抗炎症用組成物
【課題】ＮＦ−κＢ活性化の抑制を作用機序とする炎症性サイトカインの発現抑制を通じて様々な症状の改善または予防手段を提供する。
【解決手段】セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物、セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物ならびにセロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。本発明の組成物は、医薬または食品として用いられる。
【解決手段】セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物、セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物ならびにセロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。本発明の組成物は、医薬または食品として用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロトニン誘導体のＮＦ−κＢの活性化抑制作用に基づく医薬または食品用途に関する。より具体的には、例えば、セロトニン誘導体の抗炎症用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、種々の外因性または内因性の組織障害刺激に対する生体の応答である。感染などにより生体組織の一部が障害されると、組織からは様々な生体反応修飾物質が産生・放出され、炎症が生じる。初期にはTNF-αやIL-1などの炎症性サイトカインが炎症部位で産生され、それらの作用により、血管内皮上に細胞接着因子（ICAM-1、VCAM-1など）の発現が増強し、炎症性細胞の血管壁接着が亢進する。同時に、炎症部位より産生されるMCP-1やIL-8などの走化因子によって、単球やリンパ球、好中球が炎症組織に浸潤する。内皮下に浸潤した炎症性細胞からは、更に種々のサイトカインや活性酸素、水解酵素などが病原微生物などに対して分泌されるが、それらは同時に宿主組織をも障害する。このような過程を経て、起炎物質が消滅または除去されると、通常は炎症細胞の移入が停止し、炎症は消散に向かうが、組織障害が強かった場合は完全には修復されず、組織の実質細胞が結合組織により置換（線維化）される結果、組織の機能低下を招く場合が生じる。また、結核のような持続感染、自己免疫機序による自己組織障害、酸化LDLの蓄積などは、炎症を遷延化させ、慢性炎症と呼ばれる、活動性炎症反応、組織破壊、組織修復を繰り返し長期に渡って進行するという病態を形成することがある。こうした慢性炎症性疾患にはベーチェット病などのような難治性のものが少なくなく、患者は長期にわたってQOLの低下に苦しめられることになる。
【０００３】
これらの炎症プロセスにおいては、多くの遺伝子が活性化されるが、ＮＦ−κＢはこの遺伝子活性化プロセスに中心的な役割を担う転写因子である。ＮＦ−κＢは、p５０とp６５の二つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、通常、抑制性タンパクであるＩ−κＢと複合体を形成して不活性体として細胞質に存在するが、刺激によりＩ−κＢがリン酸化を受けて分解され、複合体から離脱すると、ＮＦ−κＢヘテロダイマーは核内に移行してＤＮＡと結合し、結合サイト下流の遺伝子発現を調節することが知られている。ＮＦ−κＢの活性化と核内へのトランスロケーションの過程には酸化ストレスが関与していると言われている。そのメカニズムについては未だ不明な点も多いが、ある種の活性酸素種（ＲＯＳ）がＩ−κＢリン酸化酵素を活性化し、Ｉ−κＢの分解を促すと考えられている。複数の抗酸化物質の添加や、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素の過剰発現がＮＦ−κＢの活性化を抑制することが知られている。これとは逆に、核内に移行した活性化ＮＦ−κＢのＤＮＡ上への結合は酸化剤によって阻害され、チオール類により促進される。このように、ＮＦ−κＢの活性化と、それに引き続いて起こる各種遺伝子産物の発現はいずれもレドックス制御下に置かれていると言えるが、その制御様式は異なっているため、細胞内のレドックス状態の変化がＮＦ−κＢの制御下にある遺伝子産物の発現に及ぼす影響は一様ではなく、複雑である（非特許文献１）。ＮＦ−κＢによる発現調節を受ける遺伝子産物としては、TNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症性サイトカイン、ICAM-1、VCAM-1、E-セレクチンなどの細胞接着因子、IL-8やMCP-1などの細胞走化因子（ケモカイン）、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）、組織因子（TF）や誘導型シクロオキシゲナーゼ（COX-2）などが代表的なものとしてあげられる。多くの疾患にＮＦ−κＢの活性化が関与していると言われている。重要なものとしては、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、ウイルス感染（HIV、サイトメガロウイルスなど）、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、乾癬、炎症性腸疾患（IBD）、II型糖尿病、気管支喘息、敗血症、自己免疫疾患などがあげられる。
【０００４】
ＮＦ−κＢの活性化によって発現が上昇するＶＣＡＭ−１（Vascular Cell Adhesion Molecule-1)は、分子量110kDaの糖タンパクで、主に血管内皮細胞、マクロファージなどに発現が認められる。その主な働きは、リンパ球、単球などに発現しているβ1-インテグリンファミリーの一つであるＶＬＡ４と結合することにより、白血球を血管内皮細胞上に強固に接着させることである。ＶＣＡＭ−１と疾患の関連については、動脈硬化、同種移植拒絶反応、悪性腫瘍(メラノーマ等)の転移など、様々な急性／慢性炎症性疾患の病変局所の血管内皮細胞において発現亢進が確認されている。
【０００５】
ＭＣＰ−１（Monocyte Chemotactic Protein-1）は、内皮細胞、平滑筋細胞、およびマクロファージなどから産生され、血管内皮細胞に接着した単球／マクロファージ、Ｔリンパ球の内皮下への遊走を強力に誘導することから、ＭＣＰ−１は各種の炎症病変において単球およびＴ細胞の組織浸潤を促進すると考えられている。ＭＣＰ−１も多くの疾患との関わりが知られており、気管支喘息やアレルギー性鼻炎、慢性関節リウマチ、肺高血圧、肝線維症、腎硬化症、ウイルス性脳炎、動脈硬化、子宮内膜症、炎症性腸疾患（IBD）などの慢性炎症疾患や、アレルギー疾患／免疫異常において、局所における産生亢進、あるいはMCP-1中和抗体／アンタゴニストによる症状の改善などが報告されている。
【０００６】
炎症性疾患の治療には様々な抗炎症剤が用いられるが、種々の炎症性メディエーターの産生、または炎症性細胞接着分子の発現を抑制するものとしては、いまだに決め手となるようなものはない。その理由の一つとしては、上述したように炎症反応には多数の遺伝子産物が関与するため、単一の酵素活性やサイトカイン産生をブロックするだけでは不十分と考えられることである。例えば、NSAID（非ステロイド抗炎症剤）類は、アラキドン酸代謝においてシクロオキシゲナーゼを阻害することにより、炎症性プロスタグランジンの産生を抑制するが、サイトカインの産生を直接阻害することはない。サイトカイン抗体またはサイトカイン受容体ブロッカーなどを用いた抗サイトカイン療法は、特定のサイトカインの機能を抑制できても、複数のサイトカインの活性を直接抑制することはできない。例えば、抗ICAM-1抗体は臓器移植時の拒絶反応抑制などで効果が報告されているが、他の接着分子や炎症性サイトカイン類に対する直接的な作用はない。また、抗サイトカイン療法の場合、初期の投与効果は大きくても効果の持続性が疑問視されており、慢性炎症性疾患への臨床応用は困難と考えられる。一方、従来の、免疫抑制剤を含む抗炎症剤、抗サイトカイン療法には多くの副作用が報告されている。例えば、ステロイド剤は、経口投与が可能で、非特異的に複数のサイトカインの産生を抑制するメリットを持つが、その一方で感染増悪、リバウンドなどの問題を抱えている。抗TNF-α抗体は慢性関節リウマチやクローン病で効果が示されているが、感染症やアレルギー（アナフィラキシーショック）などの重大な問題が指摘されている。
【０００７】
これら既存の抗炎症剤に対して、ＮＦ−κＢ抑制剤は、上述した各種起炎性物質の産生に関与する遺伝子の活性化における共通のプロセスを抑制するため、広く抗炎症的に作用する可能性が考えられる。すなわち、複数の炎症性サイトカインの転写を同時に抑制することにより、炎症性サイトカインの異常産生に基づく疾患を治療する医薬品、また、HIVやサイトメガロウイルスなどの、ＮＦ−κＢの活性化が自己の複製に必要なウイルスに対する抗ウイルス剤、細胞接着分子の発現を抑制することによる抗炎症または癌転移抑制剤、臓器移植の際に用いる免疫抑制剤への応用などが考えられる。
【０００８】
食品などに含まれる天然成分にもＮＦ−κＢ抑制作用を有するものがいくつか知られている（ケルセチン（非特許文献２）、クルクミン（非特許文献３）、イソビテキシン（非特許文献４）、アピゲニン（非特許文献５）、ピクノジェノール（非特許文献６）、など）。これらのポリフェノール類は経口的に摂取されており、安全性は比較的高いと考えられるだけでなく、一部については抗酸化活性や抗動脈硬化作用などが報告されている（非特許文献７、８）ことなどから、慢性炎症病態の日常的な制御や、炎症性疾患の発症予防に有用である可能性がある。しかしながら、これらのＮＦ−κＢの抑制作用はin vitroで調べられたものであるのに対し、生体内ではポリフェノール類は代謝されて抗酸化作用が減弱する、あるいは失われる例が報告されている（非特許文献９）ことから、これらの物質が実際に生体内で抗炎症作用を発揮するかどうかについては不明である。
【０００９】
ベニバナ種子脱脂粕抽出物は、in vitroで低比重リポタンパク（LDL）の酸化を強力に抑制し、apoE KOマウスにおける動脈硬化病変形成を抑制する作用（特許文献１）、動脈硬化モデルであるKHCウサギや、ヒトボランティアにおける血圧・脈波改善作用（特許文献２）を有することが示されている。この抽出物中に含まれるヒドロキシ桂皮酸セロトニンアミド（セロトニン誘導体）は、apoE KOマウスにおける抗動脈硬化活性本体の少なくとも一つであると考えられる（特許文献１）。ベニバナ種子中のセロトニン誘導体としては、主としてN-(ｐ-Coumaroyl)serotonin（ＣＳ）とN-Feruloylserotonin（ＦＳ）、およびそれらの配糖体の４種が知られており、これらの化合物の構造は、上記非特許文献２〜６に示されたＮＦ−κＢ抑制剤とは全く異なるものである。ＣＳとＦＳは、共にほぼ同レベルの抗酸化活性（DPPHラジカル消去活性、LDL酸化抑制作用など）を有することが示されている。これらのうち、ＣＳについては、細菌のリポ多糖（LPS）で刺激されたヒト末梢血単球におけるTNF-α、IL-1、IL-6などの炎症性サイトカイン産生を抑制することがKawashimaらにより報告されている（非特許文献１０）。この報告によれば、ＣＳは50μM以上の濃度でTNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6の産生を転写レベルで阻害し、ＮＦ−κＢ活性化阻害がEMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）の結果認められたとしている。しかしながら、同じ研究グループの続報（非特許文献１１）では、上記のＣＳの効果は炎症性サイトカインに特異的なものではなく、末梢血由来単球におけるＣＳの非特異的なタンパク合成阻害作用と抗酸化作用の結果であると考察している。これらの知見を総合すると、末梢血単球以外の細胞におけるセロトニン誘導体の炎症性サイトカイン発現またはＮＦ−κＢ活性に及ぼす影響は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開番号第２００３／０８６４３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７/０３２５５１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Halliwell B and Gutteridge JM, Free Radicals in Biology and Medicine Third Edition, Oxford Science Publications (1999)
【非特許文献２】Martinez-Florez Sら、J. Nutr. 135:1359-1365 (2005)
【非特許文献３】Yeh C-Hら、J. Surgical Res.125:109-116 (2005)
【非特許文献４】Lin C-Mら、Planta Medica 71:748-753 (2005)
【非特許文献５】Gerritsen MEら、Am. J. Pathol. 147:278-292 (1995)
【非特許文献６】Packer L, Book of abstracts, 219th ACS National Meeting, SanFrancisco, CA, March 26-30, (2000)
【非特許文献７】Nakamura Yら、Jpn. J. Cancer Res. 89:361-370 (1998)
【非特許文献８】Kamada Cら、Free Rad. Res. 39:185-194 (2005)
【非特許文献９】Williamson Gら, Free Rad Res. 39:457-469 (2005)
【非特許文献１０】Kawashima Sら、J. Interferon Cytokine Res. 18:423-428 (1998)
【非特許文献１１】Takii Tら、Int. Immunopharmacol. 3:273-277 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ＮＦ−κＢ活性化の抑制を作用機序とする炎症性サイトカインの発現抑制を通じて様々な症状の改善または予防手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、セロトニン誘導体、とりわけフェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニンが血管内皮細胞に対して有意なＮＦ−κＢ活性化の抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１４】
〔１〕セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔５〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔７〕医薬である、前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔８〕ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔７〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔９〕食品である、前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔９〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔１０〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１２〕前記〔７〕または〔８〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢ活性化を抑制する方法。
〔１３〕ＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔１４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔１３に記載の使用。
〔１６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１３〕に記載の使用。
〔１７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔１３〕〜〔１６〕いずれかに記載の使用。
〔１８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔１７〕に記載の使用。
〔１９〕前記〔７〕または〔８〕に記載の組成物および当該組成物をＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔２０〕ＮＦ−κＢ活性化に起因する状態の治療または改善に用いられるという表示を付した、前記〔１０〕または〔１１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔２１〕セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物。
〔２２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２５〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔２１〕〜〔２４〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔２６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔２５〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２７〕医薬である、前記〔２１〕〜〔２６〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔２８〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔２７〕に記載の発現抑制組成物。
〔２９〕食品である、前記〔２１〕〜〔２６〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔３０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔２９〕に記載の発現抑制用組成物。
〔３１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔３０〕に記載の発現抑制用組成物。
〔３２〕前記〔２７〕または〔２８〕に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現を抑制する方法。
〔３３〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔３４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３７〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔３３〕〜〔３６〕いずれかに記載の使用。
〔３８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔３７〕に記載の使用。
〔３９〕前記〔２７〕または〔２８〕に記載の組成物、および当該組成物をＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔４０〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する状態の予防または改善に用いられるという表示を付した、前記〔３０〕または〔３１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔４１〕セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。
〔４２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔４１〕〜〔４４〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔４６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔４５〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４７〕医薬である、前記〔４１〕〜〔４６〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔４８〕炎症性腸疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔４７〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４９〕食品である、前記〔４１〕〜〔４６〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔５０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔４９〕に記載の抗炎症用組成物。
〔５１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔５０〕に記載の抗炎症用組成物。
〔５２〕前記〔４７〕または〔４８〕に記載の抗炎症用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患を治療または予防する方法。
〔５３〕抗炎症用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔５４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔５３〕〜〔５６〕いずれかに記載の使用。
〔５８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔５７〕に記載の使用。
〔５９〕前記〔４７〕または〔４８〕に記載の組成物、および当該組成物を炎症性疾患の治療または予防に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔６０〕炎症性疾患の予防または改善に用いられるという表示を付した、前記〔５０〕または〔５１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔６１〕セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔６１〕〜〔６４〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔６５〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６７〕セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制剤。
〔６８〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔６９〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔７０〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔７１〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔６７〕〜〔７０〕いずれかに記載の発現抑制剤。
〔７２〕前記植物が紅花の種子である、前記〔７１〕に記載の発現抑制剤。
〔７３〕セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症剤。
〔７４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔７３〕〜〔７６〕いずれかに記載の抗炎症剤。
〔７８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔７７〕に記載の抗炎症剤。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＮＦ−κＢの活性化に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＲＯＳ産生の上昇を用量依存的に低下させることを調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響をリアルタイムＰＣＲで調べた結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）のタンパク質発現誘導に及ぼす影響を免疫染色で調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、セロトニン誘導体がヒト大動脈内皮細胞上への単球接着に及ぼす影響を細胞数の計測により調べた結果を示すグラフである。
【図６】図６は、セロトニン誘導体がヒト大動脈内皮細胞上への単球接着に及ぼす影響を蛍光標識により調べた結果を示すグラフである。
【図７】図７は、セロトニン誘導体が単球の遊走能に及ぼす影響を細胞数の計測により調べた結果を示すグラフである。
【図８】図８は、セロトニン誘導体が単球の遊走能に及ぼす影響を蛍光標識により調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、セロトニン誘導体を摂取したマウスにおける血漿中のｓＶＣＡＭ−１レベルを調べた結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、セロトニン誘導体を摂取したヒトボランティアにおける血清中のｓＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）レベルを調べた結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸腸管長（A）、大腸重量（B）、単位長あたりの大腸重量（C）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の白血球数（A）、血小板数（B）、好中球数（C）、単球数（D）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１３】図１３は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の血中NOx濃度に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１４】図１４は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸病理組織における影響を示す写真である。
【図１５】図１５は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸組織におけるIL-1β、TNFαの遺伝子発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、有効成分としてセロトニン誘導体を含有するＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物に関するものである。既に背景技術の欄でも述べたように、炎症性疾患の発症、増悪の過程には、各種の炎症性メディエーター（炎症性サイトカイン、接着因子、白血球走化因子、プロスタグランジン類など）の産生が関与している。これらの炎症性メディエーターの産生に関わる遺伝子の多くは、その発現過程にＮＦ−κＢの活性化というプロセスを共有していることが知られている。また、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１やサイトメガロウイルスなどは、自己の複製の過程でＮＦ−κＢの活性化を必要とする。また、各種サイトカインの発現誘導にもＮＦ−κＢの活性化が関与している。したがって、ＮＦ−κＢの活性化を抑制する物質は、多くの炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患などの発症および進展を抑制する可能性がある。
【００１７】
炎症性疾患としては、例えば、心筋梗塞、ウイルス性脳炎、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、乾癬、炎症性腸疾患、肺高血圧、敗血症、II型糖尿病、肝線維症、腎硬化症、子宮内膜症などがあげられる。
【００１８】
ウイルス感染としては、例えば、エイズ、成人Ｔ細胞白血病、ヘルペスウイルス、ＥＢウイルスなどがあげられる。
【００１９】
腫瘍の転移としては、例えば、悪性腫瘍(メラノーマ、大腸癌、乳癌等)の転移があげられる。
【００２０】
免疫疾患としては、例えば、アレルギー（気管支喘息、アレルギー性鼻炎など）、同種移植拒絶反応などがあげられる。
【００２１】
本発明は、ＮＦ−κＢの活性化が深く関与していると考えられる上記疾患および障害を予防、改善または治療するために、セロトニン誘導体を用いる方法を提供するものである。ただし、ＮＦ−κＢの活性化に応答する疾患および障害は、ここにあげたものに限定されない。なお、本明細書および請求の範囲にいうセロトニン誘導体は、製品化上許容し得る塩を含有する概念であり、塩としては、酸付加塩、例えば無機酸付加塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩など）、有機酸付加塩（蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、アミノ酸との塩（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、金属塩、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）およびアルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）などがあげられる。
【００２２】
本発明における「ＮＦ−κＢ活性化抑制」とは、ＮＦ−κＢの核内への移行を抑制することをいう。ＮＦ−κＢの核内への移行の抑制については、実施例１に記載の方法により確認することができる。すなわち、ヒト大動脈内皮細胞の培養液中に被験物質を添加し、所定の時間インキュベートした後、グルコースで刺激した前記細胞から核を抽出し、核内に移行した活性化ＮＦ−κＢ（ｐ６５）を検出する。ＮＦ−κＢが活性化されていないグルコース刺激前の細胞を陰性対照とし、被験物質を添加しないでグルコースで刺激した細胞を陽性対照として、前記ｐ６５の検出程度が陽性対照よりも陰性対照に近い場合、ＮＦ−κＢ活性化抑制であると判断する。
【００２３】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物に含まれるセロトニン誘導体としては、例えば下記の式で表される化合物（Ｉ）が例示される。
【００２４】
【化１】
【００２５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または糖を表し、ｎ、ｍ、およびｌは０または１を表す）本明細書において、炭素数１〜３のアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピルがあげられる。糖としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、フルクトース、ルチノース、ガラクツロン酸、グルクロン酸、ネオヘスペリドースなどがあげられる。好ましい化合物としてはヒドロキシ桂皮酸のセロトニンアミドが例示される。
【００２６】
ヒドロキシ桂皮酸としては、p-クマル酸、フェルラ酸、カフェ酸が好適なものとしてあげられ、そのセロトニンアミドとしては、N-(ｐ−クマロイル)セロトニン（あるいはｐ−クマリルセロトニン、またはｐ−クマロイルセロトニン）、N-フェルロイルセロトニン（あるいはフェルリルセロトニン、またはフェルロイルセロトニン）、カフェオイルセロトニンが例示される。
【００２７】
本発明で使用されるセロトニン誘導体は配糖体であってもよい。ここで配糖体とは、式（Ｉ）におけるＲ１にグルコースがβグルコシド結合したO-β-D-グルコピラノシドなどが例示されるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
セロトニン誘導体は、上記化合物の１種を単独で、あるいは２種以上の化合物を併用して、使用することができる。
【００２９】
セロトニン誘導体は、化学的に合成することにより、また天然物から抽出することにより調製可能である。
【００３０】
当該化合物は自体既知のものであり、その合成には自体既知の方法を採用すればよい。好適な具体例としては、後述の試験例１に記載の方法があげられる。
【００３１】
天然物から抽出する場合には、原料としては様々な植物組織が用いられる。例えば、紅花やヤグルマギクをはじめとするキク科植物、特にその種子、クロヒエやコンニャクイモ等の特にその穀粒、塊茎などがあげられるが、好ましくは紅花の種子、あるいはその脱脂粕である。本発明において植物種子とは、植物種子を構成する全体、あるいはその一部、例えば、種皮、胚乳、胚芽等を取り出したものでもよく、それらの混合物であってもよい。これらのものからの抽出方法としては、例えば、下記の如き方法があげられる。
【００３２】
植物組織は、通常脱脂物（ミール）として抽出に供される。脱脂物は自体公知の方法により、例えば植物種子等の植物組織を脱脂して得ることができるが、例えば種子を圧搾抽出するかまたは種子の破砕物にｎ−ヘキサン等を加えて抽出した後、抽出系から固形分を取り出し、該固形分を乾燥して得ることができる。脱脂程度は通常６０重量％以上、好ましくは８０重量％以上である。
【００３３】
また、抽出方法としては、例えば以下の、原料である脱脂後の植物種子を水で洗浄後、有機溶媒で抽出する方法が例示される。
【００３４】
水は、特に限定されず、例えば蒸留水、水道水、工業用水及びこれらの混合水等のいずれも用いることができる。水には、本発明の効果が得られる限り、他の物質、例えば無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等）、酸（例えば塩化水素、酢酸、炭酸、過酸化水素、リン酸等）、アルカリ（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等）等を含んでいてもよい。洗浄の際のｐＨは通常２〜９であり、好ましくは５〜７である。
【００３５】
水の使用量は、総量として、原料である脱脂後の植物種子に対して、通常２〜１００倍量（水容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは１０〜４０倍量である。
【００３６】
洗浄は、自体公知の方法で、原料である脱脂後の植物種子と水とを接触させて行うことができる。例えば、脱脂後の植物種子を水に懸濁後、濾過して固形の洗浄処理物を回収する方法等があげられる。洗浄は、上記の量の水を、脱脂後の植物種子に一度にまたは複数回に分けて、または連続的に接触させて行ってもよい。接触させる際の温度は通常５〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃である。接触させる時間は通常１０〜２４０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００３７】
上記のようにして得られた脱脂後の植物種子等の洗浄処理物から有機溶媒で抽出して植物種子等の抽出物を得ることができる。
【００３８】
有機溶媒として、例えば、低級アルコール、アセトン、アセトニトリル及びそれらの混合溶媒等があげられるが、それらに限定されない。有機溶媒は、水を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。有機溶媒の濃度は、通常２０〜９５重量％、好ましくは５０〜９０重量％である。有機溶媒は抽出後の抽出物の濃縮、乾燥及び食品製造の点からは低級アルコールが好ましい。低級アルコールとして、例えば炭素数１〜４のアルコールがあげられ、具体的には例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等があげられるが、これらに限定されない。低級アルコールは、食品製造の点からは、エタノールが好ましい。エタノールは、エタノール分を５０重量％以上含む含水エタノールあるいは無水エタノールが好ましい。
【００３９】
有機溶媒の使用量は、原料である脱脂後の植物種子の通常２〜４０倍量（有機溶媒容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは２〜１０倍量である。抽出温度は通常２０〜７５℃、好ましくは５０〜７０℃である。抽出時間は通常１０〜２４０分、好ましくは６０〜１２０分である。
【００４０】
抽出後、懸濁液より濾過等により固形分を分離して得られた抽出液は、そのまま、または必要により濃縮、乾燥して本発明の植物種子抽出物として用いることができる。濃縮、乾燥は抽出液そのままを濃縮、乾燥してもよく、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖、デンプン、サイクロデキストリン等）を添加して実施してもよい。上記の溶媒で抽出された抽出物は、その純度で、本発明に供してもよいが、更に自体公知の方法により精製しても良い。
【００４１】
更に純度を上げるための一例を記載するが、これに限定されない。上述の溶媒抽出物の有機溶媒を減圧留去し、水を加え、抽出物を水に懸濁し、水相を非極性溶媒、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン等で、好ましくはｎ−ヘキサンで洗浄し、洗浄後の水層を、二層に分かれて目的の組成物を抽出できる溶媒、例えば、酢酸エステルやｎ−ブタノールなど、好ましくは、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸プロピル等で抽出する。次いで、抽出液を飽和食塩水等で洗浄し、有機層を得る。酢酸エステルで抽出した場合、該有機層を、例えば、無水硫酸マグネシウム等で、脱水し、次いで減圧濃縮して、固形物（組成物）を得る。以上のどの段階で、精製を止めても良いし、いずれかの工程を省いても良いし、改変を加えても良いし、更に精製を進めても良い。上記溶媒の種類を変えることも含めて多段抽出法や向流分配法なども用いることができる。
【００４２】
本発明で使用されるセロトニン誘導体、とりわけN-(ｐ-クマロイル)セロトニン、およびN-フェルロイルセロトニンは、細胞内の酸化ストレスを抑制することにより、ＮＦ−κＢの活性化を抑制し、その核内移行を抑制する。その結果、ＮＦ−κＢの制御下にあるＶＣＡＭ−１やＭＣＰ−１遺伝子などの発現が転写レベルで抑制され、それらの遺伝子産物の過剰産生が抑制され、抗炎症的に作用するものと考えられる。N-(ｐ-クマロイル)セロトニン（p-クマロイルセロトニン）、およびN-フェルロイルセロトニン（フェルロイルセロトニン）は、以下の構造式で表される。
【００４３】
【化２】
【００４４】
別の側面では、本発明は、セロトニン誘導体を含有するＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物にも関する。当該組成物は、上述した多くの炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患の中でも、特に、炎症性腸疾患、肺高血圧症、関節リウマチ、肝線維症などの難治性炎症性免疫疾患、臓器移植後の動脈硬化、腎硬化症、子宮内膜症、気管支喘息またはアレルギー性鼻炎の改善または予防が期待される。
【００４５】
本発明の組成物は、前記セロトニン誘導体を有効成分とし、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン、サイクロデキストリン等）、場合によっては、香料、色素、調味料、安定剤、防腐剤等も含有するものであり、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、食品（食品組成物）や医薬製剤（医薬組成物）として用いることができる。
【００４６】
本発明の組成物中に含まれるセロトニン誘導体の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常、０．０００１〜９９．９重量％であり、好ましくは０．００１〜９９．５重量％であり、より好ましくは０．００５〜９９重量％である。
【００４７】
特に、医薬として使用する場合、医薬として許容できる担体（添加剤も含む）と共に製剤化することができる。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品をも含むものであり、さらにダイエタリーサプリメント（サプリメント、栄養補助食品）、飼料、食品添加物等も本発明の食品に包含される。
【００４９】
食品用途の場合、セロトニン誘導体を、例えば、ドレッシング、マヨネーズ等の一般食品（いわゆる健康食品を含む）に含有させて用いることもできる。また、セロトニン誘導体を、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン等）、場合によっては、香料、色素等と共に、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップ及びトローチ等に製剤化して、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメントとして用いることができる。また、本発明の組成物は、飼料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料に添加して摂取または投与することができる。
【００５０】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「ＮＦ−κＢ活性化に起因する状態の予防または改善に用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５１】
本発明のＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の改善または予防のために用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５２】
本発明の抗炎症用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「炎症性疾患の改善または予防のために用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５３】
本発明の組成物の対象は、ヒトを含む動物（ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類等）である。また、本発明の組成物が標的とする細胞は、単球以外の細胞であれば特に限定されるものではないが、ＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１が高発現している細胞、具体的には、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、腎糸球体細胞が好適な例としてあげられる。また、本発明の組成物が対象とするエフェクター細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球などの顆粒球、キラーＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、樹状細胞などがあげられる。
【００５４】
本発明の組成物の摂取または投与方法は、摂取または投与対象の年齢、体重、健康状態によって異なるが、例えば、健康の維持・増進や疾患の予防を目的とする場合は、通常、食品の形態にして経口的に摂取し、一方、疾患の治療や健康回復を目的とする場合には、通常、医薬品、または食品の形態にして、経口的、または注射、外用剤などにより投与する。用量としては、合成したセロトニン誘導体を投与する場合、成人１日当たり０．２ｍｇ〜２ｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２ｇを１日１回から数回に分けて摂取、または服用することが好ましい。また、実施例６または実施例８の紅花種子抽出物を経口的に摂取する場合、成人１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは、１００ｍｇ〜１０ｇを１日１回から数回に分けて摂取、または服用することが好ましい。この場合、一日あたりの摂取量または1回あたりの摂取量を一単位包装とすることができる。
【００５５】
本発明の組成物中に含まれるセロトニン誘導体は、上述のように動物に摂取または投与された後、その血中濃度が一定期間一定のレベルを維持していることが好ましい。血中濃度としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常５０μＭ未満であり、好ましくは０．１〜１０，０００ｎＭ、より好ましくは１〜５，０００ｎＭ、さらにより好ましくは１００〜１，０００ｎＭが推奨される。
【００５６】
セロトニン誘導体は、様々な植物の種子や塊茎などに含まれており、とりわけ紅花種子に多く含まれている。韓国では古来、紅花種子は骨折治癒促進、骨粗鬆症予防などの用途で、民間で用いられており、安全性は高いと考えられる。実施例９の結果も、本発明の組成物の毒性が低く、副作用がほとんど認められないことを裏付けている。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例等をあげて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
試験例１（セロトニン誘導体の合成）
ｐ−クマロイルセロトニン（ＣＳ）、およびフェルロイルセロトニン（ＦＳ）を以下の方法で合成した。
【００５８】
ＣＳ：セロトニン塩酸塩をジメチルホルムアミド（５ｍＬ／ｇ ｖｓ．セロトニン塩酸塩、以下同様）およびジクロロメタン（２０ｍＬ／ｇ）で溶解後、ｔｒａｎｓ−４−クマル酸（１．０モル／モル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−エチル−カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびトリエチルアミンを各１．１等量加え、室温で終夜攪拌し反応させた。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチルと水（各４０ｍＬ／ｇセロトニン量）を加え、酢酸エチル抽出を行った。３回の酢酸エチル抽出により得た抽出相を５％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤を除去した抽出液を減圧濃縮し、酢酸エチル−エタノール（１０：０．６）にて晶析後、得られた結晶を酢酸エチルで洗浄し、乾燥させ、ＣＳを得た（収率＝６９．８％）。
【００５９】
ＦＳ：セロトニン塩酸塩とｔｒａｎｓ−４−フェルラ酸より上記ＣＳと同様の方法で合成したが、晶析はメタノール−クロロホルム（１：１５）にて行った（収率69.2％）。
【００６０】
実施例１（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＮＦ−κＢの活性化に及ぼす作用）
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）はクロネティクスより購入し、３〜４代継代培養（３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下）したものを実験に用いた。培養ディッシュ（１００ｍｍφ）中で、ＣＳおよびＦＳ（各５および１０μＭ）と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭのグルコースで２時間刺激した。Nuclear Extract Kit (アクティブモチーフ)を用いて細胞より核を抽出し、TransAM ＮＦ−κＢ p65 Kit (アクティブモチーフ)を用いて核内に移行した活性化ＮＦ−κＢ（ｐ６５）を検出した。
【００６１】
図１に示したように、２時間の高濃度グルコース処理により、ｐ６５の核内移行は顕著に増加し、ＮＦ−κＢの著明な活性化が認められたが、５および１０μＭのＣＳまたはＦＳの前処理により、ｐ６５の核内移行は有意に抑制された。このことから、セロトニン誘導体はヒト大動脈内皮細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を抑制することが示された。
【００６２】
ＮＦ−κＢ活性化抑制機序を調べるため、上記と同様にセロトニン誘導体を前処理したＨＡＥＣ細胞を２５ｍＭグルコースで１時間刺激し、細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）産生に基づく蛍光強度を、Takahashi Mら、Free Radic. Biol. Med. 31:164-174 (2001)の方法に従って測定したところ、高濃度グルコース刺激によるＲＯＳ産生の上昇を、セロトニン誘導体は用量依存的に低下させることが判明した（図２）。このことから、セロトニン誘導体は、細胞内酸化ストレスを抑制することにより、ＮＦ−κＢの活性化とそれに引き続いて起こるＮＦ−κＢの核内移行を抑制することが示された。
【００６３】
実施例２（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の遺伝子発現に及ぼす作用）
１０μＭのＣＳまたはＦＳで２４時間前処理したＨＡＥＣ細胞を２５ｍＭグルコースで３時間刺激した後、トータルＲＮＡをIsogenキット(ニッポンジーン)を用いて抽出した。１μｇのRNAから、１００Ｕ／ｍＬの逆転写酵素（タカラバイオ）と０．１μMのオリゴ(ｄＴ)-アダプター（タカラバイオ）（反応液総量５０μＬ）を用いてｃＤＮＡを合成した（４２℃、４０分）。リアルタイムＰＣＲは7300 Real Time PCR system (アプライドバイオシステムス)を用いて行い、SYBER Green Iを用いてＰＣＲ産物を検出した。
【００６４】
ＰＣＲ反応組成（RT-PCRキット、タカラバイオ）：１２．５μＬ Premix Ex Taq、２．５μＬ SYBER Green I、合成プライマー、ROX reference dye、ｃＤＮＡ（２０ｎｇのトータルＲＮＡに相当）、最終反応容量２５μＬ
プライマーは以下の配列のものを用いた。
ＶＣＡＭ−１遺伝子の検出：
5’-CCCTTGACCGGCTGGAGATT-3’（センス）（配列番号１）
5’-CTGGGGGCAACATTGACATAAAGTG-3’（アンチセンス）（配列番号２）
ＭＣＰ−１遺伝子の検出：
5’-CGCCTCCAGCATGAAAGTCT-3’（センス）（配列番号３）
5’-GGAATGAAGGTGGCTGCTATG-3’（アンチセンス）（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ（内部標準）遺伝子の検出：
5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’（センス）（配列番号５）
5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（アンチセンス）（配列番号６）
ＰＣＲは以下の条件で実施した。
熱変性：９５℃で１５秒、伸長反応：４０サイクル（９５℃で３秒、６０℃で３１秒）
ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨを内部標準として求めた。
【００６５】
図３Ａ、Ｂに示したように、高濃度グルコース刺激により、ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡのＨＡＥＣ細胞における発現量は共に未処理細胞の約３倍に上昇したが、ＣＳ、ＦＳはいずれもその上昇を有意に抑制した。このことから、セロトニン誘導体はヒト大動脈内皮細胞を高グルコースで刺激した際のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の発現を転写レベルで抑制することが示された。実施例１の結果から、セロトニン誘導体は、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することにより、高グルコース刺激によって誘導されるこれらの遺伝子の転写を抑制したものと考えられた。
【００６６】
実施例３（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１タンパク質発現に及ぼす作用）
９６穴マイクロプレート上でコンフルエントになるまで増殖させたＨＡＥＣ細胞を０．１〜１０μＭのセロトニン誘導体と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭグルコースで４時間刺激した。細胞層をHanks液で洗った後、抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ベクトンディキンソン）を添加して３７℃、１時間インキュベートし、洗浄後、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギＦ(ａｂ’)２フラグメント；カッペル）と１時間インキュベートした。発色基質（ο−フェニレンジアミン２塩酸塩）を添加して約３０分後（室温）、各ウエルの吸光度（４９２ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで定量した。一方、培地中のＭＣＰ−１濃度は、Human MCP-1 Immunoassay Kit (バイオソースインターナショナル)を用いて定量した。
【００６７】
図４Ａ、Ｂに示したように、高濃度グルコース刺激により細胞膜上のＶＣＡＭ−1の発現、および培地中へのＭＣＰ−１分泌は、未処理時のそれぞれ２倍弱、約３．５倍に上昇したが、ＣＳおよびＦＳは共に用量依存的にこれらの発現誘導を抑制した。このことから、セロトニン誘導体は、ヒト大動脈内皮細胞を高グルコースで刺激した際のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の発現誘導を抑制することがタンパク質レベルで示された。
【００６８】
実施例４（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＨＡＥＣ細胞上への単球接着に及ぼす作用）
２４穴マルチウエルプレートにてコンフルエントまで増殖させたＨＡＥＣ細胞をＣＳ、およびＦＳ（各５および１０μＭ）と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭグルコースで４時間刺激した。細胞層をHanks液で洗浄後、Ｕ−９３７単球細胞（ＡＴＣＣより購入）の懸濁液（１×１０６／ｍＬ）を２００μＬ添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。再び洗浄後、１％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＨＡＥＣ上に接着したＵ−９３７細胞数を顕微鏡下で計測した（２０視野）。実験は３回行い、結果はそれらの平均値で表した。蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた実験も同様に実施した。具体的には、１０μＭの２’,７’−ビス(２−カルボキシエチル)−５(６)−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル (ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、モレキュラープローブス)存在下でＵ−９３７細胞をインキュベート（３７℃、１時間）後、遠心により細胞を洗浄した。蛍光標識されたＵ−９３７細胞（１×１０６／ｍＬ）をＨＡＥＣ細胞に添加し、３７℃、１時間インキュベートした。浮遊しているＵ−９３７細胞を除去後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。接着した細胞の蛍光量を蛍光プレートリーダー（バイオラッド・フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ.５０３ｎｍ、Ｅｍ.５２５ｎｍ）。
【００６９】
図５に示したように、高濃度のグルコース刺激により、ＨＡＥＣ細胞上に接着したＵ−９３７細胞数は著明に増加したが、ＣＳおよびＦＳとのプレインキュベーションにより、接着した細胞数はセロトニン誘導体の用量依存的に減少した。同様の結果は、蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた蛍光強度アッセイによっても確認された（図６）。これらのことから、セロトニン誘導体は、高濃度グルコース刺激により誘導される単球の内皮細胞上への接着を抑制することが示された。実施例２、実施例３および高濃度グルコース刺激ＨＡＥＣにおけるＵ−９３７細胞の接着は、抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体の添加により抑制された（データ示さず）ことから、セロトニン誘導体が内皮細胞上のＶＣＡＭ−１発現誘導を抑制した結果であると考えられた。
【００７０】
実施例５（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）が単球の遊走能に及ぼす作用）
単球の遊走能はトランスウエルシステム（ポアサイズ３μｍ；ＢＤバイオサイエンス）を用いて行った。２４マルチウエルプレート中に設置したトランスウエル上で培養したＨＡＥＣを５、および１０μＭのセロトニン誘導体と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭのグルコースで４時間刺激した。Ｕ−９３７細胞懸濁液(１０６細胞／ｍＬ)２００μＬをトランスウエル内に添加し、そのまま３７℃で２時間インキュベートした。メンブレンを通過してトランスウエル下部に遊走してきた細胞の数を検鏡下でカウントした（２０視野）。実験は３回繰り返し、結果はそれらの平均値で表した。蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた実験も同様に実施した。上述した方法でＢＣＥＣＦ−ＡＭ標識したＵ−９３７細胞をトランスウエル上部に播種して３７℃、２時間インキュベートした。メンブレンを通過してトランスウエル下部に遊走してきた細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液に回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。遊走細胞由来の蛍光を蛍光プレートリーダー（バイオラッド フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ．５０３ｎｍ、Ｅｍ．５２５ｎｍ）。
【００７１】
インキュベート（３７℃、１時間）後、遠心操作により細胞を洗浄した。蛍光標識されたＵ−９３７細胞（１×１０６／ｍＬ）をＨＡＥＣ細胞に添加し、３７℃、１時間インキュベートした。浮遊しているＵ−９３７細胞を除去後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。接着した細胞の蛍光量を蛍光プレートリーダー（バイオラッド フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ．５０３ｎｍ、Ｅｍ．５２５ｎｍ）。
【００７２】
図７に示したように、ＨＡＥＣ細胞を高濃度グルコースで刺激することにより、内皮下に遊走するＵ−９３７細胞数が劇的に上昇したが、ＨＡＥＣ細胞をＣＳまたはＦＳとプレインキュベートすることにより、遊走細胞数は有意に減少した。同様の結果は、蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた蛍光強度アッセイによっても確認された（図８）。これらのことから、セロトニン誘導体は、高濃度グルコース刺激により誘導される単球の内皮下への遊走を抑制することが示された。実施例２および実施例３の結果から、セロトニン誘導体による単球の遊走抑制は、内皮細胞からのＭＣＰ−１産生を抑制した結果であると考えられた。
【００７３】
実施例６（動物用ベニバナ種子抽出物の調製）
ベニバナ種子抽出物の調製を以下の方法で実施した。搾油後のベニバナ脱脂種子６００ｇに３，０００ｍＬの９０容量％エタノール水を加えて、６０℃の湯浴中で３時間、加温、攪拌した後、ろ過した。ろ過後の固形分に対して同様の操作を１回行い、得られたろ過液を合一して減圧濃縮にて５００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液に水を加えて１，０００ｍＬとし、内容物を懸濁した後、５００ｍＬのｎ−ヘキサンにて２回洗浄し、洗浄後の水層を酢酸エチル５００ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後減圧濃縮してベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）１０．１ｇを得た。この方法で得られた抽出物中の総セロトニン誘導体含量（アグリコン＋配糖体）は２４．１％（アグリコン換算では２１．４％）であった。
【００７４】
実施例７（セロトニン誘導体およびベニバナ種子抽出物の摂取がａｐｏＥノックアウトマウス血漿中のｓＶＣＡＭ−１レベルに及ぼす作用）
６〜７週齢の雄性ａｐｏＥノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリーより購入）を１群７〜１０匹として、
１）対照（Control）、
２）セロトニン誘導体０．２％投与区（ＣＳ ＋ ＦＳ (０．２)；試験例１で合成されたＣＳ、ＦＳ各０．１重量％含有）、
３）セロトニン誘導体０．４％投与区（ＣＳ ＋ ＦＳ (０．４)；試験例１で合成されたＣＳ、ＦＳ各０．２％重量含有）、
４）ＦＳ ０．４％投与区（ＦＳ；試験例１で合成されたＦＳのみ０．４重量％含有）、
５）ベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）１％投与区（ＳＳＥ；実施例６で得たＳＳＥを１重量％含有）の計５群に分け、表１に示すような組成の餌を１５週間自由摂取させた。投与期間終了後、マウスをエーテル麻酔下、腹部大静脈より採血（抗凝固剤：ＥＤＴＡ−２Ｋ＋ヘパリン）し、３，０００ｒｐｍ、１５分の遠心操作を行い、血漿を回収した。血漿中の可溶性ＶＣＡＭ−１（ｓＶＣＡＭ−１）濃度は、ｓＶＣＡＭ−１測定ＥＬＩＳＡキット”Mouse sVCAM-1/CD106 Quantikine ELISA Kit”（Ｒ&Ｄシステムス）を用いて測定した。
得られた値については各群間で分散分析を行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定で試験食群の平均値を対照群のそれと比較した。
【００７５】
図９に示したように、セロトニン誘導体を長期摂取させたａｐｏＥノックアウトマウスの血中ｓＶＣＡＭ−１レベルは、いずれの群においても低下傾向を示した。ＳＳＥを摂取させた動物においては統計学的に有意に血中ｓＶＣＡＭ−１レベルを低下させた。これらのことから、セロトニン誘導体、およびセロトニン誘導体を含むベニバナ種子抽出物はＶＣＡＭ−１レベルを低下させることが動物レベルでも確認された。
【００７６】
【表１】
【００７７】
実施例８（ヒトボランティア試験用試験食の調製）
ベニバナ種子抽出物の調製を以下に記載した方法で実施した。脱脂ベニバナ種子１００ｋｇを２０００Ｌの水にて３０℃、３０分間攪拌洗浄後固液分離を行い、得られた固形分に６０容積％エチルアルコール−水を１５００Ｌ加え、６０℃に昇温後、同温にて６０分間攪拌抽出した。同操作を３経路同時に実施して得た固液分離後の抽出液を合一し、ろ過助剤（ＫＣフロック）を用いて圧搾濾過後、ろ過液中の固形分量と等量のγ-サイクロデキストリン（CAVAMAX W8 FOOD、シクロケム）の水溶液を加え、減圧下５０〜６０℃にて濃縮した。得られた濃縮液を８８℃、１時間加熱殺菌及び、６０℃、１５時間の乾燥後、粉砕、篩分け（６０メッシュ篩）し、ベニバナ種子抽出物粉末６ｋｇを得た。一般成分分析結果は表２のとおりであった。このベニバナ種子抽出物粉末中の総ポリフェノール含量をFolin-Ciocalteau法で測定したところ、１４３ｍｇ／ｇ抽出物粉末（ｐ−クマロイルセロトニン当量）であった。ＨＰＬＣで分析したところ、総セロトニン誘導体含量は１３８ｍｇ／ｇ抽出物粉末（１３．８重量％）であった。結果を表３に示す。このことから、セロトニン誘導体は本ベニバナ種子抽出物粉末中に含まれるフェノール類の主要成分であると考えられた。こうして調製したベニバナ種子抽出物粉末をハードカプセル充填機（ウルトラエイト、カプスゲル ジャパン）にてハードカプセルに充填した（１カプセルあたり２１０ｍｇのベニバナ種子抽出物粉末、セロトニン誘導体として約２９ｍｇを含む）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例９（ベニバナ種子抽出物粉末の摂取がヒト血清中のｓＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１レベルに及ぼす作用）
９０名のボランティア男性の加速度脈波検査を事前に行い、加速度脈波加齢指数（血管年齢）が暦年齢よりも高く、かつ血圧、血中コレステロール、血糖制御に関する薬物治療を行っていない２０名を被験者として選定した（平均暦年齢37.3±6.8歳、平均血管年齢48.1±8.1歳）。実施例８で調製した試験食カプセル１０個（ベニバナ種子抽出物粉末２．１ｇ（セロトニン誘導体として約２９０ｇ））を１日２回（朝、夕食後３０分以内、各５個ずつ）に分けて４週間毎日摂取させ、摂取開始直前（０週）、摂取終了時（４週）、および摂取終了後４週間（８週）の時点で採血を行い（午前中、空腹時採血）、血清を分離した。血清中のｓＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１濃度は、臨床検査の受託機関に委託して分析した。
【００８１】
試験食の摂取期間中において、試験食によって起因したと思われる症状の訴えは認められなかった。血液生化学パラメータ（血中脂質（総コレステロール、ＨＤＬ-コレステロール、ＬＤＬ-コレステロール、トリグリセリド）、および血糖、肝機能指標（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、γ-ＧＴＰ総タンパク、アルブミン）、腎機能指標（尿素窒素、クレアチニン）、電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋）)についても、摂取前後で異常な変化は認められなかった。
【００８２】
図１０Ａ、Ｂに示したように、４週間の試験食摂取により、ボランティア血清中のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１は試験食摂取開始前に比べて有意に低下し、試験食摂取終了後４週間でほぼ摂取開始時点のレベルに戻ることが示された。これらの結果からベニバナ種子抽出物は安全性に特に問題は認められないこと、また、ヒトにおいてもＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１レベルを低下させることが明らかとなった。
【００８３】
実施例１０（ＦＳ、およびＦＳを含有するベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルマウスに及ぼす作用）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルマウス（ＩＬ−１０欠損細胞移入モデル）は、池上らの方法（Ikenoue Y.ら、Int. Immunopharmacol., 5, 993-1006 (2005):非特許文献12）に従い、ＩＢＤの発症（下痢、体重減少）が確認されたＩＬ−１０欠損マウス（ジャクソンラボラトリーより購入したＩＬ−１０-/-マウスをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）と7世代バッククロスしたもの）から調製した脾臓、および腸間膜リンパ節細胞懸濁液（1〜3 x 107 cells /200μL）をＳＣＩＤマウス（CB-17/Icr SCID；日本クレア）の腹腔内に投与することによって作製した（本モデル動物において、細胞移入後2-3週間以内に腸管における慢性炎症が全例に発生し、臨床的にも効果が確認されている抗ＩＢＤ剤（抗ＴＮＦ受容体抗体（TNFR-Ig）やステロイド（プレドニゾロン））によって症状が改善されることが既に明らかにされている（非特許文献12））。
【００８４】
IL-10欠損細胞移入４日前に計４０匹のＳＣＩＤマウス（７週齢、♀）を下記の１）〜４）に示す４群（各群10匹）に分けると同時に対照食への馴化を開始し、細胞移入後直ちに飼料を表４に示す試験食に切り替え、３週間自由摂取させた。ベニバナ種子抽出物粉末は実施例８で示したものと同一であり、γ-サイクロデキストリンを50重量％含む。N-フェルロイルセロトニン（ＦＳ）は試験例１の方法で合成したものである。試験食摂取期間中は、週3回体重、摂餌量、飲水量の測定、および発症の有無を観察した。
【００８５】
１） Normal群（正常SCIDマウス x 対照食）
２） Control群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x 対照食）
３） SSE群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x SSE食*）
４） FS群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x FS食**）
* FS、およびp-クマロイルセロトニン（CS）を各々0.10、および0.13重量％（アグリコン換算）含有（総セロトニン誘導体含量＝0.28重量％）
**FSアグリコン0.4重量％含有
【００８６】
試験食摂取期間終了後、麻酔下にて採血し、摘出した大腸（盲腸〜肛門）の長さ、および重量（内容物洗浄後）を計測した。得られたデータについては、まずNormal群とControl群との間でt-検定を行い、試験の成立を確認した後、Control群とSSE、FS各群との間で分散分析を行い、被験物質による影響をDunnett検定にて比較した。
【００８７】
表５に示したように、IL-10欠損細胞移入により増体は有意に抑制された。摂餌量、飲水量については、群間に有意差は認められなかった。一方、図１１に示したように、IL-10欠損細胞移入によりControl群における大腸腸管長、大腸重量、および単位腸管長当たりの大腸重量はいずれも有意に増加した。また、図１２に示したように、血中の白血球数、血小板数、好中球数、単球数がいずれも有意に増加していたことから、大腸炎の発生は明らかであった。SSE、およびFSを摂取させた動物においては、大腸重量、単位腸管長当たりの大腸重量ともにControl群よりも有意に低値を示した。また、いずれの群における血小板数もControl群より有意に低下した（本モデルにおいては、病態の進展と共に血小板数が上昇することが上記文献（非特許文献１２）で示されている）。白血球数、好中球数、単球数については統計学的に有意ではなかったが、いずれもSSE群、FS群においてControl群よりも低下する傾向を示した。これらの結果は、SSE、およびFSの摂取が大腸炎を改善することを示している。
【００８８】
【表４】
【００８９】
【表５】
【００９０】
炎症反応における白血球の活性化によって、大量のNOが細胞から産生され、代謝物であるNOxの血中濃度が上昇する。このことより、血中NOx濃度は生体における炎症反応の一つの指標となることが知られている（Yuka Ikenoue ら、International Immunopharmacology 5 (2005)993-1006）。実施例１０より得た血液中のNOx濃度を「Nitric Oxide Quantitation Kit（ACTIVE MOTIF社）」にて測定したところ、図１３に示すように、Control群はNormal群に比べて著明なNOx濃度の上昇を認めた。これに対し、SSE群では有意なNOx濃度の低下が、またFS群では統計学的な有意差は認めなかったものの、低下する傾向を示した。
【００９１】
実施例１０にて記載した試験において、終了時に大腸（盲腸〜肛門）の中央部から肛門側に約１ｃｍずつ切り出していき、計３本の切片を得た。そのうち１本は１０％ホルマリン溶液にて固定、２本は液体窒素にて凍結した。ホルマリン固定した大腸はパラフィン包埋後、薄切し横断の輪切り標本を作製した。標本はPAS(Periodic acid Schiff)染色法にて染色後、病理組織像の観察を実施した。一方凍結した大腸組織からISOGEN（株式会社ニッポンジーン）を用い、total RNAを抽出した。total RNA 2μgをSYBR ExScriptTM RT-PCR kit (TaKaRa)を用いて逆転写反応を行い、これを鋳型としてIL-1β、TNFαおよびGAPDHに対する定量リアルタイムPCRを行った。解析に用いたプライマーは以下のとおりである。
IL-1β：forward 5’- TCA CAG CAG CAC ATC AAC AA -3’（配列番号７）
reverse 5’- TGT CCT CAT CCT GGA AGG TC -3’（配列番号８）
TNFα：forward 5’- CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA-3’（配列番号９）
reverse 5’-AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT -3’（配列番号１０）
GAPDH：forward 5’- CTG AGG ACC AGG TTG TCT CC -3’（配列番号１１）
reverse 5’- ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC -3’（配列番号１２）
鋳型DNA ２μl、SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa）10μl、ROX Reference Dye 0.4μl、100μM forward プライマー0.04μl、100μM reverse プライマー 0.04μl、滅菌水7.52μlを氷上で混合し、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、95℃で10秒加熱後、95℃で5秒、60℃で34秒を40サイクル繰り返し、DNAを増幅した。GAPDHを内部標準として用い、IL-1βおよびTNFα発現量を評価した。
【００９２】
図１４に示したように、Control群では大腸粘膜上皮層の著明な肥厚、ならびに正常サイズの杯細胞数減少といった炎症性腸疾患特有の病理所見が認められた（Yuka Ikenoue ら、International Immunopharmacology 5 (2005)993-1006）。SSE群およびFS群ではControl群と比較して、大腸粘膜上皮層の肥厚抑制、および正常な杯細胞の増加といった所見が認められ、病理所見上においても改善効果が示された。さらに炎症性サイトカインであるIL-1β、TNFαの大腸組織におけるmRNA発現量に対し、SSE群およびFS群は、IL-1βではいずれもControl群に比べて有意な低下を示し、TNFαについてはSSE群では有意な低下を、FS群では低下の傾向を示した（図１５）。
【００９３】
血中NOxレベル、病理組織学的所見、および炎症サイトカインのmRNA発現量に対するSSE群およびFS群の効果は、大腸重量、単位腸管長当たりの大腸重量の低下といった作用が、大腸における炎症反応の抑制によるものであることを強く示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明品により、ＮＦ−κＢ活性化抑制作用を介して広く炎症性疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、慢性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、子宮内膜症などの疾患があげられ、特に、炎症性腸疾患の改善または予防が期待される。また、本発明品により、ＮＦ−κＢ活性化が関与する疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、上述した炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患などの疾患があげられる。また、本発明品により、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、肺高血圧症、関節リウマチ、肝線維症などの難治性炎症性免疫疾患、臓器移植後の動脈硬化などの疾患があげられる。本発明品は、医薬品としての使用のほか、食品への適用も可能である。
【００９５】
本出願は、日本で出願された特願２００６−１３１７７０（出願日：２００６年５月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロトニン誘導体のＮＦ−κＢの活性化抑制作用に基づく医薬または食品用途に関する。より具体的には、例えば、セロトニン誘導体の抗炎症用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、種々の外因性または内因性の組織障害刺激に対する生体の応答である。感染などにより生体組織の一部が障害されると、組織からは様々な生体反応修飾物質が産生・放出され、炎症が生じる。初期にはTNF-αやIL-1などの炎症性サイトカインが炎症部位で産生され、それらの作用により、血管内皮上に細胞接着因子（ICAM-1、VCAM-1など）の発現が増強し、炎症性細胞の血管壁接着が亢進する。同時に、炎症部位より産生されるMCP-1やIL-8などの走化因子によって、単球やリンパ球、好中球が炎症組織に浸潤する。内皮下に浸潤した炎症性細胞からは、更に種々のサイトカインや活性酸素、水解酵素などが病原微生物などに対して分泌されるが、それらは同時に宿主組織をも障害する。このような過程を経て、起炎物質が消滅または除去されると、通常は炎症細胞の移入が停止し、炎症は消散に向かうが、組織障害が強かった場合は完全には修復されず、組織の実質細胞が結合組織により置換（線維化）される結果、組織の機能低下を招く場合が生じる。また、結核のような持続感染、自己免疫機序による自己組織障害、酸化LDLの蓄積などは、炎症を遷延化させ、慢性炎症と呼ばれる、活動性炎症反応、組織破壊、組織修復を繰り返し長期に渡って進行するという病態を形成することがある。こうした慢性炎症性疾患にはベーチェット病などのような難治性のものが少なくなく、患者は長期にわたってQOLの低下に苦しめられることになる。
【０００３】
これらの炎症プロセスにおいては、多くの遺伝子が活性化されるが、ＮＦ−κＢはこの遺伝子活性化プロセスに中心的な役割を担う転写因子である。ＮＦ−κＢは、p５０とp６５の二つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、通常、抑制性タンパクであるＩ−κＢと複合体を形成して不活性体として細胞質に存在するが、刺激によりＩ−κＢがリン酸化を受けて分解され、複合体から離脱すると、ＮＦ−κＢヘテロダイマーは核内に移行してＤＮＡと結合し、結合サイト下流の遺伝子発現を調節することが知られている。ＮＦ−κＢの活性化と核内へのトランスロケーションの過程には酸化ストレスが関与していると言われている。そのメカニズムについては未だ不明な点も多いが、ある種の活性酸素種（ＲＯＳ）がＩ−κＢリン酸化酵素を活性化し、Ｉ−κＢの分解を促すと考えられている。複数の抗酸化物質の添加や、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素の過剰発現がＮＦ−κＢの活性化を抑制することが知られている。これとは逆に、核内に移行した活性化ＮＦ−κＢのＤＮＡ上への結合は酸化剤によって阻害され、チオール類により促進される。このように、ＮＦ−κＢの活性化と、それに引き続いて起こる各種遺伝子産物の発現はいずれもレドックス制御下に置かれていると言えるが、その制御様式は異なっているため、細胞内のレドックス状態の変化がＮＦ−κＢの制御下にある遺伝子産物の発現に及ぼす影響は一様ではなく、複雑である（非特許文献１）。ＮＦ−κＢによる発現調節を受ける遺伝子産物としては、TNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症性サイトカイン、ICAM-1、VCAM-1、E-セレクチンなどの細胞接着因子、IL-8やMCP-1などの細胞走化因子（ケモカイン）、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）、組織因子（TF）や誘導型シクロオキシゲナーゼ（COX-2）などが代表的なものとしてあげられる。多くの疾患にＮＦ−κＢの活性化が関与していると言われている。重要なものとしては、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、ウイルス感染（HIV、サイトメガロウイルスなど）、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、乾癬、炎症性腸疾患（IBD）、II型糖尿病、気管支喘息、敗血症、自己免疫疾患などがあげられる。
【０００４】
ＮＦ−κＢの活性化によって発現が上昇するＶＣＡＭ−１（Vascular Cell Adhesion Molecule-1)は、分子量110kDaの糖タンパクで、主に血管内皮細胞、マクロファージなどに発現が認められる。その主な働きは、リンパ球、単球などに発現しているβ1-インテグリンファミリーの一つであるＶＬＡ４と結合することにより、白血球を血管内皮細胞上に強固に接着させることである。ＶＣＡＭ−１と疾患の関連については、動脈硬化、同種移植拒絶反応、悪性腫瘍(メラノーマ等)の転移など、様々な急性／慢性炎症性疾患の病変局所の血管内皮細胞において発現亢進が確認されている。
【０００５】
ＭＣＰ−１（Monocyte Chemotactic Protein-1）は、内皮細胞、平滑筋細胞、およびマクロファージなどから産生され、血管内皮細胞に接着した単球／マクロファージ、Ｔリンパ球の内皮下への遊走を強力に誘導することから、ＭＣＰ−１は各種の炎症病変において単球およびＴ細胞の組織浸潤を促進すると考えられている。ＭＣＰ−１も多くの疾患との関わりが知られており、気管支喘息やアレルギー性鼻炎、慢性関節リウマチ、肺高血圧、肝線維症、腎硬化症、ウイルス性脳炎、動脈硬化、子宮内膜症、炎症性腸疾患（IBD）などの慢性炎症疾患や、アレルギー疾患／免疫異常において、局所における産生亢進、あるいはMCP-1中和抗体／アンタゴニストによる症状の改善などが報告されている。
【０００６】
炎症性疾患の治療には様々な抗炎症剤が用いられるが、種々の炎症性メディエーターの産生、または炎症性細胞接着分子の発現を抑制するものとしては、いまだに決め手となるようなものはない。その理由の一つとしては、上述したように炎症反応には多数の遺伝子産物が関与するため、単一の酵素活性やサイトカイン産生をブロックするだけでは不十分と考えられることである。例えば、NSAID（非ステロイド抗炎症剤）類は、アラキドン酸代謝においてシクロオキシゲナーゼを阻害することにより、炎症性プロスタグランジンの産生を抑制するが、サイトカインの産生を直接阻害することはない。サイトカイン抗体またはサイトカイン受容体ブロッカーなどを用いた抗サイトカイン療法は、特定のサイトカインの機能を抑制できても、複数のサイトカインの活性を直接抑制することはできない。例えば、抗ICAM-1抗体は臓器移植時の拒絶反応抑制などで効果が報告されているが、他の接着分子や炎症性サイトカイン類に対する直接的な作用はない。また、抗サイトカイン療法の場合、初期の投与効果は大きくても効果の持続性が疑問視されており、慢性炎症性疾患への臨床応用は困難と考えられる。一方、従来の、免疫抑制剤を含む抗炎症剤、抗サイトカイン療法には多くの副作用が報告されている。例えば、ステロイド剤は、経口投与が可能で、非特異的に複数のサイトカインの産生を抑制するメリットを持つが、その一方で感染増悪、リバウンドなどの問題を抱えている。抗TNF-α抗体は慢性関節リウマチやクローン病で効果が示されているが、感染症やアレルギー（アナフィラキシーショック）などの重大な問題が指摘されている。
【０００７】
これら既存の抗炎症剤に対して、ＮＦ−κＢ抑制剤は、上述した各種起炎性物質の産生に関与する遺伝子の活性化における共通のプロセスを抑制するため、広く抗炎症的に作用する可能性が考えられる。すなわち、複数の炎症性サイトカインの転写を同時に抑制することにより、炎症性サイトカインの異常産生に基づく疾患を治療する医薬品、また、HIVやサイトメガロウイルスなどの、ＮＦ−κＢの活性化が自己の複製に必要なウイルスに対する抗ウイルス剤、細胞接着分子の発現を抑制することによる抗炎症または癌転移抑制剤、臓器移植の際に用いる免疫抑制剤への応用などが考えられる。
【０００８】
食品などに含まれる天然成分にもＮＦ−κＢ抑制作用を有するものがいくつか知られている（ケルセチン（非特許文献２）、クルクミン（非特許文献３）、イソビテキシン（非特許文献４）、アピゲニン（非特許文献５）、ピクノジェノール（非特許文献６）、など）。これらのポリフェノール類は経口的に摂取されており、安全性は比較的高いと考えられるだけでなく、一部については抗酸化活性や抗動脈硬化作用などが報告されている（非特許文献７、８）ことなどから、慢性炎症病態の日常的な制御や、炎症性疾患の発症予防に有用である可能性がある。しかしながら、これらのＮＦ−κＢの抑制作用はin vitroで調べられたものであるのに対し、生体内ではポリフェノール類は代謝されて抗酸化作用が減弱する、あるいは失われる例が報告されている（非特許文献９）ことから、これらの物質が実際に生体内で抗炎症作用を発揮するかどうかについては不明である。
【０００９】
ベニバナ種子脱脂粕抽出物は、in vitroで低比重リポタンパク（LDL）の酸化を強力に抑制し、apoE KOマウスにおける動脈硬化病変形成を抑制する作用（特許文献１）、動脈硬化モデルであるKHCウサギや、ヒトボランティアにおける血圧・脈波改善作用（特許文献２）を有することが示されている。この抽出物中に含まれるヒドロキシ桂皮酸セロトニンアミド（セロトニン誘導体）は、apoE KOマウスにおける抗動脈硬化活性本体の少なくとも一つであると考えられる（特許文献１）。ベニバナ種子中のセロトニン誘導体としては、主としてN-(ｐ-Coumaroyl)serotonin（ＣＳ）とN-Feruloylserotonin（ＦＳ）、およびそれらの配糖体の４種が知られており、これらの化合物の構造は、上記非特許文献２〜６に示されたＮＦ−κＢ抑制剤とは全く異なるものである。ＣＳとＦＳは、共にほぼ同レベルの抗酸化活性（DPPHラジカル消去活性、LDL酸化抑制作用など）を有することが示されている。これらのうち、ＣＳについては、細菌のリポ多糖（LPS）で刺激されたヒト末梢血単球におけるTNF-α、IL-1、IL-6などの炎症性サイトカイン産生を抑制することがKawashimaらにより報告されている（非特許文献１０）。この報告によれば、ＣＳは50μM以上の濃度でTNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6の産生を転写レベルで阻害し、ＮＦ−κＢ活性化阻害がEMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）の結果認められたとしている。しかしながら、同じ研究グループの続報（非特許文献１１）では、上記のＣＳの効果は炎症性サイトカインに特異的なものではなく、末梢血由来単球におけるＣＳの非特異的なタンパク合成阻害作用と抗酸化作用の結果であると考察している。これらの知見を総合すると、末梢血単球以外の細胞におけるセロトニン誘導体の炎症性サイトカイン発現またはＮＦ−κＢ活性に及ぼす影響は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開番号第２００３／０８６４３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７/０３２５５１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Halliwell B and Gutteridge JM, Free Radicals in Biology and Medicine Third Edition, Oxford Science Publications (1999)
【非特許文献２】Martinez-Florez Sら、J. Nutr. 135:1359-1365 (2005)
【非特許文献３】Yeh C-Hら、J. Surgical Res.125:109-116 (2005)
【非特許文献４】Lin C-Mら、Planta Medica 71:748-753 (2005)
【非特許文献５】Gerritsen MEら、Am. J. Pathol. 147:278-292 (1995)
【非特許文献６】Packer L, Book of abstracts, 219th ACS National Meeting, SanFrancisco, CA, March 26-30, (2000)
【非特許文献７】Nakamura Yら、Jpn. J. Cancer Res. 89:361-370 (1998)
【非特許文献８】Kamada Cら、Free Rad. Res. 39:185-194 (2005)
【非特許文献９】Williamson Gら, Free Rad Res. 39:457-469 (2005)
【非特許文献１０】Kawashima Sら、J. Interferon Cytokine Res. 18:423-428 (1998)
【非特許文献１１】Takii Tら、Int. Immunopharmacol. 3:273-277 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ＮＦ−κＢ活性化の抑制を作用機序とする炎症性サイトカインの発現抑制を通じて様々な症状の改善または予防手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、セロトニン誘導体、とりわけフェルロイルセロトニン、ｐ−クマロイルセロトニンが血管内皮細胞に対して有意なＮＦ−κＢ活性化の抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１４】
〔１〕セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔５〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔７〕医薬である、前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔８〕ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔７〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔９〕食品である、前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔９〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔１０〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔１２〕前記〔７〕または〔８〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢ活性化を抑制する方法。
〔１３〕ＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔１４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔１３に記載の使用。
〔１６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔１３〕に記載の使用。
〔１７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔１３〕〜〔１６〕いずれかに記載の使用。
〔１８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔１７〕に記載の使用。
〔１９〕前記〔７〕または〔８〕に記載の組成物および当該組成物をＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔２０〕ＮＦ−κＢ活性化に起因する状態の治療または改善に用いられるという表示を付した、前記〔１０〕または〔１１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
〔２１〕セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物。
〔２２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔２１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２５〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔２１〕〜〔２４〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔２６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔２５〕に記載の発現抑制用組成物。
〔２７〕医薬である、前記〔２１〕〜〔２６〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔２８〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔２７〕に記載の発現抑制組成物。
〔２９〕食品である、前記〔２１〕〜〔２６〕いずれかに記載の発現抑制用組成物。
〔３０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔２９〕に記載の発現抑制用組成物。
〔３１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔３０〕に記載の発現抑制用組成物。
〔３２〕前記〔２７〕または〔２８〕に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現を抑制する方法。
〔３３〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔３４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔３３〕に記載の使用。
〔３７〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔３３〕〜〔３６〕いずれかに記載の使用。
〔３８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔３７〕に記載の使用。
〔３９〕前記〔２７〕または〔２８〕に記載の組成物、および当該組成物をＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔４０〕ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する状態の予防または改善に用いられるという表示を付した、前記〔３０〕または〔３１〕に記載の発現抑制用組成物。
〔４１〕セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。
〔４２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔４１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔４１〕〜〔４４〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔４６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔４５〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４７〕医薬である、前記〔４１〕〜〔４６〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔４８〕炎症性腸疾患の治療または予防のために用いられる、前記〔４７〕に記載の抗炎症用組成物。
〔４９〕食品である、前記〔４１〕〜〔４６〕いずれかに記載の抗炎症用組成物。
〔５０〕食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、前記〔４９〕に記載の抗炎症用組成物。
〔５１〕保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、前記〔５０〕に記載の抗炎症用組成物。
〔５２〕前記〔４７〕または〔４８〕に記載の抗炎症用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患を治療または予防する方法。
〔５３〕抗炎症用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
〔５４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔５３〕に記載の使用。
〔５７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔５３〕〜〔５６〕いずれかに記載の使用。
〔５８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔５７〕に記載の使用。
〔５９〕前記〔４７〕または〔４８〕に記載の組成物、および当該組成物を炎症性疾患の治療または予防に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業用パッケージ。
〔６０〕炎症性疾患の予防または改善に用いられるという表示を付した、前記〔５０〕または〔５１〕に記載の抗炎症用組成物。
〔６１〕セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６２〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６３〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６４〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６１〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６５〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔６１〕〜〔６４〕いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６６〕前記植物が紅花の種子である、前記〔６５〕に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制剤。
〔６７〕セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制剤。
〔６８〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔６９〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔７０〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔６７〕に記載の発現抑制剤。
〔７１〕セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔６７〕〜〔７０〕いずれかに記載の発現抑制剤。
〔７２〕前記植物が紅花の種子である、前記〔７１〕に記載の発現抑制剤。
〔７３〕セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症剤。
〔７４〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７５〕前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７６〕前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、前記〔７３〕に記載の抗炎症剤。
〔７７〕前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、前記〔７３〕〜〔７６〕いずれかに記載の抗炎症剤。
〔７８〕前記植物が紅花の種子である、前記〔７７〕に記載の抗炎症剤。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＮＦ−κＢの活性化に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＲＯＳ産生の上昇を用量依存的に低下させることを調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響をリアルタイムＰＣＲで調べた結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト大動脈内皮細胞においてセロトニン誘導体がＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）のタンパク質発現誘導に及ぼす影響を免疫染色で調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、セロトニン誘導体がヒト大動脈内皮細胞上への単球接着に及ぼす影響を細胞数の計測により調べた結果を示すグラフである。
【図６】図６は、セロトニン誘導体がヒト大動脈内皮細胞上への単球接着に及ぼす影響を蛍光標識により調べた結果を示すグラフである。
【図７】図７は、セロトニン誘導体が単球の遊走能に及ぼす影響を細胞数の計測により調べた結果を示すグラフである。
【図８】図８は、セロトニン誘導体が単球の遊走能に及ぼす影響を蛍光標識により調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、セロトニン誘導体を摂取したマウスにおける血漿中のｓＶＣＡＭ−１レベルを調べた結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、セロトニン誘導体を摂取したヒトボランティアにおける血清中のｓＶＣＡＭ−１（Ａ）およびＭＣＰ−１（Ｂ）レベルを調べた結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸腸管長（A）、大腸重量（B）、単位長あたりの大腸重量（C）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の白血球数（A）、血小板数（B）、好中球数（C）、単球数（D）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１３】図１３は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の血中NOx濃度に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１４】図１４は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸病理組織における影響を示す写真である。
【図１５】図１５は、FS、およびベニバナ種子抽出物（SSE）がIBDモデルマウス（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス）の大腸組織におけるIL-1β、TNFαの遺伝子発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、有効成分としてセロトニン誘導体を含有するＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物に関するものである。既に背景技術の欄でも述べたように、炎症性疾患の発症、増悪の過程には、各種の炎症性メディエーター（炎症性サイトカイン、接着因子、白血球走化因子、プロスタグランジン類など）の産生が関与している。これらの炎症性メディエーターの産生に関わる遺伝子の多くは、その発現過程にＮＦ−κＢの活性化というプロセスを共有していることが知られている。また、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１やサイトメガロウイルスなどは、自己の複製の過程でＮＦ−κＢの活性化を必要とする。また、各種サイトカインの発現誘導にもＮＦ−κＢの活性化が関与している。したがって、ＮＦ−κＢの活性化を抑制する物質は、多くの炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患などの発症および進展を抑制する可能性がある。
【００１７】
炎症性疾患としては、例えば、心筋梗塞、ウイルス性脳炎、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、乾癬、炎症性腸疾患、肺高血圧、敗血症、II型糖尿病、肝線維症、腎硬化症、子宮内膜症などがあげられる。
【００１８】
ウイルス感染としては、例えば、エイズ、成人Ｔ細胞白血病、ヘルペスウイルス、ＥＢウイルスなどがあげられる。
【００１９】
腫瘍の転移としては、例えば、悪性腫瘍(メラノーマ、大腸癌、乳癌等)の転移があげられる。
【００２０】
免疫疾患としては、例えば、アレルギー（気管支喘息、アレルギー性鼻炎など）、同種移植拒絶反応などがあげられる。
【００２１】
本発明は、ＮＦ−κＢの活性化が深く関与していると考えられる上記疾患および障害を予防、改善または治療するために、セロトニン誘導体を用いる方法を提供するものである。ただし、ＮＦ−κＢの活性化に応答する疾患および障害は、ここにあげたものに限定されない。なお、本明細書および請求の範囲にいうセロトニン誘導体は、製品化上許容し得る塩を含有する概念であり、塩としては、酸付加塩、例えば無機酸付加塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩など）、有機酸付加塩（蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、アミノ酸との塩（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、金属塩、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）およびアルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）などがあげられる。
【００２２】
本発明における「ＮＦ−κＢ活性化抑制」とは、ＮＦ−κＢの核内への移行を抑制することをいう。ＮＦ−κＢの核内への移行の抑制については、実施例１に記載の方法により確認することができる。すなわち、ヒト大動脈内皮細胞の培養液中に被験物質を添加し、所定の時間インキュベートした後、グルコースで刺激した前記細胞から核を抽出し、核内に移行した活性化ＮＦ−κＢ（ｐ６５）を検出する。ＮＦ−κＢが活性化されていないグルコース刺激前の細胞を陰性対照とし、被験物質を添加しないでグルコースで刺激した細胞を陽性対照として、前記ｐ６５の検出程度が陽性対照よりも陰性対照に近い場合、ＮＦ−κＢ活性化抑制であると判断する。
【００２３】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物に含まれるセロトニン誘導体としては、例えば下記の式で表される化合物（Ｉ）が例示される。
【００２４】
【化１】
【００２５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または糖を表し、ｎ、ｍ、およびｌは０または１を表す）本明細書において、炭素数１〜３のアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピルがあげられる。糖としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、フルクトース、ルチノース、ガラクツロン酸、グルクロン酸、ネオヘスペリドースなどがあげられる。好ましい化合物としてはヒドロキシ桂皮酸のセロトニンアミドが例示される。
【００２６】
ヒドロキシ桂皮酸としては、p-クマル酸、フェルラ酸、カフェ酸が好適なものとしてあげられ、そのセロトニンアミドとしては、N-(ｐ−クマロイル)セロトニン（あるいはｐ−クマリルセロトニン、またはｐ−クマロイルセロトニン）、N-フェルロイルセロトニン（あるいはフェルリルセロトニン、またはフェルロイルセロトニン）、カフェオイルセロトニンが例示される。
【００２７】
本発明で使用されるセロトニン誘導体は配糖体であってもよい。ここで配糖体とは、式（Ｉ）におけるＲ１にグルコースがβグルコシド結合したO-β-D-グルコピラノシドなどが例示されるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
セロトニン誘導体は、上記化合物の１種を単独で、あるいは２種以上の化合物を併用して、使用することができる。
【００２９】
セロトニン誘導体は、化学的に合成することにより、また天然物から抽出することにより調製可能である。
【００３０】
当該化合物は自体既知のものであり、その合成には自体既知の方法を採用すればよい。好適な具体例としては、後述の試験例１に記載の方法があげられる。
【００３１】
天然物から抽出する場合には、原料としては様々な植物組織が用いられる。例えば、紅花やヤグルマギクをはじめとするキク科植物、特にその種子、クロヒエやコンニャクイモ等の特にその穀粒、塊茎などがあげられるが、好ましくは紅花の種子、あるいはその脱脂粕である。本発明において植物種子とは、植物種子を構成する全体、あるいはその一部、例えば、種皮、胚乳、胚芽等を取り出したものでもよく、それらの混合物であってもよい。これらのものからの抽出方法としては、例えば、下記の如き方法があげられる。
【００３２】
植物組織は、通常脱脂物（ミール）として抽出に供される。脱脂物は自体公知の方法により、例えば植物種子等の植物組織を脱脂して得ることができるが、例えば種子を圧搾抽出するかまたは種子の破砕物にｎ−ヘキサン等を加えて抽出した後、抽出系から固形分を取り出し、該固形分を乾燥して得ることができる。脱脂程度は通常６０重量％以上、好ましくは８０重量％以上である。
【００３３】
また、抽出方法としては、例えば以下の、原料である脱脂後の植物種子を水で洗浄後、有機溶媒で抽出する方法が例示される。
【００３４】
水は、特に限定されず、例えば蒸留水、水道水、工業用水及びこれらの混合水等のいずれも用いることができる。水には、本発明の効果が得られる限り、他の物質、例えば無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等）、酸（例えば塩化水素、酢酸、炭酸、過酸化水素、リン酸等）、アルカリ（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等）等を含んでいてもよい。洗浄の際のｐＨは通常２〜９であり、好ましくは５〜７である。
【００３５】
水の使用量は、総量として、原料である脱脂後の植物種子に対して、通常２〜１００倍量（水容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは１０〜４０倍量である。
【００３６】
洗浄は、自体公知の方法で、原料である脱脂後の植物種子と水とを接触させて行うことができる。例えば、脱脂後の植物種子を水に懸濁後、濾過して固形の洗浄処理物を回収する方法等があげられる。洗浄は、上記の量の水を、脱脂後の植物種子に一度にまたは複数回に分けて、または連続的に接触させて行ってもよい。接触させる際の温度は通常５〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃である。接触させる時間は通常１０〜２４０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００３７】
上記のようにして得られた脱脂後の植物種子等の洗浄処理物から有機溶媒で抽出して植物種子等の抽出物を得ることができる。
【００３８】
有機溶媒として、例えば、低級アルコール、アセトン、アセトニトリル及びそれらの混合溶媒等があげられるが、それらに限定されない。有機溶媒は、水を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。有機溶媒の濃度は、通常２０〜９５重量％、好ましくは５０〜９０重量％である。有機溶媒は抽出後の抽出物の濃縮、乾燥及び食品製造の点からは低級アルコールが好ましい。低級アルコールとして、例えば炭素数１〜４のアルコールがあげられ、具体的には例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等があげられるが、これらに限定されない。低級アルコールは、食品製造の点からは、エタノールが好ましい。エタノールは、エタノール分を５０重量％以上含む含水エタノールあるいは無水エタノールが好ましい。
【００３９】
有機溶媒の使用量は、原料である脱脂後の植物種子の通常２〜４０倍量（有機溶媒容量／脱脂後の植物種子重量、以下同様）、好ましくは２〜１０倍量である。抽出温度は通常２０〜７５℃、好ましくは５０〜７０℃である。抽出時間は通常１０〜２４０分、好ましくは６０〜１２０分である。
【００４０】
抽出後、懸濁液より濾過等により固形分を分離して得られた抽出液は、そのまま、または必要により濃縮、乾燥して本発明の植物種子抽出物として用いることができる。濃縮、乾燥は抽出液そのままを濃縮、乾燥してもよく、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖、デンプン、サイクロデキストリン等）を添加して実施してもよい。上記の溶媒で抽出された抽出物は、その純度で、本発明に供してもよいが、更に自体公知の方法により精製しても良い。
【００４１】
更に純度を上げるための一例を記載するが、これに限定されない。上述の溶媒抽出物の有機溶媒を減圧留去し、水を加え、抽出物を水に懸濁し、水相を非極性溶媒、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン等で、好ましくはｎ−ヘキサンで洗浄し、洗浄後の水層を、二層に分かれて目的の組成物を抽出できる溶媒、例えば、酢酸エステルやｎ−ブタノールなど、好ましくは、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸プロピル等で抽出する。次いで、抽出液を飽和食塩水等で洗浄し、有機層を得る。酢酸エステルで抽出した場合、該有機層を、例えば、無水硫酸マグネシウム等で、脱水し、次いで減圧濃縮して、固形物（組成物）を得る。以上のどの段階で、精製を止めても良いし、いずれかの工程を省いても良いし、改変を加えても良いし、更に精製を進めても良い。上記溶媒の種類を変えることも含めて多段抽出法や向流分配法なども用いることができる。
【００４２】
本発明で使用されるセロトニン誘導体、とりわけN-(ｐ-クマロイル)セロトニン、およびN-フェルロイルセロトニンは、細胞内の酸化ストレスを抑制することにより、ＮＦ−κＢの活性化を抑制し、その核内移行を抑制する。その結果、ＮＦ−κＢの制御下にあるＶＣＡＭ−１やＭＣＰ−１遺伝子などの発現が転写レベルで抑制され、それらの遺伝子産物の過剰産生が抑制され、抗炎症的に作用するものと考えられる。N-(ｐ-クマロイル)セロトニン（p-クマロイルセロトニン）、およびN-フェルロイルセロトニン（フェルロイルセロトニン）は、以下の構造式で表される。
【００４３】
【化２】
【００４４】
別の側面では、本発明は、セロトニン誘導体を含有するＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物にも関する。当該組成物は、上述した多くの炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患の中でも、特に、炎症性腸疾患、肺高血圧症、関節リウマチ、肝線維症などの難治性炎症性免疫疾患、臓器移植後の動脈硬化、腎硬化症、子宮内膜症、気管支喘息またはアレルギー性鼻炎の改善または予防が期待される。
【００４５】
本発明の組成物は、前記セロトニン誘導体を有効成分とし、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン、サイクロデキストリン等）、場合によっては、香料、色素、調味料、安定剤、防腐剤等も含有するものであり、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、食品（食品組成物）や医薬製剤（医薬組成物）として用いることができる。
【００４６】
本発明の組成物中に含まれるセロトニン誘導体の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常、０．０００１〜９９．９重量％であり、好ましくは０．００１〜９９．５重量％であり、より好ましくは０．００５〜９９重量％である。
【００４７】
特に、医薬として使用する場合、医薬として許容できる担体（添加剤も含む）と共に製剤化することができる。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品をも含むものであり、さらにダイエタリーサプリメント（サプリメント、栄養補助食品）、飼料、食品添加物等も本発明の食品に包含される。
【００４９】
食品用途の場合、セロトニン誘導体を、例えば、ドレッシング、マヨネーズ等の一般食品（いわゆる健康食品を含む）に含有させて用いることもできる。また、セロトニン誘導体を、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン等）、場合によっては、香料、色素等と共に、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップ及びトローチ等に製剤化して、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメントとして用いることができる。また、本発明の組成物は、飼料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料に添加して摂取または投与することができる。
【００５０】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「ＮＦ−κＢ活性化に起因する状態の予防または改善に用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５１】
本発明のＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の改善または予防のために用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５２】
本発明の抗炎症用組成物は、含有するセロトニン誘導体の生物学的作用を有効に発揮させるためには、特定保健用食品または栄養機能食品として用いられることが好ましく、その際、「炎症性疾患の改善または予防のために用いられる」という表示を付すことが推奨される。
【００５３】
本発明の組成物の対象は、ヒトを含む動物（ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類等）である。また、本発明の組成物が標的とする細胞は、単球以外の細胞であれば特に限定されるものではないが、ＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１が高発現している細胞、具体的には、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、腎糸球体細胞が好適な例としてあげられる。また、本発明の組成物が対象とするエフェクター細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球などの顆粒球、キラーＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、樹状細胞などがあげられる。
【００５４】
本発明の組成物の摂取または投与方法は、摂取または投与対象の年齢、体重、健康状態によって異なるが、例えば、健康の維持・増進や疾患の予防を目的とする場合は、通常、食品の形態にして経口的に摂取し、一方、疾患の治療や健康回復を目的とする場合には、通常、医薬品、または食品の形態にして、経口的、または注射、外用剤などにより投与する。用量としては、合成したセロトニン誘導体を投与する場合、成人１日当たり０．２ｍｇ〜２ｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２ｇを１日１回から数回に分けて摂取、または服用することが好ましい。また、実施例６または実施例８の紅花種子抽出物を経口的に摂取する場合、成人１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは、１００ｍｇ〜１０ｇを１日１回から数回に分けて摂取、または服用することが好ましい。この場合、一日あたりの摂取量または1回あたりの摂取量を一単位包装とすることができる。
【００５５】
本発明の組成物中に含まれるセロトニン誘導体は、上述のように動物に摂取または投与された後、その血中濃度が一定期間一定のレベルを維持していることが好ましい。血中濃度としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常５０μＭ未満であり、好ましくは０．１〜１０，０００ｎＭ、より好ましくは１〜５，０００ｎＭ、さらにより好ましくは１００〜１，０００ｎＭが推奨される。
【００５６】
セロトニン誘導体は、様々な植物の種子や塊茎などに含まれており、とりわけ紅花種子に多く含まれている。韓国では古来、紅花種子は骨折治癒促進、骨粗鬆症予防などの用途で、民間で用いられており、安全性は高いと考えられる。実施例９の結果も、本発明の組成物の毒性が低く、副作用がほとんど認められないことを裏付けている。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例等をあげて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
試験例１（セロトニン誘導体の合成）
ｐ−クマロイルセロトニン（ＣＳ）、およびフェルロイルセロトニン（ＦＳ）を以下の方法で合成した。
【００５８】
ＣＳ：セロトニン塩酸塩をジメチルホルムアミド（５ｍＬ／ｇ ｖｓ．セロトニン塩酸塩、以下同様）およびジクロロメタン（２０ｍＬ／ｇ）で溶解後、ｔｒａｎｓ−４−クマル酸（１．０モル／モル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−エチル−カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびトリエチルアミンを各１．１等量加え、室温で終夜攪拌し反応させた。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチルと水（各４０ｍＬ／ｇセロトニン量）を加え、酢酸エチル抽出を行った。３回の酢酸エチル抽出により得た抽出相を５％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤を除去した抽出液を減圧濃縮し、酢酸エチル−エタノール（１０：０．６）にて晶析後、得られた結晶を酢酸エチルで洗浄し、乾燥させ、ＣＳを得た（収率＝６９．８％）。
【００５９】
ＦＳ：セロトニン塩酸塩とｔｒａｎｓ−４−フェルラ酸より上記ＣＳと同様の方法で合成したが、晶析はメタノール−クロロホルム（１：１５）にて行った（収率69.2％）。
【００６０】
実施例１（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＮＦ−κＢの活性化に及ぼす作用）
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）はクロネティクスより購入し、３〜４代継代培養（３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下）したものを実験に用いた。培養ディッシュ（１００ｍｍφ）中で、ＣＳおよびＦＳ（各５および１０μＭ）と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭのグルコースで２時間刺激した。Nuclear Extract Kit (アクティブモチーフ)を用いて細胞より核を抽出し、TransAM ＮＦ−κＢ p65 Kit (アクティブモチーフ)を用いて核内に移行した活性化ＮＦ−κＢ（ｐ６５）を検出した。
【００６１】
図１に示したように、２時間の高濃度グルコース処理により、ｐ６５の核内移行は顕著に増加し、ＮＦ−κＢの著明な活性化が認められたが、５および１０μＭのＣＳまたはＦＳの前処理により、ｐ６５の核内移行は有意に抑制された。このことから、セロトニン誘導体はヒト大動脈内皮細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を抑制することが示された。
【００６２】
ＮＦ−κＢ活性化抑制機序を調べるため、上記と同様にセロトニン誘導体を前処理したＨＡＥＣ細胞を２５ｍＭグルコースで１時間刺激し、細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）産生に基づく蛍光強度を、Takahashi Mら、Free Radic. Biol. Med. 31:164-174 (2001)の方法に従って測定したところ、高濃度グルコース刺激によるＲＯＳ産生の上昇を、セロトニン誘導体は用量依存的に低下させることが判明した（図２）。このことから、セロトニン誘導体は、細胞内酸化ストレスを抑制することにより、ＮＦ−κＢの活性化とそれに引き続いて起こるＮＦ−κＢの核内移行を抑制することが示された。
【００６３】
実施例２（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の遺伝子発現に及ぼす作用）
１０μＭのＣＳまたはＦＳで２４時間前処理したＨＡＥＣ細胞を２５ｍＭグルコースで３時間刺激した後、トータルＲＮＡをIsogenキット(ニッポンジーン)を用いて抽出した。１μｇのRNAから、１００Ｕ／ｍＬの逆転写酵素（タカラバイオ）と０．１μMのオリゴ(ｄＴ)-アダプター（タカラバイオ）（反応液総量５０μＬ）を用いてｃＤＮＡを合成した（４２℃、４０分）。リアルタイムＰＣＲは7300 Real Time PCR system (アプライドバイオシステムス)を用いて行い、SYBER Green Iを用いてＰＣＲ産物を検出した。
【００６４】
ＰＣＲ反応組成（RT-PCRキット、タカラバイオ）：１２．５μＬ Premix Ex Taq、２．５μＬ SYBER Green I、合成プライマー、ROX reference dye、ｃＤＮＡ（２０ｎｇのトータルＲＮＡに相当）、最終反応容量２５μＬ
プライマーは以下の配列のものを用いた。
ＶＣＡＭ−１遺伝子の検出：
5’-CCCTTGACCGGCTGGAGATT-3’（センス）（配列番号１）
5’-CTGGGGGCAACATTGACATAAAGTG-3’（アンチセンス）（配列番号２）
ＭＣＰ−１遺伝子の検出：
5’-CGCCTCCAGCATGAAAGTCT-3’（センス）（配列番号３）
5’-GGAATGAAGGTGGCTGCTATG-3’（アンチセンス）（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ（内部標準）遺伝子の検出：
5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’（センス）（配列番号５）
5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（アンチセンス）（配列番号６）
ＰＣＲは以下の条件で実施した。
熱変性：９５℃で１５秒、伸長反応：４０サイクル（９５℃で３秒、６０℃で３１秒）
ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨを内部標準として求めた。
【００６５】
図３Ａ、Ｂに示したように、高濃度グルコース刺激により、ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡのＨＡＥＣ細胞における発現量は共に未処理細胞の約３倍に上昇したが、ＣＳ、ＦＳはいずれもその上昇を有意に抑制した。このことから、セロトニン誘導体はヒト大動脈内皮細胞を高グルコースで刺激した際のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の発現を転写レベルで抑制することが示された。実施例１の結果から、セロトニン誘導体は、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することにより、高グルコース刺激によって誘導されるこれらの遺伝子の転写を抑制したものと考えられた。
【００６６】
実施例３（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１タンパク質発現に及ぼす作用）
９６穴マイクロプレート上でコンフルエントになるまで増殖させたＨＡＥＣ細胞を０．１〜１０μＭのセロトニン誘導体と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭグルコースで４時間刺激した。細胞層をHanks液で洗った後、抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ベクトンディキンソン）を添加して３７℃、１時間インキュベートし、洗浄後、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギＦ(ａｂ’)２フラグメント；カッペル）と１時間インキュベートした。発色基質（ο−フェニレンジアミン２塩酸塩）を添加して約３０分後（室温）、各ウエルの吸光度（４９２ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで定量した。一方、培地中のＭＣＰ−１濃度は、Human MCP-1 Immunoassay Kit (バイオソースインターナショナル)を用いて定量した。
【００６７】
図４Ａ、Ｂに示したように、高濃度グルコース刺激により細胞膜上のＶＣＡＭ−1の発現、および培地中へのＭＣＰ−１分泌は、未処理時のそれぞれ２倍弱、約３．５倍に上昇したが、ＣＳおよびＦＳは共に用量依存的にこれらの発現誘導を抑制した。このことから、セロトニン誘導体は、ヒト大動脈内皮細胞を高グルコースで刺激した際のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の発現誘導を抑制することがタンパク質レベルで示された。
【００６８】
実施例４（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）がＨＡＥＣ細胞上への単球接着に及ぼす作用）
２４穴マルチウエルプレートにてコンフルエントまで増殖させたＨＡＥＣ細胞をＣＳ、およびＦＳ（各５および１０μＭ）と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭグルコースで４時間刺激した。細胞層をHanks液で洗浄後、Ｕ−９３７単球細胞（ＡＴＣＣより購入）の懸濁液（１×１０６／ｍＬ）を２００μＬ添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。再び洗浄後、１％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＨＡＥＣ上に接着したＵ−９３７細胞数を顕微鏡下で計測した（２０視野）。実験は３回行い、結果はそれらの平均値で表した。蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた実験も同様に実施した。具体的には、１０μＭの２’,７’−ビス(２−カルボキシエチル)−５(６)−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル (ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、モレキュラープローブス)存在下でＵ−９３７細胞をインキュベート（３７℃、１時間）後、遠心により細胞を洗浄した。蛍光標識されたＵ−９３７細胞（１×１０６／ｍＬ）をＨＡＥＣ細胞に添加し、３７℃、１時間インキュベートした。浮遊しているＵ−９３７細胞を除去後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。接着した細胞の蛍光量を蛍光プレートリーダー（バイオラッド・フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ.５０３ｎｍ、Ｅｍ.５２５ｎｍ）。
【００６９】
図５に示したように、高濃度のグルコース刺激により、ＨＡＥＣ細胞上に接着したＵ−９３７細胞数は著明に増加したが、ＣＳおよびＦＳとのプレインキュベーションにより、接着した細胞数はセロトニン誘導体の用量依存的に減少した。同様の結果は、蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた蛍光強度アッセイによっても確認された（図６）。これらのことから、セロトニン誘導体は、高濃度グルコース刺激により誘導される単球の内皮細胞上への接着を抑制することが示された。実施例２、実施例３および高濃度グルコース刺激ＨＡＥＣにおけるＵ−９３７細胞の接着は、抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体の添加により抑制された（データ示さず）ことから、セロトニン誘導体が内皮細胞上のＶＣＡＭ−１発現誘導を抑制した結果であると考えられた。
【００７０】
実施例５（セロトニン誘導体（ＣＳ、ＦＳ）が単球の遊走能に及ぼす作用）
単球の遊走能はトランスウエルシステム（ポアサイズ３μｍ；ＢＤバイオサイエンス）を用いて行った。２４マルチウエルプレート中に設置したトランスウエル上で培養したＨＡＥＣを５、および１０μＭのセロトニン誘導体と２４時間プレインキュベートした後、２５ｍＭのグルコースで４時間刺激した。Ｕ−９３７細胞懸濁液(１０６細胞／ｍＬ)２００μＬをトランスウエル内に添加し、そのまま３７℃で２時間インキュベートした。メンブレンを通過してトランスウエル下部に遊走してきた細胞の数を検鏡下でカウントした（２０視野）。実験は３回繰り返し、結果はそれらの平均値で表した。蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた実験も同様に実施した。上述した方法でＢＣＥＣＦ−ＡＭ標識したＵ−９３７細胞をトランスウエル上部に播種して３７℃、２時間インキュベートした。メンブレンを通過してトランスウエル下部に遊走してきた細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液に回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。遊走細胞由来の蛍光を蛍光プレートリーダー（バイオラッド フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ．５０３ｎｍ、Ｅｍ．５２５ｎｍ）。
【００７１】
インキュベート（３７℃、１時間）後、遠心操作により細胞を洗浄した。蛍光標識されたＵ−９３７細胞（１×１０６／ｍＬ）をＨＡＥＣ細胞に添加し、３７℃、１時間インキュベートした。浮遊しているＵ−９３７細胞を除去後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで２時間処理した。接着した細胞の蛍光量を蛍光プレートリーダー（バイオラッド フルオロマーク）を用いて定量した（Ｅｘ．５０３ｎｍ、Ｅｍ．５２５ｎｍ）。
【００７２】
図７に示したように、ＨＡＥＣ細胞を高濃度グルコースで刺激することにより、内皮下に遊走するＵ−９３７細胞数が劇的に上昇したが、ＨＡＥＣ細胞をＣＳまたはＦＳとプレインキュベートすることにより、遊走細胞数は有意に減少した。同様の結果は、蛍光標識したＵ−９３７細胞を用いた蛍光強度アッセイによっても確認された（図８）。これらのことから、セロトニン誘導体は、高濃度グルコース刺激により誘導される単球の内皮下への遊走を抑制することが示された。実施例２および実施例３の結果から、セロトニン誘導体による単球の遊走抑制は、内皮細胞からのＭＣＰ−１産生を抑制した結果であると考えられた。
【００７３】
実施例６（動物用ベニバナ種子抽出物の調製）
ベニバナ種子抽出物の調製を以下の方法で実施した。搾油後のベニバナ脱脂種子６００ｇに３，０００ｍＬの９０容量％エタノール水を加えて、６０℃の湯浴中で３時間、加温、攪拌した後、ろ過した。ろ過後の固形分に対して同様の操作を１回行い、得られたろ過液を合一して減圧濃縮にて５００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液に水を加えて１，０００ｍＬとし、内容物を懸濁した後、５００ｍＬのｎ−ヘキサンにて２回洗浄し、洗浄後の水層を酢酸エチル５００ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後減圧濃縮してベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）１０．１ｇを得た。この方法で得られた抽出物中の総セロトニン誘導体含量（アグリコン＋配糖体）は２４．１％（アグリコン換算では２１．４％）であった。
【００７４】
実施例７（セロトニン誘導体およびベニバナ種子抽出物の摂取がａｐｏＥノックアウトマウス血漿中のｓＶＣＡＭ−１レベルに及ぼす作用）
６〜７週齢の雄性ａｐｏＥノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリーより購入）を１群７〜１０匹として、
１）対照（Control）、
２）セロトニン誘導体０．２％投与区（ＣＳ ＋ ＦＳ (０．２)；試験例１で合成されたＣＳ、ＦＳ各０．１重量％含有）、
３）セロトニン誘導体０．４％投与区（ＣＳ ＋ ＦＳ (０．４)；試験例１で合成されたＣＳ、ＦＳ各０．２％重量含有）、
４）ＦＳ ０．４％投与区（ＦＳ；試験例１で合成されたＦＳのみ０．４重量％含有）、
５）ベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）１％投与区（ＳＳＥ；実施例６で得たＳＳＥを１重量％含有）の計５群に分け、表１に示すような組成の餌を１５週間自由摂取させた。投与期間終了後、マウスをエーテル麻酔下、腹部大静脈より採血（抗凝固剤：ＥＤＴＡ−２Ｋ＋ヘパリン）し、３，０００ｒｐｍ、１５分の遠心操作を行い、血漿を回収した。血漿中の可溶性ＶＣＡＭ−１（ｓＶＣＡＭ−１）濃度は、ｓＶＣＡＭ−１測定ＥＬＩＳＡキット”Mouse sVCAM-1/CD106 Quantikine ELISA Kit”（Ｒ&Ｄシステムス）を用いて測定した。
得られた値については各群間で分散分析を行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定で試験食群の平均値を対照群のそれと比較した。
【００７５】
図９に示したように、セロトニン誘導体を長期摂取させたａｐｏＥノックアウトマウスの血中ｓＶＣＡＭ−１レベルは、いずれの群においても低下傾向を示した。ＳＳＥを摂取させた動物においては統計学的に有意に血中ｓＶＣＡＭ−１レベルを低下させた。これらのことから、セロトニン誘導体、およびセロトニン誘導体を含むベニバナ種子抽出物はＶＣＡＭ−１レベルを低下させることが動物レベルでも確認された。
【００７６】
【表１】
【００７７】
実施例８（ヒトボランティア試験用試験食の調製）
ベニバナ種子抽出物の調製を以下に記載した方法で実施した。脱脂ベニバナ種子１００ｋｇを２０００Ｌの水にて３０℃、３０分間攪拌洗浄後固液分離を行い、得られた固形分に６０容積％エチルアルコール−水を１５００Ｌ加え、６０℃に昇温後、同温にて６０分間攪拌抽出した。同操作を３経路同時に実施して得た固液分離後の抽出液を合一し、ろ過助剤（ＫＣフロック）を用いて圧搾濾過後、ろ過液中の固形分量と等量のγ-サイクロデキストリン（CAVAMAX W8 FOOD、シクロケム）の水溶液を加え、減圧下５０〜６０℃にて濃縮した。得られた濃縮液を８８℃、１時間加熱殺菌及び、６０℃、１５時間の乾燥後、粉砕、篩分け（６０メッシュ篩）し、ベニバナ種子抽出物粉末６ｋｇを得た。一般成分分析結果は表２のとおりであった。このベニバナ種子抽出物粉末中の総ポリフェノール含量をFolin-Ciocalteau法で測定したところ、１４３ｍｇ／ｇ抽出物粉末（ｐ−クマロイルセロトニン当量）であった。ＨＰＬＣで分析したところ、総セロトニン誘導体含量は１３８ｍｇ／ｇ抽出物粉末（１３．８重量％）であった。結果を表３に示す。このことから、セロトニン誘導体は本ベニバナ種子抽出物粉末中に含まれるフェノール類の主要成分であると考えられた。こうして調製したベニバナ種子抽出物粉末をハードカプセル充填機（ウルトラエイト、カプスゲル ジャパン）にてハードカプセルに充填した（１カプセルあたり２１０ｍｇのベニバナ種子抽出物粉末、セロトニン誘導体として約２９ｍｇを含む）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例９（ベニバナ種子抽出物粉末の摂取がヒト血清中のｓＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１レベルに及ぼす作用）
９０名のボランティア男性の加速度脈波検査を事前に行い、加速度脈波加齢指数（血管年齢）が暦年齢よりも高く、かつ血圧、血中コレステロール、血糖制御に関する薬物治療を行っていない２０名を被験者として選定した（平均暦年齢37.3±6.8歳、平均血管年齢48.1±8.1歳）。実施例８で調製した試験食カプセル１０個（ベニバナ種子抽出物粉末２．１ｇ（セロトニン誘導体として約２９０ｇ））を１日２回（朝、夕食後３０分以内、各５個ずつ）に分けて４週間毎日摂取させ、摂取開始直前（０週）、摂取終了時（４週）、および摂取終了後４週間（８週）の時点で採血を行い（午前中、空腹時採血）、血清を分離した。血清中のｓＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１濃度は、臨床検査の受託機関に委託して分析した。
【００８１】
試験食の摂取期間中において、試験食によって起因したと思われる症状の訴えは認められなかった。血液生化学パラメータ（血中脂質（総コレステロール、ＨＤＬ-コレステロール、ＬＤＬ-コレステロール、トリグリセリド）、および血糖、肝機能指標（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、γ-ＧＴＰ総タンパク、アルブミン）、腎機能指標（尿素窒素、クレアチニン）、電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋）)についても、摂取前後で異常な変化は認められなかった。
【００８２】
図１０Ａ、Ｂに示したように、４週間の試験食摂取により、ボランティア血清中のＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１は試験食摂取開始前に比べて有意に低下し、試験食摂取終了後４週間でほぼ摂取開始時点のレベルに戻ることが示された。これらの結果からベニバナ種子抽出物は安全性に特に問題は認められないこと、また、ヒトにおいてもＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１レベルを低下させることが明らかとなった。
【００８３】
実施例１０（ＦＳ、およびＦＳを含有するベニバナ種子抽出物（ＳＳＥ）の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルマウスに及ぼす作用）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルマウス（ＩＬ−１０欠損細胞移入モデル）は、池上らの方法（Ikenoue Y.ら、Int. Immunopharmacol., 5, 993-1006 (2005):非特許文献12）に従い、ＩＢＤの発症（下痢、体重減少）が確認されたＩＬ−１０欠損マウス（ジャクソンラボラトリーより購入したＩＬ−１０-/-マウスをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）と7世代バッククロスしたもの）から調製した脾臓、および腸間膜リンパ節細胞懸濁液（1〜3 x 107 cells /200μL）をＳＣＩＤマウス（CB-17/Icr SCID；日本クレア）の腹腔内に投与することによって作製した（本モデル動物において、細胞移入後2-3週間以内に腸管における慢性炎症が全例に発生し、臨床的にも効果が確認されている抗ＩＢＤ剤（抗ＴＮＦ受容体抗体（TNFR-Ig）やステロイド（プレドニゾロン））によって症状が改善されることが既に明らかにされている（非特許文献12））。
【００８４】
IL-10欠損細胞移入４日前に計４０匹のＳＣＩＤマウス（７週齢、♀）を下記の１）〜４）に示す４群（各群10匹）に分けると同時に対照食への馴化を開始し、細胞移入後直ちに飼料を表４に示す試験食に切り替え、３週間自由摂取させた。ベニバナ種子抽出物粉末は実施例８で示したものと同一であり、γ-サイクロデキストリンを50重量％含む。N-フェルロイルセロトニン（ＦＳ）は試験例１の方法で合成したものである。試験食摂取期間中は、週3回体重、摂餌量、飲水量の測定、および発症の有無を観察した。
【００８５】
１） Normal群（正常SCIDマウス x 対照食）
２） Control群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x 対照食）
３） SSE群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x SSE食*）
４） FS群（IL-10欠損細胞移入SCIDマウス x FS食**）
* FS、およびp-クマロイルセロトニン（CS）を各々0.10、および0.13重量％（アグリコン換算）含有（総セロトニン誘導体含量＝0.28重量％）
**FSアグリコン0.4重量％含有
【００８６】
試験食摂取期間終了後、麻酔下にて採血し、摘出した大腸（盲腸〜肛門）の長さ、および重量（内容物洗浄後）を計測した。得られたデータについては、まずNormal群とControl群との間でt-検定を行い、試験の成立を確認した後、Control群とSSE、FS各群との間で分散分析を行い、被験物質による影響をDunnett検定にて比較した。
【００８７】
表５に示したように、IL-10欠損細胞移入により増体は有意に抑制された。摂餌量、飲水量については、群間に有意差は認められなかった。一方、図１１に示したように、IL-10欠損細胞移入によりControl群における大腸腸管長、大腸重量、および単位腸管長当たりの大腸重量はいずれも有意に増加した。また、図１２に示したように、血中の白血球数、血小板数、好中球数、単球数がいずれも有意に増加していたことから、大腸炎の発生は明らかであった。SSE、およびFSを摂取させた動物においては、大腸重量、単位腸管長当たりの大腸重量ともにControl群よりも有意に低値を示した。また、いずれの群における血小板数もControl群より有意に低下した（本モデルにおいては、病態の進展と共に血小板数が上昇することが上記文献（非特許文献１２）で示されている）。白血球数、好中球数、単球数については統計学的に有意ではなかったが、いずれもSSE群、FS群においてControl群よりも低下する傾向を示した。これらの結果は、SSE、およびFSの摂取が大腸炎を改善することを示している。
【００８８】
【表４】
【００８９】
【表５】
【００９０】
炎症反応における白血球の活性化によって、大量のNOが細胞から産生され、代謝物であるNOxの血中濃度が上昇する。このことより、血中NOx濃度は生体における炎症反応の一つの指標となることが知られている（Yuka Ikenoue ら、International Immunopharmacology 5 (2005)993-1006）。実施例１０より得た血液中のNOx濃度を「Nitric Oxide Quantitation Kit（ACTIVE MOTIF社）」にて測定したところ、図１３に示すように、Control群はNormal群に比べて著明なNOx濃度の上昇を認めた。これに対し、SSE群では有意なNOx濃度の低下が、またFS群では統計学的な有意差は認めなかったものの、低下する傾向を示した。
【００９１】
実施例１０にて記載した試験において、終了時に大腸（盲腸〜肛門）の中央部から肛門側に約１ｃｍずつ切り出していき、計３本の切片を得た。そのうち１本は１０％ホルマリン溶液にて固定、２本は液体窒素にて凍結した。ホルマリン固定した大腸はパラフィン包埋後、薄切し横断の輪切り標本を作製した。標本はPAS(Periodic acid Schiff)染色法にて染色後、病理組織像の観察を実施した。一方凍結した大腸組織からISOGEN（株式会社ニッポンジーン）を用い、total RNAを抽出した。total RNA 2μgをSYBR ExScriptTM RT-PCR kit (TaKaRa)を用いて逆転写反応を行い、これを鋳型としてIL-1β、TNFαおよびGAPDHに対する定量リアルタイムPCRを行った。解析に用いたプライマーは以下のとおりである。
IL-1β：forward 5’- TCA CAG CAG CAC ATC AAC AA -3’（配列番号７）
reverse 5’- TGT CCT CAT CCT GGA AGG TC -3’（配列番号８）
TNFα：forward 5’- CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA-3’（配列番号９）
reverse 5’-AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT -3’（配列番号１０）
GAPDH：forward 5’- CTG AGG ACC AGG TTG TCT CC -3’（配列番号１１）
reverse 5’- ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC -3’（配列番号１２）
鋳型DNA ２μl、SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa）10μl、ROX Reference Dye 0.4μl、100μM forward プライマー0.04μl、100μM reverse プライマー 0.04μl、滅菌水7.52μlを氷上で混合し、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、95℃で10秒加熱後、95℃で5秒、60℃で34秒を40サイクル繰り返し、DNAを増幅した。GAPDHを内部標準として用い、IL-1βおよびTNFα発現量を評価した。
【００９２】
図１４に示したように、Control群では大腸粘膜上皮層の著明な肥厚、ならびに正常サイズの杯細胞数減少といった炎症性腸疾患特有の病理所見が認められた（Yuka Ikenoue ら、International Immunopharmacology 5 (2005)993-1006）。SSE群およびFS群ではControl群と比較して、大腸粘膜上皮層の肥厚抑制、および正常な杯細胞の増加といった所見が認められ、病理所見上においても改善効果が示された。さらに炎症性サイトカインであるIL-1β、TNFαの大腸組織におけるmRNA発現量に対し、SSE群およびFS群は、IL-1βではいずれもControl群に比べて有意な低下を示し、TNFαについてはSSE群では有意な低下を、FS群では低下の傾向を示した（図１５）。
【００９３】
血中NOxレベル、病理組織学的所見、および炎症サイトカインのmRNA発現量に対するSSE群およびFS群の効果は、大腸重量、単位腸管長当たりの大腸重量の低下といった作用が、大腸における炎症反応の抑制によるものであることを強く示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明品により、ＮＦ−κＢ活性化抑制作用を介して広く炎症性疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、慢性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、子宮内膜症などの疾患があげられ、特に、炎症性腸疾患の改善または予防が期待される。また、本発明品により、ＮＦ−κＢ活性化が関与する疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、上述した炎症性疾患、ウイルス感染、腫瘍の転移、免疫疾患などの疾患があげられる。また、本発明品により、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の予防または治療が可能となる。具体的には、肺高血圧症、関節リウマチ、肝線維症などの難治性炎症性免疫疾患、臓器移植後の動脈硬化などの疾患があげられる。本発明品は、医薬品としての使用のほか、食品への適用も可能である。
【００９５】
本出願は、日本で出願された特願２００６−１３１７７０（出願日：２００６年５月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項２】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項３】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項４】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項５】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１〜４いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項６】
前記植物が紅花の種子である、請求項５に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項７】
医薬である、請求項１〜６いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項８】
ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、請求項７に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項９】
食品である、請求項１〜６いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１０】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項９に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１１】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項１０に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１２】
請求項７または８に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢ活性化を抑制する方法。
【請求項１３】
ＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項１４】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１３〜１６いずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記植物が紅花の種子である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物。
【請求項２０】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２１】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２２】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２３】
セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１９〜２２いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２４】
前記植物が紅花の種子である、請求項２３に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２５】
医薬である、請求項１９〜２４いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２６】
ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、請求項２５に記載の発現抑制組成物。
【請求項２７】
食品である、請求項１９〜２４いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２８】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項２７に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２９】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項２８に記載の発現抑制用組成物。
【請求項３０】
請求項２５または２６に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現を抑制する方法。
【請求項３１】
ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項３２】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項３１〜３４いずれかに記載の使用。
【請求項３６】
前記植物が紅花の種子である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。
【請求項３８】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項３９】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４０】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４１】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項３７〜４０いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４２】
前記植物が紅花の種子である、請求項４１に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４３】
医薬である、請求項３７〜４２いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４４】
炎症性腸疾患の治療または予防のために用いられる、請求項４３に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４５】
食品である、請求項３７〜４２いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４６】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項４５に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４７】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項４６に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４８】
請求項４３または４４に記載の抗炎症用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患を治療または予防する方法。
【請求項４９】
抗炎症用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項５０】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項４９〜５２いずれかに記載の使用。
【請求項５４】
前記植物が紅花の種子である、請求項５３に記載の使用。
【請求項１】
セロトニン誘導体を含有してなるＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項２】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項３】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項４】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項５】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１〜４いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項６】
前記植物が紅花の種子である、請求項５に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項７】
医薬である、請求項１〜６いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項８】
ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、請求項７に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項９】
食品である、請求項１〜６いずれかに記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１０】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項９に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１１】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項１０に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物。
【請求項１２】
請求項７または８に記載のＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢ活性化を抑制する方法。
【請求項１３】
ＮＦ−κＢ活性化抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項１４】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１３〜１６いずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記植物が紅花の種子である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
セロトニン誘導体を含有してなる、ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物。
【請求項２０】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２１】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２２】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項１９に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２３】
セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項１９〜２２いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２４】
前記植物が紅花の種子である、請求項２３に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２５】
医薬である、請求項１９〜２４いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２６】
ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現に起因する疾患の治療または予防のために用いられる、請求項２５に記載の発現抑制組成物。
【請求項２７】
食品である、請求項１９〜２４いずれかに記載の発現抑制用組成物。
【請求項２８】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項２７に記載の発現抑制用組成物。
【請求項２９】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項２８に記載の発現抑制用組成物。
【請求項３０】
請求項２５または２６に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現を抑制する方法。
【請求項３１】
ＮＦ−κＢを介したＶＣＡＭ−１および／またはＭＣＰ−１の発現抑制用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項３２】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項３１〜３４いずれかに記載の使用。
【請求項３６】
前記植物が紅花の種子である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
セロトニン誘導体を含有してなる抗炎症用組成物。
【請求項３８】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項３９】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４０】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項３７に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４１】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項３７〜４０いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４２】
前記植物が紅花の種子である、請求項４１に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４３】
医薬である、請求項３７〜４２いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４４】
炎症性腸疾患の治療または予防のために用いられる、請求項４３に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４５】
食品である、請求項３７〜４２いずれかに記載の抗炎症用組成物。
【請求項４６】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項４５に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４７】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項４６に記載の抗炎症用組成物。
【請求項４８】
請求項４３または４４に記載の抗炎症用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患を治療または予防する方法。
【請求項４９】
抗炎症用組成物を製造するためのセロトニン誘導体の使用。
【請求項５０】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンおよびｐ−クマロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記セロトニン誘導体がフェルロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記セロトニン誘導体がｐ−クマロイルセロトニンである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記セロトニン誘導体が植物から抽出されたものである、請求項４９〜５２いずれかに記載の使用。
【請求項５４】
前記植物が紅花の種子である、請求項５３に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図５】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図５】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１３−３５８５８（Ｐ２０１３−３５８５８Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２１１０１３（Ｐ２０１２−２１１０１３）
【出願日】平成２４年９月２５日（２０１２．９．２５）
【分割の表示】特願２００８−５１４５１７（Ｐ２００８−５１４５１７）の分割
【原出願日】平成１９年５月９日（２００７．５．９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月２５日（２０１２．９．２５）
【分割の表示】特願２００８−５１４５１７（Ｐ２００８−５１４５１７）の分割
【原出願日】平成１９年５月９日（２００７．５．９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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