説明

変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法

PALSAR法によりDNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにPALSAR法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。DNAリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、DNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ライゲーション反応及び自己集合体を形成する自己集合反応を用いて、DNAチップ、DNAマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズ(本発明では、DNAチップ、DNAマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズをDNAチップと総称する。)の変異遺伝子の検出感度を向上させることができるシグナル増幅方法に関する。
【背景技術】
従来の遺伝子変異検出は、オリゴヌクレオチド同士をターゲットに結合させDNAリガーゼを用いて連結させるOLA(Oligonucleotide Ligation Assay)法(例えば、米国特許第4,988,617号明細書及びD.Nickerson.Proc Natl.Acad.Sci.,vol.87,pp.8923−8927(1990).参照。)、標識したddNTPを用い一塩基伸長させるTDI(Template−directed dye−terminator incorporation)法(例えば、Chen X et al.,Nucleic Acids Research,vol.25,No.2,pp.347−353(1997).参照。)、インベーダー法(例えば、米国特許第5,985,557号明細書参照)等、様々な方法を利用しているが、上記の方法は、マルチプレックスやコスト、汎用性などに課題を持つ。
また、表面を特殊加工したスライドガラスなどの支持体に多数のDNAプローブを高密度に固定し、標識したターゲットもしくはシグナル検出用プローブをハイブリダイゼーションさせシグナルを検出する技術は、従来から用いられてきたサザンブロット法と比較して、感度が十分の一と低く(例えば、村松正明ら、「DNAマイクロアレイと最新PCR法」秀潤社、85−86,2000.参照。)、反応時間が長いという課題があった。
上記の問題を鑑み、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した(例えば、特許第3267576号公報参照。)。この方法は、3箇所の領域から構成される一対のオリゴヌクレオチド(HoneyComb Probe、以下、HCPと称する。)を用いる方法であり、第一HCPと第二HCPの各々の3箇所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の1箇所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、一対のHCPを反応させた場合、互いにハイブリダイズし、HCPの自己集合反応により集合体を形成させることができる(以下、この自己集合反応による集合体の形成法をPALSAR法と称する。)。
【発明の開示】
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したPALSAR法を用いて、変異遺伝子の検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
本発明は、PALSAR法によりDNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにPALSAR法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第1の態様は、DNAリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、DNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるものである。
本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第2の態様は、捕捉用プローブと第1プローブをターゲットDNAにハイブリダイズさせる第1工程、ターゲットDNAの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、DNAリガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第1プローブを連結させる第2工程、前記ターゲットDNAを除去させる第3工程、及び複数のオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第4工程を有し、前記捕捉用プローブと前記第1プローブの塩基配列が、前記第1工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記ターゲットDNAの変異部位に位置し且つ該末端と前記第1プローブが隣接する状態でターゲットDNAとアニーリングするように構成されており、前記複数のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが前記第1プローブと相補的な領域を有することを特徴とする。上記シグナル増幅方法により、DNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることができる。上記第1工程において、捕捉用プローブと第1プローブのターゲットDNAへの結合は、捕捉用プローブと第1プローブをターゲットDNAに同時に結合させても良く、捕捉用プローブをターゲットDNAに結合させた後、第1プローブとターゲットDNAを結合させても良く、第1プローブをターゲットDNAに結合させた後、捕捉用プローブとターゲットDNAを結合させても良く、結合順序は特に限定されない。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を、あらかじめ上記第1プローブと相補的な配列にすることが好適である。
上記自己集合反応として、第1に、互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブ(本発明では、HCPと称する。)を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。一種類の変異遺伝子を検出する場合、上記一対のHCPの一方が上記第1プローブとして用いることができるように構成することが好ましい。
上記自己集合反応として、第2に、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第1の系と、
No.3及びNo.4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域及び5’側領域の2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第2の系とを有し、該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用できる。上記一対のダイマー形成用プローブ及び上記一対の架橋プローブを、該プローブのいずれか一つ、より好ましくは一対のダイマー形成用プローブの一方が上記第1プローブとして用いることができるように構成することが好適である。
上記プローブの塩基配列を、第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
上記プローブの塩基配列を、第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域、第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
上記ターゲットDNAに一本鎖のDNA又は二本鎖のDNAを用いることができる。上記シグナル増幅方法において、直接ターゲットDNAとして用いられるのは、一本鎖のDNAであるが、二本鎖を解離することにより、二本鎖のDNAも使用することができる。例えば、DNAを鋳型にした遺伝子増幅法(例えば、PCR法やLCR法等)を用いて増幅されたDNAを使用することが可能である。また、標的遺伝子がRNAである場合、RNAを鋳型にした遺伝子増幅法(例えば、RT−PCR法等)を用いて増幅されたDNAを使用することも可能であり、本発明に含まれるものである。
上記DNAチップが、ターゲットDNAを捕捉するための捕捉用プローブを結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やITO電極(indium oxide電極)などを使用することができる。
上記自己集合体に対して、あらかじめ発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識した標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ100を原理的に示す模式図である。
図2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ102を原理的に示す模式図である。
図3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ110を原理的に示す模式図である。
図4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ112を原理的に示す模式図である。
図5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ114を原理的に示す模式図である。
図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ116を原理的に示す模式図である。
図7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ124を原理的に示す模式図である。
図8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ126を原理的に示す模式図である。
図9は、ターゲットDNAの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ200を原理的に示す模式図である。
図10は、ターゲットDNAの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ202を原理的に示す模式図である。
図11は、ターゲットDNAの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ204を原理的に示す模式図である。
図12は、ターゲットDNAの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ206を原理的に示す模式図である。
図13は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ136を原理的に示す模式図である。
図14は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ138を原理的に示す模式図である。
図15は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例におけるステップ146を原理的に示す模式図である。
図16は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例におけるステップ148を原理的に示す模式図である。
図17は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第5の例におけるステップ150を原理的に示す模式図である。
図18は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第5の例におけるステップ152を原理的に示す模式図である。
図19は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第5の例におけるステップ154を原理的に示す模式図である。
図20は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第5の例におけるステップ156を原理的に示す模式図である。
図21は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ160を原理的に示す模式図である。
図22は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ162を原理的に示す模式図である。
図23は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ163を原理的に示す模式図である。
図24は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ164を原理的に示す模式図である。
図25は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ165を原理的に示す模式図である。
図26は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例におけるステップ166を原理的に示す模式図である。
図27は、実施例1の結果を示す写真である。
図28は、実施例2の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。
図1〜図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例を原理的に示す模式図である。第1の例は、ターゲットDNA(10a)の変異部位(11a)が捕捉用プローブ(12a)の末端(13a)と相補している場合を示す。さらに、第1の例は、互いに相補的な3領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ[即ち、一対のHCP;HCP−1(5’−X−Y−Z−3’)(16a)及びHCP−2(5’−X’−Y’−Z’−3’)(18a)]を用いたPALSAR法を利用したシグナル増幅方法であり、該一対のHCP(16a,18a)は、図3に示した如く、あらかじめ蛍光物質(22)で標識されており、HCP−1(16a)はターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、捕捉用プローブ(12a)と隣接してターゲットDNA(10a)にハイブリダイズするように構成されている。
図1に示した如く、支持体(14)上にターゲットDNA(10a)に相補的な領域を有し且つ該ターゲットDNA(10a)の遺伝子変異部位(11a)が末端(13a)に位置する捕捉用プローブ(12a)を結合させ、ターゲットDNA(10a)を加える(ステップ100)。次に図2に示した如く、ターゲットDNA(10a)を捕捉した後(ステップ102)、図3に示した如く、そのターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質(22)で標識された片方のHCP−1(16a)を捕捉用プローブ(12a)と隣り合った形で結合させる(ステップ110)。
ターゲットDNA(10a)の変異部位(11a)と捕捉用プローブ(12a)の末端(13a)とが相補されているため、図4に示した如く、ライゲーション反応により、捕捉用プローブ(12a)とHCP−1(16a)が連結される(ステップ112)。ライゲーション反応後、図5に示すように、ターゲットDNA(10a)を除去する(ステップ114)。図5は、ターゲットDNA(10a)を解離させ、HCP−1(16a)を連結させた捕捉用プローブ(12a)が支持体(14)に結合している状態を示す。
図6に示したごとく、一対のHCP(16a,18a)を加えて、自己集合反応により自己集合体(20a)を形成させ、シグナルを増幅することができる(ステップ116)。
図7及び図8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例を原理的に示す模式図である。第2の例は、一対のHCP(16a,18a)を用いたPALSAR法を利用したシグナル増幅方法であり、且つターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、蛍光物質(22)で標識されていない一対のHCP(16a,18a)を用いる例を示す。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、そのターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる片方のHCP−1(16a)を捕捉用プローブ(12a)と隣り合った形で結合させる。
ライゲーション反応により、捕捉用プローブ(12a)とHCP−1(16a)を連結させた後、ターゲットDNA(10a)を除去する(ステップ120)。一対のHCP(16a,18a)を加えて、自己集合反応により自己集合体(20b)を形成させた後(ステップ122)、図7に示したごとく、形成された自己集合体(20b)に対してインターカレーター(24)を挿入し(ステップ124)、図8に示した如く、シグナルを増幅することができる(ステップ126)。なお、ステップ122とステップ124を同時に行うことも可能である。
図9〜図12は、ターゲットDNA(10b)の変異部位(11b)が捕捉用プローブ(12a)の末端(13a)と相補していない場合の参考例を原理的に示す模式図である。図9に示した如く、ターゲットDNA(10b)を捕捉した後(ステップ200)、図10に示した如く、そのターゲットDNA(10b)と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質(22)で標識された片方のHCP−1(16a)を捕捉用プローブ(12a)と隣り合った形で結合させる(ステップ202)。次に図11に示した如く、ターゲットDNA(10b)の変異部位(11b)と捕捉用プローブ(12a)の末端(13a)とが相補されないため、ライゲーション反応が行われず(ステップ204)、図12のようにターゲットDNA(10b)を解離させると(ステップ206)、捕捉用プローブ(12a)のみ支持体(14)に結合した状態となり、その後、一対のHCP(16a,18a)を加えることにより形成される自己集合体(20a)は、捕捉用プローブ(12a)に結合せず、洗浄等により除去されるため、シグナル増幅は行われない。
図13及び図14は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例を原理的に示す模式図である。第3の例はターゲットDNA(10a)の変異部位(11a)が捕捉用プローブ(12a)の末端(13a)と相補している場合を示す。さらに、第3の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ[ダイマー形成用プローブ−1,2(5’−X−a−b−3’,5’−d−a’−e−3’)(26,28)]及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ[架橋プローブ−1,2(5’−d’−b’−3’,5’−X’−e’−3’)(30,32)]を用いたPALSAR法を利用したシグナル増幅方法であり、あらかじめ蛍光物質(22)で標識された一対のダイマー形成用プローブ(26,28)により形成されたダイマーを用いた場合の例を示す。なお、該ダイマー形成用プローブ−1(26)は、ターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、且つ捕捉用プローブ(12a)と隣接してターゲットDNA(10a)にハイブリダイズするように構成されている。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、そのターゲットDNA(10a)と相補的な領域を持ち、蛍光物質(22)で標識された一対のダイマー形成用プローブ−1,2(26,28)より形成されたダイマーを捕捉用プローブ(12a)と隣り合った形で結合させる(ステップ130)。次に、ライゲーション反応により、捕捉用プローブ(12a)とダイマー形成用プローブ−1(26)を連結し(ステップ132)、ターゲットDNA(10a)を解離させた後(ステップ134)、図13に示した如く、ダイマー形成用プローブ−1,2(26,28)より形成されたダイマー及び架橋プローブ−1,2(30,32)を添加し、上記プローブ(26,28,30及び32)をハイブリダイゼーションさせ(ステップ136)、図14に示した如く、ダイマー形成用プローブ(26,28)と架橋プローブ(30,32)の自己集合反応により自己集合体(20c)を形成させ、シグナル増幅させることができる(ステップ138)。
図15及び図16は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例を原理的に示す模式図である。第4の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ[ダイマー形成用プローブ−1,2(26,28)]及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ(30,32)を用いたPALSAR法を利用したシグナル増幅方法であり、一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマーを用いて、ダイマー形成用プローブ(26,28)及び架橋プローブ(30,32)を標識しない場合の例である。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、そのターゲットDNA(10a)と相補的な領域を有する一対のダイマー形成用プローブ−1,2(26,28)より形成されたダイマーを捕捉用プローブ(12a)と隣り合った形で結合させる(ステップ140)。
ライゲーション反応により、捕捉用ブローブ(12a)とダイマー形成用プローブ−1(26)を連結させた後、ターゲットDNA(10a)を除去する(ステップ142)。一対のダイマー形成用プローブ(26,28)より形成されたダイマー及び一対の架橋プローブ(30,32)を加えて、自己集合反応により自己集合体(20d)を形成させた後(ステップ144)、図15に示したごとく、形成された自己集合体(20d)に対してインターカレーター(24)を挿入し(ステップ146)、図16に示した如く、シグナルを増幅することができる(ステップ148)。なお、ステップ144とステップ146を同時に行うことも可能である。
上記した例では、自己集合体を形成するオリゴヌクレオチド・プローブの一つを第1プローブと同一とした場合の例を示したが、必ずしも同一である必要はなく、第1プローブとオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが結合できるように構成されているプローブを用いることができる。
上記した例では、予め支持体に結合させておいた捕捉用プローブを用いたが、捕捉用プローブと支持体とを結合させる段階は、ターゲットDNAを除去する段階までであればいつでもよく、特に限定されない。例えば、捕捉用プローブとターゲットDNAを結合させた後、捕捉用プローブ、ターゲットDNA、第1プローブが全て結合した後、及びライゲーション反応後等が挙げられる。
図17〜図20は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第5の例を原理的に示す模式図である。第5の例は、同時に複数の変異遺伝子を検出する方法であり、各ターゲットDNA(10e,10f,10g)の相補的配列を先端に持ち、2箇所のHCP領域を含む第1プローブ(34e,34f,34g)と、一対のHCP(16e,18e)を用いる例を示す。第1プローブは標的とする遺伝子の数だけ必要であり、この例では3種類の遺伝子(10e,10f及び10g)の例を示しているため、先端領域の異なる3種類の第1プローブ(34e,34f及び34g)を用いる。第1プローブの先端領域を除く2領域は共通のHCPの配列を有しているため、第1プローブの種類に関わらずHCPは一対のみでシグナルを増幅することができる。
図17に示したごとく支持体(14)上にターゲットDNA−1(10e)に相補的な領域を有し且つ該ターゲットDNAの遺伝子変異部位(11e)が末端(13e)に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる4種の捕捉用プローブ(12e)、ターゲットDNA−2(10f)に相補的な領域を有し且つ該ターゲットDNAの遺伝子変異部位(11f)が末端(13f)に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる4種の捕捉用プローブ(12f)、並びにターゲットDNA−3(10g)に相補的な領域を有し且つ該ターゲットDNAの遣伝子変異部位(11g)が末端(13g)に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる4種の捕捉用プローブ(12g)を別々に結合させる(ステップ150)。なお、図17〜図20において、末端のみ異なる捕捉用プローブ及び該末端はそれぞれ同一符号で示した。次に図18に示した如く、ターゲットDNA(10e,10f及び10g)及び第1プローブ(34e,34f及び34g)を捕捉用プローブ(12e,12f及び12g)に応じて結合させる(ステップ152)。変異部位が相補されていない場合でも末端部分を除き同様に結合するが、この図には末端部分が相補されている場合のみを示した。次に図19に示した如く、ライゲーション反応後ターゲットDNA(10e,10f及び10g)及び未反応プローブを除去する(ステップ154)。
図20に示した如く、一対のHCP(16e,18e)を加え、自己集合体(20e)を形成させシグナルを増幅することができる(ステップ156)。なお、第5の例では、遺伝子変異部位について4塩基全てを分析する場合を示したが、捕捉用プローブ末端の塩基は必要に応じて適宜選択すればよく、特に限定されないものである。
図21〜図26は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第6の例を原理的に示す模式図である。第6の系は、ライゲーション反応を2箇所で行い、第1プローブ(34h)にHCP−1(16h)と捕捉用プローブ(12h)を連結させるという特徴を持つ。HCP−1(16h)、第1プローブ(34h)、捕捉用プローブ(12h)は、お互いに隣接するように設計されている。同時に複数の変異遺伝子を検出する場合、第5の例と同様、第1プローブの先端領域を各ターゲットDNAに相補的にする以外は、第2プローブ、HCP一対とも遺伝子の種類に関わらず共通のオリゴヌクレオチド・プローブを用いることができる。
図21は、第1プローブ(34h)、第2プローブ(36)、ターゲットDNA(10h)及び支持体(14)上に固定された捕捉用プローブ(12h)を示す(ステップ160)。第1プローブ(34h)はターゲットDNA(10h)に相補的な配列を有し且つHCP−1(16h)の配列を1箇所有し、第2プローブ(36)はHCP−2(18h)と同じ配列を2箇所有する。図22に示したごとく、第1プローブ(34h)は第2プローブ(36)とターゲットDNA(10h)の両者とハイブリダイズする(ステップ162)。図23に示した如く、HCP−1(16h)を加えハイブリダイゼーションを行い、HCP−1(16h)と第2プローブ(36)がハイブリダイズすることによりHCP−1(16h)と第1プローブ(34h)が隣接する。この結果、第1プローブ(34h)の両末端がそれぞれ捕捉用プローブ(12h)とHCP−1(16h)に隣接した状態となる(ステップ163)。なお、ステップ162とステップ163は、同時に行うことも可能である。図24、図25に示した如く、捕捉用プローブ(12h)の末端部分(13h)がターゲットDNA(10h)の変異部位(11h)と相補している場合ライゲーション反応後(ステップ164)、ターゲットDNA(10h)、第2プローブ(36)及び未反応プローブを除去することにより、捕捉用プローブ(12h)、第1プローブ(34h)、HCP−1(16h)が1本に連結された状態となる(ステップ165)。図26に示す如く一対のHCP(16h,18h)を加えることにより、自己集合体(20h)が形成され(ステップ166)、シグナルを増幅することができる。
本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド・プローブにあらかじめ検出のための標識物質として、125Iや32P等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光物質やCy3・Cy5等の蛍光物質、4−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、ターゲットDNAを検出することも可能である。
核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、ターゲットDNAを検出することも可能である。図8及び図16に示した如く、インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲットDNAを検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、SYBR Green I stain、SYBR Green II stain、SYBR Green Gold stain、Vista Green stain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、RiboGreen、011Green、Hoechst 33258(Bis−Benzimide)、Propidium Iodide、YO−PRO−1 Iodide、YO−PRO−3 Iodide(以上、Molecular Probe社製)、臭化エチジウム、Distamycin A、TOTO、Psoralen、アクリジニウムオレンジ(Acridine Orange)、AOAO(homodimer)等が使用できる。
上記したオリゴヌクレオチド・プローブを構成する核酸は、通常DNA又はRNAで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸(PNA、例えば、国際公開第92/20702号パンフレット参照。)やLocked Nucleic Acid(LNA、例えば、Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54,3607−3630.、Koshkin AA et al.J.Am,Chem.Soc,1998.120,13252−13253.、及びWahlestedt C et al.PNAS.2000.97,5633−5638.参照。)が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、例えばDNAプローブとRNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はDNA、RNA又は核酸類似体(例えばPNAやLNA等)から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、例えばDNAのみから構成される必要がなく、必要に応じて、例えば、DNAとRNAから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ(キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
本発明における標的遺伝子測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組識液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中の標的遺伝子を公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。
なお、図において、先端鋭角部は3’末端を示し、起端黒丸印は5’末端を示すものである。
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【実施例1】
1.目的
PALSAR法を用いて変異末端部位の塩基の違いによる変異遺伝子の検出を試みた。
2.材料
以下に実施例1で用いたオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を示す。
(1)キャプチャープローブ(捕捉用プローブ)

(2)ターゲット遺伝子−1(Hemochromatosis遺伝子の塩基配列をもとに合成。変異部位(845番目アミノ酸)を下線で示した。)
ターゲット遺伝子−1−T:

ターゲット遺伝子−1−A:

ターゲット遺伝子−1−C:

ターゲット遺伝子−1−G:

(3)第1プローブ

(4)HCP
HCP−1−1:

HCP−1−2:

ハイブリダイゼーション溶液として、[終濃度6×SSC、0.1mg/mLサケの精子DNA、5×デンハルト溶液、0.2%SDS]を調製した。
キャプチャープローブを固定する基盤としてアミノ修飾オリゴDNA固定マイクロアレイ用コートスライドグラス(MATSUNAMI GLASS社製)を用い、スポッターとして、DNAマイクロアレイヤー32ピン型(Greiner bio−one社製)を用いた。
3.方法
3−1.スライドグラスの作製
a)キャプチャープローブのスポッティング
各キャプチャープローブ(100pmol/μL)とスポッティング溶液(MATSUNAMI GLASS社製)を等量混ぜ、4種のプローブ溶液を調製した。得られたプローブ溶液をスライドグラス上にN=4となるようスポットした。異なるプローブ溶液をスポットする際は、滅菌水、及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。スポット後のスライドグラスは、湿潤箱に入れ遮光し、一晩静置した。
b)キャプチャープローブの固定
ブロッキング溶液(MATSUNAMI GLASS社製)1つ、滅菌水2つ、冷メタノール1つをそれぞれ染色バットに用意し、ブロッキング溶液にて20分、各滅菌水にて3分、冷メタノールにて3分、順次、スポッティング後のスライドグラスを浸し、固定後風乾させ、スライドグラスを作成した。
3−2.検出
a)ハイブリダイゼーション反応
4組のハイブリダイゼーション溶液に各ターゲット遺伝子をそれぞれ30pmol(30μL)となるよう添加し、第1プローブ30pmol(30μL)を加えた。95℃、2分にて熱解離させた各溶液25μLを、前記キャプチャープローブを固定したスライドグラス上のチャンバー内にて42℃、2時間反応させ、キャプチャープローブ、ターゲット遺伝子、第1プローブをハイブリダイズさせた。反応後のスライドは、2×SSC+0.1%SDS溶液で2回、1×SSC溶液にて1回、0.2×SSC溶液にて1回洗浄し風乾させた。
b)ライゲーション反応及びアルカリ変性
リガーゼは耐熱性リガーゼ(Tth DNA ligase)を用いた。このリガーゼ添付の緩衝液(buffer)を用いて、液量30μLにリガーゼ(30U)を添加し、この溶液の25μLをチャンバー内にて反応させた。反応条件は、65℃15分とした。
ライゲーション反応後、スライドグラスを0.2×SSC溶液にて軽く洗浄し、0.25M NaOH溶液にて10分間アルカリ処理を行い、未反応プローブ及び余剰プローブを除去した。また、NaOH溶液の中和には0.25M HCl溶液を用いた。変性後のスライドは、2×SSC+0.1%SDS溶液で2回、1×SSC溶液にて1回、0.2×SSC溶液にて1回、洗浄し風乾させた。
c)自己集合体形成反応
ハイブリダイゼーション溶液に、5’末端をそれぞれCy3標識した一対のHCP(HCP−1−1及びHCP−1−2)を終濃度1pmol/μLとなるよう加えた。95℃、2分にて熱解離させたこの溶液25μLを、アルカリ変性後の洗浄風乾させたスライドグラス上のチャンバー内にて68℃、2時間反応させ、自己集合体を形成させた。反応後のスライドは、2×SSC+0.1%SDS溶液で2回、1×SSC溶液にて1回、0.2×SSC溶液にて1回、洗浄し風乾させスライドグラス上のCy3の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図27に示す。
図27に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。
【実施例2】
1.目的
12種類の遺伝子におけるマルチプレックス(multiplex)検出の検討を行った。
2.材料
以下に実施例2で用いたオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を示す。
(1)キャプチャープローブ


(2)第1プローブ
第1プローブ−1b:

第1プローブ−2:

第1プローブ−3:

第1プローブ−4:

第1プローブ−5:

第1プローブ−6:

第1プローブ−7:

第1プローブ−8:

第1プローブ−9:

第1プローブ−10:

第1プローブ−11:

第1プローブ−12:

(3)ターゲット遺伝子
ターゲット遺伝子−3(3’側領域CP−3−Tと相補的):

ターゲット遺伝子−6(3’側領域CP−6−Aと相補的):

ターゲット遺伝子−7(3’側領域CP−7−Gと相補的):

ターゲット遺伝子−9(3’側領域CP−9−Gと相補的):

ターゲット遺伝子−10(3’側領域CP−10−Cと相補的):

ターゲット遺伝子−12(3’側領域CP−12−Tと相補的):

(4)HCP
HCP−2−1:

HCP−2−2:

なお、上記キャプチャープローブ、第1プローブの3’側領域及びターゲット遺伝子は、それぞれ下記の遺伝子の塩基配列をもとに合成したものである。
Hemochromatosis遺伝子:CP−1及び第1プローブ−1(変異部位845番塩基),CP−10、第1プローブ−10及びターゲット遺伝子−10(変異部位187番塩基)、ApolipoproteinE遺伝子:CP−2及び第1プローブ−2(変異部位112番目アミノ酸),CP−3、第1プローブ−3及びターゲット遺伝子−3(変異部位158番目アミノ酸)、ApolipoproteinB100遺伝子:CP−4及び第1プローブ−4、Methylenetetrahydrofolate reductase遺伝子:CP−5及び第1プローブ−5、Medium Chain Acyl−CoenzymeA Dehydrogenase遺伝子:CP−6、第1プローブ−6及びターゲット遺伝子−6、Angiotensinogen遺伝子:CP−7、第1プローブ−7及びターゲット遺伝子−7、p53遺伝子:CP−8及び第1プローブ−8(変異部位47番目アミノ酸),CP−9、第1プローブ−9及びターゲット遺伝子−9(変異部位72番目アミノ酸)、KRAS遺伝子:CP−11及び第1プローブ−11(変異部位12番目アミノ酸)、CP−12及び第1プローブ−12(変異部位61番目アミノ酸)。
ハイブリダイゼーション溶液、スライドグラス及びスポッターは実施例1と同様のものを用いた。
3.方法
3−1.スライドグラスの作製
各キャプチャープローブ(CP100pmol/μL)とスポッティング溶液(MATSUNAMI GLASS社製)を等量混ぜ、24種のプローブ溶液を調製した。このプローブ溶液をスライドグラス上にN=1となるよう12遺伝子分、計24ヶ所スポットした。なお、異なるプローブ液をスポットする際は、滅菌水、及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。スポット後のスライドグラスは、湿潤箱に入れ遮光し、一晩静置した。
その後、実施例1と同様にキャプチャープローブの固定を行い、スライドグラスを作製した。
3−2.検出
ハイブリダイゼーション溶液に、6種類のターゲット遺伝子をそれぞれ30pmol(30μL)ずつ添加し、さらに12種類の第1プローブすべてをそれぞれ30pmol(30μL)ずつ加えた。95℃、2分にて熱解離させたこれらの溶液25μLを、前記キャプチャープローブ24本を固定したスライドグラス上のチャンバー内にて42℃、2時間反応させ、キャプチャープローブ、ターゲット遺伝子、第1プローブをハイブリダイズさせた。反応後のスライドは、2×SSC+0.1%SDS溶液で2回、1×SSC溶液にて1回、0.2×SSC溶液にて1回洗浄し風乾させた。
その後、HCPとしてHCP−2−1及びHCP−2−2を用いた以外は実施例1と同様にして実施例1と同様にして、ライゲーション反応、アルカリ処理及び自己集合体形成反応を行い、スライドグラス上の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図28に示す。
図28に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。
【産業上の利用可能性】
以上述べた如く、本発明によれば、PALSAR法によりDNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにPALSAR法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することができる。
【配列表】























【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
DNAリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、DNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
【請求項2】
捕捉用プローブと第1プローブをターゲットDNAにハイブリダイズさせる第1工程、
ターゲットDNAの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、DNAリガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第1プローブを連結させる第2工程、
前記ターゲットDNAを除去させる第3工程、及び
複数のオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第4工程を有し、
前記捕捉用プローブと前記第1プローブの塩基配列が、前記第1工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記ターゲットDNAの変異部位に位置し且つ該末端と前記第1プローブが隣接する状態でターゲットDNAとアニーリングするように構成されており、
前記複数のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが前記第1プローブと相補的な領域を有することを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
【請求項3】
前記自己集合反応が、互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項1又は2記載のシグナル増幅方法。
【請求項4】
前記自己集合反応が、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第1の系と、
No.3及びNo.4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域及び5’側領域の2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第2の系とを有し、
該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項1又は2記載のシグナル増幅方法。
【請求項5】
前記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項4記載のシグナル増幅方法。
【請求項6】
前記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項4記載のシグナル増幅方法。
【請求項7】
前記ターゲットDNAに一本鎖のDNA又は二本鎖のDNAを用いることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項8】
前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめ前記第1プローブと相補的な配列にすることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項9】
前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項10】
前記支持体が、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項9記載のシグナル増幅方法。
【請求項11】
前記自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項12】
前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項11記載のシグナル増幅方法。
【請求項13】
前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項14】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項15】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項16】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
【請求項17】
前記オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項1〜16のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。

【国際公開番号】WO2004/074480
【国際公開日】平成16年9月2日(2004.9.2)
【発行日】平成18年6月1日(2006.6.1)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−502795(P2005−502795)
【国際出願番号】PCT/JP2004/002007
【国際出願日】平成16年2月20日(2004.2.20)
【出願人】(000000217)エーザイ株式会社 (102)
【Fターム(参考)】