微生物触媒を用いた化合物の製造方法
【課題】微生物触媒を用いて、反応基質から化合物を製造するにあたり、経済的かつ高品質の化合物を製造する。
【解決手段】微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して微生物触媒貯槽から反応槽まで供給するに際して、微生物触媒懸濁液の配管内線速度を、通常設定される線速度よりも遅い
０．０２〜０．１３ｍ／ｓ とする。
【解決手段】微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して微生物触媒貯槽から反応槽まで供給するに際して、微生物触媒懸濁液の配管内線速度を、通常設定される線速度よりも遅い
０．０２〜０．１３ｍ／ｓ とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物触媒を用いた、反応基質から化合物を製造する方法に関する。好ましくは、微生物触媒を用いた、アミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物触媒を用いた、反応基質から化合物を製造する方法としては、微生物の増殖を伴う発酵生産法と、微生物菌体を酵素源とした酵素法が知られている。微生物触媒を用いて製造される化合物は様々なものが知られており、代表的な化合物としてアクリルアミドなどのアミド化合物が挙げられる。
アクリルアミドを原料としたアクリルアミド系ポリマーは、凝集剤、抄紙用増粘剤等の用途に利用される。いずれの用途においても、高分子量、高溶解性、および色調が無色に近いアクリルアミド系ポリマーが所望されている。
【０００３】
一方、アクリルアミドの製造方法に関しては、微生物触媒を用いた酵素法を採用することが好適であることが知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
酵素法でアクリルアミドを製造する場合においても、アクリルアミド系ポリマーのさらなる品質向上のために、様々な取り組みがなされている。例えば、触媒使用量を制限する方法（特許文献３参照）、製造したアクリルアミド水溶液中から、触媒由来の不純物を除去する方法（特許文献４参照）、微生物触媒およびアミド化合物を含む液の移送に容積型ポンプを用いる方法（特許文献５参照）、が知られている。
しかしながら、微生物触媒を用いた酵素法によって得られたアクリルアミドを原料としたアクリルアミド系ポリマーは、いまだ分子量、溶解性が不充分であり、色調は無色とは言えない。
【０００４】
現在まで、酵素法でアクリルアミドを製造する際、微生物触媒を反応槽に供給する条件について検討された報告例はこれまでほとんどない。なお、液体を移送する際の配管内線速度については、一般的に以下のような値が採用されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
【表１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３１６７１４号公報
【特許文献２】特開平０９−１１８７０４号公報
【特許文献３】特開２００１−２９９３７６号公報
【特許文献４】特開２００１−７８７４９号公報
【特許文献５】特開２００６−１８７２５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「化学プラント建設便覧」 ＩＳＢＮ ４−６２１−０２７８６−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高品質な化合物を得ることができる化合物の製造方法を提供することにある。また、不純物の少ないアミド化合物を得ることができるアミド化合物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、従来着目されなかった反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程に着目した。そして、該供給工程における微生物触媒の摩耗を抑制することで、高品質な化合物が得られるという知見を得た。本発明者らは、該知見に基づいて、微生物触媒懸濁液を反応槽まで供給するに際して、配管内線速度を、通常設定される線速度よりも遅い０．０２〜０．１３ｍ／ｓとすることで、高品質な化合物を製造できることを突き止め、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、微生物触媒を用いて、反応基質から化合物を製造する方法であって、前記微生物触媒を溶媒に懸濁した微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して前記微生物触媒懸濁液を反応槽内に供給する供給工程を有し、前記供給工程において、供給用配管における前記微生物触媒懸濁液の配管内線速度を０．０２〜０．１３ｍ／ｓとすることを特徴とする化合物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物の製造方法によれば、高品質な化合物を得ることができる。加えて、微生物触媒の沈降による損失を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考実施例１で用いた、微生物触媒の供給系を模した装置の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜化合物の製造方法＞
本発明の化合物の製造方法は、微生物触媒懸濁液を供給用配管を介して生体触媒懸濁液を反応槽内に供給する供給工程を有する。
本発明の製造方法は、微生物触媒を用いるあらゆる化合物の製造、例えば、アルコール類やアミド類などの汎用化学品、抗生物質・生理活性物質などの医薬品、その原料や中間体などの製造に適用が可能である。特にニトリル化合物からアミド化合物を製造する際に用いることが好ましい。アミド化合物の場合、具体的には、微生物触媒の存在下、水中でニトリル化合物を水和する反応によりアミド化合物水溶液を得る。
【００１４】
ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、微生物触媒によるニトリル化合物の水和反応は、常温、常法により行うことができる。ニトリル化合物がアクリロニトリルの場合、アクリロニトリルの水和反応は、例えば、以下のように行われる。
【００１５】
本発明のアクリロニトリルの水和反応には、(i) 反応原料（微生物触媒、アクリロニトリル、原料水を含む）を反応槽に一度に全量仕込んでから反応させる方法（回分反応）、(ii) 反応原料の一部を反応槽に仕込んだ後、連続的又は間歇的に残りの反応原料を供給して反応させる方法（半回分反応）、及び(iii) 反応原料の連続的又は間歇的な供給と、反応混合物（反応原料及び生成したアクリルアミドを含む）の連続的又は間歇的な取り出しを行いながら、反応槽内の反応混合物を全量抜き出すことなく連続的に製造する方法（連続反応）のいずれの反応を適用することもできる。工業的にアクリルアミドを大量にかつ効率的に製造しやすい点で、連続反応が好ましい。また、反応槽は１つのみを使用してもよいし、複数個を併用してもよい。複数の反応槽を用いて連続的に反応を行う際には、微生物触媒、アクリロニトリルの供給は、反応の効率等を悪化させすぎない範囲内であれば、最も上流に位置する反応槽のみには限定されず、それよりも下流の反応槽に導入してもよい。本発明の製造方法における反応温度（反応混合物温度）は、限定はされないが、１０〜４０℃であることが好ましく、２０〜３５℃であることがより好ましい。反応温度が１０℃以上であれば、微生物触媒の反応活性を充分に高められるだけでなく、冷却水温度を上げることができるため、冷凍機に替えて冷水塔を利用することができ、冷却水の冷却エネルギーを低減することができる。また、反応温度が４０℃以下であれば、微生物触媒の失活を抑制しやすい。
また、本発明の製造方法における反応時間は、限定はされないが、例えば、１〜５０時間であることが好ましく、より好ましくは３〜２０時間である。
【００１６】
＜微生物触媒＞
本発明における「微生物触媒」とは、反応基質から化合物を生産する能力のある酵素活性を有する微生物、または微生物の処理物である。本発明が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、微生物触媒はニトリルヒドラターゼを有する微生物である。「ニトリルヒドラターゼ」とは、ニトリル化合物をこれに対応するアミド化合物に変換する酵素である。ニトリルヒドラターゼとしては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリジューム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等に属する微生物由来のものが知られている。
【００１７】
また、前記微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を取得し、常法により、該遺伝子をそのまま、または人為的に改良して任意の宿主に該遺伝子を導入した形質転換体を用いることもできる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９参照）。このような形質転換体としては、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０７７０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７５６）（特開平８−２６６２７７号公報）、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０８２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）（特開平９−２７５９７８号公報）、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換したロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｍ３３（ＶＫＭＡｃ−１５１５ＤあるいはＫＣＣＭ−１０６３５）（国際公開第２００６／０６２１８９号公報）、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種のニトリルヒドラターゼ（特開平４−２１１３７９号公報）、で形質転換した微生物等が挙げられる。
【００１８】
微生物触媒の形態としては、前記微生物等を定法に従い培養した培養液、培養液から分離し必要に応じて洗浄された休止菌体の形態が挙げられる。
化合物の品質を考慮すると、本発明においては、培養液から分離し洗浄した休止菌体を用いることが好ましい。微生物触媒の調製は、本発明が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、例えば、以下のように行われる。
【００１９】
炭素源（グルコース等の糖類）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源；酵母エキス、ペプトン、肉エキス等の有機窒素）および必要に応じて無機塩類、金属塩、ビタミン等を添加した培地中で、２０〜４０℃、ｐＨ５〜９でニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養する。培養は、適宜、振盪培養または回転培養としてもよい。培養終了後、菌体を有機酸水溶液で洗浄し、微生物触媒を調製する。
【００２０】
＜反応基質＞
本発明で用いられる反応基質とは、微生物触媒によって化合物が製造され得るものであればよい。反応基質はカウンターイオンとの塩であってもよい。製造される化合物がアミド化合物である場合、反応基質はニトリル化合物である。
本発明における「ニトリル化合物」とは、ニトリルヒドラターゼの作用によりアミド化合物に変換されるものである。ニトリル化合物としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリル等の脂肪族飽和ニトリル；アクリロニトリル、メタアクリロニトリル等の脂肪族不飽和ニトリル；ベンゾニトリル、フタロジニトリル等の芳香族ニトリル；３−シアノピリジン、２−シアノピリジン等の複素環式ニトリルが挙げられる。
【００２１】
＜微生物触媒懸濁液＞
微生物触媒懸濁液とは、上記微生物触媒を溶媒に懸濁させた懸濁液である。微生物触媒を懸濁させる溶媒は特段の限定はされないが、有機酸水溶液に懸濁することが好ましい。この有機酸水溶液としては、酵素活性を阻害しない有機酸水溶液であれば特に限定されない。例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、カルボン酸等が挙げられ、製造する化合物に適した有機酸を適宜選択することができる。例えば、アミド化合物を製造する場合には、特開２００２−２８１９９４に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
培養液から分離し洗浄した休止菌体を化合物製造に用いる場合、懸濁させる休止菌体の乾燥菌体濃度は、乾燥菌体として４質量％以上、好ましくは５質量％以上である。但し、菌体濃度が２０質量％を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になる。従って、菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％、更に好ましくは、８質量％である。
【００２３】
ここでの休止菌体の乾燥菌体濃度は、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣濃度[％]）と、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を以下の式に代入することにより求められる：
【００２４】
【数１】
【００２５】
微生物触媒懸濁液は、反応槽への懸濁液の供給に支障が可能な粘度であればよく、特段の限定はされないが、通常、２５℃での粘度が１０,０００ｃｐ以下であり、好ましくは１，０００ｃｐ以下であり、より好ましくは１００ｃｐ以下である。粘度が極端に高い場合には、供給用配管を介しての反応槽への微生物触媒の供給が困難になったり、高品質の化合物が得られない場合がある。
【００２６】
＜反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程＞
反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程は、供給用配管を介して行う。供給用配管は、微生物触媒懸濁液の供給量に応じた適当な管径を有する管を用いることができる。また、化合物の製造において、実質的に影響を及ぼさない材料で形成することができる。このような材料としては、製造する化合物がアミド化合物の場合には、ステンレス、銅、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びフッ素系樹脂などが挙げられる。
本発明の製造方法では、供給工程において、供給過程における微生物触媒の磨耗を抑制するために、配管内線速度を０．１３ｍ／ｓ以下で行う。すなわち、微生物触媒の摩耗を抑制することで、高品質の化合物を製造することができる。また、供給過程における微生物触媒の配管内での沈降を抑制するために、配管内線速度を ０．０２ｍ／ｓ以上で行う。すなわち、反応槽に供給されない微生物触媒を抑制することで、経済的に化合物を製造することができる。
したがって、反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程では、供給用配管における微生物触媒懸濁液の配管内線速度は、０．０２〜０．１３ｍ／ｓであり、好ましくは０．０５〜０．１０ｍ／ｓ、より好ましくは０．０５〜０．０９ｍ／ｓである。なお、配管内線速度は次式で表される。
【００２７】
【数２】
【００２８】
【数３】
【００２９】
ここでの「配管内線速度」とは、微生物触媒懸濁液を保存する微生物触媒貯槽と、反応槽とをつなぐ供給用配管において、その全長の内８０％以上の長さを占める、同一の配管内径をもつ配管内での線速度を指し、触媒貯槽、反応槽、微生物触媒を供給するために使用する移送ポンプ等と配管とを接続するフランジや異径ユニオンなどの接続部分を除く。
【００３０】
本発明の供給工程において、微生物触媒懸濁液は触媒貯槽に貯留され、供給用配管を介して触媒貯槽から反応槽内に供給される。微生物触媒懸濁液が、触媒貯槽から反応槽に供給されるまでの微生物触媒懸濁液の移送時間は、供給工程での微生物触媒の供給配管内での沈降や腐敗を抑制するために、短時間であることが好ましく、２時間以内とすることがより好ましい。なお、化合物製造における反応様式が、連続反応である場合においては、触媒貯槽と反応槽とをつなぐ供給配管内での微生物触媒の滞留時間を２時間以内とすることが好ましい。
【００３１】
本発明の供給工程において、触媒貯槽から反応槽内に添加されるまでの微生物触媒懸濁液の温度は、室温で可能である。但し供給過程での微生物触媒の失活や腐敗を抑制するには低温であることがより好ましい。具体的には氷点〜３５℃、好ましくは氷点〜３０℃、より好ましくは氷点〜２０℃、さらに好ましくは氷点〜１０℃である。ここで、「氷点」とは、微生物触媒懸濁液の固体状態と液体状態の平衡温度を意味し、微生物触媒懸濁液の
組成や配管内の圧力によって変化する温度である。
本発明の供給工程において、触媒貯槽から反応槽内に添加されるまでの微生物触媒懸濁液の温度が上昇することを防ぐために、供給用配管に断熱材・保冷材などを用いることが好ましい。
【００３２】
以上説明した本発明の化合物の製造方法にあっては、微生物触媒貯槽から反応槽まで供給するに際して、供給用配管における配管内線速度を ０．０２〜０．１３m/s とすることで、微生物触媒の磨耗を抑えることができ、結果、高品質の化合物を提供することができる。特に、アミド化合物を製造する場合には、上記配管内線速度とすることで、微生物触媒に由来する不純物の発生を抑制できる。また、微生物触媒の配管内での沈降が抑制され、微生物触媒を有効に利用でき、経済的な化合物の製造が可能になる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されるものではない。
［実施例１］
（１）微生物触媒懸濁液の調製：
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を、グルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により好気的に培養した。
培養終了後、培養液をクロスフロー型中空糸膜モジュール（株式会社クラレ製ＭＬＥ７１０１）に通して循環濾過し、濾液の量に対応する量の０．１質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）を連続的に培養液に供給して洗浄を行った。洗浄後、前記アクリル酸ナトリウム水溶液の供給を停止した状態でろ過を継続し、乾燥菌体濃度が５質量％となるまで濃縮したものを、微生物触媒懸濁液とした。この微生物触媒懸濁液の粘度を２５℃で測定したところ１０ｃｐであった。
【００３４】
（アクリルアミドの生成）
ジャケット冷却器付反応槽（槽内径：０．８ｍ、高さ：１．４ｍ）を４槽直列に連結した。
第１槽目に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５０．６Ｌ／ｈｒ、アクリロニトリルを２７．１Ｌ／ｈｒ、及び菌体懸濁液を６９０ｇ／ｈｒで連続的に添加し、第２槽目に、アクリロニトリルのみを１１．６Ｌ／ｈｒで連続的に添加した。菌体懸濁液の供給用配管長さは２ｍとし、配管内径は１．６ｍｍとした（線速度０．１ｍ／ｓ相当）。
第１槽から第４槽までの各槽の反応液量を５００Ｌに調整し、第１槽から第４槽までの反応液温度がそれぞれ２２℃、２３℃、２４℃及び２５℃となるようにジャケットの冷却水（１０℃）を用いて温度制御した。２枚パドル翼（翼径：３５０ｍｍ、翼幅：１００ｍｍ）を用いて、第１槽から第４槽までの全ての反応器における反応液流体あたりの攪拌動力を０．０８ｋＷ／ｍ3となるように調整した（フルード数：０．０５７）。ただし、反応液流体あたりの攪拌所要動力は、各反応器における攪拌所要動力を液量（５００Ｌ＝０．５ｍ3）で除して算出した。
反応開始から４日後、第４槽から流出してくる反応液を、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製、ＰｏｒａＰａｋ−ＰＳ、１ｍ、１８０℃；キャリアガス：ヘリウム；検出器：ＦＩＤ）により測定した。
その結果、未反応のアクリロニトリルは検出されず、５０．５％のアクリルアミドが検出された。この反応液の一部を採取し、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過することで、菌体を除き、アクリルアミド水溶液を得た。得られたアクリルアミド水溶液は、無色透明であった。
【００３５】
［比較例１］
ステンレス配管の配管内径を０．８ｍｍ（線速度０．３８ｍ／ｓ相当）とした以外は、実施例１と同様にして、菌体を除いたアクリルアミド水溶液を得た。得られたアクリルアミド水溶液は、透明であったがやや黄色味を帯びていた。
【００３６】
送液過程での微生物触媒の破砕などにより、比較例１では製造されたアクリルアミド水溶液は着色しており、好ましくない。
【００３７】
［参考実施例１］
次に、微生物触媒懸濁液を送液した際の、微生物触媒濃度について実験を行った。
（１）微生物触媒の調製：
乾燥菌体濃度が１２質量％となるまで濃縮した以外は、実施例１と同様にして、微生物触媒懸濁液を得た。この微生物触媒懸濁液の粘度を２５℃で測定したところ２５０ｃｐであった。
【００３８】
（２）微生物触媒懸濁液の送液：
参考実施例１で用いた微生物触媒懸濁液の供給系を模した装置を図１に示す。長さが１ｍのステンレス配管（内径８ｍｍ）３本を、９０°エルボ（ウシオＺユニオン ＦＬＺ−８−００ ＰＰ）で接続した。前記（１）で調製した微生物触媒懸濁液を２年７ヶ月冷蔵保存した後、微生物触媒貯槽に加え、チューブポンプ（ポンプ：Ｃｏｌｅ-Ｐａｒｍｅｒ ７５５３-７０、ヘッド：Ｃｏｌｅ-Ｐａｒｍｅｒ ７７２０１-６２）により、ステンレス配管内に送液した。このとき、ステンレス配管内の微生物触媒懸濁液の線速度が０．０９ｍ/ｓとなるように送液した。
【００３９】
（３）微生物触媒懸濁液の濃度測定：
ステンレス配管より吐出された微生物触媒懸濁液を回収し、希釈した後に、波長６３０ｎｍにおける濁度を測定することで、微生物触媒懸濁液中における微生物触媒の濃度を測定した。
【００４０】
（４）微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度測定：
前記（３）で希釈した微生物触媒懸濁液を遠心分離（４℃、１２７００×Ｇ、５ｍｉｎ）し、微生物触媒を沈降させ、上清を得た。上清を分光光度計（日立計器製、ＧｅｎｅＳｐｅｃIII）を用いて、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４１】
［参考比較例１］
ステンレス配管内の線速度が０．４１ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中における微生物触媒濃度と、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４２】
［参考比較例２］
ステンレス配管内の線速度が０．００３ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中における微生物触媒濃度と、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４３】
参考実施例１、並びに参考比較例１及び２の測定結果を表２に示す。なお、微生物触媒濃度および不純物濃度は、参考実施例１での測定結果を１とした相対値で示す。
【表２】
【００４４】
送液過程で微生物触媒が破砕されたためか、線速度を０．４１ｍ/ｓとした参考比較例１では、参考実施例１よりも不純物濃度が高かった。この線速度で微生物触媒懸濁液を供給した場合、製品となるアミド化合物濃度中に、微生物触媒由来の不純物濃度が増加し、好ましくない。
一方、線速度を０．００３ｍ/ｓとした参考比較例２では、送液過程で微生物触媒が沈降したためか、送液後の微生物触媒懸濁液濃度が、参考実施例１よりも低かった。この線速度で微生物触媒懸濁液を供給した場合、微生物触媒を送液過程で損失することとなり、非経済的なアミド化合物製造法となる。
【００４５】
［参考実施例２］
３ヶ月冷蔵保存した微生物触媒懸濁液を用いた以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒濃度を測定した。また、送液後の微生物触媒懸濁液について、アクリルアミド生成反応速を測定し、ニトリルヒドラターゼ活性を算出した。測定は、適宜希釈した微生物触媒懸濁液を調製し、ここに基質のアクリロニトリル水溶液を添加して開始し、１０℃１０分の振盪ののち、微生物触媒を濾過分離して反応を停止し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ-１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
【００４６】
［参考実施例３］
ステンレス配管内の線速度が０．０５ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４７】
［参考比較例３］
ステンレス配管内の線速度が０．１７ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４８】
［参考比較例４］
ステンレス配管内の線速度が０．０１ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４９】
測定結果を表３に示す。なお、微生物触媒懸濁液濃度および不純物濃度は、参考実施例２での測定結果を１とした相対値で示す。
【表３】
【００５０】
送液過程での微生物触媒の破砕や沈降により、参考比較例３、参考比較例４では送液後の微生物触媒濃度とニトリルヒドラターゼ活性が低く、微生物触媒を送液過程で損失することとなり、非経済的なアミド化合物製造法となる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の化合物の製造方法により、経済的で高品質な化合物を得ることができる。特にアミド化合物を製造した場合には、経済的で不純物の少ないアミド化合物を得ることができる。
【符号の説明】
【００５２】
１ 菌液リザーバー
２ チューブポンプ
３ 菌液回収
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物触媒を用いた、反応基質から化合物を製造する方法に関する。好ましくは、微生物触媒を用いた、アミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物触媒を用いた、反応基質から化合物を製造する方法としては、微生物の増殖を伴う発酵生産法と、微生物菌体を酵素源とした酵素法が知られている。微生物触媒を用いて製造される化合物は様々なものが知られており、代表的な化合物としてアクリルアミドなどのアミド化合物が挙げられる。
アクリルアミドを原料としたアクリルアミド系ポリマーは、凝集剤、抄紙用増粘剤等の用途に利用される。いずれの用途においても、高分子量、高溶解性、および色調が無色に近いアクリルアミド系ポリマーが所望されている。
【０００３】
一方、アクリルアミドの製造方法に関しては、微生物触媒を用いた酵素法を採用することが好適であることが知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
酵素法でアクリルアミドを製造する場合においても、アクリルアミド系ポリマーのさらなる品質向上のために、様々な取り組みがなされている。例えば、触媒使用量を制限する方法（特許文献３参照）、製造したアクリルアミド水溶液中から、触媒由来の不純物を除去する方法（特許文献４参照）、微生物触媒およびアミド化合物を含む液の移送に容積型ポンプを用いる方法（特許文献５参照）、が知られている。
しかしながら、微生物触媒を用いた酵素法によって得られたアクリルアミドを原料としたアクリルアミド系ポリマーは、いまだ分子量、溶解性が不充分であり、色調は無色とは言えない。
【０００４】
現在まで、酵素法でアクリルアミドを製造する際、微生物触媒を反応槽に供給する条件について検討された報告例はこれまでほとんどない。なお、液体を移送する際の配管内線速度については、一般的に以下のような値が採用されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
【表１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３１６７１４号公報
【特許文献２】特開平０９−１１８７０４号公報
【特許文献３】特開２００１−２９９３７６号公報
【特許文献４】特開２００１−７８７４９号公報
【特許文献５】特開２００６−１８７２５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「化学プラント建設便覧」 ＩＳＢＮ ４−６２１−０２７８６−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高品質な化合物を得ることができる化合物の製造方法を提供することにある。また、不純物の少ないアミド化合物を得ることができるアミド化合物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、従来着目されなかった反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程に着目した。そして、該供給工程における微生物触媒の摩耗を抑制することで、高品質な化合物が得られるという知見を得た。本発明者らは、該知見に基づいて、微生物触媒懸濁液を反応槽まで供給するに際して、配管内線速度を、通常設定される線速度よりも遅い０．０２〜０．１３ｍ／ｓとすることで、高品質な化合物を製造できることを突き止め、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、微生物触媒を用いて、反応基質から化合物を製造する方法であって、前記微生物触媒を溶媒に懸濁した微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して前記微生物触媒懸濁液を反応槽内に供給する供給工程を有し、前記供給工程において、供給用配管における前記微生物触媒懸濁液の配管内線速度を０．０２〜０．１３ｍ／ｓとすることを特徴とする化合物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物の製造方法によれば、高品質な化合物を得ることができる。加えて、微生物触媒の沈降による損失を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考実施例１で用いた、微生物触媒の供給系を模した装置の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜化合物の製造方法＞
本発明の化合物の製造方法は、微生物触媒懸濁液を供給用配管を介して生体触媒懸濁液を反応槽内に供給する供給工程を有する。
本発明の製造方法は、微生物触媒を用いるあらゆる化合物の製造、例えば、アルコール類やアミド類などの汎用化学品、抗生物質・生理活性物質などの医薬品、その原料や中間体などの製造に適用が可能である。特にニトリル化合物からアミド化合物を製造する際に用いることが好ましい。アミド化合物の場合、具体的には、微生物触媒の存在下、水中でニトリル化合物を水和する反応によりアミド化合物水溶液を得る。
【００１４】
ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、微生物触媒によるニトリル化合物の水和反応は、常温、常法により行うことができる。ニトリル化合物がアクリロニトリルの場合、アクリロニトリルの水和反応は、例えば、以下のように行われる。
【００１５】
本発明のアクリロニトリルの水和反応には、(i) 反応原料（微生物触媒、アクリロニトリル、原料水を含む）を反応槽に一度に全量仕込んでから反応させる方法（回分反応）、(ii) 反応原料の一部を反応槽に仕込んだ後、連続的又は間歇的に残りの反応原料を供給して反応させる方法（半回分反応）、及び(iii) 反応原料の連続的又は間歇的な供給と、反応混合物（反応原料及び生成したアクリルアミドを含む）の連続的又は間歇的な取り出しを行いながら、反応槽内の反応混合物を全量抜き出すことなく連続的に製造する方法（連続反応）のいずれの反応を適用することもできる。工業的にアクリルアミドを大量にかつ効率的に製造しやすい点で、連続反応が好ましい。また、反応槽は１つのみを使用してもよいし、複数個を併用してもよい。複数の反応槽を用いて連続的に反応を行う際には、微生物触媒、アクリロニトリルの供給は、反応の効率等を悪化させすぎない範囲内であれば、最も上流に位置する反応槽のみには限定されず、それよりも下流の反応槽に導入してもよい。本発明の製造方法における反応温度（反応混合物温度）は、限定はされないが、１０〜４０℃であることが好ましく、２０〜３５℃であることがより好ましい。反応温度が１０℃以上であれば、微生物触媒の反応活性を充分に高められるだけでなく、冷却水温度を上げることができるため、冷凍機に替えて冷水塔を利用することができ、冷却水の冷却エネルギーを低減することができる。また、反応温度が４０℃以下であれば、微生物触媒の失活を抑制しやすい。
また、本発明の製造方法における反応時間は、限定はされないが、例えば、１〜５０時間であることが好ましく、より好ましくは３〜２０時間である。
【００１６】
＜微生物触媒＞
本発明における「微生物触媒」とは、反応基質から化合物を生産する能力のある酵素活性を有する微生物、または微生物の処理物である。本発明が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、微生物触媒はニトリルヒドラターゼを有する微生物である。「ニトリルヒドラターゼ」とは、ニトリル化合物をこれに対応するアミド化合物に変換する酵素である。ニトリルヒドラターゼとしては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリジューム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等に属する微生物由来のものが知られている。
【００１７】
また、前記微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を取得し、常法により、該遺伝子をそのまま、または人為的に改良して任意の宿主に該遺伝子を導入した形質転換体を用いることもできる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９参照）。このような形質転換体としては、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０７７０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７５６）（特開平８−２６６２７７号公報）、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０８２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）（特開平９−２７５９７８号公報）、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌細菌のニトリルヒドラターゼで形質転換したロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｍ３３（ＶＫＭＡｃ−１５１５ＤあるいはＫＣＣＭ−１０６３５）（国際公開第２００６／０６２１８９号公報）、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種のニトリルヒドラターゼ（特開平４−２１１３７９号公報）、で形質転換した微生物等が挙げられる。
【００１８】
微生物触媒の形態としては、前記微生物等を定法に従い培養した培養液、培養液から分離し必要に応じて洗浄された休止菌体の形態が挙げられる。
化合物の品質を考慮すると、本発明においては、培養液から分離し洗浄した休止菌体を用いることが好ましい。微生物触媒の調製は、本発明が、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する場合、例えば、以下のように行われる。
【００１９】
炭素源（グルコース等の糖類）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源；酵母エキス、ペプトン、肉エキス等の有機窒素）および必要に応じて無機塩類、金属塩、ビタミン等を添加した培地中で、２０〜４０℃、ｐＨ５〜９でニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養する。培養は、適宜、振盪培養または回転培養としてもよい。培養終了後、菌体を有機酸水溶液で洗浄し、微生物触媒を調製する。
【００２０】
＜反応基質＞
本発明で用いられる反応基質とは、微生物触媒によって化合物が製造され得るものであればよい。反応基質はカウンターイオンとの塩であってもよい。製造される化合物がアミド化合物である場合、反応基質はニトリル化合物である。
本発明における「ニトリル化合物」とは、ニトリルヒドラターゼの作用によりアミド化合物に変換されるものである。ニトリル化合物としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリル等の脂肪族飽和ニトリル；アクリロニトリル、メタアクリロニトリル等の脂肪族不飽和ニトリル；ベンゾニトリル、フタロジニトリル等の芳香族ニトリル；３−シアノピリジン、２−シアノピリジン等の複素環式ニトリルが挙げられる。
【００２１】
＜微生物触媒懸濁液＞
微生物触媒懸濁液とは、上記微生物触媒を溶媒に懸濁させた懸濁液である。微生物触媒を懸濁させる溶媒は特段の限定はされないが、有機酸水溶液に懸濁することが好ましい。この有機酸水溶液としては、酵素活性を阻害しない有機酸水溶液であれば特に限定されない。例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、カルボン酸等が挙げられ、製造する化合物に適した有機酸を適宜選択することができる。例えば、アミド化合物を製造する場合には、特開２００２−２８１９９４に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
培養液から分離し洗浄した休止菌体を化合物製造に用いる場合、懸濁させる休止菌体の乾燥菌体濃度は、乾燥菌体として４質量％以上、好ましくは５質量％以上である。但し、菌体濃度が２０質量％を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になる。従って、菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％、更に好ましくは、８質量％である。
【００２３】
ここでの休止菌体の乾燥菌体濃度は、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣濃度[％]）と、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を以下の式に代入することにより求められる：
【００２４】
【数１】
【００２５】
微生物触媒懸濁液は、反応槽への懸濁液の供給に支障が可能な粘度であればよく、特段の限定はされないが、通常、２５℃での粘度が１０,０００ｃｐ以下であり、好ましくは１，０００ｃｐ以下であり、より好ましくは１００ｃｐ以下である。粘度が極端に高い場合には、供給用配管を介しての反応槽への微生物触媒の供給が困難になったり、高品質の化合物が得られない場合がある。
【００２６】
＜反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程＞
反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程は、供給用配管を介して行う。供給用配管は、微生物触媒懸濁液の供給量に応じた適当な管径を有する管を用いることができる。また、化合物の製造において、実質的に影響を及ぼさない材料で形成することができる。このような材料としては、製造する化合物がアミド化合物の場合には、ステンレス、銅、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びフッ素系樹脂などが挙げられる。
本発明の製造方法では、供給工程において、供給過程における微生物触媒の磨耗を抑制するために、配管内線速度を０．１３ｍ／ｓ以下で行う。すなわち、微生物触媒の摩耗を抑制することで、高品質の化合物を製造することができる。また、供給過程における微生物触媒の配管内での沈降を抑制するために、配管内線速度を ０．０２ｍ／ｓ以上で行う。すなわち、反応槽に供給されない微生物触媒を抑制することで、経済的に化合物を製造することができる。
したがって、反応槽への微生物触媒懸濁液の供給工程では、供給用配管における微生物触媒懸濁液の配管内線速度は、０．０２〜０．１３ｍ／ｓであり、好ましくは０．０５〜０．１０ｍ／ｓ、より好ましくは０．０５〜０．０９ｍ／ｓである。なお、配管内線速度は次式で表される。
【００２７】
【数２】
【００２８】
【数３】
【００２９】
ここでの「配管内線速度」とは、微生物触媒懸濁液を保存する微生物触媒貯槽と、反応槽とをつなぐ供給用配管において、その全長の内８０％以上の長さを占める、同一の配管内径をもつ配管内での線速度を指し、触媒貯槽、反応槽、微生物触媒を供給するために使用する移送ポンプ等と配管とを接続するフランジや異径ユニオンなどの接続部分を除く。
【００３０】
本発明の供給工程において、微生物触媒懸濁液は触媒貯槽に貯留され、供給用配管を介して触媒貯槽から反応槽内に供給される。微生物触媒懸濁液が、触媒貯槽から反応槽に供給されるまでの微生物触媒懸濁液の移送時間は、供給工程での微生物触媒の供給配管内での沈降や腐敗を抑制するために、短時間であることが好ましく、２時間以内とすることがより好ましい。なお、化合物製造における反応様式が、連続反応である場合においては、触媒貯槽と反応槽とをつなぐ供給配管内での微生物触媒の滞留時間を２時間以内とすることが好ましい。
【００３１】
本発明の供給工程において、触媒貯槽から反応槽内に添加されるまでの微生物触媒懸濁液の温度は、室温で可能である。但し供給過程での微生物触媒の失活や腐敗を抑制するには低温であることがより好ましい。具体的には氷点〜３５℃、好ましくは氷点〜３０℃、より好ましくは氷点〜２０℃、さらに好ましくは氷点〜１０℃である。ここで、「氷点」とは、微生物触媒懸濁液の固体状態と液体状態の平衡温度を意味し、微生物触媒懸濁液の
組成や配管内の圧力によって変化する温度である。
本発明の供給工程において、触媒貯槽から反応槽内に添加されるまでの微生物触媒懸濁液の温度が上昇することを防ぐために、供給用配管に断熱材・保冷材などを用いることが好ましい。
【００３２】
以上説明した本発明の化合物の製造方法にあっては、微生物触媒貯槽から反応槽まで供給するに際して、供給用配管における配管内線速度を ０．０２〜０．１３m/s とすることで、微生物触媒の磨耗を抑えることができ、結果、高品質の化合物を提供することができる。特に、アミド化合物を製造する場合には、上記配管内線速度とすることで、微生物触媒に由来する不純物の発生を抑制できる。また、微生物触媒の配管内での沈降が抑制され、微生物触媒を有効に利用でき、経済的な化合物の製造が可能になる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されるものではない。
［実施例１］
（１）微生物触媒懸濁液の調製：
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を、グルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により好気的に培養した。
培養終了後、培養液をクロスフロー型中空糸膜モジュール（株式会社クラレ製ＭＬＥ７１０１）に通して循環濾過し、濾液の量に対応する量の０．１質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）を連続的に培養液に供給して洗浄を行った。洗浄後、前記アクリル酸ナトリウム水溶液の供給を停止した状態でろ過を継続し、乾燥菌体濃度が５質量％となるまで濃縮したものを、微生物触媒懸濁液とした。この微生物触媒懸濁液の粘度を２５℃で測定したところ１０ｃｐであった。
【００３４】
（アクリルアミドの生成）
ジャケット冷却器付反応槽（槽内径：０．８ｍ、高さ：１．４ｍ）を４槽直列に連結した。
第１槽目に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５０．６Ｌ／ｈｒ、アクリロニトリルを２７．１Ｌ／ｈｒ、及び菌体懸濁液を６９０ｇ／ｈｒで連続的に添加し、第２槽目に、アクリロニトリルのみを１１．６Ｌ／ｈｒで連続的に添加した。菌体懸濁液の供給用配管長さは２ｍとし、配管内径は１．６ｍｍとした（線速度０．１ｍ／ｓ相当）。
第１槽から第４槽までの各槽の反応液量を５００Ｌに調整し、第１槽から第４槽までの反応液温度がそれぞれ２２℃、２３℃、２４℃及び２５℃となるようにジャケットの冷却水（１０℃）を用いて温度制御した。２枚パドル翼（翼径：３５０ｍｍ、翼幅：１００ｍｍ）を用いて、第１槽から第４槽までの全ての反応器における反応液流体あたりの攪拌動力を０．０８ｋＷ／ｍ3となるように調整した（フルード数：０．０５７）。ただし、反応液流体あたりの攪拌所要動力は、各反応器における攪拌所要動力を液量（５００Ｌ＝０．５ｍ3）で除して算出した。
反応開始から４日後、第４槽から流出してくる反応液を、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製、ＰｏｒａＰａｋ−ＰＳ、１ｍ、１８０℃；キャリアガス：ヘリウム；検出器：ＦＩＤ）により測定した。
その結果、未反応のアクリロニトリルは検出されず、５０．５％のアクリルアミドが検出された。この反応液の一部を採取し、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過することで、菌体を除き、アクリルアミド水溶液を得た。得られたアクリルアミド水溶液は、無色透明であった。
【００３５】
［比較例１］
ステンレス配管の配管内径を０．８ｍｍ（線速度０．３８ｍ／ｓ相当）とした以外は、実施例１と同様にして、菌体を除いたアクリルアミド水溶液を得た。得られたアクリルアミド水溶液は、透明であったがやや黄色味を帯びていた。
【００３６】
送液過程での微生物触媒の破砕などにより、比較例１では製造されたアクリルアミド水溶液は着色しており、好ましくない。
【００３７】
［参考実施例１］
次に、微生物触媒懸濁液を送液した際の、微生物触媒濃度について実験を行った。
（１）微生物触媒の調製：
乾燥菌体濃度が１２質量％となるまで濃縮した以外は、実施例１と同様にして、微生物触媒懸濁液を得た。この微生物触媒懸濁液の粘度を２５℃で測定したところ２５０ｃｐであった。
【００３８】
（２）微生物触媒懸濁液の送液：
参考実施例１で用いた微生物触媒懸濁液の供給系を模した装置を図１に示す。長さが１ｍのステンレス配管（内径８ｍｍ）３本を、９０°エルボ（ウシオＺユニオン ＦＬＺ−８−００ ＰＰ）で接続した。前記（１）で調製した微生物触媒懸濁液を２年７ヶ月冷蔵保存した後、微生物触媒貯槽に加え、チューブポンプ（ポンプ：Ｃｏｌｅ-Ｐａｒｍｅｒ ７５５３-７０、ヘッド：Ｃｏｌｅ-Ｐａｒｍｅｒ ７７２０１-６２）により、ステンレス配管内に送液した。このとき、ステンレス配管内の微生物触媒懸濁液の線速度が０．０９ｍ/ｓとなるように送液した。
【００３９】
（３）微生物触媒懸濁液の濃度測定：
ステンレス配管より吐出された微生物触媒懸濁液を回収し、希釈した後に、波長６３０ｎｍにおける濁度を測定することで、微生物触媒懸濁液中における微生物触媒の濃度を測定した。
【００４０】
（４）微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度測定：
前記（３）で希釈した微生物触媒懸濁液を遠心分離（４℃、１２７００×Ｇ、５ｍｉｎ）し、微生物触媒を沈降させ、上清を得た。上清を分光光度計（日立計器製、ＧｅｎｅＳｐｅｃIII）を用いて、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４１】
［参考比較例１］
ステンレス配管内の線速度が０．４１ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中における微生物触媒濃度と、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４２】
［参考比較例２］
ステンレス配管内の線速度が０．００３ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中における微生物触媒濃度と、微生物触媒懸濁液から流出する不純物濃度を測定した。
【００４３】
参考実施例１、並びに参考比較例１及び２の測定結果を表２に示す。なお、微生物触媒濃度および不純物濃度は、参考実施例１での測定結果を１とした相対値で示す。
【表２】
【００４４】
送液過程で微生物触媒が破砕されたためか、線速度を０．４１ｍ/ｓとした参考比較例１では、参考実施例１よりも不純物濃度が高かった。この線速度で微生物触媒懸濁液を供給した場合、製品となるアミド化合物濃度中に、微生物触媒由来の不純物濃度が増加し、好ましくない。
一方、線速度を０．００３ｍ/ｓとした参考比較例２では、送液過程で微生物触媒が沈降したためか、送液後の微生物触媒懸濁液濃度が、参考実施例１よりも低かった。この線速度で微生物触媒懸濁液を供給した場合、微生物触媒を送液過程で損失することとなり、非経済的なアミド化合物製造法となる。
【００４５】
［参考実施例２］
３ヶ月冷蔵保存した微生物触媒懸濁液を用いた以外は、参考実施例１と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒濃度を測定した。また、送液後の微生物触媒懸濁液について、アクリルアミド生成反応速を測定し、ニトリルヒドラターゼ活性を算出した。測定は、適宜希釈した微生物触媒懸濁液を調製し、ここに基質のアクリロニトリル水溶液を添加して開始し、１０℃１０分の振盪ののち、微生物触媒を濾過分離して反応を停止し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ-１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
【００４６】
［参考実施例３］
ステンレス配管内の線速度が０．０５ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４７】
［参考比較例３］
ステンレス配管内の線速度が０．１７ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４８】
［参考比較例４］
ステンレス配管内の線速度が０．０１ｍ/ｓとなるように送液した以外は、参考実施例２と同様にして、送液後の微生物触媒懸濁液中の微生物触媒懸濁液濃度とニトリルヒドラターゼ活性を測定した。
【００４９】
測定結果を表３に示す。なお、微生物触媒懸濁液濃度および不純物濃度は、参考実施例２での測定結果を１とした相対値で示す。
【表３】
【００５０】
送液過程での微生物触媒の破砕や沈降により、参考比較例３、参考比較例４では送液後の微生物触媒濃度とニトリルヒドラターゼ活性が低く、微生物触媒を送液過程で損失することとなり、非経済的なアミド化合物製造法となる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の化合物の製造方法により、経済的で高品質な化合物を得ることができる。特にアミド化合物を製造した場合には、経済的で不純物の少ないアミド化合物を得ることができる。
【符号の説明】
【００５２】
１ 菌液リザーバー
２ チューブポンプ
３ 菌液回収
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物触媒を用いて、反応基質から化合物を製造する方法であって、
前記微生物触媒を溶媒に懸濁した微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して反応槽内に供給する供給工程を有し、
前記供給工程において、供給用配管における前記微生物触媒懸濁液の配管内線速度を０．０２〜０．１３ｍ/ｓとする
ことを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項２】
前記微生物触媒懸濁液中、微生物触媒が乾燥重量として４〜２０質量％の濃度で存在する
ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記微生物触媒を反応槽に連続的に供給する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記反応基質がニトリル化合物であり、化合物がアミド化合物である
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１】
微生物触媒を用いて、反応基質から化合物を製造する方法であって、
前記微生物触媒を溶媒に懸濁した微生物触媒懸濁液を、供給用配管を介して反応槽内に供給する供給工程を有し、
前記供給工程において、供給用配管における前記微生物触媒懸濁液の配管内線速度を０．０２〜０．１３ｍ/ｓとする
ことを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項２】
前記微生物触媒懸濁液中、微生物触媒が乾燥重量として４〜２０質量％の濃度で存在する
ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記微生物触媒を反応槽に連続的に供給する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記反応基質がニトリル化合物であり、化合物がアミド化合物である
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２１７３５１（Ｐ２０１２−２１７３５１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８３５５９（Ｐ２０１１−８３５５９）
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（３０１０５７９２３）ダイヤニトリックス株式会社 (127)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（３０１０５７９２３）ダイヤニトリックス株式会社 (127)
【Ｆターム（参考）】
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