微生物によるコエンザイムＱ１０の製造法
【課題】従来、コエンザイムＱ１０の微生物による発酵を利用する方法では、コエンザイムＱ１０を安価に生産することは困難であった。本発明は、コエンザイムＱ１０を安価で効率的に製造するために、コエンザイムＱ１０生産微生物の、細胞中のコエンザイムＱ１０含有量をさらに増大させる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法である。
【解決手段】コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用するコエンザイムＱ１０の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＱ１０は、人の生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成因子であり、酸化的リン酸化反応における電子の運搬子として働くことによりＡＴＰの生成に関与している。従来から、コエンザイムＱ１０は、各種疾病に対して優れた薬理及び生理効果を示す物質として、医薬品以外にも栄養補助食品や化粧品に使用される等、幅広い用途で用いられている。
【０００３】
コエンザイムＱ１０の製法としては、化学合成法が考えられるが、その合成プロセスは煩雑・危険で、コスト高と予想される。また、化学合成法の場合は、安全性が懸念される（Ｚ）−異性体の副生・混入を最小化する必要もある（非特許文献１）。たとえば、ヨーロッパ局方においては、酸化型のコエンザイムＱ１０中の（Ｚ）−異性体の含有量は０．１％以下でなければならないと規定されている。
【０００４】
コエンザイムＱ１０の別の製法として、微生物による発酵を利用する方法、すなわち、コエンザイムＱ１０生産微生物を培養し、生産されたコエンザイムＱ１０を採取する方法が報告されているが、いずれも細胞中のコエンザイムＱ１０含有量が低いために、コエンザイムＱ１０を安価に生産することは困難であった。特許文献１には、コエンザイムＱ１０生産微生物を、特定のポリエーテル系非イオン界面活性剤の存在下で培養する方法が開示されているが、この界面活性剤は、高価であるため、この方法ではコストがかかり、生産性向上のメリットがあまりない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−５９１９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】バイオメディカル アンド クリニカル アスペクト オブ コエンザイムＱ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ）、３巻、１９項−３０項、１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のとおり、コエンザイムＱ１０のより効率的な製造方法が求められていた。本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物の、細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、コエンザイムＱ１０を生産することができる微生物を、特定のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することにより、細胞中のコエンザイムＱ１０を顕著に増加させることができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安価かつ簡便な方法で、コエンザイムＱ１０生産微生物の細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を、顕著に増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のコエンザイムＱ１０の製造法では、コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とする。
【００１２】
本発明で用いられるコエンザイムＱ１０生産微生物としては、コエンザイムＱ１０を生産することが出来る微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができるが、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物を用いるのが良い。なおここでいう生産能力は、従来公知の一般的な培養法における生産能力を意味し特に限定されないが、例えば後述する実施例でのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル無添加の条件で培養した場合の生産能力である。そのようなコエンザイムＱ１０生産微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロモナス（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ）属、アシドフィラス（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、ブレロミセス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属、ブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、キオノスファエラ（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、セリノステルス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ）属、エキソフィアラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ）属、エキソバシジウム（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、フィロミセス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、フィロバシジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、グラフィオラ（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、コッコバエラ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ）属、クルツマノミセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ララリア（Ｌａｌａｒｉａ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、レギオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、オースポリジウム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ペトロミセス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、リゾモナス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）属、ロドビウム（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ）属、ロドプラネス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、スポトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、シンポジオミコプシス（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、ステリグマトスポリジウム（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、タファリナ（Ｔａｐｈａｒｉｎａ）属、トレメラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、チレチアリア（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ）属、チレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）属、トリポスポリウム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チレチオプシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ）属、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、ウデニオミセス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅ）属、キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、キサントバクテリウム（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ハイホモナス（Ｈｙｈｏｍｏｎｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等の微生物を挙げることができる。
【００１３】
培養の容易さや生産性の観点からは、細菌（好ましくは非光合成細菌）及び酵母が好ましく、例えば、細菌ではアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属等が挙げられる。好ましい種としては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＩＦＯ１３２６３）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ４７１８）、アスペルギルス・クラバータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ ＪＣＭ１７１８）、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ１５２３７）、アミノバクター・アガノウエンシス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｇａｎｏｕｅｎｓｉｓ ＪＣＭ７８５４）、アグロモナス・オリゴトロフィカ（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＪＣＭ１４９４）、アシドフィラス・ムルチボルム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ ＪＣＭ８８６７）、ブレロミセス・アルバス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ ＩＦＯ１１９２）、ブレラ・アルメニカ（Ｂｕｌｌｅｒａ ａｒｍｅｎｉａｃａ ＩＦＯ１０１１２）、ブレブンジモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ２７８８）、クリプトコッカス・ラウレンティー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ ＩＦＯ０６０９）、キオノスファエラ・アポバシジアリス（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ ａｐｏｂａｓｉｄｉａｌｉｓ ＣＢＳ７４３０）、カンジタ・クルバータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｕｒｖａｔａ ＡＴＣＣ１０５６７）、セリノステルス・ルテオアルバス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ ｌｕｔｅｏａｌｂｕｓ ＪＣＭ２９２３）、エキソフィアラ・アルカロフィラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ１２５１９）、エキソバシジウム・グラシル（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｇｒａｃｉｌｅ ＩＦＯ７７８８）、フィロミセス・フゾエンシス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｚｈｏｕｅｎｓｉｓ ＩＦＯ１０３７４）、フィロバシジエラ・ネオフォルマス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ＣＢＳ１３２）、フィロバシジウム・カプスロイゲヌム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｃａｐｓｕｌｏｉｇｅｎｕｍ ＣＢＳ１９０６）、ゲオトリカム ・カピタウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｉｔａｔｕｍ ＪＣＭ６２５８）、グラフィオラ・シリンドリカム（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ ＩＦＯ６４２６）、グルコノバクター・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＩＦＯ３２５７）、コッコバエラ・イムペラタエ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｉｍｐｅｒａｔａｅ ＪＣＭ７８２６）、クルツマノミセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ ＩＦＯ１０１１８）、ララリア・セラシ（Ｌａｌａｒｉａ ｃｅｒａｓｉ ＣＢＳ２７５．２８）、ロイコスポリジウム・スコティー（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ ＩＦＯ１２１２）、レギオネラ・アニーサ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ ＪＣＭ７５７３）、メチロバクテリウム・エキトルグエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｇｕｅｎｓ ＪＣＭ２８０２）、ミコプラナ・ラモーサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｒａｍｏｓａ ＪＣＭ７８２２）、オースポリジウム・マルガリチフェルム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒｕｍ ＣＢＳ２５３１）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＩＡＭ １２０２３）、シュードモナス・シルキリエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ ＩＡＭ １０９２）、シュドジマ・アフィジス（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ ＣＢＳ５１７．２３）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＪＣＭ６８９２）、ペトロミセス・アリアセウス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｉａｃｅｕｓ ＩＦＯ７５３８）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ＩＦＯ１１２５）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ０３８７）、ロドスポリジウム・ジオボバツム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ ＡＴＣＣ１８３０）、リゾモナス・スベリファシエンス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｅｒｉｆａｃｉｅｎｓ ＩＦＯ１５２１２）、ロドビウム・オリエンツ（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ ｏｒｉｅｎｔｓ ＪＣＭ９３３７）、ロドプラネス・エレガンス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＪＣＭ９２２４）、ロドシュードモナス・パルトリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＪＣＭ２５２４）、ロドバクター・カプスレータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ１００３）、スポロボロミセス・ホルサティカス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｈｏｌｓａｔｉｃｕｓ ＩＦＯ１０３４）、スポロボロミセス・パラロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ ＩＦＯ０４７１）、スポリジオボラス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＩＦＯ１８４０）、サイトエラ・コンプリカタ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ１０７４８）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＩＦＯ０３４７）、スフィンゴモナス・パラパウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＩＦＯ１５１００）、スポトリクム・セルロフィリウム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｉｕｍ ＡＴＣＣ２０４９３）、シンポジオミコプシス・パフィオペジリ（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｉ ＪＣＭ８３１８）、ステリグマトスポリジウム・ポリモルファ（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ ＩＦＯ１０１２１）、スフィンゴモナス・アドヘシバ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈｅｓｉｖａ ＪＣＭ７３７０）、タファリナ・カエルレスセンス（Ｔａｐｈａｒｉｎａ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ ＣＢＳ３５１．３５）、トレメラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ ＡＴＣＣ２４４３８）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ１１９８）、チレチアリア・アノマラ（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ ａｎｏｍａｌａ ＣＢＳ４３６．７２）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｉｅｓ ＪＣＭ１７６１）、トリポスポリウム・ブラタム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍｂｕｌｌａｔｕｍ ＪＣＭ２００６）、チレチオプシス・ワシントネシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｎｔｏｎｅｓｉｓ ＣＢＳ５４４）、ウスチラゴ・エスクレンタ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ＩＦＯ９８８７）、ウデニオミセス・メガロスポラス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ ｍｅｇａｌｏｓｐｏｒｕｓ ＪＣＭ５２６９）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ ＩＦＯ１０１２９）、キサントバクテリウム・フラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ ＪＣＭ１２０４）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ ＡＴＣＣ１０１１４）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＡＴＣＣ１１５５０）、ハイホモナス・ヒシアナ（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｈｉｒｓｃｈｉａｎａ ＡＴＣＣ３３８８６）、リゾビウム・メロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＡＴＣＣ９９３０）等が挙げられる。
【００１４】
本発明では、コエンザイムＱ１０生産微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物のコエンザイムＱ１０生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した微生物も好ましく使用することができる。遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良する手段としては、遺伝子組換え（自己遺伝子の改良、増幅、破壊や、外来遺伝子の導入及び該遺伝子の改良、増幅を含む）や、変異源による変異誘発が挙げられるが、変異源による変異誘発が好ましい。
【００１５】
変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、各変異誘発段階によりコエンザイムＱ１０を生産する能力が改良されうることから、２回以上の変異誘発を行うのが好ましい。変異誘発処理にかけられる微生物細胞の候補としては、通常は、前記増殖方法並びに測定方法により評価した場合にできるだけ高いコエンザイムＱ１０生産能力を有するものが好ましいことは言うまでもない。例えばこのような変異誘発を行った場合、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、上述した範囲のみならず、より好ましくは１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物をも用いることが出来る。
【００１６】
変異誘発処理は、任意の適当な変異源を用いて行うことができる。「変異源」なる語は、広義の意味において、例えば変異誘発効果を有する薬剤のみならず、ＵＶ照射のような変異誘発効果を有する処理も含む。適当な変異源の例として、エチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き、より高いコエンザイムＱ１０生産能力を有する微生物細胞の適切な選択を行うことができる。
【００１７】
本発明において、生産されるコエンザイムＱ１０の形態としては、酸化型あるいは還元型のどちらでも良く、その混合物でも良い。
【００１８】
本発明で用いられるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビトールのエチレンオキシド付加物に、炭素数が１４〜１８の脂肪酸がエステル結合したものであれば特に限定されない。また、該脂肪酸としては、脂肪酸部分の炭素数は１４〜１８であれば特に限定されないが、その炭素数は１４、１６または１８が好ましく、１４または１８がより好ましい。該脂肪酸としては、不飽和あるいは飽和のいずれでもよく限定されない。本発明で使用されるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０）またはポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ６０）であり、より好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステルまたはポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルである。
【００１９】
本発明で用いられる培地は、微生物の増殖に適した多量栄養素や微量栄養素を含む一般的な培地が使用できる。上記栄養素としては、例えば、炭素源（例えば、グルコース、シュークロース、マルトース、デンプン、コーンシロップ、糖蜜等の炭水化物；メタノール、エタノール等のアルコール等）、窒素源（例えば、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、尿素、ペプトン等）、リン源（例えば、リン酸アンモニウム、リン酸等）、並びに、微量栄養素（例えば、マグネシウム、カリウム、亜鉛、銅、鉄、マンガン、モリブデン、硫酸、塩酸等のミネラル；ビオチン、デスチオビオチン、ビタミンＢ１等のビタミン類；アラニン、ヒスチジン等のアミノ酸；酵母エキスやマルトエキスのビタミン類を含有する天然原料等）からなるが、これらに制限されるものではない。なお、酵母エキス等の天然培地成分中には、リン酸塩等のリン源も含まれる。また、上記の栄養素は、適宜、組み合わせて用いられる。
【００２０】
上記培地に、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを添加する場合の、培地に対するその添加濃度は特に限定されないが、好ましくは、０．００５〜０．０３重量％、より好ましくは、０．０１〜０．０３重量％、さらに好ましくは、０．０１５〜０．０３重量％である。０．００５重量％未満では、その添加効果が十分に発揮されないことがあり、０．０３重量％を超える濃度では、微生物の生存が傷害されることがある。
【００２１】
脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの添加方法としては、初発仕込み培地に添加しても良いし、連続的に供給しても良いし、培養途中に添加しても良いが、初発仕込み培地に添加するのが好ましい。
【００２２】
培養時の温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃である。１５℃未満では、工業生産のために許容されるには微生物の増殖速度が低くなる傾向があり、４５℃を越える高温では、微生物の生存が傷害され易い傾向にある。
【００２３】
培養時のｐＨは、通常４〜９、好ましくは５〜８である。ｐＨ３以下及び、ｐＨ１０以上では、いずれも微生物の増殖が阻害され易い傾向がある。
【００２４】
工業規模での発酵生産においては、微生物の種類にもよるが、培養中、炭素源（生成したアルコールも含む）の濃度を、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度に制御するのが好ましい。よって、培養液中の炭素源の濃度が、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度、つまり、通常２０ｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２ｇ／Ｌ以下となるように、培養を制御するのが好ましい。
【００２５】
炭素源の濃度制御のためには、流加培養法を採用するのが好ましい。ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）或いは残糖濃度等の培養管理指標に基づき、栄養源（特に炭素源）の供給を調節することにより、培養液中の炭素源濃度を制御することができる。栄養源の供給は、微生物の種類にもよるが、培養の当初から開始しても良いし、培養途中から開始してもよい。
【００２６】
栄養源の供給は、連続的であっても良いし、断続的であってもよい。なお、栄養源の供給にあたっては、上記炭素源を他の成分から分離して、別に培地に供給するのが好ましい。
【００２７】
培養は、所望のコエンザイムＱ１０の生産量に達した時点で終了することができる。培養時間は特に制限されないが、好ましくは、２０〜２００時間であり、特に好ましくは、６０〜１００時間である。
【００２８】
上記の培養は、通常、好気的に行われる。ここで、「好気的」なる語は、培養中に酸素の制限（酸素の欠乏）が生じないように酸素の供給が行われることを意味し、好ましくは、培養中に酸素の制限が実質的に生じないように酸素の供給が充分に行われることを意味する。培養は、通常は通気下、好ましくは通気攪拌下に行われる。
【００２９】
本発明では、コエンザイムＱ１０生産微生物を用いて、上記のようにして、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを添加した培地で培養することで、培地当たり１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３μｇ／ｍＬ以上という高い値で、コエンザイムＱ１０を生産することができる。
【００３０】
次に、上記培養により生産されたコエンザイムＱ１０の回収について説明する。コエンザイムＱ１０の回収は、公知の方法にて行うことができる。例えば、上記培養で得られた微生物細胞からの有機溶剤を用いる抽出が一般的である。
【００３１】
抽出に用いる有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００３２】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００３３】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等である。
一般に、ヘプタン類、ヘプタンはもちろん、炭素数７を有するメチルシクロヘキサン等の異種ヘプタンやそれらの複数混合物が好ましく用いられる。さらに好ましくは、炭素数５のペンタン類（例えば、ペンタン等）、炭素数６のヘキサン類（例えば、ヘキサン、シクロヘキサン等）、炭素数７のヘプタン類（例えば、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等）等である。特に好ましくは、上記酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘキサン類（例えば、ヘキサン、シクロヘキサン等）またはヘプタン類（例えば、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等）等であり、最も好ましくはヘキサンまたはヘプタンである。
【００３４】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００３５】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００３６】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００３７】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００３８】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００３９】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００４０】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００４１】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００４２】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００４３】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００４４】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００４５】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロナセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００４６】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００４７】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００４８】
上記有機溶剤の中でも、沸点、粘性等の性質（例えば、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の行いやすい沸点（１気圧下、約３０〜１５０℃）、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくい融点（約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下）を持ち、粘性が低い（２０℃において約１０ｃｐ以下等））を考慮して選定するのが好ましい。
【００４９】
上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の湿菌体や乾燥菌体から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、親水性有機溶剤を用いるのが好ましい。具体的には、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等を挙げることができる。
【００５０】
また、上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、疎水性有機溶剤を用いるのが好ましく、これは微生物由来の水溶性物質の除去を助成する。また、疎水性有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類が好ましい。
【００５１】
上記の親水性有機溶剤と疎水性有機溶剤の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、全溶液の容量に対して、好ましくは親水性有機溶剤が５〜５０容量％、疎水性有機溶剤が２５〜６５容量％の範囲である。両者は混合して使用しても良い。コエンザイムＱ１０の回収において、抽出時の温度は、特に制限さない。
【００５２】
このようにして得られたコエンザイムＱ１０を含有する抽出液を、所望によりカラムクロマトグラフィー、還元処理等により精製した後、晶析操作を用いて、高純度のコエンザイムＱ１０結晶を取得することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例をあげて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
コエンザイムＱ１０生産微生物ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ１１２５株を、５リットル容培養器を用いて、２５００ｍＬの培地（硫酸カリウム０．３３重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１５３重量％、塩化ナトリウム０．０１７重量％、硫酸亜鉛七水和物０．０１７重量％、硫酸マンガン五水和物０．００１６８重量％、ビタミンＢ１硝酸塩０．０００２７８重量％、リン酸０．２２５重量％、硫酸鉄（II）七水和物０．０１０５重量％、硫酸銅(II)五水和物０．０００５４重量％、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル(Ｔｗｅｅｎ４０) ０．０２重量％、グルコース７．５重量％、ｐＨ４．９）中で２０時間培養し、２０時間目以降から、培養液濃度が０．３６重量％となるようにエタノールを添加しながら、９５時間通気撹拌培養した。得られた培養液に抽出溶媒（メタノール／クロロホルム＝３／１）を添加し、３０分間激しく振とうしてコエンザイムＱ１０の抽出を行った。得られた溶媒相を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、コエンザイムＱ１０生産量を調べた。比較例として、Ｔｗｅｅｎ４０を無添加とした条件で同様に実施した。その結果を表１に示す。
【００５５】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ４．６×２５０ｍｍ
移動相：メタノール／ヘキサン＝８５／１５
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２７５ｎｍ
【００５６】
【表１】
【実施例２】
【００５７】
コエンザイムＱ１０生産微生物サイトエラ・コンプリカタ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ）ＩＦＯ １０７４８株を、５リットル容培養器を用いて、２５００ｍＬの培地（硫酸カリウム０．３３重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１５３重量％、塩化ナトリウム０．０１７重量％、硫酸亜鉛七水和物０．０１７重量％、硫酸マンガン五水和物０．００１６８重量％、ビタミンＢ１硝酸塩０．０００２７８重量％、リン酸０．２２５重量％、硫酸鉄（II）七水和物０．０１０５重量％、硫酸銅(II)五水和物０．０００５４重量％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０）０．０２重量％、グルコース７．５重量％、ｐＨ４．９）中で２０時間培養し、２０時間目以降から、培養液濃度が０．３６重量％となるようにエタノールを添加しながら、９５時間通気撹拌培養した。得られた培養液に抽出溶媒（メタノール／クロロホルム＝３／１）を添加し、３０分間激しく振とうしてコエンザイムＱ１０の抽出を行った。得られた溶媒相を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、コエンザイムＱ１０生産量を調べた。比較例として、Ｔｗｅｅｎ８０を無添加とした条件と、Ｔｗｅｅｎ８０の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０）を添加した条件でも、同様にそれぞれ実施した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用するコエンザイムＱ１０の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＱ１０は、人の生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成因子であり、酸化的リン酸化反応における電子の運搬子として働くことによりＡＴＰの生成に関与している。従来から、コエンザイムＱ１０は、各種疾病に対して優れた薬理及び生理効果を示す物質として、医薬品以外にも栄養補助食品や化粧品に使用される等、幅広い用途で用いられている。
【０００３】
コエンザイムＱ１０の製法としては、化学合成法が考えられるが、その合成プロセスは煩雑・危険で、コスト高と予想される。また、化学合成法の場合は、安全性が懸念される（Ｚ）−異性体の副生・混入を最小化する必要もある（非特許文献１）。たとえば、ヨーロッパ局方においては、酸化型のコエンザイムＱ１０中の（Ｚ）−異性体の含有量は０．１％以下でなければならないと規定されている。
【０００４】
コエンザイムＱ１０の別の製法として、微生物による発酵を利用する方法、すなわち、コエンザイムＱ１０生産微生物を培養し、生産されたコエンザイムＱ１０を採取する方法が報告されているが、いずれも細胞中のコエンザイムＱ１０含有量が低いために、コエンザイムＱ１０を安価に生産することは困難であった。特許文献１には、コエンザイムＱ１０生産微生物を、特定のポリエーテル系非イオン界面活性剤の存在下で培養する方法が開示されているが、この界面活性剤は、高価であるため、この方法ではコストがかかり、生産性向上のメリットがあまりない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−５９１９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】バイオメディカル アンド クリニカル アスペクト オブ コエンザイムＱ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ）、３巻、１９項−３０項、１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のとおり、コエンザイムＱ１０のより効率的な製造方法が求められていた。本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物の、細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、コエンザイムＱ１０を生産することができる微生物を、特定のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することにより、細胞中のコエンザイムＱ１０を顕著に増加させることができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安価かつ簡便な方法で、コエンザイムＱ１０生産微生物の細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を、顕著に増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のコエンザイムＱ１０の製造法では、コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とする。
【００１２】
本発明で用いられるコエンザイムＱ１０生産微生物としては、コエンザイムＱ１０を生産することが出来る微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができるが、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物を用いるのが良い。なおここでいう生産能力は、従来公知の一般的な培養法における生産能力を意味し特に限定されないが、例えば後述する実施例でのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル無添加の条件で培養した場合の生産能力である。そのようなコエンザイムＱ１０生産微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロモナス（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ）属、アシドフィラス（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、ブレロミセス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属、ブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、キオノスファエラ（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、セリノステルス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ）属、エキソフィアラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ）属、エキソバシジウム（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、フィロミセス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、フィロバシジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、グラフィオラ（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、コッコバエラ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ）属、クルツマノミセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ララリア（Ｌａｌａｒｉａ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、レギオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、オースポリジウム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ペトロミセス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、リゾモナス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）属、ロドビウム（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ）属、ロドプラネス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、スポトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、シンポジオミコプシス（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、ステリグマトスポリジウム（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、タファリナ（Ｔａｐｈａｒｉｎａ）属、トレメラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、チレチアリア（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ）属、チレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）属、トリポスポリウム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チレチオプシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ）属、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、ウデニオミセス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅ）属、キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、キサントバクテリウム（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ハイホモナス（Ｈｙｈｏｍｏｎｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等の微生物を挙げることができる。
【００１３】
培養の容易さや生産性の観点からは、細菌（好ましくは非光合成細菌）及び酵母が好ましく、例えば、細菌ではアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属等が挙げられる。好ましい種としては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＩＦＯ１３２６３）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ４７１８）、アスペルギルス・クラバータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ ＪＣＭ１７１８）、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ１５２３７）、アミノバクター・アガノウエンシス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｇａｎｏｕｅｎｓｉｓ ＪＣＭ７８５４）、アグロモナス・オリゴトロフィカ（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＪＣＭ１４９４）、アシドフィラス・ムルチボルム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ ＪＣＭ８８６７）、ブレロミセス・アルバス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ ＩＦＯ１１９２）、ブレラ・アルメニカ（Ｂｕｌｌｅｒａ ａｒｍｅｎｉａｃａ ＩＦＯ１０１１２）、ブレブンジモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ２７８８）、クリプトコッカス・ラウレンティー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ ＩＦＯ０６０９）、キオノスファエラ・アポバシジアリス（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ ａｐｏｂａｓｉｄｉａｌｉｓ ＣＢＳ７４３０）、カンジタ・クルバータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｕｒｖａｔａ ＡＴＣＣ１０５６７）、セリノステルス・ルテオアルバス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ ｌｕｔｅｏａｌｂｕｓ ＪＣＭ２９２３）、エキソフィアラ・アルカロフィラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ１２５１９）、エキソバシジウム・グラシル（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｇｒａｃｉｌｅ ＩＦＯ７７８８）、フィロミセス・フゾエンシス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｚｈｏｕｅｎｓｉｓ ＩＦＯ１０３７４）、フィロバシジエラ・ネオフォルマス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ＣＢＳ１３２）、フィロバシジウム・カプスロイゲヌム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｃａｐｓｕｌｏｉｇｅｎｕｍ ＣＢＳ１９０６）、ゲオトリカム ・カピタウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｉｔａｔｕｍ ＪＣＭ６２５８）、グラフィオラ・シリンドリカム（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ ＩＦＯ６４２６）、グルコノバクター・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＩＦＯ３２５７）、コッコバエラ・イムペラタエ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｉｍｐｅｒａｔａｅ ＪＣＭ７８２６）、クルツマノミセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ ＩＦＯ１０１１８）、ララリア・セラシ（Ｌａｌａｒｉａ ｃｅｒａｓｉ ＣＢＳ２７５．２８）、ロイコスポリジウム・スコティー（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ ＩＦＯ１２１２）、レギオネラ・アニーサ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ ＪＣＭ７５７３）、メチロバクテリウム・エキトルグエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｇｕｅｎｓ ＪＣＭ２８０２）、ミコプラナ・ラモーサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｒａｍｏｓａ ＪＣＭ７８２２）、オースポリジウム・マルガリチフェルム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒｕｍ ＣＢＳ２５３１）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＩＡＭ １２０２３）、シュードモナス・シルキリエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ ＩＡＭ １０９２）、シュドジマ・アフィジス（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ ＣＢＳ５１７．２３）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＪＣＭ６８９２）、ペトロミセス・アリアセウス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｉａｃｅｕｓ ＩＦＯ７５３８）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ＩＦＯ１１２５）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ０３８７）、ロドスポリジウム・ジオボバツム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ ＡＴＣＣ１８３０）、リゾモナス・スベリファシエンス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｅｒｉｆａｃｉｅｎｓ ＩＦＯ１５２１２）、ロドビウム・オリエンツ（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ ｏｒｉｅｎｔｓ ＪＣＭ９３３７）、ロドプラネス・エレガンス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＪＣＭ９２２４）、ロドシュードモナス・パルトリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＪＣＭ２５２４）、ロドバクター・カプスレータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ１００３）、スポロボロミセス・ホルサティカス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｈｏｌｓａｔｉｃｕｓ ＩＦＯ１０３４）、スポロボロミセス・パラロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ ＩＦＯ０４７１）、スポリジオボラス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＩＦＯ１８４０）、サイトエラ・コンプリカタ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ１０７４８）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＩＦＯ０３４７）、スフィンゴモナス・パラパウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＩＦＯ１５１００）、スポトリクム・セルロフィリウム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｉｕｍ ＡＴＣＣ２０４９３）、シンポジオミコプシス・パフィオペジリ（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｉ ＪＣＭ８３１８）、ステリグマトスポリジウム・ポリモルファ（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ ＩＦＯ１０１２１）、スフィンゴモナス・アドヘシバ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈｅｓｉｖａ ＪＣＭ７３７０）、タファリナ・カエルレスセンス（Ｔａｐｈａｒｉｎａ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ ＣＢＳ３５１．３５）、トレメラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ ＡＴＣＣ２４４３８）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ１１９８）、チレチアリア・アノマラ（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ ａｎｏｍａｌａ ＣＢＳ４３６．７２）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｉｅｓ ＪＣＭ１７６１）、トリポスポリウム・ブラタム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍｂｕｌｌａｔｕｍ ＪＣＭ２００６）、チレチオプシス・ワシントネシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｎｔｏｎｅｓｉｓ ＣＢＳ５４４）、ウスチラゴ・エスクレンタ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ＩＦＯ９８８７）、ウデニオミセス・メガロスポラス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ ｍｅｇａｌｏｓｐｏｒｕｓ ＪＣＭ５２６９）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ ＩＦＯ１０１２９）、キサントバクテリウム・フラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ ＪＣＭ１２０４）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ ＡＴＣＣ１０１１４）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＡＴＣＣ１１５５０）、ハイホモナス・ヒシアナ（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｈｉｒｓｃｈｉａｎａ ＡＴＣＣ３３８８６）、リゾビウム・メロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＡＴＣＣ９９３０）等が挙げられる。
【００１４】
本発明では、コエンザイムＱ１０生産微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物のコエンザイムＱ１０生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した微生物も好ましく使用することができる。遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良する手段としては、遺伝子組換え（自己遺伝子の改良、増幅、破壊や、外来遺伝子の導入及び該遺伝子の改良、増幅を含む）や、変異源による変異誘発が挙げられるが、変異源による変異誘発が好ましい。
【００１５】
変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、各変異誘発段階によりコエンザイムＱ１０を生産する能力が改良されうることから、２回以上の変異誘発を行うのが好ましい。変異誘発処理にかけられる微生物細胞の候補としては、通常は、前記増殖方法並びに測定方法により評価した場合にできるだけ高いコエンザイムＱ１０生産能力を有するものが好ましいことは言うまでもない。例えばこのような変異誘発を行った場合、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、上述した範囲のみならず、より好ましくは１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物をも用いることが出来る。
【００１６】
変異誘発処理は、任意の適当な変異源を用いて行うことができる。「変異源」なる語は、広義の意味において、例えば変異誘発効果を有する薬剤のみならず、ＵＶ照射のような変異誘発効果を有する処理も含む。適当な変異源の例として、エチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き、より高いコエンザイムＱ１０生産能力を有する微生物細胞の適切な選択を行うことができる。
【００１７】
本発明において、生産されるコエンザイムＱ１０の形態としては、酸化型あるいは還元型のどちらでも良く、その混合物でも良い。
【００１８】
本発明で用いられるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビトールのエチレンオキシド付加物に、炭素数が１４〜１８の脂肪酸がエステル結合したものであれば特に限定されない。また、該脂肪酸としては、脂肪酸部分の炭素数は１４〜１８であれば特に限定されないが、その炭素数は１４、１６または１８が好ましく、１４または１８がより好ましい。該脂肪酸としては、不飽和あるいは飽和のいずれでもよく限定されない。本発明で使用されるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０）またはポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ６０）であり、より好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステルまたはポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルである。
【００１９】
本発明で用いられる培地は、微生物の増殖に適した多量栄養素や微量栄養素を含む一般的な培地が使用できる。上記栄養素としては、例えば、炭素源（例えば、グルコース、シュークロース、マルトース、デンプン、コーンシロップ、糖蜜等の炭水化物；メタノール、エタノール等のアルコール等）、窒素源（例えば、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、尿素、ペプトン等）、リン源（例えば、リン酸アンモニウム、リン酸等）、並びに、微量栄養素（例えば、マグネシウム、カリウム、亜鉛、銅、鉄、マンガン、モリブデン、硫酸、塩酸等のミネラル；ビオチン、デスチオビオチン、ビタミンＢ１等のビタミン類；アラニン、ヒスチジン等のアミノ酸；酵母エキスやマルトエキスのビタミン類を含有する天然原料等）からなるが、これらに制限されるものではない。なお、酵母エキス等の天然培地成分中には、リン酸塩等のリン源も含まれる。また、上記の栄養素は、適宜、組み合わせて用いられる。
【００２０】
上記培地に、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを添加する場合の、培地に対するその添加濃度は特に限定されないが、好ましくは、０．００５〜０．０３重量％、より好ましくは、０．０１〜０．０３重量％、さらに好ましくは、０．０１５〜０．０３重量％である。０．００５重量％未満では、その添加効果が十分に発揮されないことがあり、０．０３重量％を超える濃度では、微生物の生存が傷害されることがある。
【００２１】
脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの添加方法としては、初発仕込み培地に添加しても良いし、連続的に供給しても良いし、培養途中に添加しても良いが、初発仕込み培地に添加するのが好ましい。
【００２２】
培養時の温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃である。１５℃未満では、工業生産のために許容されるには微生物の増殖速度が低くなる傾向があり、４５℃を越える高温では、微生物の生存が傷害され易い傾向にある。
【００２３】
培養時のｐＨは、通常４〜９、好ましくは５〜８である。ｐＨ３以下及び、ｐＨ１０以上では、いずれも微生物の増殖が阻害され易い傾向がある。
【００２４】
工業規模での発酵生産においては、微生物の種類にもよるが、培養中、炭素源（生成したアルコールも含む）の濃度を、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度に制御するのが好ましい。よって、培養液中の炭素源の濃度が、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度、つまり、通常２０ｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２ｇ／Ｌ以下となるように、培養を制御するのが好ましい。
【００２５】
炭素源の濃度制御のためには、流加培養法を採用するのが好ましい。ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）或いは残糖濃度等の培養管理指標に基づき、栄養源（特に炭素源）の供給を調節することにより、培養液中の炭素源濃度を制御することができる。栄養源の供給は、微生物の種類にもよるが、培養の当初から開始しても良いし、培養途中から開始してもよい。
【００２６】
栄養源の供給は、連続的であっても良いし、断続的であってもよい。なお、栄養源の供給にあたっては、上記炭素源を他の成分から分離して、別に培地に供給するのが好ましい。
【００２７】
培養は、所望のコエンザイムＱ１０の生産量に達した時点で終了することができる。培養時間は特に制限されないが、好ましくは、２０〜２００時間であり、特に好ましくは、６０〜１００時間である。
【００２８】
上記の培養は、通常、好気的に行われる。ここで、「好気的」なる語は、培養中に酸素の制限（酸素の欠乏）が生じないように酸素の供給が行われることを意味し、好ましくは、培養中に酸素の制限が実質的に生じないように酸素の供給が充分に行われることを意味する。培養は、通常は通気下、好ましくは通気攪拌下に行われる。
【００２９】
本発明では、コエンザイムＱ１０生産微生物を用いて、上記のようにして、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを添加した培地で培養することで、培地当たり１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３μｇ／ｍＬ以上という高い値で、コエンザイムＱ１０を生産することができる。
【００３０】
次に、上記培養により生産されたコエンザイムＱ１０の回収について説明する。コエンザイムＱ１０の回収は、公知の方法にて行うことができる。例えば、上記培養で得られた微生物細胞からの有機溶剤を用いる抽出が一般的である。
【００３１】
抽出に用いる有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００３２】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００３３】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等である。
一般に、ヘプタン類、ヘプタンはもちろん、炭素数７を有するメチルシクロヘキサン等の異種ヘプタンやそれらの複数混合物が好ましく用いられる。さらに好ましくは、炭素数５のペンタン類（例えば、ペンタン等）、炭素数６のヘキサン類（例えば、ヘキサン、シクロヘキサン等）、炭素数７のヘプタン類（例えば、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等）等である。特に好ましくは、上記酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘキサン類（例えば、ヘキサン、シクロヘキサン等）またはヘプタン類（例えば、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等）等であり、最も好ましくはヘキサンまたはヘプタンである。
【００３４】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００３５】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００３６】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００３７】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００３８】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００３９】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００４０】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００４１】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００４２】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００４３】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００４４】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００４５】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロナセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００４６】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００４７】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００４８】
上記有機溶剤の中でも、沸点、粘性等の性質（例えば、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の行いやすい沸点（１気圧下、約３０〜１５０℃）、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくい融点（約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下）を持ち、粘性が低い（２０℃において約１０ｃｐ以下等））を考慮して選定するのが好ましい。
【００４９】
上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の湿菌体や乾燥菌体から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、親水性有機溶剤を用いるのが好ましい。具体的には、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等を挙げることができる。
【００５０】
また、上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、疎水性有機溶剤を用いるのが好ましく、これは微生物由来の水溶性物質の除去を助成する。また、疎水性有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類が好ましい。
【００５１】
上記の親水性有機溶剤と疎水性有機溶剤の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、全溶液の容量に対して、好ましくは親水性有機溶剤が５〜５０容量％、疎水性有機溶剤が２５〜６５容量％の範囲である。両者は混合して使用しても良い。コエンザイムＱ１０の回収において、抽出時の温度は、特に制限さない。
【００５２】
このようにして得られたコエンザイムＱ１０を含有する抽出液を、所望によりカラムクロマトグラフィー、還元処理等により精製した後、晶析操作を用いて、高純度のコエンザイムＱ１０結晶を取得することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例をあげて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
コエンザイムＱ１０生産微生物ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ１１２５株を、５リットル容培養器を用いて、２５００ｍＬの培地（硫酸カリウム０．３３重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１５３重量％、塩化ナトリウム０．０１７重量％、硫酸亜鉛七水和物０．０１７重量％、硫酸マンガン五水和物０．００１６８重量％、ビタミンＢ１硝酸塩０．０００２７８重量％、リン酸０．２２５重量％、硫酸鉄（II）七水和物０．０１０５重量％、硫酸銅(II)五水和物０．０００５４重量％、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル(Ｔｗｅｅｎ４０) ０．０２重量％、グルコース７．５重量％、ｐＨ４．９）中で２０時間培養し、２０時間目以降から、培養液濃度が０．３６重量％となるようにエタノールを添加しながら、９５時間通気撹拌培養した。得られた培養液に抽出溶媒（メタノール／クロロホルム＝３／１）を添加し、３０分間激しく振とうしてコエンザイムＱ１０の抽出を行った。得られた溶媒相を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、コエンザイムＱ１０生産量を調べた。比較例として、Ｔｗｅｅｎ４０を無添加とした条件で同様に実施した。その結果を表１に示す。
【００５５】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ４．６×２５０ｍｍ
移動相：メタノール／ヘキサン＝８５／１５
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２７５ｎｍ
【００５６】
【表１】
【実施例２】
【００５７】
コエンザイムＱ１０生産微生物サイトエラ・コンプリカタ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ）ＩＦＯ １０７４８株を、５リットル容培養器を用いて、２５００ｍＬの培地（硫酸カリウム０．３３重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１５３重量％、塩化ナトリウム０．０１７重量％、硫酸亜鉛七水和物０．０１７重量％、硫酸マンガン五水和物０．００１６８重量％、ビタミンＢ１硝酸塩０．０００２７８重量％、リン酸０．２２５重量％、硫酸鉄（II）七水和物０．０１０５重量％、硫酸銅(II)五水和物０．０００５４重量％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０）０．０２重量％、グルコース７．５重量％、ｐＨ４．９）中で２０時間培養し、２０時間目以降から、培養液濃度が０．３６重量％となるようにエタノールを添加しながら、９５時間通気撹拌培養した。得られた培養液に抽出溶媒（メタノール／クロロホルム＝３／１）を添加し、３０分間激しく振とうしてコエンザイムＱ１０の抽出を行った。得られた溶媒相を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、コエンザイムＱ１０生産量を調べた。比較例として、Ｔｗｅｅｎ８０を無添加とした条件と、Ｔｗｅｅｎ８０の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０）を添加した条件でも、同様にそれぞれ実施した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法。
【請求項２】
培地に対するポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの添加濃度が、０．００５〜０．０３重量％である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルである請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
培養時間が６０〜１００時間である請求項１〜３いずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
コエンザイムＱ１０生産微生物が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アミノバクター（Aminobacter）属、アグロモナス（Agromonas）属、アシドフィラス（Acidiphilium）属、ブレロミセス（Bulleromyces）属、ブレラ（Bullera）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キオノスファエラ（Chionosphaera）属、カンジタ（Candida）属、セリノステルス（Cerinosterus）属、エキソフィアラ（Exisophiala）属、エキソバシジウム（Exobasidium）属、フィロミセス（Fellomyces）属、フィロバシジエラ（Filobasidiella）属、フィロバシジウム（Filobasidium）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、グラフィオラ（Graphiola）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、コッコバエラ（Kockovaella）属、クルツマノミセス（Kurtzmanomyces）属、ララリア（Lalaria）属、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）属、レギオネラ（Legionella）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ミコプラナ（Mycoplana）属、オースポリジウム（Oosporidium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュドジマ（Psedozyma）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ペトロミセス（Petromyc）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、リゾモナス（Rhizomonas）属、ロドビウム（Rhodobium）属、ロドプラネス（Rhodoplanes）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリジオボラス（Sporidiobolus）属、サイトエラ（Saitoella）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポトリクム（Sporotrichum）属、シンポジオミコプシス（Sympodiomycopsis）属、ステリグマトスポリジウム（Sterigmatosporidium）属、タファリナ（Tapharina）属、トレメラ（Tremella）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、チレチアリア（Tilletiaria）属、チレチア（Tilletia）属、トリポスポリウム（Tolyposporium）属、チレチオプシス（Tilletiopsis）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、ウデニオミセス（Udeniomyce）属、キサントフィロミセス（Xanthophllomyces）属、キサントバクテリウム（Xanthobacter）属、ペキロマイセス（Paecilomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ハイホモナス（Hyhomonus）属、又は、リゾビウム（Rhizobium）属の微生物である請求項１〜４いずれか１項記載の製造法。
【請求項１】
コエンザイムＱ１０生産微生物を、脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する培地で培養することを特徴とするコエンザイムＱ１０の製造法。
【請求項２】
培地に対するポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの添加濃度が、０．００５〜０．０３重量％である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルである請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
培養時間が６０〜１００時間である請求項１〜３いずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
コエンザイムＱ１０生産微生物が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アミノバクター（Aminobacter）属、アグロモナス（Agromonas）属、アシドフィラス（Acidiphilium）属、ブレロミセス（Bulleromyces）属、ブレラ（Bullera）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キオノスファエラ（Chionosphaera）属、カンジタ（Candida）属、セリノステルス（Cerinosterus）属、エキソフィアラ（Exisophiala）属、エキソバシジウム（Exobasidium）属、フィロミセス（Fellomyces）属、フィロバシジエラ（Filobasidiella）属、フィロバシジウム（Filobasidium）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、グラフィオラ（Graphiola）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、コッコバエラ（Kockovaella）属、クルツマノミセス（Kurtzmanomyces）属、ララリア（Lalaria）属、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）属、レギオネラ（Legionella）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ミコプラナ（Mycoplana）属、オースポリジウム（Oosporidium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュドジマ（Psedozyma）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ペトロミセス（Petromyc）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、リゾモナス（Rhizomonas）属、ロドビウム（Rhodobium）属、ロドプラネス（Rhodoplanes）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリジオボラス（Sporidiobolus）属、サイトエラ（Saitoella）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポトリクム（Sporotrichum）属、シンポジオミコプシス（Sympodiomycopsis）属、ステリグマトスポリジウム（Sterigmatosporidium）属、タファリナ（Tapharina）属、トレメラ（Tremella）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、チレチアリア（Tilletiaria）属、チレチア（Tilletia）属、トリポスポリウム（Tolyposporium）属、チレチオプシス（Tilletiopsis）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、ウデニオミセス（Udeniomyce）属、キサントフィロミセス（Xanthophllomyces）属、キサントバクテリウム（Xanthobacter）属、ペキロマイセス（Paecilomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ハイホモナス（Hyhomonus）属、又は、リゾビウム（Rhizobium）属の微生物である請求項１〜４いずれか１項記載の製造法。
【公開番号】特開２０１３−７８２９１（Ｐ２０１３−７８２９１Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２０３９０（Ｐ２０１１−２２０３９０）
【出願日】平成２３年１０月４日（２０１１．１０．４）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月４日（２０１１．１０．４）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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