歯周病菌生育抑制用組成物
【課題】安全性が高く、口腔内への投与後、比較的短時間で効果が発揮される歯周病菌生育抑制組成物を提供する。
【解決手段】ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）を、歯周病菌生育抑制用組成物の有効成分とする。
【解決手段】ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）を、歯周病菌生育抑制用組成物の有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病菌生育抑制用組成物、これを含む歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、口腔内の悩みとして齲蝕に次いで第二番目に多い疾患である。歯周病は、歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨等の歯周組織を破壊し、その機能を侵す。歯周病の原因となる歯周病菌として、グラム陰性菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タンナレラ・フォーシシア（Tannerrella forsythia）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）等の口腔内細菌が知られている（例えば、非特許文献１）。このような歯周病菌は、口臭症の発症にも関与することが明らかとなっている。
【０００３】
一般に、ヒトや動物等の宿主に有益に働く微生物をプロバイオティクスとよび、整腸作用、免疫調節作用等の消化管を介したプロバイオティクスの効果が知られている。近年では、口腔内においてもプロバイオティクスの有用性が検証されており、歯周病、口臭、齲蝕等への抑制効果が報告されている（例えば、非特許文献２）。
【０００４】
このうち、乳酸菌を歯周病の予防や治療に用いることについて、以下のような報告がある。
【０００５】
非特許文献３、４では、ヒトの口腔内から分離された乳酸菌は、数日から数週間経口投与すると、投与中止後も数週間にわたってある程度は口腔内に定着し、歯周病菌を減少させることが報告されている。
【０００６】
特許文献１には、健常人の口腔内より分離されたラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を有効成分とする歯周病の発生防止又は治療用の生菌製剤または乳酸菌含有食品が開示されている。
同文献には、試験管内での抗菌活性試験において、培地中に１×１０6ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌と同等の生菌数のラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で１２時間培養後には歯周病菌の生存率は０．００２％に低下したことが記載されている。
【０００７】
また、このラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株の歯周病菌に対する抗菌活性について、接種菌数を変化させて経時的に調べた報告（例えば、非特許文献５）によると、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌とその１００分の１の生菌数の１×１０6ｃｆｕ／ｍｌのラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で１２時間培養後には歯周病菌の生菌数は検出限界以下にまで減少したとのことである。また、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌と同等の生菌数の１×１０8ｃｆｕ／ｍｌのラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で９時間培養後には歯周病菌の生菌数は検出限界以下にまで減少したとのことである。
すなわち、同文献では、ラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株は、歯周病菌との混合培養において、生菌数１００倍の歯周病菌を１２時間以内に殺菌し、同等の生菌数の歯周病菌を９時間以内に殺菌したことが報告されているといえる。
【０００８】
特許文献２には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス
ＯＬＬ１２５５株及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４株を含有する口腔内疾患予防用及び／又は治療用の発酵乳が記載されている。同文献には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２５５株及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４株を用いて得られた発酵乳が、歯周病菌の増殖を抑制したことが示されている。
【０００９】
特許文献３には、ビフィズス菌、乳酸菌又は酪酸菌に属する菌と、それらの菌が資化しうる糖類を含有することを特長とする歯周病の予防剤又は治療剤が開示されている。同文献には、混合培養において、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌とそれぞれ５×１０6ｃｆｕ／ｍｌの３種類の乳酸菌を混合接種すると、３７℃で２４時間培養後には歯周病菌はある程度増殖が抑制されるが、強い抗菌活性は観察されなかったことが記載されている。
【００１０】
特許文献４には、発酵乳の製造に使用されるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌および／またはその培養物を含有する、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス除菌および／または感染防御のための組成物が開示されている。同文献には、エンテロコッカス・フェシウム（１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）は、歯周病菌との混合培養において、生菌数約１０倍（１×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）の歯周病菌に対して２４時間培養後には増殖を抑制したものの、強い抗菌活性は観察されなかったことが記載されている。
【００１１】
特許文献５には、ヒトの消化管から分離され、耐酸性の高い菌株として選抜されたラクトバシラス・サリバリウスＷＢ２１株を有効成分として含有する食中毒、又は、口腔疾患の予防及び／又は治療組成物が開示されている。
【００１２】
特許文献６には、ラクトコッカス属に属する特定の菌株からなるポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤が記載されている。
【００１３】
また、歯周病菌が産生する物質（例えば、タンパク質）による、乳酸菌の増殖の抑制に関する報告があり、乳酸菌と歯周病菌は互いに競合することが知られている（非特許文献７）。
【００１４】
ところで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株については、特許文献７に記載されるように、虫歯予防用組成物の有効成分としての用途が知られている。
【００１５】
歯周病と齲蝕はともに口腔内細菌による感染症ではあるものの、それらの原因菌の特徴ならびに発病の機序は大きく異なる。齲蝕は、グラム陽性であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）やストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）等の齲蝕原性細菌が産生する酸による歯質の脱灰によって起こる。これらの齲蝕原性細菌は、非水溶性グルカンとともに歯垢を形成し、歯垢中に齲蝕の原因となる酸を産生する（例えば、非特許文献１）。実際に、齲蝕原性細菌に対して強い抗菌活性を示す物質であっても、歯周病菌に対する抗菌活性は弱いものもあることが報告されている（例えば、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第４２０３８５５号公報
【特許文献２】特許第４４６９７９２号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２９２号公報
【特許文献４】特開２００６−３２８０５２号公報
【特許文献５】特許第３９４４０７６号公報
【特許文献６】特開２０１０−１２４７７２号公報
【特許文献７】特開２００８−２３７１９８号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】口腔衛生学２０１０、松久保隆、八重垣建、前野正夫編、一世出版、東京、２０１０年、第１６０−１８４頁
【非特許文献２】ペリオドントロジー２０００（Periodontology 2000）、デンマーク、第４８巻、２００８年、ｐ．１１１〜１４７
【非特許文献３】アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、アメリカ、第７２巻、２００６年、ｐ．３０５０〜３０５３
【非特許文献４】日本歯周病学会誌、日本、第４８巻、２００６年、ｐ．３１５〜３２４
【非特許文献５】日本歯周病学会誌、日本、第４６巻、２００４年、ｐ．１１８〜１２６
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー（Journal of Medical Microbiology）、イギリス、第５２巻、２００３年、ｐ．１０８３〜１０９３
【非特許文献７】リサーチ・イン・マイクロバイオロジー（Research in Microbiology）、フランス、第１５４巻、ｐ．６６９〜６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
歯周病菌の増殖抑制効果があるとされる乳酸菌のうち、ヒトの検体から分離された乳酸菌は、比較的ヒトの口腔内に定着し易く、歯周病菌の持続的な増殖抑制効果が期待される。
しかしながら、このような乳酸菌は、人によっては長期間の投与や摂取により、副作用を生ずる場合もあり、口腔内組成物や食品に利用する場合の安全性を確保しにくいという問題がある。
一方、例えば、ヒトの検体以外の自然界から分離され、発酵乳の製造などに使用される乳酸菌は、安全性の観点から実用性が高い。
しかしながら、乳酸菌の投与、摂取後は一過的に口腔内に存在するものの、長期間にわたる口腔内での定着性は低いという問題がある。
【００１９】
したがって、特にヒト口腔以外の自然界から分離された乳酸菌を口腔内でプロバイオティクスとして応用するためには、乳酸菌が口腔内に留まっているうちに効果が発揮される菌株を選択する必要、つまり、摂取後比較的短時間で効果が発揮される菌株を選択する必要がある。
そこで、本発明は、安全性が高く、口腔内への投与後、比較的短時間で効果が発揮される歯周病菌生育抑制組成物を提供することを課題とする。また、安全性が高く、効果にも優れた、歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、前記背景技術に鑑み、乳酸菌の持つ生理機能について鋭意探索を重ねた結果、ヒト口腔以外の自然界から分離された特定の乳酸菌株が、歯周病菌に対して強い抗菌活性を示すことを見出した。
【００２１】
すなわち、前記課題を解決する本発明は、 ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）を有効成分とする歯周
病菌生育抑制用組成物である。
【００２２】
本発明の好ましい形態では、歯周病菌生育抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上の菌数となるように投与される。
【００２３】
特に、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに属する歯周病菌の生育抑制に好適である。
【００２４】
また、本発明は、上記の歯周病菌生育抑制用組成物を含有する歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の組成物は、従来のヒト口腔以外の自然界から分離された乳酸菌株を含む組成物に比して、短時間に歯周病菌の生育の抑制効果を発揮し、安全性も高い。
従って、本発明の歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、歯周病や口臭の予防や治療に有効であり、且つ安全性も高い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】試験例２における歯周病菌の生菌数を示す図である。
【図２】試験例２における乳酸菌の生菌数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００２８】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（本明細書において、単に「ＴＬ６株」という。）を有効成分とする。ＴＬ６株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に、平成１９年１月１７日より、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８で寄託されている。
本菌株は、特開２００８−２３７１９８公報に開示されるように、自然界から採取した各種試料から分離した菌株の中から、還元脱脂粉乳培地でストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養したときに、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択し、さらにストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する菌株を選択することによって得られた菌株である。
また、ＴＬ６株の菌学的性質は、特開２００８−２３７１９８公報に開示されているとおりである。また、同文献にも記載されているように、ＴＬ６株は、発酵乳の製造に適した菌株であり、人体に対して安全である。
【００２９】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物には、ＴＬ６株と同等以上の歯周病菌生育抑制効果を有し、口腔内に投与した場合に安全である限り、ＴＬ６株の変異株を用いてもよい。ある変異株がＴＬ６株と「歯周病菌生育抑制効果」を有するか否かは、例えば、後述する試験例に示すような方法で、変異株と歯周病菌を混合培養し、歯周病菌数の変化をＴＬ６株のそれと比較することにより確認することができる。このような変異株は、ＴＬ６株に非人為的に変異が導入されることで構築されてもよい。また、ＵＶ等の変異原を用いた処理によりＴＬ６株に変異を導入して変異株を構築してもよく、種々の遺伝子操作法によりＴ
Ｌ６株に変異を導入して変異株を構築してもよい。
なお、上述のＴＬ６株の変異株は、ＴＬ６株を親株として派生した菌株であり、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス種に属する株に限定される。また、上述のＴＬ６株の変異株には、従来知られる歯周病菌の予防、治療効果が確認された乳酸菌株は一切含まれない。
以下の説明において、ＴＬ６株と上述の変異株をまとめて、単に「ＴＬ６株」という場合がある。
【００３０】
ＴＬ６株は、ラクトバチルス属に属する細菌の培養に通常用いられる培養条件で培養することが可能である。例えば、培養温度としては、通常２５〜５０℃程度、好ましくは３５〜４２℃程度である。また、培養条件としては、微好気条件又は嫌気条件が好ましい。
【００３１】
ＴＬ６株を培養する培地としては、特に限定されず、ラクトバチルス属に属する細菌の培養に通常用いられる培地を用いることができる。すなわち、炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、スクロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。
【００３２】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ＴＬ６株の培養物の全部又は菌体を含む一部であってもよい。例えば、培養後得られた培養物を遠心分離して、菌体を回収して用いることもできる。
上記のようにして得られた培養物の全部又は一部は、保存性、取り扱い性の観点から、乾燥することが好ましい。乾燥の方法としては、凍結乾燥が好ましい。
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、後述するように、歯周病や口臭の予防や治療を目的とした剤や飲食品の有効成分として用いることができる。
【００３３】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物における、ＴＬ６株の濃度は、その使用方法、使用量などに応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
【００３４】
また、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
後述する試験例に示すとおり、ＴＬ６株と歯周病菌を混合培養した場合、ＴＬ６株が、歯周病菌の１％程度であっても、９時間という短時間で、歯周病菌の生育を抑制する。さらに、後述する試験例の結果から、ＴＬ６株が、歯周病菌の１００％程度である場合には、３時間という短時間で、歯周病菌の生育を抑制することが推測される。
【００３５】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、有効成分であるＴＬ６株以外に、口腔内で有益な作用を示すその他の成分、例えばキシリトールやソルビトール等の糖アルコール、カテキン等のポリフェノール、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトパーオキシダーゼ、免疫グロブリン等のタンパク質を含むことも好ましい。
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、その他、口腔内に投与する組成物に通常用いられる成分を含むことができる。
【００３６】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、各種食品に、歯周病菌生育抑制効果を与えるための食品添加剤として使用することができる。
【００３７】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、グラム陰性菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タンナレラ・フォーシシア（Tannerrella forsythia）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）等の歯周病菌の生育抑制に効果がある。特に、ポルフィロモナス・ジンジバリスの生育抑制に効果がある。
【００３８】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、歯周病菌生育抑制用組成物を含む。本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は医薬の形態を含む。
その剤形としては、口腔内へ投与できる形態であればよいが、口腔内に一定時間（数分以上）留まらせるのに適した形態が好ましく、洗浄液、トローチ錠、チューイングガム、ペーストなどが挙げられる。
歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤と共に、ＴＬ６株を製剤化することにより製造できる。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を使用できる。
【００３９】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤における、ＴＬ６株の濃度は、その使用方法、使用量などに応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常０．０１〜３０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％である。
また、ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常１０7〜１０10ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０8〜１０9ｃｆｕ／ｇである。
【００４０】
また、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
例えば、歯周病予備群或いは歯周病患者のヒトの口腔内には、１０8〜１０10ｃｆｕ程度の歯周病菌が口腔内に存在している。従って、本発明の歯周病や口臭の予防及び／又は治療剤の１回の投与菌数は、通常１０7ｃｆｕ以上、好ましくは１０8ｃｆｕ以上、更に好ましくは１０9ｃｆｕ以上である。
【００４１】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、口腔内に投与される。口腔内への投与の形態としては、口腔内への投与後に口腔内から吐き出される形態、口腔内への投与後嚥下される形態の何れであってもよい。例えばトローチ、散剤、液剤、歯磨きペースト等が挙げられる。中でも、口腔内に滞留しやすいトローチのような形態が好ましい。本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、１日に複数回、好ましくは２〜３回、３〜４時間おきに投与することが好ましい。特に、食後３０分以内に投与することが好ましい。
【００４２】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、歯周病菌生育抑制用組成物を含む。
その形態としては、例えば、ヨーグルト等の発酵食品、チョコレートやキャンディー、チューインガム等の菓子類等が挙げられる。中でも、ＴＬ６菌株を十分量摂取しやすい、発酵食品が好ましい。
【００４３】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品における、ＴＬ６株の濃度は、その飲食品の形態に応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常０．０１〜３０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％である。
また、ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常１０6〜１０10ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０7〜１０9ｃｆｕ／ｇである。
【００４４】
また、本発明の歯周病及び口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
上述の通り、ヒトの口腔内の歯周病菌数を考慮して、本発明の歯周病や口臭の予防用及び／又は治療用の食品の１回の摂取菌数は、通常１０7ｃｆｕ以上、好ましくは１０8ｃｆｕ以上、更に好ましくは１０9ｃｆｕ以上である。
【００４５】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、１日に複数回、好ましくは２〜３回、３〜４時間おきに摂取することが好ましい。特に、キャンディーやチューイングガム等の形態では、食後または食間に摂取することが好ましい。
【００４６】
本発明の歯周病及び口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、「歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用」との用途が表示された飲食品として販売することが好ましい。
【００４７】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的方法により提供する行為、等が例示できる。
【００４８】
しかしながら、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、例えば、特定保健用食品（健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号））としての表示（特に保健の用途の表示）が最も好適である。
【００４９】
なお、以上のような表示を行うために使用する文言は、「歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用」という文言のみに限られるわけではなく、それ以外の文言であっても、歯周病及び／又は口臭の予防、或いは治療の効果を示唆する文言、又は歯周病及び／又は口臭の予防、或いは治療によって二次的に生じる効果を示唆する文言であれば、使用できることはいうまでもない。
【００５０】
次に、試験例を示して、ＴＬ６株の歯周病菌に対する抗菌作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、歯周病菌に抗菌作用を有する乳酸菌を選択するために行った。
（１）歯周病菌前培養液の調製
歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスＪＣＭ８５２５株（理化学研究所より分譲）を５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコース添加を添加したＧＡＭブイヨン（日水製薬社製）４ｍｌに接種し、８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ社製）の内部で３７℃、１日間培養し、歯周病菌前培養液とした。
【００５１】
（２）乳酸菌試験菌液の調製
乳酸桿菌の基準菌株（理化学研究所又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより分譲）１３種類、又は乳酸桿菌の保存菌株２８種類を５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコース添加を添加したＧＡＭブイヨン４ｍｌに接種し、８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバーの内部で３７℃、１日間培養した。この培養液を、リン酸緩衝生理食塩水で１００倍に希釈し、乳酸菌試験菌液とした。
【００５２】
（３）試験方法
５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコースを添加したＧＡＭブイヨン４ｍｌを含む容量１５ｍｌのチューブに歯周病菌の前培養液４０μＬ及び乳酸菌の試験菌液４０μＬを添加し、攪拌した。この混合培養液を８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバー内で３７℃で混合培養した。混合培養開始８、９、及び１０時間後に培養液１００μＬを採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて１０倍希釈系列を作成し、その希釈液を２０μｌずつ歯周病菌のみ選択的に検出するための寒天培地（５％ウマ脱繊血、５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、７５ｍｇ／Ｌネオマイシン、及び３．５ｍｇ／Ｌバンコマイシンを添加した血液寒天基礎培地ＮＯ．２（オキソイド社製））に塗布し、嫌気性チャンバー内で３７℃、５日間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニーの数を測定した。検出された細菌のコロニー数から、上記の試験混合液１ｍｌ当りの歯周病菌生菌数の対数値（ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）を求めた。対照実験として、乳酸菌試験菌液を無添加の条件で歯周病菌生菌数を調べた。
【００５３】
（４）試験結果
本試験の結果を表１、２に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１に示すとおり、乳酸菌の基準菌株のうち、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）
ＪＣＭ１１３１株は、混合培養開始１０時間後において、歯周病菌を初菌数（約７．０ ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）の１００分の１以下（４．７０ ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）に低下させ、殺菌活性が観察された。一方、それ以外の乳酸菌の基準菌株１２菌株では、混合培養において１０時間後まで、乳酸菌無添加の対照と比べて歯周病菌の生菌数に殆ど影響を及ぼさなかった。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２に示すとおり、保存菌株のうち、ＴＬ６株は９時間後において歯周病菌数を検出限界以下に低下させ、殺菌活性が観察された。また、ラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）１０２−１−１株は、１０時間後において歯周病菌数を検出限界以下に低下させ、殺菌活性が観察された。一方、上記の２菌株以外の保存菌株２６株では、混合培養において１０時間後まで乳酸菌無添加の対照と比べて歯周病菌の生菌数に殆ど影響を及ぼさなかった。したがって、供試した基準菌株及び保存菌株のうち、ＴＬ６株が最も短時間のうちに歯周病菌に対する抗菌活性を発揮することがわかった。
【００５８】
［試験例２］
本試験は、試験例１で歯周病菌への抗菌活性がみられたＴＬ６株について、その抗菌活性の強さ、特に歯周病菌を殺菌するのに要する時間を検討するために行った。
【００５９】
（１）歯周病菌前培養液の調製
上記試験例１と同様の方法で歯周病菌前培養液を調製した。
【００６０】
（２）乳酸菌試験菌液の調製
上記試験例１と同様の方法でＴＬ６株を培養し、乳酸菌試験菌液を調製した。
【００６１】
（３）試験方法
上記試験例１と同様の方法で歯周病菌と乳酸菌を混合培養した。ただし、混合培養開始直後（０時間）、３、６、７、８、９、及び１０時間後の歯周病の生菌数を上記試験例１と同様の方法で測定した。さらに、リン酸緩衝生理食塩水にて作成した１０倍希釈系列のうち２０μＬを、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に塗布し、１０％炭酸ガスを充填したインキュベーター中で３７℃、３日間培養し、寒天培地上に形成されたコロニー数をカウントし、乳酸菌の生菌数を測定した。
【００６２】
（４）試験結果
本試験の結果を図１及び２に示す。図１には歯周病菌の生菌数の結果を示した（○：乳酸菌無添加、●：乳酸菌添加）。また、図２には乳酸菌の生菌数の結果を示した（○：乳酸菌無添加、●：乳酸菌添加）。その結果、歯周病菌および乳酸菌の生菌数は、混合培養開始時点（０時間後）では、それぞれ７．４４ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ、および４．９６ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌであった。乳酸菌との混合培養では、歯周病菌の生菌数は、混合培養開始６時間後まで増加し、８時間後までほぼ一定の生菌数が観察された、一方、乳酸菌無添加の対照では、歯周病の生菌数は、培養開始１０時間後まで増加した。また、乳酸菌の生菌数は混合培養開始１０時間後まで増加した。乳酸菌との混合培養開始９時間後において、歯周病菌の生菌数は検出限界以下（＜２．７０ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）にまで低下し、殺菌活性が観察された。したがって、ＴＬ６株は、歯周病菌の増殖培地を用いた混合培養において、生菌数約１００倍の歯周病菌を９時間以内に殺菌することが明らかとなった。
なお、ＴＬ６株の菌数は、混合培養開始６時間後において７．４８ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌにまで増加し、歯周病菌の混合培養開始時点（０時間後）とほぼ同じ生菌数に達した。この時点（混合培養開始６時間後）を基準とすると、その３時間後（混合培養開始後９時間後）には歯周病菌が検出限界以下にまで殺菌されたことになる。従って、ＴＬ６株は、同等の生菌数の歯周病菌を、少なくとも３時間以内に殺菌することが推測された。
【００６３】
以上の試験から、ＴＬ６株は、従来の乳酸菌株に比して、歯周病菌に対する抗菌性が高く、短時間で歯周病菌を殺菌することができることが分かった。
【実施例】
【００６４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１］
肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００ｇ、ペプトン１００ｇ、乳糖２００ｇ、リン酸水素二カリウム５０ｇ、リン酸二水素カリウム１０ｇ、シスチン４ｇ及び水９．５Ｌの組成からなる培地で、２５℃１６時間前培養したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のシードカルチャー５００ｍＬを、前記培地と同一組成の培地１０Ｌに接種し、２５℃１６時間培養した。更に、９０℃で３０分間殺菌した前記培地
と同一組成の培地２００Ｌに、前記培養液全量（１０．５Ｌ）を接種し、２５℃１６時間培養した。培養後の生菌数は３．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬであった。
次いで、シャープレス型遠心分離機を用いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水（９０℃３０分間殺菌済）に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳１０％、蔗糖１％、グルタミン酸ソーダ１％からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、８．５×１０10ｃｆｕ／ｇのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含む粉末約２．２ｋｇを得た。
【００６６】
この粉末は、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物であり、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤、或いは本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品の原料として利用することができる。
【００６７】
［実施例２］
還元難消化性デキストリン１４ｋｇ及びソルビトール６ｋｇに、実施例３で得られたラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含む粉末２０ｇを加えて均一に混合し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の菌末を含有する生菌剤約２０ｋｇを得た。
【００６８】
この粉末は、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤であり、歯周病や口臭の予防や治療に有効であることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物の剤や飲食品への適用は、口腔内の衛生状態を確保する手段として、安全であり、かつ効果的である。特に、長期間の日常的な摂取にも適しているため、実用性に優れる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病菌生育抑制用組成物、これを含む歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、口腔内の悩みとして齲蝕に次いで第二番目に多い疾患である。歯周病は、歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨等の歯周組織を破壊し、その機能を侵す。歯周病の原因となる歯周病菌として、グラム陰性菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タンナレラ・フォーシシア（Tannerrella forsythia）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）等の口腔内細菌が知られている（例えば、非特許文献１）。このような歯周病菌は、口臭症の発症にも関与することが明らかとなっている。
【０００３】
一般に、ヒトや動物等の宿主に有益に働く微生物をプロバイオティクスとよび、整腸作用、免疫調節作用等の消化管を介したプロバイオティクスの効果が知られている。近年では、口腔内においてもプロバイオティクスの有用性が検証されており、歯周病、口臭、齲蝕等への抑制効果が報告されている（例えば、非特許文献２）。
【０００４】
このうち、乳酸菌を歯周病の予防や治療に用いることについて、以下のような報告がある。
【０００５】
非特許文献３、４では、ヒトの口腔内から分離された乳酸菌は、数日から数週間経口投与すると、投与中止後も数週間にわたってある程度は口腔内に定着し、歯周病菌を減少させることが報告されている。
【０００６】
特許文献１には、健常人の口腔内より分離されたラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を有効成分とする歯周病の発生防止又は治療用の生菌製剤または乳酸菌含有食品が開示されている。
同文献には、試験管内での抗菌活性試験において、培地中に１×１０6ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌と同等の生菌数のラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で１２時間培養後には歯周病菌の生存率は０．００２％に低下したことが記載されている。
【０００７】
また、このラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株の歯周病菌に対する抗菌活性について、接種菌数を変化させて経時的に調べた報告（例えば、非特許文献５）によると、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌とその１００分の１の生菌数の１×１０6ｃｆｕ／ｍｌのラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で１２時間培養後には歯周病菌の生菌数は検出限界以下にまで減少したとのことである。また、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌と同等の生菌数の１×１０8ｃｆｕ／ｍｌのラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株を混合接種すると、３７℃で９時間培養後には歯周病菌の生菌数は検出限界以下にまで減少したとのことである。
すなわち、同文献では、ラクトバチルス・サリバリウスＴＩ２７１１株は、歯周病菌との混合培養において、生菌数１００倍の歯周病菌を１２時間以内に殺菌し、同等の生菌数の歯周病菌を９時間以内に殺菌したことが報告されているといえる。
【０００８】
特許文献２には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス
ＯＬＬ１２５５株及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４株を含有する口腔内疾患予防用及び／又は治療用の発酵乳が記載されている。同文献には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２５５株及びストレプトコッカス・サーモフィルスＯＬＳ３２９４株を用いて得られた発酵乳が、歯周病菌の増殖を抑制したことが示されている。
【０００９】
特許文献３には、ビフィズス菌、乳酸菌又は酪酸菌に属する菌と、それらの菌が資化しうる糖類を含有することを特長とする歯周病の予防剤又は治療剤が開示されている。同文献には、混合培養において、培地中に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの歯周病菌とそれぞれ５×１０6ｃｆｕ／ｍｌの３種類の乳酸菌を混合接種すると、３７℃で２４時間培養後には歯周病菌はある程度増殖が抑制されるが、強い抗菌活性は観察されなかったことが記載されている。
【００１０】
特許文献４には、発酵乳の製造に使用されるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌および／またはその培養物を含有する、ポルフィロモナス・ジンジヴァリス除菌および／または感染防御のための組成物が開示されている。同文献には、エンテロコッカス・フェシウム（１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）は、歯周病菌との混合培養において、生菌数約１０倍（１×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）の歯周病菌に対して２４時間培養後には増殖を抑制したものの、強い抗菌活性は観察されなかったことが記載されている。
【００１１】
特許文献５には、ヒトの消化管から分離され、耐酸性の高い菌株として選抜されたラクトバシラス・サリバリウスＷＢ２１株を有効成分として含有する食中毒、又は、口腔疾患の予防及び／又は治療組成物が開示されている。
【００１２】
特許文献６には、ラクトコッカス属に属する特定の菌株からなるポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤が記載されている。
【００１３】
また、歯周病菌が産生する物質（例えば、タンパク質）による、乳酸菌の増殖の抑制に関する報告があり、乳酸菌と歯周病菌は互いに競合することが知られている（非特許文献７）。
【００１４】
ところで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株については、特許文献７に記載されるように、虫歯予防用組成物の有効成分としての用途が知られている。
【００１５】
歯周病と齲蝕はともに口腔内細菌による感染症ではあるものの、それらの原因菌の特徴ならびに発病の機序は大きく異なる。齲蝕は、グラム陽性であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）やストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）等の齲蝕原性細菌が産生する酸による歯質の脱灰によって起こる。これらの齲蝕原性細菌は、非水溶性グルカンとともに歯垢を形成し、歯垢中に齲蝕の原因となる酸を産生する（例えば、非特許文献１）。実際に、齲蝕原性細菌に対して強い抗菌活性を示す物質であっても、歯周病菌に対する抗菌活性は弱いものもあることが報告されている（例えば、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第４２０３８５５号公報
【特許文献２】特許第４４６９７９２号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２９２号公報
【特許文献４】特開２００６−３２８０５２号公報
【特許文献５】特許第３９４４０７６号公報
【特許文献６】特開２０１０−１２４７７２号公報
【特許文献７】特開２００８−２３７１９８号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】口腔衛生学２０１０、松久保隆、八重垣建、前野正夫編、一世出版、東京、２０１０年、第１６０−１８４頁
【非特許文献２】ペリオドントロジー２０００（Periodontology 2000）、デンマーク、第４８巻、２００８年、ｐ．１１１〜１４７
【非特許文献３】アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、アメリカ、第７２巻、２００６年、ｐ．３０５０〜３０５３
【非特許文献４】日本歯周病学会誌、日本、第４８巻、２００６年、ｐ．３１５〜３２４
【非特許文献５】日本歯周病学会誌、日本、第４６巻、２００４年、ｐ．１１８〜１２６
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー（Journal of Medical Microbiology）、イギリス、第５２巻、２００３年、ｐ．１０８３〜１０９３
【非特許文献７】リサーチ・イン・マイクロバイオロジー（Research in Microbiology）、フランス、第１５４巻、ｐ．６６９〜６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
歯周病菌の増殖抑制効果があるとされる乳酸菌のうち、ヒトの検体から分離された乳酸菌は、比較的ヒトの口腔内に定着し易く、歯周病菌の持続的な増殖抑制効果が期待される。
しかしながら、このような乳酸菌は、人によっては長期間の投与や摂取により、副作用を生ずる場合もあり、口腔内組成物や食品に利用する場合の安全性を確保しにくいという問題がある。
一方、例えば、ヒトの検体以外の自然界から分離され、発酵乳の製造などに使用される乳酸菌は、安全性の観点から実用性が高い。
しかしながら、乳酸菌の投与、摂取後は一過的に口腔内に存在するものの、長期間にわたる口腔内での定着性は低いという問題がある。
【００１９】
したがって、特にヒト口腔以外の自然界から分離された乳酸菌を口腔内でプロバイオティクスとして応用するためには、乳酸菌が口腔内に留まっているうちに効果が発揮される菌株を選択する必要、つまり、摂取後比較的短時間で効果が発揮される菌株を選択する必要がある。
そこで、本発明は、安全性が高く、口腔内への投与後、比較的短時間で効果が発揮される歯周病菌生育抑制組成物を提供することを課題とする。また、安全性が高く、効果にも優れた、歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、前記背景技術に鑑み、乳酸菌の持つ生理機能について鋭意探索を重ねた結果、ヒト口腔以外の自然界から分離された特定の乳酸菌株が、歯周病菌に対して強い抗菌活性を示すことを見出した。
【００２１】
すなわち、前記課題を解決する本発明は、 ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）を有効成分とする歯周
病菌生育抑制用組成物である。
【００２２】
本発明の好ましい形態では、歯周病菌生育抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上の菌数となるように投与される。
【００２３】
特に、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに属する歯周病菌の生育抑制に好適である。
【００２４】
また、本発明は、上記の歯周病菌生育抑制用組成物を含有する歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の組成物は、従来のヒト口腔以外の自然界から分離された乳酸菌株を含む組成物に比して、短時間に歯周病菌の生育の抑制効果を発揮し、安全性も高い。
従って、本発明の歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤、並びに、該組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、歯周病や口臭の予防や治療に有効であり、且つ安全性も高い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】試験例２における歯周病菌の生菌数を示す図である。
【図２】試験例２における乳酸菌の生菌数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００２８】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（本明細書において、単に「ＴＬ６株」という。）を有効成分とする。ＴＬ６株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に、平成１９年１月１７日より、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８で寄託されている。
本菌株は、特開２００８−２３７１９８公報に開示されるように、自然界から採取した各種試料から分離した菌株の中から、還元脱脂粉乳培地でストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養したときに、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択し、さらにストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する菌株を選択することによって得られた菌株である。
また、ＴＬ６株の菌学的性質は、特開２００８−２３７１９８公報に開示されているとおりである。また、同文献にも記載されているように、ＴＬ６株は、発酵乳の製造に適した菌株であり、人体に対して安全である。
【００２９】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物には、ＴＬ６株と同等以上の歯周病菌生育抑制効果を有し、口腔内に投与した場合に安全である限り、ＴＬ６株の変異株を用いてもよい。ある変異株がＴＬ６株と「歯周病菌生育抑制効果」を有するか否かは、例えば、後述する試験例に示すような方法で、変異株と歯周病菌を混合培養し、歯周病菌数の変化をＴＬ６株のそれと比較することにより確認することができる。このような変異株は、ＴＬ６株に非人為的に変異が導入されることで構築されてもよい。また、ＵＶ等の変異原を用いた処理によりＴＬ６株に変異を導入して変異株を構築してもよく、種々の遺伝子操作法によりＴ
Ｌ６株に変異を導入して変異株を構築してもよい。
なお、上述のＴＬ６株の変異株は、ＴＬ６株を親株として派生した菌株であり、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス種に属する株に限定される。また、上述のＴＬ６株の変異株には、従来知られる歯周病菌の予防、治療効果が確認された乳酸菌株は一切含まれない。
以下の説明において、ＴＬ６株と上述の変異株をまとめて、単に「ＴＬ６株」という場合がある。
【００３０】
ＴＬ６株は、ラクトバチルス属に属する細菌の培養に通常用いられる培養条件で培養することが可能である。例えば、培養温度としては、通常２５〜５０℃程度、好ましくは３５〜４２℃程度である。また、培養条件としては、微好気条件又は嫌気条件が好ましい。
【００３１】
ＴＬ６株を培養する培地としては、特に限定されず、ラクトバチルス属に属する細菌の培養に通常用いられる培地を用いることができる。すなわち、炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、スクロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。
【００３２】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ＴＬ６株の培養物の全部又は菌体を含む一部であってもよい。例えば、培養後得られた培養物を遠心分離して、菌体を回収して用いることもできる。
上記のようにして得られた培養物の全部又は一部は、保存性、取り扱い性の観点から、乾燥することが好ましい。乾燥の方法としては、凍結乾燥が好ましい。
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、後述するように、歯周病や口臭の予防や治療を目的とした剤や飲食品の有効成分として用いることができる。
【００３３】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物における、ＴＬ６株の濃度は、その使用方法、使用量などに応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
【００３４】
また、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
後述する試験例に示すとおり、ＴＬ６株と歯周病菌を混合培養した場合、ＴＬ６株が、歯周病菌の１％程度であっても、９時間という短時間で、歯周病菌の生育を抑制する。さらに、後述する試験例の結果から、ＴＬ６株が、歯周病菌の１００％程度である場合には、３時間という短時間で、歯周病菌の生育を抑制することが推測される。
【００３５】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、有効成分であるＴＬ６株以外に、口腔内で有益な作用を示すその他の成分、例えばキシリトールやソルビトール等の糖アルコール、カテキン等のポリフェノール、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトパーオキシダーゼ、免疫グロブリン等のタンパク質を含むことも好ましい。
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、その他、口腔内に投与する組成物に通常用いられる成分を含むことができる。
【００３６】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、各種食品に、歯周病菌生育抑制効果を与えるための食品添加剤として使用することができる。
【００３７】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物は、グラム陰性菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タンナレラ・フォーシシア（Tannerrella forsythia）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）等の歯周病菌の生育抑制に効果がある。特に、ポルフィロモナス・ジンジバリスの生育抑制に効果がある。
【００３８】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、歯周病菌生育抑制用組成物を含む。本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は医薬の形態を含む。
その剤形としては、口腔内へ投与できる形態であればよいが、口腔内に一定時間（数分以上）留まらせるのに適した形態が好ましく、洗浄液、トローチ錠、チューイングガム、ペーストなどが挙げられる。
歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤と共に、ＴＬ６株を製剤化することにより製造できる。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を使用できる。
【００３９】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤における、ＴＬ６株の濃度は、その使用方法、使用量などに応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常０．０１〜３０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％である。
また、ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常１０7〜１０10ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０8〜１０9ｃｆｕ／ｇである。
【００４０】
また、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
例えば、歯周病予備群或いは歯周病患者のヒトの口腔内には、１０8〜１０10ｃｆｕ程度の歯周病菌が口腔内に存在している。従って、本発明の歯周病や口臭の予防及び／又は治療剤の１回の投与菌数は、通常１０7ｃｆｕ以上、好ましくは１０8ｃｆｕ以上、更に好ましくは１０9ｃｆｕ以上である。
【００４１】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、口腔内に投与される。口腔内への投与の形態としては、口腔内への投与後に口腔内から吐き出される形態、口腔内への投与後嚥下される形態の何れであってもよい。例えばトローチ、散剤、液剤、歯磨きペースト等が挙げられる。中でも、口腔内に滞留しやすいトローチのような形態が好ましい。本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤は、１日に複数回、好ましくは２〜３回、３〜４時間おきに投与することが好ましい。特に、食後３０分以内に投与することが好ましい。
【００４２】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、歯周病菌生育抑制用組成物を含む。
その形態としては、例えば、ヨーグルト等の発酵食品、チョコレートやキャンディー、チューインガム等の菓子類等が挙げられる。中でも、ＴＬ６菌株を十分量摂取しやすい、発酵食品が好ましい。
【００４３】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品における、ＴＬ６株の濃度は、その飲食品の形態に応じて、歯周病菌の生育を抑制することができる範囲に調節することができる。
ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常０．０１〜３０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％である。
また、ＴＬ６株の含有量の目安としては、通常１０6〜１０10ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０7〜１０9ｃｆｕ／ｇである。
【００４４】
また、本発明の歯周病及び口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、ＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上、好ましくは１００％以上の菌数となるように投与される形態で用いられることが好ましい。
上述の通り、ヒトの口腔内の歯周病菌数を考慮して、本発明の歯周病や口臭の予防用及び／又は治療用の食品の１回の摂取菌数は、通常１０7ｃｆｕ以上、好ましくは１０8ｃｆｕ以上、更に好ましくは１０9ｃｆｕ以上である。
【００４５】
本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、１日に複数回、好ましくは２〜３回、３〜４時間おきに摂取することが好ましい。特に、キャンディーやチューイングガム等の形態では、食後または食間に摂取することが好ましい。
【００４６】
本発明の歯周病及び口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品は、「歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用」との用途が表示された飲食品として販売することが好ましい。
【００４７】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的方法により提供する行為、等が例示できる。
【００４８】
しかしながら、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、例えば、特定保健用食品（健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号））としての表示（特に保健の用途の表示）が最も好適である。
【００４９】
なお、以上のような表示を行うために使用する文言は、「歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用」という文言のみに限られるわけではなく、それ以外の文言であっても、歯周病及び／又は口臭の予防、或いは治療の効果を示唆する文言、又は歯周病及び／又は口臭の予防、或いは治療によって二次的に生じる効果を示唆する文言であれば、使用できることはいうまでもない。
【００５０】
次に、試験例を示して、ＴＬ６株の歯周病菌に対する抗菌作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、歯周病菌に抗菌作用を有する乳酸菌を選択するために行った。
（１）歯周病菌前培養液の調製
歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスＪＣＭ８５２５株（理化学研究所より分譲）を５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコース添加を添加したＧＡＭブイヨン（日水製薬社製）４ｍｌに接種し、８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ社製）の内部で３７℃、１日間培養し、歯周病菌前培養液とした。
【００５１】
（２）乳酸菌試験菌液の調製
乳酸桿菌の基準菌株（理化学研究所又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより分譲）１３種類、又は乳酸桿菌の保存菌株２８種類を５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコース添加を添加したＧＡＭブイヨン４ｍｌに接種し、８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバーの内部で３７℃、１日間培養した。この培養液を、リン酸緩衝生理食塩水で１００倍に希釈し、乳酸菌試験菌液とした。
【００５２】
（３）試験方法
５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、及び７ｇ／Ｌグルコースを添加したＧＡＭブイヨン４ｍｌを含む容量１５ｍｌのチューブに歯周病菌の前培養液４０μＬ及び乳酸菌の試験菌液４０μＬを添加し、攪拌した。この混合培養液を８５％窒素ガス、５％水素ガス、及び１０％炭酸ガスを充填した嫌気性チャンバー内で３７℃で混合培養した。混合培養開始８、９、及び１０時間後に培養液１００μＬを採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて１０倍希釈系列を作成し、その希釈液を２０μｌずつ歯周病菌のみ選択的に検出するための寒天培地（５％ウマ脱繊血、５ｍｇ／Ｌヘミン、１ｍｇ／Ｌメナジオン、７５ｍｇ／Ｌネオマイシン、及び３．５ｍｇ／Ｌバンコマイシンを添加した血液寒天基礎培地ＮＯ．２（オキソイド社製））に塗布し、嫌気性チャンバー内で３７℃、５日間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニーの数を測定した。検出された細菌のコロニー数から、上記の試験混合液１ｍｌ当りの歯周病菌生菌数の対数値（ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）を求めた。対照実験として、乳酸菌試験菌液を無添加の条件で歯周病菌生菌数を調べた。
【００５３】
（４）試験結果
本試験の結果を表１、２に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１に示すとおり、乳酸菌の基準菌株のうち、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）
ＪＣＭ１１３１株は、混合培養開始１０時間後において、歯周病菌を初菌数（約７．０ ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）の１００分の１以下（４．７０ ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）に低下させ、殺菌活性が観察された。一方、それ以外の乳酸菌の基準菌株１２菌株では、混合培養において１０時間後まで、乳酸菌無添加の対照と比べて歯周病菌の生菌数に殆ど影響を及ぼさなかった。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２に示すとおり、保存菌株のうち、ＴＬ６株は９時間後において歯周病菌数を検出限界以下に低下させ、殺菌活性が観察された。また、ラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）１０２−１−１株は、１０時間後において歯周病菌数を検出限界以下に低下させ、殺菌活性が観察された。一方、上記の２菌株以外の保存菌株２６株では、混合培養において１０時間後まで乳酸菌無添加の対照と比べて歯周病菌の生菌数に殆ど影響を及ぼさなかった。したがって、供試した基準菌株及び保存菌株のうち、ＴＬ６株が最も短時間のうちに歯周病菌に対する抗菌活性を発揮することがわかった。
【００５８】
［試験例２］
本試験は、試験例１で歯周病菌への抗菌活性がみられたＴＬ６株について、その抗菌活性の強さ、特に歯周病菌を殺菌するのに要する時間を検討するために行った。
【００５９】
（１）歯周病菌前培養液の調製
上記試験例１と同様の方法で歯周病菌前培養液を調製した。
【００６０】
（２）乳酸菌試験菌液の調製
上記試験例１と同様の方法でＴＬ６株を培養し、乳酸菌試験菌液を調製した。
【００６１】
（３）試験方法
上記試験例１と同様の方法で歯周病菌と乳酸菌を混合培養した。ただし、混合培養開始直後（０時間）、３、６、７、８、９、及び１０時間後の歯周病の生菌数を上記試験例１と同様の方法で測定した。さらに、リン酸緩衝生理食塩水にて作成した１０倍希釈系列のうち２０μＬを、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に塗布し、１０％炭酸ガスを充填したインキュベーター中で３７℃、３日間培養し、寒天培地上に形成されたコロニー数をカウントし、乳酸菌の生菌数を測定した。
【００６２】
（４）試験結果
本試験の結果を図１及び２に示す。図１には歯周病菌の生菌数の結果を示した（○：乳酸菌無添加、●：乳酸菌添加）。また、図２には乳酸菌の生菌数の結果を示した（○：乳酸菌無添加、●：乳酸菌添加）。その結果、歯周病菌および乳酸菌の生菌数は、混合培養開始時点（０時間後）では、それぞれ７．４４ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ、および４．９６ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌであった。乳酸菌との混合培養では、歯周病菌の生菌数は、混合培養開始６時間後まで増加し、８時間後までほぼ一定の生菌数が観察された、一方、乳酸菌無添加の対照では、歯周病の生菌数は、培養開始１０時間後まで増加した。また、乳酸菌の生菌数は混合培養開始１０時間後まで増加した。乳酸菌との混合培養開始９時間後において、歯周病菌の生菌数は検出限界以下（＜２．７０ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌ）にまで低下し、殺菌活性が観察された。したがって、ＴＬ６株は、歯周病菌の増殖培地を用いた混合培養において、生菌数約１００倍の歯周病菌を９時間以内に殺菌することが明らかとなった。
なお、ＴＬ６株の菌数は、混合培養開始６時間後において７．４８ｌｏｇ10 ｃｆｕ／ｍｌにまで増加し、歯周病菌の混合培養開始時点（０時間後）とほぼ同じ生菌数に達した。この時点（混合培養開始６時間後）を基準とすると、その３時間後（混合培養開始後９時間後）には歯周病菌が検出限界以下にまで殺菌されたことになる。従って、ＴＬ６株は、同等の生菌数の歯周病菌を、少なくとも３時間以内に殺菌することが推測された。
【００６３】
以上の試験から、ＴＬ６株は、従来の乳酸菌株に比して、歯周病菌に対する抗菌性が高く、短時間で歯周病菌を殺菌することができることが分かった。
【実施例】
【００６４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１］
肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００ｇ、ペプトン１００ｇ、乳糖２００ｇ、リン酸水素二カリウム５０ｇ、リン酸二水素カリウム１０ｇ、シスチン４ｇ及び水９．５Ｌの組成からなる培地で、２５℃１６時間前培養したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のシードカルチャー５００ｍＬを、前記培地と同一組成の培地１０Ｌに接種し、２５℃１６時間培養した。更に、９０℃で３０分間殺菌した前記培地
と同一組成の培地２００Ｌに、前記培養液全量（１０．５Ｌ）を接種し、２５℃１６時間培養した。培養後の生菌数は３．０×１０9ｃｆｕ／ｍＬであった。
次いで、シャープレス型遠心分離機を用いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水（９０℃３０分間殺菌済）に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳１０％、蔗糖１％、グルタミン酸ソーダ１％からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０Ｌに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、８．５×１０10ｃｆｕ／ｇのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含む粉末約２．２ｋｇを得た。
【００６６】
この粉末は、本発明の歯周病菌生育抑制用組成物であり、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤、或いは本発明の歯周病及び／又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品の原料として利用することができる。
【００６７】
［実施例２］
還元難消化性デキストリン１４ｋｇ及びソルビトール６ｋｇに、実施例３で得られたラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含む粉末２０ｇを加えて均一に混合し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の菌末を含有する生菌剤約２０ｋｇを得た。
【００６８】
この粉末は、本発明の歯周病及び／又は口臭の予防及び／又は治療剤であり、歯周病や口臭の予防や治療に有効であることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の歯周病菌生育抑制用組成物の剤や飲食品への適用は、口腔内の衛生状態を確保する手段として、安全であり、かつ効果的である。特に、長期間の日常的な摂取にも適しているため、実用性に優れる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０７５８）を有効成分とする歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上の菌数となるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項３】
歯周病菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリスである請求項１又は２に記載の歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を含有する歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品。
【請求項１】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０７５８）を有効成分とする歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、歯周病菌の菌数に対して１％以上の菌数となるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項３】
歯周病菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリスである請求項１又は２に記載の歯周病菌生育抑制用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を含有する歯周病又は口臭の予防及び／又は治療剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を含有する歯周病又は口臭の予防用及び／又は治療用の飲食品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−２５６９９（Ｐ２０１２−２５６９９Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６６１３６（Ｐ２０１０−１６６１３６）
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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