０%のＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを用い、その他の条件は１．にしたがった。なおハイブリダイズしたＤＮＡを同時に検出するため、反応停止液を添加後の６５℃で５分間の熱処理を除き、直接ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動をおこなった。
【００２５】３−ａ．標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡと32P標識プローブＤＮＡを混合し、６５℃で１０分加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行いハイブリダイズさせた。続いてＥＸＯを添加し３７℃で６０分間分解反応をおこなった。
【００２６】３ーｂ．始めにハイブリダイズしていたプローブが分解された後、フリーとなった標的配列に新たなプローブが再びハイブリダイズして起こるサイクリング反応（図１の２ラウンド目以降の反応）を見るため、３−ｂの実験を行った。標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡと標識していないプローブＤＮＡとを混合し６５℃１０分間加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行いハイブリダイズさせた。続いてＥＸＯ、32P標識プローブＤＮＡを添加し、３７℃で６０分間分解反応をおこなった。
【００２７】いずれの場合も分解反応の終了後に１．と同じ様に反応液をオートラジオグラフィーにより分析した。結果を図４に示す。レーン１〜３が３−ａ．に、レーン４〜６が３−ｂ．に対応している。なお図４にはＤＭＳＯの結果しか示さないが、他の反応促進剤においてもほぼ同様の実験結果を得た。反応促進剤非存在下ではアニール処理によってハイブリダイズしていたプローブＤＮＡは分解されるが（レーン２）、２ラウンド目以降の３７℃でのハイブリダイゼーションと分解反応からなるサイクリング反応が起こりにくいことがわかった（レーン５）。
【００２８】３−ｃ（実験結果は示さない）．反応促進剤の作用を確認するために単にハイブリダイズに対する促進効果のみを調査した。実験として次に示す温度条件で等量の32P標識プローブＤＮＡと標的配列のハイブリダイズに及ぼす反応促進剤の影響を観察した。反応後は１．と同様にオートラジオグラフィーにより分析した。温度条件として次の３点を調べた。
条件Ａ：煮沸２分／６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｂ：６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｃ：３７℃で１０分反応液はハイブリダイゼーションの効率のみを見るため、32P標識プローブ５０fmol、標的配列を含むＭ１３ファージＤＮＡ（５０fmol）を使用し、反応促進剤２０%（ＤＭＳＯ、ＰＧ、またはＥＧ）を添加した。その他の反応液の組成は実験１．と同様である。その結果、反応促進剤が存在する場合はいずれの温度条件でも十分にハイブリダイズしていたが、反応促進剤が存在しない時には温度条件にはかかわらずわずかのハイブリダイズしか確認されなかった。特に条件Ｃ（３７℃で１０分）では反応促進剤が無ければ痕跡程度のハイブリダイズしか観察されず、反応促進剤がハイブリダイズを促進していることが明らかとなった。以上の実験により、一定温度（３７℃）の条件下での標的配列とプローブＤＮＡのハイブリダイズの効率を添加剤が促進していることがわかった。またＥＸＯに対しては少なくともプローブＤＮＡ分解活性を阻害しないため、図１のサイクリング反応が進行すると考えられる。
【００２９】４．ＤＭＳＯ存在下での検出感度１．と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１pmolに変化させて本発明による検出方法の感度を確認した。結果を図５に示す。１０fmol程度のＤＮＡを検出可能なことが確認された。本発明による検出方法の感度がきわめて高いことがわかる。
【００３０】５．反応特異性本発明による検出方法の反応特異性を確認した。検出対象として次のようなＤＮＡを用い、操作は１．にしたがった。結果を図６に示す。
検出対象としたＤＮＡ：・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ（レーン３）
・プローブＤＮＡと同じ配列（方向性が同一であるため相補的ではない）を持つＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ（レーン４）
・挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環状ＤＮＡ（レーン５）
・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３直鎖状ＤＮＡ（ＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つＭ１３ＲＦ・ＤＮＡを制限酵素EcoRIで切断して直鎖状とし９５℃で加熱処理して変性させたもの、レーン６）
・対照として、プローブＤＮＡのみを泳動した（レーン１）、・標的配列の無い状態でＥＸＯを反応させた（レーン２）。
図から明らかなように、プローブＤＮＡの分解は検出対象となるＤＮＡが標的配列を含む場合にのみ観察され（レーン３、６）、本発明による検出方法が特異的であることが確認された。データは示さないが、この他にもサケ精子ＤＮＡを対象とした場合にもプローブＤＮＡの分解が起きないことを確認した。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、特別な温度制御操作をすることなく塩基配列の増幅と検出を行うことができるので自動化が容易である。また本発明による反応では、生成物の増加が直線的に進むので標的核酸の定量性に優れる。ＰＣＲ法では生成物が指数的に増加するため増幅率には優れるものの反応条件を厳しく管理しても定量性には限界があるが、本発明では反応条件の管理が容易なうえ十分な定量性を維持することが可能である。本発明の利点の一つに、コンタミネーションの影響を受け難いことがあげられる。すなわち本発明ではＥＸＯによって分解したプローブを検出するので、たとえ増幅後の核酸がコンタミネーションを起こしても増幅につながるおそれはない。ＰＣＲ法では誤って増幅された配列が新たな鋳型として機能するため、特に反応初期のクロスコンタミネーションは結果に重大な影響をおよぼす。このような特性から見ても本発明の定量性が優れているということができる。更に本発明の付随的な効果として変異位置の特定に応用可能なことがあげられる。標的核酸に変異部位が存在する時は、プローブＤＮＡとのミスマッチの位置でＥＸＯによる分解が起こりにくくなる。したがって、分解後のプローブＤＮＡの長さを測定する事により標的核酸上の変異の位置が限定出来得る。以上のようにこの本発明による塩基配列の検出方法は種々の利点を有するものであり、遺伝子の分析において有効な方法となることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の反応原理を示す模式図である。
【図２】図２は本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出方法によって得られたオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１，３，５，７： 標的配列非存在下に反応させた。
レーン２，４，６，８： 標的配列（１０fmol）存在下反応させた。
レーン１，２： 添加剤を加えない条件下反応させた。
レーン３，４： 添加剤としてＤＭＳＯ(20%)を加えて反応させた。
レーン５，６： 添加剤としてＰＧ(20%)を加えて反応させた。
レーン７，８： 添加剤としてＥＧ(20%)を加えて反応させた。
【図３】図３はＤＭＳＯ濃度を変化させて至適濃度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：ＤＭＳＯを添加せず反応させた。
レーン２：１０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン３：２０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン４：３０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン５：４０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
レーン６：５０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。
【図４】図４は、反応促進剤の作用を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。レーン１〜３が３−ａ．に、レーン４〜６が３−ｂ．に対応している。
レーン１，４：プローブＤＮＡのみ。
レーン２，５：ＤＭＳＯを添加しない。
レーン３，６：２０%ＤＭＳＯを添加した。
レーン１，２，３：32P標識プローブをはじめから添加しＥＸＯ処理した。
レーン４，５，６：未標識プローブをハイブリダイズさせた後、ＥＸＯと32P標識プローブを添加した。
【図５】図５は標的配列の濃度を変化させて感度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：標的配列を含むＤＮＡを添加せず、反応させた。
レーン２：標的配列を含むＤＮＡを１pmol添加し反応させた。
レーン３：標的配列を含むＤＮＡを１００fmol添加し反応させた。
レーン４：標的配列を含むＤＮＡを１０fmol添加し反応させた。
レーン５：標的配列を含むＤＮＡを１fmol添加し反応させた。
【図６】図６は検出対象となるＤＮＡを変化させて特異性を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図である。
レーン１：プローブＤＮＡのみ。
レーン２：標的配列を含むＤＮＡを添加せず反応させた。
レーン３：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。
レーン４：プローブＤＮＡと同じ配列（相補的ではない）をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。
レーン５：挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環状ＤＮＡ。
レーン６：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつ二本鎖直鎖状のＤＮＡ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】次の工程ＡとＢを反応促進剤の存在下で繰り返すことによって産生されるプローブＤＮＡ分解産物を検出することを特徴とする塩基配列検出方法。
Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼＩＩＩを作用させてプローブＤＮＡを３’側から分解する工程
【請求項２】プローブＤＮＡを予想される標的ＤＮＡの量に対して過剰量で用いることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項３】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、およびプロピレングリコールからなる群から選ばれる請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項４】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡの５’末端が標識されていることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項５】標的ＤＮＡが逆転写酵素によってＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項６】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、および反応促進剤とで構成されることを特徴とする塩基配列検出用試薬。
【請求項７】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、およびプロピレングリコールからなる群から選ばれる請求項６の塩基配列検出用試薬。
【請求項１】次の工程ＡとＢを反応促進剤の存在下で繰り返すことによって産生されるプローブＤＮＡ分解産物を検出することを特徴とする塩基配列検出方法。
Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼＩＩＩを作用させてプローブＤＮＡを３’側から分解する工程
【請求項２】プローブＤＮＡを予想される標的ＤＮＡの量に対して過剰量で用いることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項３】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、およびプロピレングリコールからなる群から選ばれる請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項４】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡの５’末端が標識されていることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項５】標的ＤＮＡが逆転写酵素によってＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項６】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、および反応促進剤とで構成されることを特徴とする塩基配列検出用試薬。
【請求項７】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、およびプロピレングリコールからなる群から選ばれる請求項６の塩基配列検出用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開平６−３２７４９９
【公開日】平成６年（１９９４）１１月２９日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−１４２７４５
【出願日】平成５年（１９９３）５月２１日
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
【公開日】平成６年（１９９４）１１月２９日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）５月２１日
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
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