擬微小重力環境下での三次元組織構築方法
【課題】三次元組織の構築方法の提供。
【解決手段】多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択され、第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される方法。
【解決手段】多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択され、第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬微小重力環境下で、複数の異なる細胞タイプを培養することによる三次元組織の構築方法に関する。より具体的には、本発明は、擬微小重力環境下で、複数の異なる細胞タイプを培養することによる、血管様組織を備えた骨組織構築方法に関する。本発明により作製される再生組織は、移植療法などの再生医療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、自家骨髄単核球系細胞移植による血管新生療法（非特許文献１）や骨髄細胞移植による心筋梗塞後の心機能の改善（非特許文献２）など、骨髄細胞を利用した再生治療が注目されている。
【０００３】
骨髄細胞の中には間葉系幹細胞（ＭＳＣ）以外にも造血幹細胞（ＨＳＣ）など多分化能を有する多くの有用な細胞種が存在しており、それらが総合的に組織再生に寄与していると考えられている。
【０００４】
一方、これまでにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系において、骨髄細胞を培養細胞・組織と作用させ、組織工学的に組織を効率的に構築する方法は報告されていない。
【０００５】
現在、様々な病気や障害の治療方法として、組織工学的に作製された移植用組織の利用が注目されている。例えば、従来、骨欠損の治療方法としては自家骨移植が一般的に用いられている。しかし、自家骨移植には、移植可能な大きさ及び／又は形状の骨が準備できない、移植用の骨組織を取得するために侵襲的に手術を行なう必要があるなどの問題がある（非特許文献３）。そこで、自家骨移植に代わる骨再生方法として、組織工学的に構築した骨組織の利用に対する需要が高まっている。
【０００６】
また、組織再生の分野においては、血管を有さない移植組織は、組織が生存するために必要な酸素及び栄養素などを組織内部に送達することができないために、移植後、定着せずに内部が壊死することが問題となっていた。ｉｎ ｖｉｖｏでの組織再生の試みはこれまでにも報告されているが（非特許文献４）、移植した組織への宿主由来の血管の侵入に時間がかかり、移植組織の壊死を生じていた。そのため、当該分野においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管を備えた組織を構築する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００２． ３６０（９３３１）：ｐ．４２７−３５．
【非特許文献２】Ｏｒｌｉｃ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１０（６８２９）：ｐ．７０１−５．
【非特許文献３】Ｎａｋａｓａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ，２００５．７５（２）：ｐ．３５０−５．
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３１（６）：ｐ．１１７１−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、移植などに有用な組織をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率的に構築する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、擬微小重力環境下、複数の異なる細胞タイプを用いて培養を行なうことにより、移植や薬剤スクリーニング、および動物実験モデルの代替法として利用することも可能な三次元組織を構築できることを見出した。
【００１０】
特に、本発明者らは、擬微小重力環境下、複数の異なる細胞タイプを用いて培養を行なうことにより、血管様組織を備えた移植等に有用な骨組織を構築できることを見出した。本発明の方法により構築された骨組織を移植片として用いる場合、移植後の移植組織内での血管ネットワークの構築をスムーズに実現することができる。
【００１１】
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ 多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。
［２］ 多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、［１］の方法。
［３］ 第一の細胞タイプが、骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を含む、［１］または［２］の方法。
［４］ 脱調節された増殖能を有する細胞が、癌細胞から選択される、［１］の方法。
［５］ 第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ （ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、［１］〜［５］のいずれかの方法。
【００１２】
［７］ 分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［６］の方法。
［８］ （ａ）骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、内皮細胞分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、該骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を擬微小重力環境下、骨分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、［６］の方法。
［９］ 内皮細胞分化誘導因子が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［８］の方法。
【００１３】
［１０］ 骨分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、およびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［８］または［９］の方法。
［１１］ 細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される材料を含む多孔性材料である、［６］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］ 得られた三次元組織が、血管様組織および／または骨様組織を含む、［８］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ 擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］ １軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、［１３］の方法。
【００１４】
また、本発明は以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）第１の細胞タイプを培養液中又は細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下で培養するステップ、及び
（ｂ）続いて、第１の細胞タイプとは異なる第２の細胞タイプを播種し、擬微小重力環境下でさらに培養するステップ
を含む、血管様構造を備えた骨組織構築方法。
〔２〕ステップ（ａ）の培養が内皮細胞への分化を誘導する条件下で行なわれる、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕第１の細胞タイプが、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、樹立細胞株細胞、癌細胞、骨髄細胞から分化誘導した血管内皮細胞様細胞、及びそれらのいずれかの混合物からなる群より選択され、第２の細胞タイプが、骨髄細胞、骨髄細胞由来細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、樹立細胞株細胞、癌細胞、及びそれらのいずれかの混合物からなる群より選択される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１５】
〔４〕第１の細胞タイプが骨髄細胞から分化誘導した血管内皮細胞様細胞であり、第２の細胞タイプが骨髄細胞又は間葉系幹細胞である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕内皮細胞への分化誘導が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される成長因子を用いて行なわれる、上記〔２〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔６〕擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の１／１００〜１／１０に相当する重力を物体に与える環境である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
〔７〕擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕１軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらの誘導体、及びそれらの２種以上から構成される複合体からなる群より選択される多孔性足場材料である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０〕細胞培養を、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、及びこれらのうちいずれか２種以上の混合物からなる群より選択される骨分化誘導因子の存在下で行なう、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、様々な三次元組織を構築することができる。より詳細には、本発明によれば、骨移植等に有用な三次元骨組織を取得することができる。本発明により得られる骨組織を用いれば、移植組織内での血管ネットワークの構築がスムーズに実現されるため、移植組織がより確実に定着する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】骨髄細胞から内皮細胞への分化を表す図である。内皮細胞用培地中で培養した骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＦＩＴＣ標識抗フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）抗体染色の蛍光強度を示す。播種密度：黒菱形：１×１０３細胞／ｃｍ２；黒四角：１×１０４細胞／ｃｍ２；黒三角：２×１０５細胞／ｃｍ２。
【図２】骨髄細胞から内皮細胞への分化を表す図である。内皮細胞用培地中で培養した骨髄間葉系幹細胞の細胞表面ＣＤ３１発現を示す。播種密度：点線：１×１０３細胞／ｃｍ２；破線：１×１０４細胞／ｃｍ２；実線：２×１０５細胞／ｃｍ２。
【図３】構築された組織のマクロ像を表す図である。骨髄間葉系幹細胞由来内皮細胞（ＥＣ）を、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣ添加（右）又は無添加（左）にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。
【図４】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣ添加（下段）又は無添加（上段）にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。ａ、ｄ：トルイジンブルー染色；ｂ、ｅ：ＨＥ染色；ｃ、ｆ：アリザリンレッドＳ染色。スケールバー：１００μｍ。
【図５】構築された組織中の内皮細胞（ＥＣ）連絡を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣを添加して、骨形成培地中でさらに１週間培養した。組織を、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンを用いて免疫組織学的に染色した。蛍光像（左）及び位相差顕微鏡像と蛍光像との重ね合わせ像（右）。スケールバー：２０μｍ。
【図６】細胞足場材料中のＭＳＣ由来ＥＣのＨＥ染色像を表す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、足場材料に以下の各密度で播種し、１週間培養した。足場材料あたり：１×１０６細胞（ａ）；３×１０６細胞（ｂ）；５×１０６細胞（ｃ）；１×１０７細胞（ｄ）；５×１０７細胞（ｅ）。スケールバー：１００μｍ。
【図７−１】足場材料中のＥＣ連絡を示す図である。足場材料あたり（ａ）１×１０７細胞又は（ｂ）５×１０７細胞の密度で細胞を播種し、１週間培養した。薄切し、切片をＦＩＴＣ標識フルオレセイントマトレクチンで免疫組織学的に染色した。蛍光像（左）及び位相差顕微鏡像と蛍光像との重ね合わせ像（右）。スケールバー：２０μｍ。
【図７−２】足場材料中のＥＣ連絡を示す図である。足場材料あたり１×１０７細胞の密度で細胞を播種し、１週間培養した。薄切し、切片をＦＩＴＣ標識フルオレセイントマトレクチンで免疫組織学的に染色した。スケールバー：２０μｍ。
【図８】構築された組織の組織学的分析を示す図である。足場材料あたり５×１０６細胞密度でＭＳＣ由来ＥＣを播種し、１週間培養し、ＭＳＣ添加にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。（ａ）：ＨＥ染色；（ｂ）：オステオポンチン染色；（ｃ）：オステオカルシン染色。スケールバー：１００μｍ。
【図９】内皮細胞用培地で培養したＭＳＣ由来ＥＣと、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分とを骨分化誘導培地中、回転培養装置により共培養して得られた組織のマクロ像を表す図である。スケールバー：１ｍｍ。
【図１０】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（（ａ）、（ｂ））または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（（ｃ）、（ｄ））にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。（ａ）および（ｃ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）および（ｄ）：ＨＥ染色。スケールバー：１００μｍ。
【図１１】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（ａ）または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（ｂ）にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。組織を、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンを用いて免疫組織学的に染色した。
【図１２】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、骨分化誘導培地中でさらに３週間培養した。丸で囲まれた領域は、細胞がマトリックスに埋もれている代表的な部位を示す。（ａ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）：ＨＥ染色。スケールバー：５０μｍ。
【図１３】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを１×１０７細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（ａ）または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（ｂ）にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。（ａ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）：抗コラーゲンＩ抗体を用いた免疫組織学的染色；スケールバー：（ａ）および（ｂ）は５０μｍ
【図１４】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中にて培養することなく、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。組織はトルイジンブルー染色した。
【図１５】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはＭＳＣ由来ＥＣを足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間、静置培養または回転培養した。（ａ）および（ｂ）：ＨＵＶＥＣ；（ｃ）および（ｄ）：ＭＳＣ由来のＥＣ。（ａ）および（ｃ）：回転培養；（ｃ）および（ｄ）：静置培養。組織はトルイジンブルー染色した。スケールバー：１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む。
【００２０】
本発明において「三次元組織」とは、少なくとも１種の細胞を三次元培養することによって得られる立体的な集合体（三次元集合体）を意味する。当該三次元集合体において、細胞は三次元的に増殖することが可能であり、細胞が細胞培養用プレートなどの上に張り付くように二次元的に延伸する細胞培養（二次元細胞培養）によって得られる組織モデルと比べて、より生体内に近い細胞環境を実現することができるために、実際の組織の細胞に近い機能を有することができる。
【００２１】
本発明において構築される「三次元組織」としては、特に限定されないが、皮膚、毛髪、骨・軟骨、歯、角膜、血管、心臓、肝臓、膵臓、神経、食道などの生体組織や固形癌モデル（特に限定されないが、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌など）が挙げられる。好ましくは、骨組織であり、さらに好ましくは血管様組織を備える骨組織である。
【００２２】
「多分化能を有する細胞」には、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞が含まれる。ここで第一の細胞タイプにおける「骨髄細胞」には、骨髄間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分に特定されることなく、骨髄より採取された分化・増殖能力を有する未分化の細胞が全て含まれる。本発明に用いられる間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞は、当業者であれば公知の手法を用いて取得することができる（例えば、Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ １９９２，１３：８１−８８；Ｙｏｏ ＪＵ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．１９９８，８０：１７４５−１７５７；Ｏｈｙａｂｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６，９５（５）：１００３−８などを参照されたい）。特に骨髄間葉系幹細胞が好ましい。骨髄間葉系幹細胞は採取が比較的容易であり、増殖能力が高い。これらの細胞は、樹立された培養細胞株であっても良く、また患者の生体から単離された細胞を好適に用いて調製することができる。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。さらに、これらの細胞は、凍結保存されたものであってもよい。つまり、予め採取した細胞を凍結保存しておき、必要に応じて利用することもできる。
【００２３】
「分化誘導された細胞」とは、多分化能を有する細胞を分化誘導して得られた分化細胞を意味する。今日、多分化能を有する細胞を様々な分化細胞、例えば、表皮細胞、神経細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、血管細胞、筋細胞、肝細胞、内皮細胞などに分化誘導する方法が明らかにされている（Ｂｙｒｎｅ，ＪＡ．，ｅｔ．ａｌ.，２００６，Ｃｕｒｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． １（２）１２７−１３８；Ｈｗａｎｇ，ＮＳ．，２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１（１），９７−１０６；Ｂｉａｎｃｏ Ｐ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，１１８−１２１）。例えば、このような細胞としては、骨髄細胞を分化誘導して得られる内皮細胞様細胞が挙げられる。骨髄細胞の内皮細胞様細胞への分化誘導は常法に従って行なうことができる。例えば、骨髄細胞を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、又はこれらの組み合わせを含有する内皮細胞用培地中で培養することにより内皮細胞様細胞へ分化を誘導することができる。内皮細胞様細胞へ分化したことの確認は、内皮細胞のマーカー遺伝子またはタンパク質（例えば、フォン・ウィルブラント因子など）の発現を検出することによって行うことができる。なお、本明細書において、多分化能を有する細胞より分化誘導された内皮細胞様細胞を、単に「内皮細胞」と呼ぶこともある。
【００２４】
「脱調節された増殖能を有する細胞」には、癌細胞が含まれる。癌細胞は固形癌に由来するものが好ましい。
【００２５】
第二の細胞タイプとしての「骨髄細胞」には、骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分が含まれる。
【００２６】
「骨髄細胞由来の浮遊細胞成分」には、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、血球、顆粒球、巨核球（特に、これらに限定されない）からなる群から選択される少なくとも１種の細胞が含まれる。骨髄細胞由来の浮遊細胞成分は、従来公知の手法によって採取することが可能である（Ｓａｋａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，７９（３），４４５−４４８；Ｄｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９９，６５（５），４１１−４１３）。すなわち、Ｔ−フラスコ（ＢＤ社製）など骨髄間葉系細胞の培養に一般的に用いられる培養フラスコに、採取されたまたは保存された骨髄細胞を播種して適当な培地中（例えば、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）など）にて１〜２４時間培養し、培養フラスコに接着していない細胞を回収すればよい。
【００２７】
これら「骨髄間葉系幹細胞」および「骨髄細胞由来の浮遊細胞成分」は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生体から単離された骨髄細胞を好適に用いて調製することができる。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。さらに、患者から採取した骨髄細胞は、凍結保存されたものであってもよい。つまり、予め採取した骨髄細胞を凍結保存しておき、必要に応じて利用することもできる。
【００２８】
本発明において「擬微小重力環境」とは、宇宙空間における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。すなわち、回転している物体は、地球の重力と応力とのベクトル和で表される力を受けるため、その大きさと方向は時間により変化する。したがって、時間平均すると物体には地球の重力（ｇ）よりもはるかに小さな重力しか作用しないこととなり、宇宙空間によく似た「擬微小重力環境」が実現される。
【００２９】
「擬微小重力環境」は、細胞が沈降することなく均一に分散した状態で増殖分化し、３次元的に凝集して、組織塊を形成できるような環境であることが必要である。言い換えれば、播種細胞の沈降速度に同調するように回転速度を調節して、細胞に対する地球の重力の影響を最小化することが望まれる。具体的には、培養細胞にかかる微小重力は、時間平均して地球の重力（ｇ）の１／１００〜１／１０倍程度であることが望ましい。
【００３０】
本発明では、擬微小重力環境を実現するために、好ましくは、回転式のバイオリアクターを使用する。そのようなバイオリアクターとしては、例えば、ＲＷＶ（Ｒａｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ：米国特許第５，００２，８９０号）、ＲＣＣＳ（Ｒｏｔａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＳｙｓｔｅｍＴＭ：Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、３Ｄクリノスタット、並びに特開平８−１７３１４３号、特開平９−３７７６７号、及び特開２００２−４５１７３号に記載されているものなどを用いることができる。なかでも、ＲＷＶ及びＲＣＣＳはガス交換機能を備えているという点で優れている。
【００３１】
また、１軸式と２軸式では、１軸式の回転式バイオリアクターの方が好ましい。２軸式（例えば、２軸式クリノスタット等）では、ずり応力（シェアストレス）を最小化することができず、またサンプル自体も回転するため、１軸式バイオリアクターのようにベッセル内にサンプルがふわふわと浮かんだ状態を再現することができないからである。このふわふわと浮かんだ状態が、特別な足場材料がない場合でも大きな３次元組織塊を得るために重要である。
【００３２】
本発明の実施例で用いられているＲＷＶは、ＮＡＳＡによって開発されたガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。ＲＷＶを用いる場合、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養が行われる。バイオリアクター内には、回転による応力のため、実質的に地球の重力よりもはるかに小さい「微小重力環境」が実現される。この擬微小重力環境下において、細胞は培養液内に均一に懸濁され、最小のずり応力下で必要時間にわたって培養され、凝集して組織塊を形成する。足場材料を用いる培養の場合、細胞は足場材料全体に均一に広がり、良好に増殖する。
【００３３】
ＲＷＶを用いる場合の好ましい回転速度は、ベッセルの直径並びに組織塊の大きさ及び質量に応じて適宜設定され、例えば直径５ｃｍのベッセルを用いる場合であれば５〜２５ｒｐｍ程度、好ましくは７．５〜１７ｒｐｍであることが望ましい。この条件であれば、播種細胞の沈降速度とベッセルの回転速度とが同調し、細胞に対する地球の重力の影響が最小化されるからである。この場合、ベッセル内の細胞に作用する重力は実質的に地上の重力（ｇ）の１／１００〜１／１０倍程度となる。
【００３４】
本発明における擬微小重力環境下での細胞培養は、細胞足場材料の存在下で行なってもよいし、足場材料なしで細胞懸濁液の状態から開始してもよい。好ましくは、細胞足場材料の存在下で行う。本発明における細胞足場材料としては多孔性ポリマー材料が好ましく用いられる。「多孔性ポリマー材料」とは、ポリマー材料であって、多孔質構造を形成しているものを指す。多孔質構造とは、数μｍ〜数１０μｍ程度の無数の孔（空隙）が存在する構造であり、本発明においては、多孔質構造の空隙率（全体積に比した空隙部分の体積の割合）は４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％である。空隙率が低すぎると、細胞の侵入が不十分になり、空隙率が高すぎると、構造の強度を保つことができない。ポリマー材料は、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含む。上記の材料の列挙は例示であって、限定的なものではない。特に、ポリカプロラクトン及びポリグリコール酸は、細胞との接着性が高く、適度な力学的強度を有することから、本発明の方法に好適である。これら化合物の「誘導体」には、上記化合物の表面にタンパク質や高分子が固定化またはコーティングされた複合体が含まれる。
【００３５】
細胞足場材料の形状は、特に限定されず、球状、ディスク状、粒子状、ブロック状など任意の形状を用いることができる。細胞足場材料の大きさは、特に限定されず、例えば最長部の長さ（直径など）を、０．２ｍｍ〜３０ｍｍの範囲より適宜選択することができる。
【００３６】
細胞足場材料は、市販のもの（特に限定されないが、ＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）など）を利用することができる。
【００３７】
細胞の培養に用いられる培地としては、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、所望の細胞タイプの培養に通常用いられる培地を、細胞の特性に合わせて適宜選択して用いることができる。また、該培地には、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）等の抗生物質などを添加してもよい。
【００３８】
培地には、細胞の分化誘導因子を添加する。「分化誘導因子」とは、上記多分化能を有する細胞を特定の分化状態へと誘導することができる、一または複数種の化合物を意味する。分化誘導因子としては、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ハイドロコルチゾンなどが挙げられ、目的とする組織に応じて、これら化合物の少なくとも１種を培地に含めることができる。上記のとおり多分化能を保持する細胞の分化を誘導する方法は公知であり、本発明においてはそれらを利用することができる。例えば、細胞の血管内皮への分化を誘導するためには、ＥＢＭ（内皮細胞基本培地）中に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アスコルビン酸およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した内皮細胞用培地を用いることができる。細胞の骨分化を誘導するためには、α−ＭＥＭ等の基本培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、およびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した骨分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の脂肪細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンおよびデキサメタゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の心筋細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、デキサメタゾン、アスコルビン酸、トランスフェリンおよびインシュリンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した心筋細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の肝細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭおよびデキサメタゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した肝細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。
【００３９】
なお、上記第一の細胞タイプおよび／または第二の細胞タイプは、擬微小重力環境下にて共培養する前に、別個の分化誘導因子を添加したそれぞれ培地中で予め培養されていてもよい。それぞれの細胞を別個に分化誘導することによって、構築される組織に複数の組織を含めることが可能となると共に、他方の分化誘導因子の干渉（例えば、細胞増殖の阻害など）を避けることができる。
【００４０】
すなわち、本発明は以下のステップを含み得る。
（ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ。
【００４１】
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）では、第一の細胞タイプの血管内皮への分化を誘導するために、ＥＢＭ（内皮細胞基本培地）中に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した内皮細胞用培地を用いて、多分化能を有する細胞および／またはそれらから分化誘導された内皮細胞の培養を行ない、ステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で得られた内皮細胞を含む培養組織塊と第二の細胞タイプ（骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分）の骨分化を誘導するために、当該培養組織塊と第二の細胞タイプをα−ＭＥＭ等の基本培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェートおよびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した骨分化誘導培地を用いて共培養を行なう。本発明において、多分化能を有する細胞として、骨髄間葉系幹細胞を利用することが好ましい。また、骨髄間葉系幹細胞は骨に分化するのみならず、血管内皮細胞に分化することも報告されている（Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，１９９９．８５（３）：ｐ．２２１−８．）。さらに、血管周囲の細胞の供給源となり血管を安定化させることができる（Ｃｒｉｓａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００８．３（３）：ｐ．３０１−１３．；Ａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００８．１１１（９）：ｐ．４５５１−８．）。すなわち、骨髄間葉系幹細胞は骨成分の細胞を供給し、さらに血管を形成、安定化させることが期待できる。ステップ（ｂ）において、第二の細胞タイプ（骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分）はステップ（ａ）で得られた培養組織塊に播種してもよいし、培地中に添加してもよい。また、下記表１に示すとおり、第二の細胞タイプは使用せずに、目的の三次元組織を構築することも可能である。
【００４２】
本実施形態においては、血管様組織を備えた骨様組織からなる三次元組織を構築することができる。本発明において、「血管様組織」とは、顕微鏡的に観察される内皮細胞（例えば、内皮細胞のマーカーを発現している細胞）の管状構造、網状構造等を意味する。なお、本明細書において、血管様組織を単に、「血管組織」と呼ぶこともある。また、本発明において、「骨様組織」とは、顕微鏡的に観察される骨組織の構造（例えば、細胞がマトリックスに埋もれている状態）を有する、また例えばアリザリンレッドＳ染色、オステオポンチン染色、オステオカルシン染色など骨組織を染色する手法により染色される組織を意味する。なお、本明細書において、骨様組織を単に、「骨組織」と呼ぶこともある。
【００４３】
また、本発明において、第一の細胞タイプ、第二の細胞タイプおよび培地に添加する分化誘導因子を適宜組み合わせることによって、様々な組織を分化誘導することが可能である。以下に第一の細胞タイプ、第二の細胞タイプおよび培地に添加する分化誘導因子の組み合わせの代表的な実施形態を挙げる。目的とする組織の分化を誘導するために、下記細胞および分化誘導因子を適宜選択して使用することができる。ただし、本発明は、これらの組み合わせに限定されるものではない。
【００４４】
【表１】
【００４５】
細胞の培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行なうことが望ましい。培養期間は特に限定されないが、例えば、ステップ（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ、少なくとも３日間、好ましくは少なくとも５日間、最も好ましくは少なくとも７日間である。
【００４６】
足場材料を使用する培養では、好ましくは第一の細胞タイプを１ｃｍ３の足場材料あたり１×１０７〜５×１０９細胞の密度で、足場材料を使用しない培養では、好ましくは第一の細胞タイプを１×１０５〜１×１０７／ｃｍの密度で播種する。また、第二の細胞タイプについては、足場材料を使用する培養では、１ｃｍ３の足場材料あたり１×１０７〜５×１０９細胞の密度で、足場材料を使用しない培養では、１×１０５〜１×１０７／ｃｍの密度で播種または添加することができる。
【００４７】
特に、上記血管様組織を備えた骨組織からなる三次元組織を構築する実施形態についていえば、ステップ（ａ）において足場材料あたり１×１０６〜５×１０７細胞を播種し、１〜２週間培養することができる。ただし、培養期間は足場材料に播種する細胞量および足場材料の大きさなどの要因によって適宜変更することができる。例えば、直径５ｍｍ×高さ２ｍｍのサイズを有する足場材料あたり、５×１０６細胞を播種して１４日培養すると、細胞が足場材料の外周を覆ってしまい、内部が壊死することがある。この場合は、最適な培養期間は１４日よりも少ない日数である。
【００４８】
本発明の方法を再生医療に応用すれば、自己由来の細胞を利用した組織の再生が可能になる。すなわち、患者から採取した骨髄細胞等を擬微小重力環境下で３次元的に培養して、障害・欠損を有する組織に移植可能な新たな組織を構築し、該患者に移植することができる。また、本発明の方法により構築された組織は拒絶反応の危険性がない上、自家骨移植と比較して正常組織の侵襲が少なく、また生体内での血管ネットワークの構築もスムーズであるため、より安全かつ確実な組織再生を実現することができる。また、本発明の方法により構築される三次元組織は、生体内に近い細胞環境を実現することができるために、実際の組織に近い機能を有し、薬剤スクリーニング、および動物実験モデルの代替法として利用することも可能である。
【００４９】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５０】
本明細書中で引用する全ての特許文献、刊行物、技術文書は、それらが本明細書に記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５１】
実施例１：骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から内皮細胞（ＥＣ）への分化
日本白色家兎（ＪＷ／ＳＣＫ、１０日齢、メス）より骨髄細胞を採取し、Ｔ−７５フラスコ（底面積：７５ｃｍ２；ＢＤ社製）に播種した。１〜３週間の培養後、Ｔ−２５フラスコ（底面積：２５ｃｍ２；ＢＤ社製）に２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で継代した。骨髄細胞の培養は、α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０％ ＦＢＳ中で行ない、継代後は内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で行なった。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は以下の通りである（内皮細胞添加因子セット（ＥＧＭ（登録商標）−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（カタログ番号：ＣＣ−４１７６））：
【００５２】
ＥＧＭ−２−ＭＶ
・ＥＢＭ（内皮細胞基本培地） ５００ｍＬ
・ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子） 約０．５ｍＬ
・ｈＦＧＦ−Ｂ（組換えヒト線維芽細胞成長因子） 約２ｍＬ
・ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子） 約０．５ｍＬ
・アスコルビン酸 約０．５ｍＬ
・ヒドロコルチゾン 約０．２ｍＬ
・Ｒ３−ＩＧＦ（インスリン様成長因子）−１ 約０．５ｍＬ
・ＧＡ−１０００（５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシン、５０μｇ／ｍＬ アンホテリシン−Ｂ） 約０．５ｍＬ
・ＦＢＳ（ウシ胎児血清） 約２５ｍＬ（５％）
骨髄細胞から内皮細胞への分化を確認するため、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）についての蛍光免疫染色、及び細胞表面ＣＤ３１発現解析を行った。
【００５３】
播種３日後と１週間後の細胞をガラスボトムディッシュ（底面積：１ｃｍ２；ＩＷＡＫＩ）に継代し、２４時間培養した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ溶液中で１％ ＦＩＴＣ標識抗フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）抗体（ヒツジポリクローナル；ａｂｃａｍ社より入手）（ＰＢＳ中）と３０分間反応させた。蛍光顕微鏡を用いて染色像を観察した。得られた画像の蛍光強度を、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ ４．６（カール・ツァイス社製）を用いて測定し、細胞の面積あたりの蛍光強度を算出し、分化前のＭＳＣについての蛍光強度と比較した。各サンプルから８個の細胞を無作為に選定し、その平均値を算出した（ｎ＝１）。
【００５４】
さらに、播種１週間後の細胞表面におけるＣＤ３１（血小板細胞接着因子（ＰＥＣＡＭ））の発現をＦＡＣＳ（ＢＤ社製ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭセルソーター）により解析した。各密度で播種した細胞を１×１０６個ずつ回収し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ−２％ ＦＢＳ中で１％ ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３１抗体（マウスモノクローナル（ＷＭ−５９）；ａｂｃａｍ社より入手）と３０分間、氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２００μｇ／ｍＬ ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を加え、ＦＡＣＳで解析した。
【００５５】
結果
ｖＷＦの免疫蛍光染色の結果（図１）から、１×１０４細胞／ｃｍ２、２×１０５細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、培養日数が増えるにつれ蛍光強度が増加することが観察された。一方、１×１０３細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、培養１週間では蛍光強度の増加は観察されなかった。
【００５６】
図２に示されるように、１週間培養した細胞のＣＤ３１発現について調べたところ、２×１０５細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、１×１０３細胞／ｃｍ２、１×１０４細胞／ｃｍ２で播種した細胞と比較してＣＤ３１を多く発現していた。ＣＤ３１は成熟した内皮細胞が発現するマーカーとして知られているため（Ｊｏａｃｈｉｍ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００４．２２（３）：ｐ．３７７−３８４．）、１×１０３細胞／ｃｍ２、１×１０４細胞／ｃｍ２で播種した細胞は１週間の培養では成熟していないと考えられる。結果から、高密度で細胞を播種し、培養することにより、分化を促進することができることが確認された。
【００５７】
実施例２：骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と骨髄由来間葉系幹細胞由来内皮細胞（ＭＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＣ）の回転培養
実施例１に記載のように調製した内皮細胞（ＥＣ）を、細胞足場材料であるＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に、足場材料あたり１×１０６〜５×１０７細胞の密度で播種し、減圧（１００ｍｍＨｇ、５分間）により細胞懸濁液を足場材料内部に取り込ませた（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｅｎｇ，２００２．１２（２）：ｐ．２０３−９．；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３．２４（１３）：ｐ．２２７７−８６．）。５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベートした後、回転培養装置（ＲＷＶバイオリアクター；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）で培養を行なった。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（１×１０６〜５×１０６細胞／足場材料）を播き足し、さらに１週間、下記の組成を有する骨分化誘導培地中で培養した。培地は３日おきに交換した。回転速度は、培養サンプルの沈降の様子を確認しながら調節した（７．５〜１２ｒｐｍ）。
【００５８】
骨分化誘導培地
・α−ＭＥＭ
・１０ｍＭ β−グリセロホスフェート
・５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸
・１０ｎＭ デキサメタゾン
【００５９】
実施例３：組織学的評価
実施例２に記載のように、ＥＣ（１×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（１×１０６細胞／足場材料）を播き足した後に、骨分化誘導培地中で１週間培養した（図３、右）。対照として、ＥＣ（１×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣを添加せずに骨分化誘導培地中で１週間培養した（図３、左）。
【００６０】
図４に示すＨＥ染色の結果から、ＭＳＣを播き足したサンプルでは、足場材料の中心部付近に細胞が集まり、ＭＳＣを添加していないサンプルでは、足場材料全体に細胞が点在していた。また、いずれのサンプルにおいても、アリザリンレッドＳ染色に対して陽性であり、骨組織が形成されていることが確認された（図４、右）。さらに、レクチン染色（図５）により、ＭＳＣを添加したサンプルでは血管様の細胞が観察された。
【００６１】
ＥＣの播種密度について検討したところ、図６のＨＥ染色の結果から示されるように、細胞の播種密度が上昇するにつれ、細胞が足場材料内に多く侵入し、１×１０７細胞／足場材料でプラトーに達していた。
【００６２】
また、図７−１に示すレクチン染色の結果から、足場材料内により多くの細胞が取り込まれたサンプル（１×１０７及び５×１０７細胞／足場材料）では、血管様の構造が観察された。また、分岐を有する血管様の構造も観察された（図７−２）。
【００６３】
さらに実施例２に記載のように、ＭＳＣ由来のＥＣ（５×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（５×１０６細胞／足場材料）を播き足した後に、骨分化誘導培地中で１週間培養した。得られた組織の切片を公知の手法に基づいて作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、オステオポンチン染色およびオステオカルシン染色を行った。
【００６４】
各染色結果を図８に示す。
図８より明らかなように、得られた組織はオステオポンチン（図８（ｂ））およびオステオカルシン（図８（ｃ））染色に対し陽性であることから、得られた組織中に骨組織が形成されたことが示された。
【００６５】
実施例４：骨髄細胞由来の浮遊細胞成分存在下における骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来内皮細胞（ＭＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＣ）の回転培養
（１）骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から内皮細胞（ＥＣ）への分化
上記実施例１と同様に、ＭＳＣからＥＣを調製した。調製後の細胞は、内皮細胞の表現系の代表的なマーカーである、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）とＣＤ３１（血小板細胞接着因子（ＰＥＣＡＭ））の発現を解析することで分化を確認した。
【００６６】
（２）骨髄細胞からの浮遊細胞成分の分離
上記ＭＳＣを採取したウサギとは異なる個体より骨髄細胞を採取し、Ｔ−７５フラスコ（底面積：７５ｃｍ２；ＢＤ社製）に播種した。α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）および１０％ ＦＢＳを含む培地中、インキュベーターで２４時間培養後、フラスコに接着していない細胞を回収した。回収した浮遊細胞成分は、遠心処理によりチューブに集め、使用時まではインキュベーター中に保管した。
【００６７】
（３）骨髄間葉系幹細胞由来内皮細胞と浮遊細胞成分とのＲＷＶ回転共培養
上記（１）にて調製したＭＳＣ由来のＥＣをＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に播種し（５×１０６細胞／足場材料、または１×１０７細胞／足場材料）、減圧（１００ｍｍＨｇ，５ｍｉｎ）により細胞懸濁液を足場材料内部へ浸透させ（（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，上掲）、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で２時間培養した。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は上記の通りである。その後、回転培養装置（ＲＷＶバイオリアクター；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）で回転培養を行った。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地中にて３日または１週間培養を行った後、骨分化誘導培地に切り替えて培養を行った。骨分化誘導培地の組成は上記のとおりである。骨分化誘導培地には、上記（２）にて調製した浮遊細胞成分を添加して用いた。浮遊細胞成分は、一羽のウサギから採取できる量の１２分の１量を骨分化誘導培地に添加した。培養は、５％ＣＯ２，３７℃にて、浮遊細胞成分を添加した骨分化誘導培地を用いて、２日おきに培地交換を行った。回転速度は、培養サンプルの沈降の様子を確認しながら調節した（７．５〜３０ｒｐｍ）。
【００６８】
（４）組織学的評価
上記（３）で得られた各組織を４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液中で固定し（４℃、３日間）、その後、０．１Ｍ ｔｒｉｓ−０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液で脱灰（２５℃、３日間）を行い、パラフィンに包埋しパラフィンブロックを作製した。なお、当該組織は約３ｍｍの直径を有した（図９）。さらに、上記（３）で得られた各組織を凍結包埋剤（４％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（Ｌｅｉｃａ））で包埋し、凍結ブロックを作製した。パラフィンブロックおよび凍結ブロックをミクロトームで５μｍの厚さの切片にし、トルイジンブルー、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色し、組織学的評価を行った。
【００６９】
また、各切片上の組織をプロテイナーゼＫ溶液（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でタンパク質除去し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と反応させた後に、抗コラーゲンＩ抗体（第一ファインケミカル株式会社）またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ （Ｔｏｍａｔｏ） Ｌｅｃｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造元のプロトコルに従って用いて免疫染色を行った。
【００７０】
ＭＳＣ由来のＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下、骨分化誘導培地中で１週間培養して得られた組織の染色像を図１０および１１に示す。
【００７１】
図１０（トルイジンブルー染色：（ａ）および（ｃ）；ＨＥ染色：（ｂ）および（ｄ））より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下で培養することにより（図１０（ａ）および（ｂ））、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下で培養した場合（図１０（ｃ）および（ｄ））と比べて、より高密度な組織を構築できることが確認された。
【００７２】
図１１（レクチン染色：（ａ）および（ｂ））より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と共培養して得られた組織中には、浮遊細胞成分の非存在下にて培養して得られた組織中に観察される血管様組織（図１１（ｂ））と比べて、より太い血管様組織が観察された（図１１（ａ））。
【００７３】
ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下で、骨分化誘導培地で３週間培養して得られた組織の染色像（トルイジンブルー染色：（ａ）；ＨＥ染色：（ｂ）を図１２に示す。上記１週間の培養結果（図１１）と比べ、組織中心部においてもマトリックスが産生されていることが観察された。また、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）の様に細胞がマトリックスに埋もれている様子が観察された（図１２（ａ）、丸で囲まれた領域）。
【００７４】
また、ＭＳＣ由来のＥＣの足場材料に対する播種濃度を１×１０７細胞／足場材料として、上記と同様の条件で培養して得られた組織切片をプロテイナーゼＫ溶液（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でタンパク質除去し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と反応させた後に、抗コラーゲンＩ抗体（第一ファインケミカル株式会社）またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ （Ｔｏｍａｔｏ） Ｌｅｃｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造元のプロトコルに従って用いて免疫染色を行った。
【００７５】
この結果を図１３に示す。図１３（トルイジンブルー染色：（ａ）；抗コラーゲンＩ抗体染色：（ｂ））より明らかなように、１週間の培養により得られた組織の中心部においてもマトリックスの産生が観察された。当該組織を抗コラーゲンＩ抗体を用いて免疫染色した結果を図１３（ｂ）に示す。この結果より、産生されたマトリックスがＩ型コラーゲンであることが示唆された。
【００７６】
（５）コントロール実験
コントロール実験として、ＭＳＣ由来のＥＣを上記（３）と同様に足場材料に播種した後、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養することなく、上記（３）同様に骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と骨分化誘導培地中で１週間共培養を行った。
【００７７】
結果を図１４に示す。
図１４より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養することなく、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と共に骨分化誘導に付した場合、組織はほとんど構築されず、足場材料中に細胞が点在しているのみであった。
【００７８】
また、骨髄細胞を上記（３）と同様に足場材料に播種し、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養した後、上記（３）同様に骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と骨分化誘導培地中で１週間共培養を行った。この場合においても、組織はほとんど構築されず、足場材料中に細胞が点在しているのみであった。
【００７９】
以上の結果より明らかなように、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下、ＭＳＣ由来のＥＣを骨分化誘導培地中で培養することにより、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下にて得られる組織と比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで太い血管様組織を備え、かつマトリックスを多く産生した三次元組織を構築することができた。心筋梗塞モデルのサルに骨髄幹細胞であるＣＤ３４＋細胞の移植を行った結果、局所血流と心機能の有意な改善は観察されたが、移植細胞由来の新生血管も心筋細胞もほとんど検出されなかったこと、および移植細胞は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分泌していることが報告されている（Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ３４＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００５．２３（３）：ｐ．３５５−６４．）。このことから、共培養した浮遊細胞成分により、ＶＥＧＦの分泌が促進された結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで太い血管様組織を備え、かつマトリックスを多く産生した三次元組織を構築された可能性が示唆される。
【００８０】
また、コントロール実験においてはいずれの場合も、組織はほとんど構築されなかった。これはＭＳＣ由来のＥＣを浮遊細胞成分と共培養させたことで、ＭＳＣを内皮細胞用培地で培養したことでそれぞれの細胞の分化が促進され、増殖が抑制されたために組織が構築できなかったことが示唆される。
【００８１】
実施例５：細胞源と培養法の比較
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とＭＳＣ由来のＥＣの静置培養とＲＷＶ回転培養における細胞増殖について比較を行った。
【００８２】
ＨＵＶＥＣはＢＤより入手した。ＭＳＣ由来のＥＣは、上記実施例１と同様に、調製した。
【００８３】
各細胞をＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に播種し（ＨＵＶＥＣ（５×１０７細胞／足場材料）、ＭＳＣ由来のＥＣ（５×１０６細胞／足場材料））、減圧（１００ｍｍＨｇ，５ｍｉｎ）により細胞懸濁液を足場材料内部へ浸透させ（（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，上掲）、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で、静置培養または回転培養に付した。培養期間はいずれも１週間とした。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は上記の通りである。
【００８４】
各培養方法における各細胞の増殖結果を図１５に示す。
図１５より明らかなように、いずれの培養方法であってもＭＳＣ由来のＥＣ（図１５（ｃ）および（ｄ））がＨＵＶＥＣ（図１５（ａ）および（ｂ））に比べてより増殖した。また、いずれの細胞であっても、回転培養（図１５（ａ）および（ｃ））が静置培養（図１５（ｂ）および（ｄ））よりも効率的に細胞を増殖させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、複数の組織を含む三次元組織の構築を可能とし、再生医療、薬剤開発等、組織工学等の分野で利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬微小重力環境下で、複数の異なる細胞タイプを培養することによる三次元組織の構築方法に関する。より具体的には、本発明は、擬微小重力環境下で、複数の異なる細胞タイプを培養することによる、血管様組織を備えた骨組織構築方法に関する。本発明により作製される再生組織は、移植療法などの再生医療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、自家骨髄単核球系細胞移植による血管新生療法（非特許文献１）や骨髄細胞移植による心筋梗塞後の心機能の改善（非特許文献２）など、骨髄細胞を利用した再生治療が注目されている。
【０００３】
骨髄細胞の中には間葉系幹細胞（ＭＳＣ）以外にも造血幹細胞（ＨＳＣ）など多分化能を有する多くの有用な細胞種が存在しており、それらが総合的に組織再生に寄与していると考えられている。
【０００４】
一方、これまでにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系において、骨髄細胞を培養細胞・組織と作用させ、組織工学的に組織を効率的に構築する方法は報告されていない。
【０００５】
現在、様々な病気や障害の治療方法として、組織工学的に作製された移植用組織の利用が注目されている。例えば、従来、骨欠損の治療方法としては自家骨移植が一般的に用いられている。しかし、自家骨移植には、移植可能な大きさ及び／又は形状の骨が準備できない、移植用の骨組織を取得するために侵襲的に手術を行なう必要があるなどの問題がある（非特許文献３）。そこで、自家骨移植に代わる骨再生方法として、組織工学的に構築した骨組織の利用に対する需要が高まっている。
【０００６】
また、組織再生の分野においては、血管を有さない移植組織は、組織が生存するために必要な酸素及び栄養素などを組織内部に送達することができないために、移植後、定着せずに内部が壊死することが問題となっていた。ｉｎ ｖｉｖｏでの組織再生の試みはこれまでにも報告されているが（非特許文献４）、移植した組織への宿主由来の血管の侵入に時間がかかり、移植組織の壊死を生じていた。そのため、当該分野においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管を備えた組織を構築する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００２． ３６０（９３３１）：ｐ．４２７−３５．
【非特許文献２】Ｏｒｌｉｃ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１０（６８２９）：ｐ．７０１−５．
【非特許文献３】Ｎａｋａｓａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ，２００５．７５（２）：ｐ．３５０−５．
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３１（６）：ｐ．１１７１−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、移植などに有用な組織をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率的に構築する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、擬微小重力環境下、複数の異なる細胞タイプを用いて培養を行なうことにより、移植や薬剤スクリーニング、および動物実験モデルの代替法として利用することも可能な三次元組織を構築できることを見出した。
【００１０】
特に、本発明者らは、擬微小重力環境下、複数の異なる細胞タイプを用いて培養を行なうことにより、血管様組織を備えた移植等に有用な骨組織を構築できることを見出した。本発明の方法により構築された骨組織を移植片として用いる場合、移植後の移植組織内での血管ネットワークの構築をスムーズに実現することができる。
【００１１】
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ 多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。
［２］ 多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、［１］の方法。
［３］ 第一の細胞タイプが、骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を含む、［１］または［２］の方法。
［４］ 脱調節された増殖能を有する細胞が、癌細胞から選択される、［１］の方法。
［５］ 第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ （ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、［１］〜［５］のいずれかの方法。
【００１２】
［７］ 分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［６］の方法。
［８］ （ａ）骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、内皮細胞分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、該骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を擬微小重力環境下、骨分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、［６］の方法。
［９］ 内皮細胞分化誘導因子が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［８］の方法。
【００１３】
［１０］ 骨分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、およびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、［８］または［９］の方法。
［１１］ 細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される材料を含む多孔性材料である、［６］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］ 得られた三次元組織が、血管様組織および／または骨様組織を含む、［８］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ 擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］ １軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、［１３］の方法。
【００１４】
また、本発明は以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）第１の細胞タイプを培養液中又は細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下で培養するステップ、及び
（ｂ）続いて、第１の細胞タイプとは異なる第２の細胞タイプを播種し、擬微小重力環境下でさらに培養するステップ
を含む、血管様構造を備えた骨組織構築方法。
〔２〕ステップ（ａ）の培養が内皮細胞への分化を誘導する条件下で行なわれる、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕第１の細胞タイプが、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、樹立細胞株細胞、癌細胞、骨髄細胞から分化誘導した血管内皮細胞様細胞、及びそれらのいずれかの混合物からなる群より選択され、第２の細胞タイプが、骨髄細胞、骨髄細胞由来細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、樹立細胞株細胞、癌細胞、及びそれらのいずれかの混合物からなる群より選択される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【００１５】
〔４〕第１の細胞タイプが骨髄細胞から分化誘導した血管内皮細胞様細胞であり、第２の細胞タイプが骨髄細胞又は間葉系幹細胞である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕内皮細胞への分化誘導が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される成長因子を用いて行なわれる、上記〔２〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔６〕擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の１／１００〜１／１０に相当する重力を物体に与える環境である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
〔７〕擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕１軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらの誘導体、及びそれらの２種以上から構成される複合体からなる群より選択される多孔性足場材料である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１０〕細胞培養を、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、及びこれらのうちいずれか２種以上の混合物からなる群より選択される骨分化誘導因子の存在下で行なう、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、様々な三次元組織を構築することができる。より詳細には、本発明によれば、骨移植等に有用な三次元骨組織を取得することができる。本発明により得られる骨組織を用いれば、移植組織内での血管ネットワークの構築がスムーズに実現されるため、移植組織がより確実に定着する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】骨髄細胞から内皮細胞への分化を表す図である。内皮細胞用培地中で培養した骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＦＩＴＣ標識抗フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）抗体染色の蛍光強度を示す。播種密度：黒菱形：１×１０３細胞／ｃｍ２；黒四角：１×１０４細胞／ｃｍ２；黒三角：２×１０５細胞／ｃｍ２。
【図２】骨髄細胞から内皮細胞への分化を表す図である。内皮細胞用培地中で培養した骨髄間葉系幹細胞の細胞表面ＣＤ３１発現を示す。播種密度：点線：１×１０３細胞／ｃｍ２；破線：１×１０４細胞／ｃｍ２；実線：２×１０５細胞／ｃｍ２。
【図３】構築された組織のマクロ像を表す図である。骨髄間葉系幹細胞由来内皮細胞（ＥＣ）を、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣ添加（右）又は無添加（左）にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。
【図４】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣ添加（下段）又は無添加（上段）にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。ａ、ｄ：トルイジンブルー染色；ｂ、ｅ：ＨＥ染色；ｃ、ｆ：アリザリンレッドＳ染色。スケールバー：１００μｍ。
【図５】構築された組織中の内皮細胞（ＥＣ）連絡を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、細胞足場材料と共に内皮細胞用培地中で１週間培養し、ＭＳＣを添加して、骨形成培地中でさらに１週間培養した。組織を、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンを用いて免疫組織学的に染色した。蛍光像（左）及び位相差顕微鏡像と蛍光像との重ね合わせ像（右）。スケールバー：２０μｍ。
【図６】細胞足場材料中のＭＳＣ由来ＥＣのＨＥ染色像を表す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを、足場材料に以下の各密度で播種し、１週間培養した。足場材料あたり：１×１０６細胞（ａ）；３×１０６細胞（ｂ）；５×１０６細胞（ｃ）；１×１０７細胞（ｄ）；５×１０７細胞（ｅ）。スケールバー：１００μｍ。
【図７−１】足場材料中のＥＣ連絡を示す図である。足場材料あたり（ａ）１×１０７細胞又は（ｂ）５×１０７細胞の密度で細胞を播種し、１週間培養した。薄切し、切片をＦＩＴＣ標識フルオレセイントマトレクチンで免疫組織学的に染色した。蛍光像（左）及び位相差顕微鏡像と蛍光像との重ね合わせ像（右）。スケールバー：２０μｍ。
【図７−２】足場材料中のＥＣ連絡を示す図である。足場材料あたり１×１０７細胞の密度で細胞を播種し、１週間培養した。薄切し、切片をＦＩＴＣ標識フルオレセイントマトレクチンで免疫組織学的に染色した。スケールバー：２０μｍ。
【図８】構築された組織の組織学的分析を示す図である。足場材料あたり５×１０６細胞密度でＭＳＣ由来ＥＣを播種し、１週間培養し、ＭＳＣ添加にて、骨形成培地中でさらに１週間培養した。（ａ）：ＨＥ染色；（ｂ）：オステオポンチン染色；（ｃ）：オステオカルシン染色。スケールバー：１００μｍ。
【図９】内皮細胞用培地で培養したＭＳＣ由来ＥＣと、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分とを骨分化誘導培地中、回転培養装置により共培養して得られた組織のマクロ像を表す図である。スケールバー：１ｍｍ。
【図１０】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（（ａ）、（ｂ））または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（（ｃ）、（ｄ））にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。（ａ）および（ｃ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）および（ｄ）：ＨＥ染色。スケールバー：１００μｍ。
【図１１】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（ａ）または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（ｂ）にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。組織を、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンを用いて免疫組織学的に染色した。
【図１２】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、骨分化誘導培地中でさらに３週間培養した。丸で囲まれた領域は、細胞がマトリックスに埋もれている代表的な部位を示す。（ａ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）：ＨＥ染色。スケールバー：５０μｍ。
【図１３】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを１×１０７細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下（ａ）または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下（ｂ）にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。（ａ）：トルイジンブルー染色；（ｂ）：抗コラーゲンＩ抗体を用いた免疫組織学的染色；スケールバー：（ａ）および（ｂ）は５０μｍ
【図１４】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ＭＳＣ由来ＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地中にて培養することなく、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、骨分化誘導培地中でさらに１週間培養した。組織はトルイジンブルー染色した。
【図１５】構築された組織の組織学的分析を示す図である。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはＭＳＣ由来ＥＣを足場材料に播種し、内皮細胞用培地中で１週間、静置培養または回転培養した。（ａ）および（ｂ）：ＨＵＶＥＣ；（ｃ）および（ｄ）：ＭＳＣ由来のＥＣ。（ａ）および（ｃ）：回転培養；（ｃ）および（ｄ）：静置培養。組織はトルイジンブルー染色した。スケールバー：１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む。
【００２０】
本発明において「三次元組織」とは、少なくとも１種の細胞を三次元培養することによって得られる立体的な集合体（三次元集合体）を意味する。当該三次元集合体において、細胞は三次元的に増殖することが可能であり、細胞が細胞培養用プレートなどの上に張り付くように二次元的に延伸する細胞培養（二次元細胞培養）によって得られる組織モデルと比べて、より生体内に近い細胞環境を実現することができるために、実際の組織の細胞に近い機能を有することができる。
【００２１】
本発明において構築される「三次元組織」としては、特に限定されないが、皮膚、毛髪、骨・軟骨、歯、角膜、血管、心臓、肝臓、膵臓、神経、食道などの生体組織や固形癌モデル（特に限定されないが、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌など）が挙げられる。好ましくは、骨組織であり、さらに好ましくは血管様組織を備える骨組織である。
【００２２】
「多分化能を有する細胞」には、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞が含まれる。ここで第一の細胞タイプにおける「骨髄細胞」には、骨髄間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分に特定されることなく、骨髄より採取された分化・増殖能力を有する未分化の細胞が全て含まれる。本発明に用いられる間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞は、当業者であれば公知の手法を用いて取得することができる（例えば、Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ １９９２，１３：８１−８８；Ｙｏｏ ＪＵ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．１９９８，８０：１７４５−１７５７；Ｏｈｙａｂｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６，９５（５）：１００３−８などを参照されたい）。特に骨髄間葉系幹細胞が好ましい。骨髄間葉系幹細胞は採取が比較的容易であり、増殖能力が高い。これらの細胞は、樹立された培養細胞株であっても良く、また患者の生体から単離された細胞を好適に用いて調製することができる。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。さらに、これらの細胞は、凍結保存されたものであってもよい。つまり、予め採取した細胞を凍結保存しておき、必要に応じて利用することもできる。
【００２３】
「分化誘導された細胞」とは、多分化能を有する細胞を分化誘導して得られた分化細胞を意味する。今日、多分化能を有する細胞を様々な分化細胞、例えば、表皮細胞、神経細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、血管細胞、筋細胞、肝細胞、内皮細胞などに分化誘導する方法が明らかにされている（Ｂｙｒｎｅ，ＪＡ．，ｅｔ．ａｌ.，２００６，Ｃｕｒｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． １（２）１２７−１３８；Ｈｗａｎｇ，ＮＳ．，２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１（１），９７−１０６；Ｂｉａｎｃｏ Ｐ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，１１８−１２１）。例えば、このような細胞としては、骨髄細胞を分化誘導して得られる内皮細胞様細胞が挙げられる。骨髄細胞の内皮細胞様細胞への分化誘導は常法に従って行なうことができる。例えば、骨髄細胞を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、又はこれらの組み合わせを含有する内皮細胞用培地中で培養することにより内皮細胞様細胞へ分化を誘導することができる。内皮細胞様細胞へ分化したことの確認は、内皮細胞のマーカー遺伝子またはタンパク質（例えば、フォン・ウィルブラント因子など）の発現を検出することによって行うことができる。なお、本明細書において、多分化能を有する細胞より分化誘導された内皮細胞様細胞を、単に「内皮細胞」と呼ぶこともある。
【００２４】
「脱調節された増殖能を有する細胞」には、癌細胞が含まれる。癌細胞は固形癌に由来するものが好ましい。
【００２５】
第二の細胞タイプとしての「骨髄細胞」には、骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分が含まれる。
【００２６】
「骨髄細胞由来の浮遊細胞成分」には、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、血球、顆粒球、巨核球（特に、これらに限定されない）からなる群から選択される少なくとも１種の細胞が含まれる。骨髄細胞由来の浮遊細胞成分は、従来公知の手法によって採取することが可能である（Ｓａｋａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，７９（３），４４５−４４８；Ｄｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９９，６５（５），４１１−４１３）。すなわち、Ｔ−フラスコ（ＢＤ社製）など骨髄間葉系細胞の培養に一般的に用いられる培養フラスコに、採取されたまたは保存された骨髄細胞を播種して適当な培地中（例えば、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）など）にて１〜２４時間培養し、培養フラスコに接着していない細胞を回収すればよい。
【００２７】
これら「骨髄間葉系幹細胞」および「骨髄細胞由来の浮遊細胞成分」は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生体から単離された骨髄細胞を好適に用いて調製することができる。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。さらに、患者から採取した骨髄細胞は、凍結保存されたものであってもよい。つまり、予め採取した骨髄細胞を凍結保存しておき、必要に応じて利用することもできる。
【００２８】
本発明において「擬微小重力環境」とは、宇宙空間における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。すなわち、回転している物体は、地球の重力と応力とのベクトル和で表される力を受けるため、その大きさと方向は時間により変化する。したがって、時間平均すると物体には地球の重力（ｇ）よりもはるかに小さな重力しか作用しないこととなり、宇宙空間によく似た「擬微小重力環境」が実現される。
【００２９】
「擬微小重力環境」は、細胞が沈降することなく均一に分散した状態で増殖分化し、３次元的に凝集して、組織塊を形成できるような環境であることが必要である。言い換えれば、播種細胞の沈降速度に同調するように回転速度を調節して、細胞に対する地球の重力の影響を最小化することが望まれる。具体的には、培養細胞にかかる微小重力は、時間平均して地球の重力（ｇ）の１／１００〜１／１０倍程度であることが望ましい。
【００３０】
本発明では、擬微小重力環境を実現するために、好ましくは、回転式のバイオリアクターを使用する。そのようなバイオリアクターとしては、例えば、ＲＷＶ（Ｒａｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ：米国特許第５，００２，８９０号）、ＲＣＣＳ（Ｒｏｔａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＳｙｓｔｅｍＴＭ：Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、３Ｄクリノスタット、並びに特開平８−１７３１４３号、特開平９−３７７６７号、及び特開２００２−４５１７３号に記載されているものなどを用いることができる。なかでも、ＲＷＶ及びＲＣＣＳはガス交換機能を備えているという点で優れている。
【００３１】
また、１軸式と２軸式では、１軸式の回転式バイオリアクターの方が好ましい。２軸式（例えば、２軸式クリノスタット等）では、ずり応力（シェアストレス）を最小化することができず、またサンプル自体も回転するため、１軸式バイオリアクターのようにベッセル内にサンプルがふわふわと浮かんだ状態を再現することができないからである。このふわふわと浮かんだ状態が、特別な足場材料がない場合でも大きな３次元組織塊を得るために重要である。
【００３２】
本発明の実施例で用いられているＲＷＶは、ＮＡＳＡによって開発されたガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。ＲＷＶを用いる場合、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養が行われる。バイオリアクター内には、回転による応力のため、実質的に地球の重力よりもはるかに小さい「微小重力環境」が実現される。この擬微小重力環境下において、細胞は培養液内に均一に懸濁され、最小のずり応力下で必要時間にわたって培養され、凝集して組織塊を形成する。足場材料を用いる培養の場合、細胞は足場材料全体に均一に広がり、良好に増殖する。
【００３３】
ＲＷＶを用いる場合の好ましい回転速度は、ベッセルの直径並びに組織塊の大きさ及び質量に応じて適宜設定され、例えば直径５ｃｍのベッセルを用いる場合であれば５〜２５ｒｐｍ程度、好ましくは７．５〜１７ｒｐｍであることが望ましい。この条件であれば、播種細胞の沈降速度とベッセルの回転速度とが同調し、細胞に対する地球の重力の影響が最小化されるからである。この場合、ベッセル内の細胞に作用する重力は実質的に地上の重力（ｇ）の１／１００〜１／１０倍程度となる。
【００３４】
本発明における擬微小重力環境下での細胞培養は、細胞足場材料の存在下で行なってもよいし、足場材料なしで細胞懸濁液の状態から開始してもよい。好ましくは、細胞足場材料の存在下で行う。本発明における細胞足場材料としては多孔性ポリマー材料が好ましく用いられる。「多孔性ポリマー材料」とは、ポリマー材料であって、多孔質構造を形成しているものを指す。多孔質構造とは、数μｍ〜数１０μｍ程度の無数の孔（空隙）が存在する構造であり、本発明においては、多孔質構造の空隙率（全体積に比した空隙部分の体積の割合）は４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％である。空隙率が低すぎると、細胞の侵入が不十分になり、空隙率が高すぎると、構造の強度を保つことができない。ポリマー材料は、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含む。上記の材料の列挙は例示であって、限定的なものではない。特に、ポリカプロラクトン及びポリグリコール酸は、細胞との接着性が高く、適度な力学的強度を有することから、本発明の方法に好適である。これら化合物の「誘導体」には、上記化合物の表面にタンパク質や高分子が固定化またはコーティングされた複合体が含まれる。
【００３５】
細胞足場材料の形状は、特に限定されず、球状、ディスク状、粒子状、ブロック状など任意の形状を用いることができる。細胞足場材料の大きさは、特に限定されず、例えば最長部の長さ（直径など）を、０．２ｍｍ〜３０ｍｍの範囲より適宜選択することができる。
【００３６】
細胞足場材料は、市販のもの（特に限定されないが、ＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）など）を利用することができる。
【００３７】
細胞の培養に用いられる培地としては、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、所望の細胞タイプの培養に通常用いられる培地を、細胞の特性に合わせて適宜選択して用いることができる。また、該培地には、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）等の抗生物質などを添加してもよい。
【００３８】
培地には、細胞の分化誘導因子を添加する。「分化誘導因子」とは、上記多分化能を有する細胞を特定の分化状態へと誘導することができる、一または複数種の化合物を意味する。分化誘導因子としては、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ハイドロコルチゾンなどが挙げられ、目的とする組織に応じて、これら化合物の少なくとも１種を培地に含めることができる。上記のとおり多分化能を保持する細胞の分化を誘導する方法は公知であり、本発明においてはそれらを利用することができる。例えば、細胞の血管内皮への分化を誘導するためには、ＥＢＭ（内皮細胞基本培地）中に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アスコルビン酸およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した内皮細胞用培地を用いることができる。細胞の骨分化を誘導するためには、α−ＭＥＭ等の基本培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、およびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した骨分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の脂肪細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンおよびデキサメタゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の心筋細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、デキサメタゾン、アスコルビン酸、トランスフェリンおよびインシュリンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した心筋細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。細胞の肝細胞への分化を誘導するためには、基本培地に、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭおよびデキサメタゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した肝細胞分化誘導培地を用いて培養を行えばよい。
【００３９】
なお、上記第一の細胞タイプおよび／または第二の細胞タイプは、擬微小重力環境下にて共培養する前に、別個の分化誘導因子を添加したそれぞれ培地中で予め培養されていてもよい。それぞれの細胞を別個に分化誘導することによって、構築される組織に複数の組織を含めることが可能となると共に、他方の分化誘導因子の干渉（例えば、細胞増殖の阻害など）を避けることができる。
【００４０】
すなわち、本発明は以下のステップを含み得る。
（ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ。
【００４１】
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）では、第一の細胞タイプの血管内皮への分化を誘導するために、ＥＢＭ（内皮細胞基本培地）中に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した内皮細胞用培地を用いて、多分化能を有する細胞および／またはそれらから分化誘導された内皮細胞の培養を行ない、ステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で得られた内皮細胞を含む培養組織塊と第二の細胞タイプ（骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分）の骨分化を誘導するために、当該培養組織塊と第二の細胞タイプをα−ＭＥＭ等の基本培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェートおよびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を添加した骨分化誘導培地を用いて共培養を行なう。本発明において、多分化能を有する細胞として、骨髄間葉系幹細胞を利用することが好ましい。また、骨髄間葉系幹細胞は骨に分化するのみならず、血管内皮細胞に分化することも報告されている（Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，１９９９．８５（３）：ｐ．２２１−８．）。さらに、血管周囲の細胞の供給源となり血管を安定化させることができる（Ｃｒｉｓａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００８．３（３）：ｐ．３０１−１３．；Ａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００８．１１１（９）：ｐ．４５５１−８．）。すなわち、骨髄間葉系幹細胞は骨成分の細胞を供給し、さらに血管を形成、安定化させることが期待できる。ステップ（ｂ）において、第二の細胞タイプ（骨髄間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分）はステップ（ａ）で得られた培養組織塊に播種してもよいし、培地中に添加してもよい。また、下記表１に示すとおり、第二の細胞タイプは使用せずに、目的の三次元組織を構築することも可能である。
【００４２】
本実施形態においては、血管様組織を備えた骨様組織からなる三次元組織を構築することができる。本発明において、「血管様組織」とは、顕微鏡的に観察される内皮細胞（例えば、内皮細胞のマーカーを発現している細胞）の管状構造、網状構造等を意味する。なお、本明細書において、血管様組織を単に、「血管組織」と呼ぶこともある。また、本発明において、「骨様組織」とは、顕微鏡的に観察される骨組織の構造（例えば、細胞がマトリックスに埋もれている状態）を有する、また例えばアリザリンレッドＳ染色、オステオポンチン染色、オステオカルシン染色など骨組織を染色する手法により染色される組織を意味する。なお、本明細書において、骨様組織を単に、「骨組織」と呼ぶこともある。
【００４３】
また、本発明において、第一の細胞タイプ、第二の細胞タイプおよび培地に添加する分化誘導因子を適宜組み合わせることによって、様々な組織を分化誘導することが可能である。以下に第一の細胞タイプ、第二の細胞タイプおよび培地に添加する分化誘導因子の組み合わせの代表的な実施形態を挙げる。目的とする組織の分化を誘導するために、下記細胞および分化誘導因子を適宜選択して使用することができる。ただし、本発明は、これらの組み合わせに限定されるものではない。
【００４４】
【表１】
【００４５】
細胞の培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行なうことが望ましい。培養期間は特に限定されないが、例えば、ステップ（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ、少なくとも３日間、好ましくは少なくとも５日間、最も好ましくは少なくとも７日間である。
【００４６】
足場材料を使用する培養では、好ましくは第一の細胞タイプを１ｃｍ３の足場材料あたり１×１０７〜５×１０９細胞の密度で、足場材料を使用しない培養では、好ましくは第一の細胞タイプを１×１０５〜１×１０７／ｃｍの密度で播種する。また、第二の細胞タイプについては、足場材料を使用する培養では、１ｃｍ３の足場材料あたり１×１０７〜５×１０９細胞の密度で、足場材料を使用しない培養では、１×１０５〜１×１０７／ｃｍの密度で播種または添加することができる。
【００４７】
特に、上記血管様組織を備えた骨組織からなる三次元組織を構築する実施形態についていえば、ステップ（ａ）において足場材料あたり１×１０６〜５×１０７細胞を播種し、１〜２週間培養することができる。ただし、培養期間は足場材料に播種する細胞量および足場材料の大きさなどの要因によって適宜変更することができる。例えば、直径５ｍｍ×高さ２ｍｍのサイズを有する足場材料あたり、５×１０６細胞を播種して１４日培養すると、細胞が足場材料の外周を覆ってしまい、内部が壊死することがある。この場合は、最適な培養期間は１４日よりも少ない日数である。
【００４８】
本発明の方法を再生医療に応用すれば、自己由来の細胞を利用した組織の再生が可能になる。すなわち、患者から採取した骨髄細胞等を擬微小重力環境下で３次元的に培養して、障害・欠損を有する組織に移植可能な新たな組織を構築し、該患者に移植することができる。また、本発明の方法により構築された組織は拒絶反応の危険性がない上、自家骨移植と比較して正常組織の侵襲が少なく、また生体内での血管ネットワークの構築もスムーズであるため、より安全かつ確実な組織再生を実現することができる。また、本発明の方法により構築される三次元組織は、生体内に近い細胞環境を実現することができるために、実際の組織に近い機能を有し、薬剤スクリーニング、および動物実験モデルの代替法として利用することも可能である。
【００４９】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５０】
本明細書中で引用する全ての特許文献、刊行物、技術文書は、それらが本明細書に記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５１】
実施例１：骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から内皮細胞（ＥＣ）への分化
日本白色家兎（ＪＷ／ＳＣＫ、１０日齢、メス）より骨髄細胞を採取し、Ｔ−７５フラスコ（底面積：７５ｃｍ２；ＢＤ社製）に播種した。１〜３週間の培養後、Ｔ−２５フラスコ（底面積：２５ｃｍ２；ＢＤ社製）に２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で継代した。骨髄細胞の培養は、α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０％ ＦＢＳ中で行ない、継代後は内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で行なった。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は以下の通りである（内皮細胞添加因子セット（ＥＧＭ（登録商標）−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（カタログ番号：ＣＣ−４１７６））：
【００５２】
ＥＧＭ−２−ＭＶ
・ＥＢＭ（内皮細胞基本培地） ５００ｍＬ
・ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子） 約０．５ｍＬ
・ｈＦＧＦ−Ｂ（組換えヒト線維芽細胞成長因子） 約２ｍＬ
・ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子） 約０．５ｍＬ
・アスコルビン酸 約０．５ｍＬ
・ヒドロコルチゾン 約０．２ｍＬ
・Ｒ３−ＩＧＦ（インスリン様成長因子）−１ 約０．５ｍＬ
・ＧＡ−１０００（５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシン、５０μｇ／ｍＬ アンホテリシン−Ｂ） 約０．５ｍＬ
・ＦＢＳ（ウシ胎児血清） 約２５ｍＬ（５％）
骨髄細胞から内皮細胞への分化を確認するため、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）についての蛍光免疫染色、及び細胞表面ＣＤ３１発現解析を行った。
【００５３】
播種３日後と１週間後の細胞をガラスボトムディッシュ（底面積：１ｃｍ２；ＩＷＡＫＩ）に継代し、２４時間培養した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ溶液中で１％ ＦＩＴＣ標識抗フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）抗体（ヒツジポリクローナル；ａｂｃａｍ社より入手）（ＰＢＳ中）と３０分間反応させた。蛍光顕微鏡を用いて染色像を観察した。得られた画像の蛍光強度を、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ ４．６（カール・ツァイス社製）を用いて測定し、細胞の面積あたりの蛍光強度を算出し、分化前のＭＳＣについての蛍光強度と比較した。各サンプルから８個の細胞を無作為に選定し、その平均値を算出した（ｎ＝１）。
【００５４】
さらに、播種１週間後の細胞表面におけるＣＤ３１（血小板細胞接着因子（ＰＥＣＡＭ））の発現をＦＡＣＳ（ＢＤ社製ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭセルソーター）により解析した。各密度で播種した細胞を１×１０６個ずつ回収し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ−２％ ＦＢＳ中で１％ ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３１抗体（マウスモノクローナル（ＷＭ−５９）；ａｂｃａｍ社より入手）と３０分間、氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２００μｇ／ｍＬ ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を加え、ＦＡＣＳで解析した。
【００５５】
結果
ｖＷＦの免疫蛍光染色の結果（図１）から、１×１０４細胞／ｃｍ２、２×１０５細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、培養日数が増えるにつれ蛍光強度が増加することが観察された。一方、１×１０３細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、培養１週間では蛍光強度の増加は観察されなかった。
【００５６】
図２に示されるように、１週間培養した細胞のＣＤ３１発現について調べたところ、２×１０５細胞／ｃｍ２で播種した細胞は、１×１０３細胞／ｃｍ２、１×１０４細胞／ｃｍ２で播種した細胞と比較してＣＤ３１を多く発現していた。ＣＤ３１は成熟した内皮細胞が発現するマーカーとして知られているため（Ｊｏａｃｈｉｍ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００４．２２（３）：ｐ．３７７−３８４．）、１×１０３細胞／ｃｍ２、１×１０４細胞／ｃｍ２で播種した細胞は１週間の培養では成熟していないと考えられる。結果から、高密度で細胞を播種し、培養することにより、分化を促進することができることが確認された。
【００５７】
実施例２：骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と骨髄由来間葉系幹細胞由来内皮細胞（ＭＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＣ）の回転培養
実施例１に記載のように調製した内皮細胞（ＥＣ）を、細胞足場材料であるＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に、足場材料あたり１×１０６〜５×１０７細胞の密度で播種し、減圧（１００ｍｍＨｇ、５分間）により細胞懸濁液を足場材料内部に取り込ませた（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｅｎｇ，２００２．１２（２）：ｐ．２０３−９．；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３．２４（１３）：ｐ．２２７７−８６．）。５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベートした後、回転培養装置（ＲＷＶバイオリアクター；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）で培養を行なった。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（１×１０６〜５×１０６細胞／足場材料）を播き足し、さらに１週間、下記の組成を有する骨分化誘導培地中で培養した。培地は３日おきに交換した。回転速度は、培養サンプルの沈降の様子を確認しながら調節した（７．５〜１２ｒｐｍ）。
【００５８】
骨分化誘導培地
・α−ＭＥＭ
・１０ｍＭ β−グリセロホスフェート
・５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸
・１０ｎＭ デキサメタゾン
【００５９】
実施例３：組織学的評価
実施例２に記載のように、ＥＣ（１×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（１×１０６細胞／足場材料）を播き足した後に、骨分化誘導培地中で１週間培養した（図３、右）。対照として、ＥＣ（１×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣを添加せずに骨分化誘導培地中で１週間培養した（図３、左）。
【００６０】
図４に示すＨＥ染色の結果から、ＭＳＣを播き足したサンプルでは、足場材料の中心部付近に細胞が集まり、ＭＳＣを添加していないサンプルでは、足場材料全体に細胞が点在していた。また、いずれのサンプルにおいても、アリザリンレッドＳ染色に対して陽性であり、骨組織が形成されていることが確認された（図４、右）。さらに、レクチン染色（図５）により、ＭＳＣを添加したサンプルでは血管様の細胞が観察された。
【００６１】
ＥＣの播種密度について検討したところ、図６のＨＥ染色の結果から示されるように、細胞の播種密度が上昇するにつれ、細胞が足場材料内に多く侵入し、１×１０７細胞／足場材料でプラトーに達していた。
【００６２】
また、図７−１に示すレクチン染色の結果から、足場材料内により多くの細胞が取り込まれたサンプル（１×１０７及び５×１０７細胞／足場材料）では、血管様の構造が観察された。また、分岐を有する血管様の構造も観察された（図７−２）。
【００６３】
さらに実施例２に記載のように、ＭＳＣ由来のＥＣ（５×１０６細胞／足場材料）をＥＧＭ−２−ＭＶ培地中で１週間培養し、ＭＳＣ（５×１０６細胞／足場材料）を播き足した後に、骨分化誘導培地中で１週間培養した。得られた組織の切片を公知の手法に基づいて作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、オステオポンチン染色およびオステオカルシン染色を行った。
【００６４】
各染色結果を図８に示す。
図８より明らかなように、得られた組織はオステオポンチン（図８（ｂ））およびオステオカルシン（図８（ｃ））染色に対し陽性であることから、得られた組織中に骨組織が形成されたことが示された。
【００６５】
実施例４：骨髄細胞由来の浮遊細胞成分存在下における骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来内皮細胞（ＭＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＣ）の回転培養
（１）骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から内皮細胞（ＥＣ）への分化
上記実施例１と同様に、ＭＳＣからＥＣを調製した。調製後の細胞は、内皮細胞の表現系の代表的なマーカーである、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）とＣＤ３１（血小板細胞接着因子（ＰＥＣＡＭ））の発現を解析することで分化を確認した。
【００６６】
（２）骨髄細胞からの浮遊細胞成分の分離
上記ＭＳＣを採取したウサギとは異なる個体より骨髄細胞を採取し、Ｔ−７５フラスコ（底面積：７５ｃｍ２；ＢＤ社製）に播種した。α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）および１０％ ＦＢＳを含む培地中、インキュベーターで２４時間培養後、フラスコに接着していない細胞を回収した。回収した浮遊細胞成分は、遠心処理によりチューブに集め、使用時まではインキュベーター中に保管した。
【００６７】
（３）骨髄間葉系幹細胞由来内皮細胞と浮遊細胞成分とのＲＷＶ回転共培養
上記（１）にて調製したＭＳＣ由来のＥＣをＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に播種し（５×１０６細胞／足場材料、または１×１０７細胞／足場材料）、減圧（１００ｍｍＨｇ，５ｍｉｎ）により細胞懸濁液を足場材料内部へ浸透させ（（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，上掲）、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で２時間培養した。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は上記の通りである。その後、回転培養装置（ＲＷＶバイオリアクター；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）で回転培養を行った。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地中にて３日または１週間培養を行った後、骨分化誘導培地に切り替えて培養を行った。骨分化誘導培地の組成は上記のとおりである。骨分化誘導培地には、上記（２）にて調製した浮遊細胞成分を添加して用いた。浮遊細胞成分は、一羽のウサギから採取できる量の１２分の１量を骨分化誘導培地に添加した。培養は、５％ＣＯ２，３７℃にて、浮遊細胞成分を添加した骨分化誘導培地を用いて、２日おきに培地交換を行った。回転速度は、培養サンプルの沈降の様子を確認しながら調節した（７．５〜３０ｒｐｍ）。
【００６８】
（４）組織学的評価
上記（３）で得られた各組織を４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液中で固定し（４℃、３日間）、その後、０．１Ｍ ｔｒｉｓ−０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液で脱灰（２５℃、３日間）を行い、パラフィンに包埋しパラフィンブロックを作製した。なお、当該組織は約３ｍｍの直径を有した（図９）。さらに、上記（３）で得られた各組織を凍結包埋剤（４％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（Ｌｅｉｃａ））で包埋し、凍結ブロックを作製した。パラフィンブロックおよび凍結ブロックをミクロトームで５μｍの厚さの切片にし、トルイジンブルー、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色し、組織学的評価を行った。
【００６９】
また、各切片上の組織をプロテイナーゼＫ溶液（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でタンパク質除去し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と反応させた後に、抗コラーゲンＩ抗体（第一ファインケミカル株式会社）またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ （Ｔｏｍａｔｏ） Ｌｅｃｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造元のプロトコルに従って用いて免疫染色を行った。
【００７０】
ＭＳＣ由来のＥＣを５×１０６細胞／足場材料にて足場材料に播種し、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で１週間培養した後、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下、骨分化誘導培地中で１週間培養して得られた組織の染色像を図１０および１１に示す。
【００７１】
図１０（トルイジンブルー染色：（ａ）および（ｃ）；ＨＥ染色：（ｂ）および（ｄ））より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下で培養することにより（図１０（ａ）および（ｂ））、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下で培養した場合（図１０（ｃ）および（ｄ））と比べて、より高密度な組織を構築できることが確認された。
【００７２】
図１１（レクチン染色：（ａ）および（ｂ））より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と共培養して得られた組織中には、浮遊細胞成分の非存在下にて培養して得られた組織中に観察される血管様組織（図１１（ｂ））と比べて、より太い血管様組織が観察された（図１１（ａ））。
【００７３】
ＭＳＣ由来のＥＣを骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下で、骨分化誘導培地で３週間培養して得られた組織の染色像（トルイジンブルー染色：（ａ）；ＨＥ染色：（ｂ）を図１２に示す。上記１週間の培養結果（図１１）と比べ、組織中心部においてもマトリックスが産生されていることが観察された。また、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）の様に細胞がマトリックスに埋もれている様子が観察された（図１２（ａ）、丸で囲まれた領域）。
【００７４】
また、ＭＳＣ由来のＥＣの足場材料に対する播種濃度を１×１０７細胞／足場材料として、上記と同様の条件で培養して得られた組織切片をプロテイナーゼＫ溶液（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でタンパク質除去し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と反応させた後に、抗コラーゲンＩ抗体（第一ファインケミカル株式会社）またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ （Ｔｏｍａｔｏ） Ｌｅｃｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造元のプロトコルに従って用いて免疫染色を行った。
【００７５】
この結果を図１３に示す。図１３（トルイジンブルー染色：（ａ）；抗コラーゲンＩ抗体染色：（ｂ））より明らかなように、１週間の培養により得られた組織の中心部においてもマトリックスの産生が観察された。当該組織を抗コラーゲンＩ抗体を用いて免疫染色した結果を図１３（ｂ）に示す。この結果より、産生されたマトリックスがＩ型コラーゲンであることが示唆された。
【００７６】
（５）コントロール実験
コントロール実験として、ＭＳＣ由来のＥＣを上記（３）と同様に足場材料に播種した後、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養することなく、上記（３）同様に骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と骨分化誘導培地中で１週間共培養を行った。
【００７７】
結果を図１４に示す。
図１４より明らかなように、ＭＳＣ由来のＥＣを内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養することなく、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と共に骨分化誘導に付した場合、組織はほとんど構築されず、足場材料中に細胞が点在しているのみであった。
【００７８】
また、骨髄細胞を上記（３）と同様に足場材料に播種し、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地）で培養した後、上記（３）同様に骨髄細胞由来の浮遊細胞成分と骨分化誘導培地中で１週間共培養を行った。この場合においても、組織はほとんど構築されず、足場材料中に細胞が点在しているのみであった。
【００７９】
以上の結果より明らかなように、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下、ＭＳＣ由来のＥＣを骨分化誘導培地中で培養することにより、骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の非存在下にて得られる組織と比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで太い血管様組織を備え、かつマトリックスを多く産生した三次元組織を構築することができた。心筋梗塞モデルのサルに骨髄幹細胞であるＣＤ３４＋細胞の移植を行った結果、局所血流と心機能の有意な改善は観察されたが、移植細胞由来の新生血管も心筋細胞もほとんど検出されなかったこと、および移植細胞は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分泌していることが報告されている（Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ３４＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００５．２３（３）：ｐ．３５５−６４．）。このことから、共培養した浮遊細胞成分により、ＶＥＧＦの分泌が促進された結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで太い血管様組織を備え、かつマトリックスを多く産生した三次元組織を構築された可能性が示唆される。
【００８０】
また、コントロール実験においてはいずれの場合も、組織はほとんど構築されなかった。これはＭＳＣ由来のＥＣを浮遊細胞成分と共培養させたことで、ＭＳＣを内皮細胞用培地で培養したことでそれぞれの細胞の分化が促進され、増殖が抑制されたために組織が構築できなかったことが示唆される。
【００８１】
実施例５：細胞源と培養法の比較
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とＭＳＣ由来のＥＣの静置培養とＲＷＶ回転培養における細胞増殖について比較を行った。
【００８２】
ＨＵＶＥＣはＢＤより入手した。ＭＳＣ由来のＥＣは、上記実施例１と同様に、調製した。
【００８３】
各細胞をＯＰＬＡ（登録商標）スキャホールド（ＢＤ社製）（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）に播種し（ＨＵＶＥＣ（５×１０７細胞／足場材料）、ＭＳＣ由来のＥＣ（５×１０６細胞／足場材料））、減圧（１００ｍｍＨｇ，５ｍｉｎ）により細胞懸濁液を足場材料内部へ浸透させ（（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｕｅｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，上掲）、内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２−ＭＶ培地；Ｌｏｎｚａ社製）中で、静置培養または回転培養に付した。培養期間はいずれも１週間とした。ＥＧＭ−２−ＭＶ培地の組成は上記の通りである。
【００８４】
各培養方法における各細胞の増殖結果を図１５に示す。
図１５より明らかなように、いずれの培養方法であってもＭＳＣ由来のＥＣ（図１５（ｃ）および（ｄ））がＨＵＶＥＣ（図１５（ａ）および（ｂ））に比べてより増殖した。また、いずれの細胞であっても、回転培養（図１５（ａ）および（ｃ））が静置培養（図１５（ｂ）および（ｄ））よりも効率的に細胞を増殖させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、複数の組織を含む三次元組織の構築を可能とし、再生医療、薬剤開発等、組織工学等の分野で利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。
【請求項２】
多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の細胞タイプが、骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脱調節された増殖能を有する細胞が、癌細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、請求項２，３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、内皮細胞分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、該骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を擬微小重力環境下、骨分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
内皮細胞分化誘導因子が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
骨分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェートおよびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される材料を含む多孔性材料である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
得られた三次元組織が、血管様組織および／または骨様組織を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
多分化能を有する細胞およびそれらから分化誘導された細胞または脱調節された増殖能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１種の第一の細胞タイプと骨髄細胞を含む第二の細胞タイプとを、擬微小重力環境下にて共培養することを含む、三次元組織の構築方法。
【請求項２】
多分化能を有する細胞が、骨髄細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の細胞タイプが、骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脱調節された増殖能を有する細胞が、癌細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二の細胞タイプが、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞および骨髄細胞由来の浮遊細胞成分からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）第一の細胞タイプを培養液中または細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、第二の細胞タイプの存在下にて、該第一の細胞タイプを擬微小重力環境下、分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、請求項２，３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ＢＭＰ、インシュリン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子―４、肝細胞増殖因子、オンコスタチンＭ、トランスフェリン、アルブミン、リノール酸、亜セレン酸ナトリウム、５−アザシチジン、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子およびハイドロコルチゾンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を細胞足場材料に播種し、擬微小重力環境下、内皮細胞分化誘導因子を含む培地中で培養するステップ；および
（ｂ）続いて、骨髄細胞由来の間葉系幹細胞または骨髄細胞由来の浮遊細胞成分の存在下にて、該骨髄細胞から分化誘導した内皮細胞を擬微小重力環境下、骨分化誘導因子を含む培地中でさらに培養するステップ、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
内皮細胞分化誘導因子が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
骨分化誘導因子が、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェートおよびＢＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞足場材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される材料を含む多孔性材料である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
得られた三次元組織が、血管様組織および／または骨様組織を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
擬微小重力環境が、１軸回転式バイオリアクターを用いて実現される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｗａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、請求項１３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−８０８７４（Ｐ２０１２−８０８７４Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８３７８９（Ｐ２０１１−８３７８９）
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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