汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清
本発明は、（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清単離する、ことによって入手可能な、汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清に関する。更に本発明は、がん、特に、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸癌、胃癌、若しくは膀胱癌の改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造するための、ポリクローナル抗血清の使用を提供する。更に本発明は、治療を必要とする被験者に、更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて投与されるべき医薬組成物を製造するための、本発明のポリクローナル抗血清の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、ことによって入手可能な、汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清に関する。更に本発明は、がん、特に、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸癌、胃癌、若しくは膀胱癌の改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造するための、ポリクローナル抗血清の使用を提供する。更に本発明は、治療を必要とする被験者に、更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて投与されるべき医薬組成物を製造するための、本発明のポリクローナル抗血清の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ合衆国では２００３年にがんの新規症例が約１００万人診断され、その疾患により約５０万人が死亡している。このようにがんは、合衆国及び世界中で第２の主要死因である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００３；Ｓｔｅｒｎ、２００４）。化学療法、外科手術、又は放射線療法のような従来のがん治療法は、それら治療法がしばしば非特異的及び不正確であるため、有効性がほとんど限定されている（Ｋｉｍｂａｌｌ、１９９３）。しかしながら、多くの症例では、腫瘍は遺伝子を特異的に発現しており、その産物は悪性状態を誘発又は維持するために必要である。これらのタンパク質は、有効な抗がん療法を開発及び確立するための抗原マーカーとして役立つことができる。抗原は免疫応答を誘導することが知られている。これらの抗原はタンパク質、多糖、脂質、又は糖脂質であり、リンパ球、即ちＢ細胞及びＴ細胞により「異物」として認識される。上記抗原へリンパ球が曝露されることによって急速な細胞の分裂及び分化が誘導され、曝露されたリンパ球クローンを形成する。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、次いで形質細胞は抗原と選択的に結合する抗体を産生する。モノクローナル抗体はＢリンパ球の単一クローンの産物であるが、ポリクローナル抗体はＢリンパ球の数種のクローンにより産生される。
【０００３】
ポリクローナル抗体は、ウサギをマウスの内皮細胞でワクチン接種することによって、マウスにおいてアポトーシスを誘発し、腫瘍増殖支持をブロックするために首尾よく使用されてきた。このアプローチから、強力な抗血管新生活性を有するポリクローナル免疫グロブリンが産生された。ポリクローナル抗体は、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示し、インビボ腫瘍放射性イメージングにおいて有用性を実証した（Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉ、２００３）。Ｏｋａｊｉらも、結腸癌の血管新生及び転移に対する自己免疫による阻害効果について報告している（２００４）。この研究では、Ｃｏｌｏｎ−２６がんの肝類洞内皮細胞を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスが免疫され、転移の発生を著しく阻害する予防的及び治療的抗腫瘍免疫を誘導した。免疫グロブリン応答は、抗体のサブクラスＩｇＭ及びＩｇＧが関与していた。さらに、特許出願ＷＯ０１／８９５６３号は、アレルギーを治療するための精製ポリクローナル抗体の使用を想定し、記載している。特に、複合タンパク質であることが多いアレルゲンの場合、ポリクローナル抗体による治療が明らかに有益であり、モノクローナル抗体の使用より好ましいことが開示されている。
【０００４】
Ａｂｅｌｅｖによれば、抗原は以下の４群に区別することができる：（ｉ）同種のウイルス性腫瘍に対して同一のウイルス性腫瘍抗原；（ｉｉ）患者及び腫瘍に対して特異的な発がん性腫瘍抗原；（ｉｉｉ）個々の種の腫瘍全てでは異なるが、同一ウイルスを原因とするさまざまな腫瘍では同じである移植型同種抗原又は腫瘍特異的移植抗原；並びに（ｉｖ）胚性抗原。発がんの過程で細胞は脱分化するため、胚性状態の遺伝子発現を獲得し得る。したがって、生物の胚発生に特異的な胚性抗原が、これらのがん細胞中に見出される。そのような抗原は、腫瘍に対して生物を免疫し、抗がん治療を確立するために使用することができる。最も有望な胚性抗原は、α−フェトプロテイン及びがん胎児抗原（ＣＥＡ）である。α−フェトプロテインは、胎児における主要な輸送タンパク質であり、特に臨床検査室におけるがん及び胎児の欠陥の血清マーカーとして（Ｔａｔａｒｉｎｏｖ、１９６５；Ａｂｅｌｅｖ、１９７１；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ、２００３）、並びに頸頭部癌に対する特異的免疫療法のための標的として（Ｋａｓｓ、２００２）役立つ。ＣＥＡは糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）との類似性を有する。ＣＥＡは最初、胎児結腸及び結腸腺癌に存在する抗原として同定されたが、健常な成人結腸には存在しなかった。ＣＥＡは、膵臓癌、胃癌、及び乳癌に対して最も繁用されているマーカーの１つであり、結腸直腸癌のマーカーとして最も頻繁に使用されている。ＣＥＡは、例えば特異的抗体組成物に対する治療標的としても役立つ。
【０００５】
前記特徴を有する胚性抗原は、がんの検出及びモニタリングに極めて重要になってきたが、腫瘍細胞上の胚性抗原の存在に関する情報及び理解は依然として著しく不足している。ＷＯ９９／５３９５２号は、胚性組織に特異的に由来する汎用腫瘍抗原に対する特異的抗血清の産生方法を提供する。対応する抗血清が、（悪性）腫瘍を検出するための診断ツールとして提唱された。
【０００６】
先行技術には、特異的がん関連エピトープに対するモノクローナル抗体のいくつかが記載されている。例としては、特に、乳癌の治療に使用されるＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２に対するモノクローナル抗体である。抗ヒト乳癌抗体として使用されるモノクローナル抗体は、特に、ＥＰ−Ａ２ ０ １５３ １１４号又はＷＯ８９／０６６９２号に記載されている。しかしながら、ある種の欠点に関連して、モノクローナル抗体の使用は最適ではないとも記載されている。これは、モノクローナル抗体が非常に特異的な単一抗原エピトープに対するものであるという事実による。したがって、標的が複雑な性質を有し、分子レベルで未解明であるか、又は１つの標的だけでなく１群の異なる標的が関与している場合は、モノクローナル抗体は標的を非常に低い親和性で認識するか又は全く認識せず、そのため次善の策としてしか使用されないであろう。したがって、単一のモノクローナル抗体が、がん細胞上の少数ではないおそらく関連のあるエピトープ全体をカバーするとは考えられない。このことは例えば、明確なシグナルを得るために、２種類以上のモノクローナル抗体を使用する必要がある免疫学的試験によっても例示されている。
【０００７】
したがって、当該技術分野において、増殖性疾患、特にがんの効果的な改善、予防、及び／又は治療を提供する治療の手段並びに方法に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ａｂｅｌｅｖ、１９７１、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：２９５−３５７．
【非特許文献２】米国癌協会、２００３、『がんの正確な情報』．
【非特許文献３】Ａｒｎｏｎら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、１：４２９−４４９．
【非特許文献４】Ｂａｒｌｔｒｏｐら、１９９１、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１：６１１．
【非特許文献５】Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９（４７０８）：８１−３．
【非特許文献６】Ｃｏｒｙら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍ．３：２０７−１２．
【非特許文献７】Ｃｕｍｂｅｒら、１９８５、Ｍｅｔｈ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１２：２０７−２２５．
【非特許文献８】Ｄａｖｏｌら、２００４、Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．３（２）：１１２−２１．
【非特許文献９】Ｅｃｋｅｌｍａｎら、１９８０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：３０３６−４２．
【非特許文献１０】Ｆａｎｇｅｒら、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１１）：３７５−８０．
【非特許文献１１】Ｆｌｅｃｈｎｅｒ、１９７３、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、９：７４１−７４５．
【非特許文献１２】Ｇｈｏｓｅら、１９７２、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、３：４９５−４９９．
【非特許文献１３】Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１４（１）：５−７．
【非特許文献１４】Ｈａｍａｎｎら、２００２、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、３：４０．
【非特許文献１５】Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８、『抗体：実験室マニュアル』、コールドスプリングハーバー研究所出版
【非特許文献１６】Ｈａｒｒｉｓ、２００４、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．５（５）：２９２−３０２．
【非特許文献１７】Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９７５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５：１１７５−１１８１．
【非特許文献１８】Ｋａｓｓら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（１７）：５０４９−５０５７．
【非特許文献１９】Ｋｉｍｂａｌｌ、１９９３、『生物学』、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ．Ｂｒｏｗｎ編．
【非特許文献２０】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．７（２）：２３３−４２．
【非特許文献２１】Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７（５２５９）：６８０−５．
【非特許文献２２】Ｌｉｕ Ｙｕａｎｆａｎｇら、１９９１、『ＩＵＰＡＣレポート』、４２７−４６２．
【非特許文献２３】Ｍｏｒｇａｎ及びＤａｒｌｉｎｇ、１９９３、『動物細胞培養』、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社編．
【非特許文献２４】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉら、２００３、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２：１２４３−１２５５．
【非特許文献２５】Ｏｋａｊｉら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５：８５−９０．
【非特許文献２６】Ｏｓａｗａら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、１：３７３−３８８．
【非特許文献２７】『レミントンの薬学』１９９０、第１８版増補版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ著、Ｍａｃｋ出版社、ペンシルバニア州イーストン．
【非特許文献２８】Ｒｏｄｅら、２００４、『アポトーシス、細胞死、及び細胞増殖マニュアル』、第３版、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ．
【非特許文献２９】Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉら、２００３、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：２６６７−７７．
【非特許文献３０】Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０（１）：７６−８５．
【非特許文献３１】Ｓｔａｎ、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１１５−１２１．
【非特許文献３２】Ｓｔｅｒｎ、２００４、『がんと向き合う』、ＭａｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ編．
【非特許文献３３】Ｓｚｅｋｅｒｋｅら、１９７２、Ｎｅｏｐｌａｓｍ、１９：２１１−２１５．
【非特許文献３４】Ｔａｔａｒｉｎｏｖ、１９６５、Ｖｏｐ．Ｋｈｉｍ．ＳＳＲ、１１：２０−２４．
【非特許文献３５】Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、『モノクローナル抗体−毒素結合体：特効薬に向けて』、１６８．
【非特許文献３６】Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１：３９１−６．
【非特許文献３７】Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６５７．
【非特許文献３８】Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８、『モノクローナル抗体療法』、第４５巻、Ｋａｒｇｅｒ編．
【発明の開示】
【０００８】
したがって、本発明の基礎にある技術的課題は、上記必要性を満たすこと、及び多数のさまざまな種類のがんの治療を提供すること、又は両者を同時に満たすことである。
したがって、本発明は、以下の工程：
（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、ことによって得られるポリクローナル抗血清を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において「ポリクローナル抗血清」という用語は、ポリクローナル抗体又は多重特異的抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、抗イディオタイプ抗体、及び上記のエピトープ結合断片に関するものである。ポリクローナル又は多重特異的抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、抗イディオタイプ抗体、及びエピトープ結合断片は、本明細書に概説した工程（ｉｖ）で単離されるように得られた血清中に含まれるか、又は当該技術分野において公知の対応する方法、特にＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、『抗体』（１９８８）に記載の方法を用いて更に精製することができる。本明細書において「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、即ち免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を表す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であってもよい。
【００１０】
「非ヒト脊椎動物においてインビボ液性応答を誘導する」という語句は、非ヒト脊椎動物における免疫応答の発現、特に非ヒト脊椎動物の胚性組織又はその精製画分に対する抗体反応の発現に関するものである。抗体反応は、胚性組織を用いた抗原刺激に対する１次及び２次抗体反応を含む。したがって、「インビボ液性応答を誘導する」という語句は、胚性組織に含まれる複数の抗原に対する抗体の産生に関与する免疫反応の発現に関するものである。本明細書の実施例で説明するように、非ヒト、好ましくは非ヒト脊椎動物の胚性組織は、特にホモジナイズされたマウス胎仔、例えば１２日齢の胎仔から得られる組織又は細胞であってもよい。したがって、本明細書で使用した（工程（ｉ））「非ヒト胚性組織」という用語は、最も好ましい態様では、ホモジナイズされた胎仔（又は胚性組織）から得られる単離細胞を含む。最も好ましくは、使用すべき「胚性組織細胞」は、いかなる組織塊を含まない。対応の更なる詳細は、本明細書の非限定的実施例、特に実施例１から得ることができる。本明細書で説明するように、本発明の好ましい態様では、「胚性組織」／「胚性組織細胞」は、マウス、最も好ましくはＣＢＡ／ＣａＪマウスに由来する。対応の免疫用胚性細胞は、好ましくは１０〜１４日齢のマウス胎仔であり、最も好ましくは１２日齢のマウス胎仔である。
【００１１】
「遺伝系」という用語は、本発明によれば、非ヒト脊椎動物において免疫応答を誘導するために使用すべき胚性組織／胚性細胞は少なくとも同一種であるという事実に関する。したがって、マウス由来胚性組織を使用する場合、工程（ｉ）の対応の免疫応答は、マウスにおいて誘導されるべきである。最も好ましくは、「同一遺伝系」という用語は、対応の免疫応答が誘導される動物と同種であるか、又は遺伝的に同一背景を有する動物が胚性組織の供給源として使用されるという事実に対応する。例えば実施例で説明するように、非ヒト胚性組織の供給源としてＣＢＡ／ＣａＪマウスを使用し、単離胚性組織で免疫するために同一系統（ＣＢＡ／ＣａＪ）のマウスを使用することが想定され、例示される。
【００１２】
医薬組成物の好ましい態様では、免疫されるべき非ヒト動物はマウスであり、最も好ましい態様ではマウスはＣＢＡ系マウスである。ＣＢＡ系マウスは当該技術分野で公知であり、例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国から入手可能である。ＣＢＡ系は、特にＣＢＡ／Ｈ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＪ、及びＣＢＡ／Ｎマウスを含む。実施例で示すように、ＣＢＡ／ＣａＪマウス、特にＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからストック番号０００６５４で入手可能なマウスが最も好ましい。しかしながら、本明細書に記載の「非ヒト脊椎動物」は、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、及びロバから成る群より選択してもよい。しかし、脊椎動物はマウスであることが最も好ましい。
【００１３】
本発明の更に好ましい態様は、ポリクローナル抗血清が精製ポリクローナル抗血清である医薬組成物又は使用に関するものである。
「精製ポリクローナル抗血清」という用語は、当該技術分野において公知の標準的方法を用いて精製された単離ポリクローナル抗体又はその断片に関する。しかしながら、前記用語は、「免疫」精製された抗体調製物にも関するものであり、本明細書に記載の方法の工程（ｉｖ）で得られるポリクローナル抗血清は、非胚性（すなわち産後）器官、器官溶解物、又は非胚性器官若しくは器官溶解物由来の細胞と接触させられる。好ましくは、前記の非胚性（すなわち産後）器官、器官溶解物、又は非胚性器官若しくは器官溶解物由来の細胞は、インビボ腫瘍応答が誘導されるか又は誘導された動物と同種の非ヒト動物に由来するものである。そのような精製は、当該技術分野に熟練した者に公知の望ましくない交差反応性を回避するために好適な混合、吸着、又はインキュベーション方法によって行うことができる。好ましくは、精製方法は、実施例３に記載の方法に従って行われる。
【００１４】
具体的には、「精製ポリクローナル抗血清」という用語は、単離ポリクローナル抗体又はその断片に関するものであり、均一になるまで、特に、純度が少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のレベルまで精製されている。ポリクローナル抗血清の純度は、当該技術分野で公知の方法によって、最も好ましくは本発明の実施例に記載の方法によって確認することができる。したがって、好ましくは、本発明の精製ポリクローナル抗血清調製物が含む無関係な夾雑タンパク質又はタンパク質断片は５％未満である。最も好ましくは、前記調製物が含む無関係な夾雑タンパク質又はタンパク質断片は２％未満である。
【００１５】
好ましくは、ポリクローナル抗血清は、免疫グロブリンを含む画分のような抗血清画分を含む。ポリクローナル抗血清の画分は、ＩｇＧ画分であるか、又はＦ（ａｂ’）２断片画分であるか若しくはその画分を含むことが最も好ましく有益である。
【００１６】
ポリクローナル抗血清を分画するためのさまざまな代替方法が存在し、当該技術分野に熟練した者に公知である。簡便な技法の一つに、例えばプロテインＧ又はプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィの使用が挙げられる。典型的にはカラムは、５ｍｌ又は１０ｍｌの充填されたプロテインＡ又はＧアガロースを含有する。カラムのサイズは、プロテインＡ／Ｇの結合能及び処理される抗血清の量によって決定される。プロテインＡ及びプロテインＧは、結合されるアガロース１ｍｌあたり約２０ｍｌのＩｇＧと結合する。
【００１７】
「Ｆａｂ断片」という用語は、抗原結合活性を含有する抗体断片を表す。抗体分子の２つの同一領域に相当し、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと組み合わされた完全な軽鎖を含有する。ジスルフィド結合したヘテロ２量体であり、その各鎖は１の免疫グロブリンＣドメイン及び１のＶドメインを含有し、両方のＶドメインの並置によって抗原結合部位が形成される。「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、抗体分子の２つの抗原結合領域が連結状態にある抗体断片を表す。この場合、重鎖の残りの部分はいくつかの小断片に切断される。Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、元の抗体と全く同一の抗原結合特異性を有するが、いかなるエフェクター分子又は細胞とも相互作用し得ない。
【００１８】
抗体画分、抗体調製物、及び／又は抗体断片の産生（得られた血清から出発）に関するいくつかのアプローチが文献に報告されている。例えば、米国特許第４，８４９，３５２号は、固定化パパインを用いて抗体を消化し、次いで免疫アフィニティーにより断片を精製することによる両Ｆａｂ断片の産生について記載している。また、固定化パパインを用いて抗体を消化し、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｃ小断片を得、次いでゲル濾過により免疫グロブリンを精製することによるＦ（ａｂ’）２断片の産生についても記載している。滅菌培地中で全血を用いてＦａｂ断片を産生する方法を記載する米国特許第５，７３３，７４２号には別のアプローチが示されおり、ここでは、好ましくは精製された、遊離又は固定化酵素に全血を直接接触させる。続いて、細胞残渣を遠心分離により除去し、得られた断片を分離及び回収し、次いで好ましくは免疫アフィニティーにより精製する。米国特許第４，８１４，４３３号は、Ｆａｂ断片を産生する更なるアプローチを示しており、パパイン不含Ｆａｂを得るための手順を記載している。次いで、Ｆｃ断片及びハイブリッド化合物が保持された、プロテインＡを有するカラムに溶液を通過させることによって断片を精製する。更なる方法は、ペプシンによる消化、及び硫酸アンモニウム又はナトリウムを用いた断片分画の沈殿を包含するが、通常、硫酸塩を用いた沈殿とその後の抗体画分の消化によって抗体による事前分離が行われる。
【００１９】
ポリクローナル抗血清の最も重要な臨床的使用は、がんの改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造することにある。したがって、本発明のポリクローナル抗血清は、がんを治療及び／又は改善する方法において被験者へ使用することもできる。好ましい態様では、被験者はヒト患者である。
【００２０】
したがって本発明の１つの側面では、担癌被験者を改善、予防、又は治療するためのポリクローナル抗血清の使用であり、被験者の癌腫又はがん細胞は本発明のポリクローナル抗血清に結合する抗原を発現する。治療は、特に治療効果を十分発揮する量のポリクローナル抗体を担癌被験者に投与することを含む。本発明の別の側面は、標識されたポリクローナル抗体の投与である。当業者であれば、化学療法剤、アポトーシス剤、ＤＮＡの発現を阻害する薬剤、又は放射性薬剤のような抗体に使用可能な標識の種類を熟知している。当該技術分野で公知の多数の治療薬のなかでも、放射性同位体、抗炎症剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカイン、及び化学療法剤から成る群より選択される治療薬が好ましい。
【００２１】
したがって、更なる側面では、本発明によるポリクローナル抗体／ポリクローナル抗血清、又はその断片を、それを必要とする患者に投与することができ、ここで、前記血清又は得られた抗体（断片）調製物に含まれる抗体タンパク質又はその断片は治療剤と結合している。抗体を化学療法剤に結合させる方法は前述のとおりである。好適な化学療法剤は、当該技術分野に熟練した者に公知であり、限定されるものではないが、ダウノマイシン、アドリアマイシン、エトポシド、シクロホスファミド、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルヂノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、メルファラン、リシン、アブリン、及びカリケアマイシンが含まれる。
【００２２】
これら薬剤は、２官能性又はヘテロ２官能性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、２−イミノチオラン、カルボジイミド若しくはグルタルアルデヒドの使用などのさまざまな周知の化学的方法のいずれかを用いた化学的架橋結合によって、本発明のポリクローナル抗体又はその断片へ化学的に結合させることができる。
【００２３】
抗体又は抗体断片へ、例えばクロラムブシルを結合させる方法は、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ、１９９３；Ｇｈｏｓｅ、１９７２；及びＳｚｅｋｅｒｋｅ、１９７２に記載されている。例えばダウノマイシン及びアドリアマイシンを抗体に結合させる方法は、Ｈｕｒｗｉｔｚ、１９７５及びＡｒｎｏｎ、１９８２に記載されている。抗体−リシン結合体を調製する方法は、米国特許第４，４１４，１４８号、及びＯｓａｗａ、１９８２に記載されている。カリケアマイシンを抗体に結合させる方法は、Ｈａｍａｎｎ、２００２に認めることができる。抗体へのドキソルビシンの結合は、例えばＳｔａｎ、１９９９に由来する方法を用いることができる。さまざまな免疫毒素を産生するための更なる手法は、例えばＴｈｏｒｐｅ、１９８２；Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９１；Ｂｌａｋｅｌｙ、１９９８；Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８；又はＣｕｍｂｅｒ、１９８５に認めることができる。
【００２４】
前記の抗体又は抗体断片の１つにリシン又はアブリンなどのポリペプチドを化学的に結合させることは、２官能性又はヘテロ２官能性試薬（例えば、グルタルアルデヒド又はＮスクシミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ））を用いた化学的架橋反応のような当該技術分野で公知の方法によって行うこともできる。Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８及びＣｕｍｂｅｒ、１９８５を参照されたい。
【００２５】
抗体の２つの可変ドメインが互いに結合することによって形成され、それぞれが異なるエピトープに特異的な２重特異性抗体もがん療法において提唱されている。したがって、２重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位（パラトープ）を有するハイブリッド免疫グロブリンであり、例えば化学的架橋によって調製することができる（Ｂｒｅｎｎａｎ、１９８５）。がん治療用の２重特異性抗体は、腫瘍抗原に対するパラトープと、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又は他のエフェクター細胞による貪食又は溶解反応を仲介し得る細胞表面分子に対するパラトープとによって形成される（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ、２０００；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、２００４；Ｆａｎｇｅｒ、１９９１；Ｄａｖｏｌ、２００４を参照されたい）。
【００２６】
本発明に包含される、ポリクローナル抗体に結合可能な更なる治療薬は、放射性同位体又は放射性同位体を含有する薬剤である。放射性同位体のなかでも、γ線、β線、及びα線放射性同位体を使用することができる。治療用放射性同位体としては、β線放射性同位体が好ましい。使用可能な放射性標識の種類には、インジウム１１１、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、イットリウム９０、ルテチウム１７７、レニウム１８６、レニウム１８８、ビスマス２１３、コバルト、インジウムのさまざまな同位体、その他の放射性物質がある。放射性標識抗体のためのプロトコールとして、例えばＷＯ９３／０５８０４号を参照されたい。悪性腫瘍細胞への局部照射及び破壊を実現するには、レニウム１８６、レニウム１８８、ヨウ素１３１、及びイットリウム９０が特に有用なβ線同位体であることが示されている。したがって、レニウム１８６、レニウム１８８、ヨウ素１３１、及びイットリウム９０から成る群より選択される放射性同位体が、本発明のポリクローナル抗血清のタンパク質に結合される治療薬として特に好ましい。
【００２７】
したがって、放射性核種の放射線療法では、がん細胞にさまざまな放射線量を直接照射するための放射標識抗体の使用に焦点が当てられてきた（放射免疫療法）。本発明に従って得られる抗体及び抗体断片を、当該技術分野で公知の方法により放射性核種へ化学的に結合させてもよい。特に、Ｌｉｕ Ｙｕａｎｆａｎｇ、１９９１；Ｅｃｋｅｌｍａｎ、１９８０を参照されたい。
【００２８】
本発明によれば、腫瘍特異的ポリクローナル抗血清は、各種の腫瘍又は腫瘍細胞に対するさまざまな「殺傷機序」を誘発することも可能である。例えば、腫瘍細胞上で補体系を活性化することができる。免疫グロブリン分子全体、即ちポリクローナル抗体は、腫瘍細胞に局在化して補体系を活性化することができ、その結果、膜に孔を開けて細胞を溶解させる（Ｈａｒｒｉｓ、２００４）。
【００２９】
あるいは、免疫エフェクター細胞が腫瘍増殖部位に向けて誘導され、その場所で細胞傷害作用が活性化されることもある。特に、免疫グロブリン分子がエフェクター細胞を補充して活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に至ることもある。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）は、ＩｇＧのＦｃ断片に対する受容体を有するので、その付着によって標的細胞のアポトーシスを含む細胞傷害に至る一連の反応が活性化される。
【００３０】
さらに、本明細書中に記載の各種毒素又は放射性核種のような、細胞の挙動又は細胞の生存に傷害をきたす細胞傷害性の分子又は原子は、前記の腫瘍又は腫瘍細胞の部位へ送達されることもある。腫瘍細胞に対して細胞毒性薬が有するそのような特異的標的作用によって、腫瘍部位で濃度の上昇を起す可能性があるものの、全身投与による用量規制の副作用は生じない。前記複合体は一端細胞表面に付着すると細胞質内に取り込まれ、そこで細胞の酵素が抗体と薬剤又は毒素を切り離す。その薬剤又は毒素は放出と同時に細胞死を含む傷害を細胞にもたらす。例えば、腫瘍細胞に結合した放射性標識抗体は細胞で放射能を濃縮する。細胞核から至近距離での照射によってがん細胞の死滅が起きる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、１９９３）。
【００３１】
２重特異性の免疫グロブリン療法は、疾患に関連する一定の標的構造に対する免疫エフェクター機序の選択的動員に依拠する。こうして２重特異性分子は、エフェクター機序とその標的間の連結役となる。極めて多様なエフェクター機序は治療面への応用が期待され、その多くは既に高く評価されている。それらには、エフェクター分子（例えば、毒素、薬物、プロドラッグ、サイトカイン、放射性核種）の動員、エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球）の再標的化、及び担体系の標的化が含まれる。
【００３２】
本発明のポリクローナル抗血清及び／又はそれから得られる抗体は、増殖性疾患、がんの医療的介入、及び／又は腫瘍の治療において特に有効である。
本発明の明細書に記載される「がん」又は「腫瘍」という用語は、悪性増殖に関連する疾患を含む。本発明によるがん又は腫瘍は、限定されるものではないが、下記を含む。
【００３３】
１） （ｉ）鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、口腔癌及び中咽頭癌喉頭及び下咽頭の腫瘍、唾液腺腫瘍及び傍神経節腫、並びに（ｉｉ）扁平上皮細胞癌、疣状癌、肉腫様扁平上皮細胞癌、リンパ上皮腫、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺房細胞癌、腺癌及び神経内分泌腫瘍の諸変異型を含めた頸頭部癌。
【００３４】
２） （ｉ）癌腫、腺癌、大細胞（未分化）癌及び扁平上皮細胞癌を含む各種の非小細胞肺癌、並びに（ｉｉ）燕麦細胞癌、リンパ球様癌、中期癌、及び（扁平上皮癌又は腺癌の合併した）ＳＣＬＣを含む小細胞肺癌を含めた肺癌。
【００３５】
３） （ｉ）胸腺新生物、リンパ腫、胚細胞腫瘍及び癌腫を含む縦隔上前部の新生物、上腕、腸管及び心膜の嚢胞、異常上皮小体腫瘍及び甲状腺新生物；（ｉｉ）嚢腫性病変、リンパ腫、間葉性腫瘍及びがんを含む縦隔中部新生物；並びに（ｉｉｉ）神経原性腫瘍、嚢腫病変、間葉性腫瘍及び内分泌腺腫瘍を含む縦隔後部の新生物を含めた縦隔の新生物。
【００３６】
４） （ｉ）十二指腸癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、扁平上皮細胞癌、腺棘細胞腫、カルチノイド腫瘍、平滑筋肉腫、間葉性腫瘍、上皮性新生物、混合型ＨＣＣ／胆管癌、リンパ腫、及び黒色腫を含めた消化管癌。
【００３７】
５） 腎臓及び尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道及び陰茎癌、並びに移行細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、基底細胞癌及び間葉性腫瘍を含む泌尿生殖器系の癌。
６） 上皮内、精上皮及び非精上皮腫の癌、ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、顆粒膜細胞腫、生殖芽細胞腫、中皮腫、肉腫、精巣網及び類表皮嚢胞の腺癌、リンパ腫、並びに転移性癌を含む精巣癌。
【００３８】
７） 子宮内膜癌、子宮頚、膣及び外陰の癌、子宮体癌、妊娠性絨毛性疾患、卵巣癌、卵管癌及び腹膜癌、並びに上皮内腺癌、上皮内扁平上皮癌、悪性混合型ミュラー腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｉｘｅｄ Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ：ＭＭＴ）、絨毛性腫瘍、及び胚細胞又は間質細胞の腫瘍を含む婦人科の癌。
【００３９】
８） 乳癌、即ち、上皮内癌、非浸潤性乳管癌、及び上皮内小葉癌を含む乳房の悪性腫瘍。
９） 甲状腺腫瘍、副甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膵内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍及びカルチノイド症候群、癌腫及び腺腫を含む多発性内分泌新生物１型（ＭＥＮ １）から成る群より選択される内分泌系の癌。
【００４０】
１０） （ｉ）軟組織の肉腫；並びに（ｉｉ）紡錘細胞腫瘍、傍骨性骨肉腫、骨膜性骨肉腫、パジェト肉腫、高悪性度表在性骨肉腫及び小細胞骨肉種、骨の巨細胞腫瘍、仙骨の巨細胞腫瘍、悪性線維細胞組織腫、骨の線維肉腫、骨の悪性血管内皮腫、脊索腫、骨の小円形細胞肉腫、及び骨のリンパ腫（びまん性大細胞型リンパ腫）からなる骨の肉腫を含めた軟組織及び骨の肉腫。
【００４１】
１１） 上皮、肉腫様、及び混合型腫瘍を含む悪性中皮腫。
１２） 基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、癌関連遺伝性皮膚症（色素性乾皮症、母斑性基底細胞癌症候群、ファーガソン−スミスの多発性自然治癒性上皮腫、ムーアトーレ（Ｍｕｉｒ−Ｔｏｒｒｅ）症候群、コーデン症候群、ガードナー症候群及びカーニー症候群を含む）、並びに表皮メルケル細胞から生じる腫瘍、メルケル細胞癌、表皮ランゲルハンス細胞から生じる腫瘍、毛嚢腫瘍、脂腺腫瘍、アポクリン汗腺腫瘍、エクリン汗腺腫瘍、真皮から生じる腫瘍、リンパ網内系腫瘍及び関連病態から成る群より選択される皮膚癌。
【００４２】
１３） 上皮黒色腫及び眼内黒色腫を含む悪性黒色腫。
１４） 乏突起星細胞腫、脈絡叢の腫瘍、星状細胞腫−乏突起膠腫、星状細胞腫−上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫及び膠芽細胞腫を含む中枢神経系の新生物。
【００４３】
１５） ウィルムス腫瘍、神経芽種、横紋筋肉腫、網膜芽種、ユーイング肉腫及び抹消原始神経外胚葉腫瘍、小児の固形腫瘍、並びに睾丸腫瘍、卵巣腫瘍、縦隔腫瘍及び膣腫瘍のような悪性性腺胚細胞及び性腺外胚細胞腫瘍、並びに卵黄嚢腫瘍、胎生癌腫、精上皮腫、絨毛腫、奇形腫、奇形癌及び未分化胚細胞腫を含めた小児癌。
【００４４】
１６） （ｉ）小リンパ球性リンパ腫／Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）などの細胞性非ホジキンリンパ腫、（ｉｉ）エイズ（ＡＩＤＳ）関連リンパ種、（ｉｉｉ）未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）などのＴ細胞非ホジキンリンパ腫、（ｉｖ）ホジキン病、（ｖ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む白血病、並びに（ｖｉ）リンパ芽球性リンパ腫、非開裂型小細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫及び大細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫を含む白血病を含めたリンパ腫。
【００４５】
１７） 急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病、有毛細胞白血病、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び形質細胞腫を含めた白血病。
【００４６】
１８） カポジ肉腫及び非カポジ肉腫などのエイズ関連の悪性疾患。
最も好ましい態様では、本発明のポリクローナル抗血清の使用により、治療、改善、及び／又は予防されるべきがんは、子宮癌である。
【００４７】
さらに本発明は、がんを治療するための、本発明の医薬組成物（本明細書に規定の本発明のポリクローナル抗血清を含む）の使用に関するものであり、本発明による医薬組成物が、それを必要とする個体へ１回〜数回投与され、抗体タンパク質に連結した放射性同位体、又は化学療法剤により腫瘍細胞が破壊され、治療成績がモニターされる。前記の腫瘍治療方法は、インビボでもインビトロでも行うことができる。がんは本明細書に定義されたものである。抗体の長期適用中に免疫複合体によるアナフラキシー様ショックが誘発されることがあるため、患者にはコルチコイドなどの免疫抑制剤を併用することも想定される。
【００４８】
投与されるべき前記抗体分子又は医薬組成物若しくは製剤は、医薬的に許容される担体若しくは賦形剤を更に含んでいてもよい。「医薬的に許容される担体」とは、投与される患者に対して生理学的に許容性のある担体を意味する。医薬的に許容される担体の１例は、生理食塩水である。医薬的に許容される担体はまた、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、その他の安定剤、又は賦形剤を含む医薬的に許容される各種化合物を含んでいてもよい。他の医薬的に許容される担体及び担体製剤は周知であり、例えば一般に『レミントンの薬学』、１９９０年に記載されている。当該技術分野に熟練した者であれば、生理学的に許容性のある化合物を含む医薬的に許容される担体の選択は、例えば前記組成物の投与経路に依存することを知っているであろう。
【００４９】
本明細書において「投与する」とは、前記組成物を患者に与え、結果的に患者の体内に留まらせること意味する。そのような投与は、当業者に決定される適切ないかなる経路によっても可能である。本発明の医薬組成物は、専門家に周知のさまざまな投与経路、特に静注又は標的組織への直接注入によって適用することもできる。全身投与は、静注、脈管内、筋注、動脈内、腹腔内、経口、又は髄腔内の投与が好ましい。より局所の投与は、皮下、皮内、心内膜、葉内、髄質内、肺内、又は処置すべき組織（結合、骨、筋肉、神経、上皮組織）への直接若しくは近傍で行われてもよい。ポリクローナル抗血清を用いた治療は、治療計画の全体、又は例えば、がんに対する化学療法、更なる抗体を用いた療法若しくは標準的療法の他の形態などを含む一部であってもよい。
【００５０】
最も好ましくは、本発明の医薬組成物を静脈内に投与すべきである。
動物又はヒトの身体では、治療される腫瘍の種類又は原発部位に応じて静注又は他の経路、例えば、全身、目的の組織若しくは器官へ局部又は局所により前記抗体又は薬剤を適用することは有利なことが証明できる。例えば、びまん性であるか又は局在化しにくい腫瘍などでさまざまな器官又は器官組織が治療を必要とする場合、全身投与が望ましい。また、局所腫瘍などで新生物の増殖が局所に限られる場合、局所投与が検討されよう。したがって、本発明の医薬組成物は、がん細胞又はがん組織に近接する部位において静注又は他のいかなる適切な投与法によって適用することもできる。
【００５１】
投与経路のいかんに係わらず、本発明の医薬組成物は、後述するように又は当該技術分野に熟練した者に公知の他の従来法によって医薬的に許容される剤形として製剤化される。
【００５２】
本発明の医薬組成物における有効成分の実質投与量は変更可能であるため、特定の患者、組成物及び投与法において所望の治療的応答を起こすに十分な有効成分量が得られる。
選ばれた投与量は、使用時の本医薬組成物の活性、投与経路、投与時間、使用中の本医薬組成物の排泄速度、治療期間、本医薬組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療対象患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び既往歴、並びに医療分野で周知の要因を含む諸要因に依存するであろう。
【００５３】
本発明のある非限定的態様では、ポリクローナル抗血清は生理食塩水溶液などの緩衝液５０ｍＬに溶解した、１〜１０ｍｇ、好ましくは１．５〜５．５ｍｇ、より好ましくは２ｍｇの用量として投与される。したがって、ある投与プロトコールでは、製剤の抗体用量が１〜１０％、好ましくは２〜６％、より好ましくは４〜５％、特に好ましくは４％を含んでいてもよい。好ましくは、その溶液は、約１〜１００分、好ましくは１０〜６０分、より好ましくは約２０分かけて徐々に注入される。しかしなお、それより長い投与時間も短い投与時間も想定され、当該技術分野に熟練した者、例えば担当医師の技量の枠内にある。
【００５４】
前記用量を完全に投与し得ないようなアレルギー反応又は他の反応が生じれば、より低い用量を投与時又は以降の治療に使用することもでき、その結果、用量の期待範囲は、１回の治療あたり１〜２ｍｇとなろう。タンパク質に対するアレルギー反応のリスクを低減するため、経口又は静注ジフェンヒドラミン（２５〜５０ｍｇ）を用いた前投薬が一般に行われる。ポリクローナル抗血清の投与は、先立って行われるべき必要な手術の後に開始され、その治療期間が終了するまで続けることもできる。
【００５５】
本発明は、医薬組成物を調製するための、本明細書に記載され規定されたポリクローナル抗血清の使用も提供し、前記医薬組成物が更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて治療を必要とする被験者に投与される。
【００５６】
本発明のある態様では、使用された抗増殖薬又は薬剤は市販品である。非限定的な例として、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、ＨＣｌリポソーム注入（ＨＣｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、トポテカン、塩酸塩、ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド及びエトポシド、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。例示だけを目的にすると、抗増殖薬又は薬剤は、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗物質（それぞれ各種の葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、糖修飾類似体など）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（インターカレート剤など）、及び／又はＤＮＡ修復阻害剤であってもよい。
【００５７】
本発明で想定される化学療法剤は、作用機序に従って例えば以下のグループに分類することもできる：代謝拮抗物質／抗がん剤［各種のピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カペシタビン、ゲンシタビン及びシタラビン）及びプリン類似体、葉酸拮抗薬、並びに関連阻害剤（メルカプトトウリジン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）など）；抗増殖剤／有糸分裂阻害剤［ビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）、タキセン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、エポチロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）及びネーブルビンなどの微小管阻害剤、エピディポドフィロトキシン類（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン類、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、チトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド（ｉｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、メルクロエタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソレール、テニポシド、トリエチレンチオホスフォラミド及びエトポシド（ＶＰ１６））を含む］；抗生物質［ダクチノマイシン（アクチノマイシン Ｄ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン系、ミトキサントロン、ブレオマイシン系、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシンなど］；酵素［Ｌ−アスパラギナーゼ（身体のＬ−アスパラギンを代謝し、アスパラギンを合成する能力のない細胞で枯渇させる）］；抗血小板薬；抗増殖剤／有糸分裂阻害アルキル化剤［ナイトロジェンマスタード類（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン類及びメチルメラミン類（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソウレア類（カルマスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼンズ−ダカルバジニン（ｔｒａｚｅｎｅｓ−ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ：ＤＴＩＣ）など］：抗増殖剤／有糸分裂阻害代謝拮抗物質［葉酸類似体（メトトレキサート）など］；白金配位錯体［（シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド］；ホルモン及びホルモン類似体［エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、バイカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール］；抗凝血薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩類、その他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドクレル、アブシキマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）；遊走阻害剤；分泌抑制薬（ブレベルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び増殖阻害因子［血管内皮細胞因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤］；アンジオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド類；抗体［トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、リツキシマブ］；細胞周期阻害剤及び分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、及びプレドニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤；各種毒素（コレラ毒素、リシン、緑膿菌外毒素、百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素又はジフテリア毒素、及びカスパーゼ活性化因子など）；並びに各種クロマチン分裂阻害剤。前記化学療法剤の好ましい投与量は、現在処方される投与量と等しい。
【００５８】
最も好ましくは、抗増殖薬又は薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、パクリタキセル及びセタキセルから成る群より選択される。
他の好ましい態様では、前記の抗増殖薬又は薬剤をさらに、本発明の医薬組成物の投与前、投与中又は投与後に投与されるべきである。したがって、その抗増殖薬又は薬剤をポリクローナル抗血清の投与前後の１、２、３若しくは４週以内に投与することもできる。
【００５９】
一例として、ポリクローナル抗血清を化学療法の治療計画内で投与してもよい。その化学療法は、治療の担当医及び通常の臨床経験に従って３〜４週サイクルで行うことができる。化学療法は、２年以内で１２週ごとに１回のポリクローナル抗血清投与した後、６サイクル以内で継続することができる。
【００６０】
化学療法と抗体投与による併用療法、例えば、ある化学療法剤の投与後（例えば５日以内）に、本発明（若しくは本明細書の一部）のポリクローナル抗血清を用量２ｍｇ以内で、１、３、５、９週間、次いで８週ごとに２０分かけて静注する治療計画も想定される。担当医は常に、本発明のポリクローナル抗体／ポリクローナル抗血清の使用により治療すべき患者個人の（医療的）ニーズに応じて対応する治療計画を推定する立場にある。
【００６１】
本発明を、以下の実施例に従って例示する。
【実施例１】
【００６２】
胚性細胞の取得
近交系ＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）のメス５匹及びオス２匹（６〜８週齢）を２０×３０ｃｍのケージに入れて１２時間（午後から開始）交配させた。次いで、膣栓検出により妊娠を確認し、妊娠しているメスを分別した。この日を妊娠１日目とみなした。
【００６３】
妊娠１２日目に妊娠マウスを頚椎脱臼により殺した。死の直後に、そのマウスを解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。
【００６４】
子宮を摘出し、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）が入ったペトリ皿に移した。ピンセットとハサミを用いて胎児を胎嚢から剥がし、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で２回洗った。卵黄嚢を切除した。検出された１２の膣栓のうち７つが妊娠していた。
【００６５】
ウェルセン溶液（ＰＢＳ １０００ｍｌ［ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１］中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で洗浄した胎児は、細胞を放出するため、組織グラインダーで機械的にホモジナイズした。
【００６６】
ホモジナイズされた胎児を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）を用いて妊娠マウス２匹あたり１ｍｌで洗浄した。得られた材料を１分間静置した。遊離した細胞を滅菌シリンジ（２５Ｇ ５／８針）で吸引し、組織塊を除去した。
【００６７】
単離した細胞は、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で少なくとも１００倍希釈してノイバウアー（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）改良型血球計算板を用いて計数した。
【実施例２】
【００６８】
胚特異的脾臓細胞に富む画分の取得
本明細書中における胚性細胞を４℃にて２０分間３７０×ｇで遠心した。上清を捨て、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。近交系ＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）の童貞のオス（６〜８週齢）に対して、フロイントアジュバントと細胞を混合する前記工程により得られたエマルジョン０．１ｍｌの皮下注射によって免疫した。反応性の血清を得るためには、約７０匹のオスマウスが必要であった。
【００６９】
接種して５日後に、頚椎脱臼により殺して脾臓を摘出した。
前記工程により得られた免疫マウスからの脾臓を１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）含有のペトリ皿に集め、ハサミで細片に刻んだ。次いで、単一細胞の懸濁液が得られるまで細片をポッター・エレージェン（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｅｈｊｅｎ）組織グラインダーを用いて磨りつぶした。シリンジを用いて１９Ｇ針に繰り返し通過させて細胞塊を分散させた。得られた脾臓細胞懸濁液は、２００μｍのナイロンメッシュで濾過し、１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移し、４℃にて２００×ｇで１０分間遠心した。上清は捨てた。夾雑赤血球を溶解するために、細胞ペレットに処理脾臓１個当たり塩化アンモニウム溶液（ＮＨ４Ｃｌ ０．１５Ｍ、ＫＨＣＯ３ １ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１）５ｍｌを添加し、静かに混合し、室温にて５分間インキュベーションした。インキュベーション後、得られた混合物を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心した。上清は捨てた。残った脾臓を１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄し、２０ｍｌの１９９培地に懸濁した。
【実施例３】
【００７０】
抗血清の調製
本明細書中における脾臓細胞を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨て細胞を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。生きたオスマウスに対して、前記で得られたエマルジョン０．１ｍｌの腹腔内注射によって免疫した。血清１０ｍｌを得るためにオスのマウス約５０匹へ接種した。
【００７１】
接種の４日後、それらのマウスを頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。肋骨を切断し、胸腔を開いた。肺を切除せずに入念に除けて、心臓を摘出した。胸腔から血液を集め、凝固するまで４℃にて冷蔵した。次いで、その血液を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、得られた血清を一緒にプールした。その後、５６℃での加温インキュベーションを１５〜２０分間行った。
【００７２】
正常マウスから切除した新鮮な器官の細胞とインキュベーションすることによって、望ましくない正常組織との交叉反応を回避した。そのために６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）を頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。心臓、肝臓及び腎臓細胞を切除して、それらの器官をペトリ皿に乗せ１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄した。血液を抜くために心臓を鉗子で圧し、脂肪を器官から分離した。
【００７３】
続いて、それらの器官をハサミで細片に刻み、パスツールピペットを用いて１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移した。次いで、細片を４℃にて３７０×ｇで１０分間遠心し、１９９９培地で２回洗浄した。上清は捨て、細胞を前述で得られた血液と室温にて２９〜２５分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を４℃にて３７０×ｇで２９０分間遠心し、粗い固形物を除去した。こうして得られた上清を４℃にて３５００×ｇで１０分間、最後の遠心分離にかけ、−７０℃にて保存した。
【００７４】
抗血清の更なる調製プロトコールは以下の工程を含む。
本実施例における脾臓細胞を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨て、細胞を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。童貞のオスマウスに対して、本明細書中におけるエマルジョン０．１ｍｌを腹腔内注射することによって免疫した。血清１０ｍｌを得るためにオスのマウス約５０匹へ接種した。最初に免疫から４日後、本明細書中において新たに取得した細胞によりマウスの免疫応答を増強させた。オスマウスに対して、本明細書中におけるエマルジョン０．１ｍｌの腹腔内注射により免疫応答を増強させた。
【００７５】
最後の接種から４日後、それらのマウスを頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。肋骨を切断し、胸腔を開いた。肺を傷付けないよう除けて、入念に心臓を摘出した。胸腔から血液を集め、凝固するまで４℃にて冷蔵した。次いで、その血液を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、得られた血清を一緒にプールした。その後、５６℃での加温インキュベーションを１５〜２０分間行った。
【００７６】
正常マウスから切除した新鮮な器官の細胞とインキュベーションすることにより、望ましくない正常組織との交叉反応を回避した。このために６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）を頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。心臓、肝臓及び腎臓細胞を切除して得られた器官をペトリ皿に乗せ１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄した。血液を採取するために心臓を鉗子で圧し、脂肪を器官から分離した。
【００７７】
続いて、それらの器官をハサミで細片に刻み、パスツールピペットを用いて１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移した。次いで、細片を４℃にて３７０×ｇで１０分間遠心し、１９９９培地で２回洗浄した。上清は捨て、細胞を前述で得られた血液と室温にて２９〜２５分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を４℃にて３７０×ｇで２９０分間遠心し、粗い固形物を除去した。こうして得られた上清を４℃にて３５００×ｇで１０分間、最後の遠心分離にかけ、−７０℃にて保存した。
【実施例４】
【００７８】
ポリクローナル抗体のアフィニティー精製
本明細書中に記載したポリクローナル抗血清から出発して、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス、米国）を用い、製造業者の指示書に従ってプロテインＧ・アフィニティークロマトグラフィによるＩｇＧの精製を行った。ポリクローナル抗血清２ｍＬを、結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６ｍｌまで希釈し、１２，０００ｇで５分間遠心した。得られた上清を、結合緩衝液で平衡化したカラムに流速１ｍＬ／分でかけた。このカラムをＡｂｓ２８０ｎｍ＜０．０１となるまで結合緩衝液２０ｍＬで洗浄した。吸着したＩｇＧを、溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離した。酸に不安定な各種ＩｇＧの活性を保つため、５００μｌ画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）５０μｌを含む試験管に集めた。２８０ｎｍでのＵＶモニターに従ってＩｇＧを溶離した。一般に、ＩｇＧは最初の３ｍＬ以内で溶離した。吸光度２８０ｎｍ＞０．２を示す画分をプールし、ＰＢＳ（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１）に対して透析し、−２０oＣにて保存した。
【００７９】
本明細書中に記載した工程により得られたさまざまな精製ＩｇＧは、アガロース固定化ペプシン（ＩｎｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２調製キット、カタログ番号４４８８８、Ｐｉｅｒｃｅ社、米国）を用い、製造業者の推奨方法に若干の修正を加えてペプシンにより消化した。特に、ＩｇＧ溶液及びアガロース固定化ペプシンは、酢酸（２０ｍＭ、ｐＨ２．８）で平衡化し混合した。消化は、３７℃にて静かに撹拌しながら行った。インキュベーションの２時間後、Ｆ（ａｂ’）２断片を含む上清を分離し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を加えて、ｐＨを中性近くに高めた。Ｆ（ａｂ’）２含有画分をＰＢＳで透析し、−２０℃にて保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で示されたように約９０％のＩｇＧがＦ（ａｂ’）２に転換された。
【実施例５】
【００８０】
アフィニティー精製したポリクローナル抗体の品質試験及びタンパク質濃度の定量
ＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２調製物の品質は、Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０に従ってドデシル硫酸ナトリウム存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べた。タンパク質濃度は、ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（カタログ番号２３２２７、Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を用いたスミス、１９８５の方法に従ってビシンコニン酸により測定した。
【実施例６】
【００８１】
腫瘍特異的免疫染色
腫瘍を特異的に認識するために、ホルマリン固定パラフィン包埋した組織を免疫染色した。チェッカーボード・マルチノーマル・ブロック・スライド（カタログ番号Ｔ１０６５）及びチェッカーボード・マルチチューモア・ブロック・スライド（カタログ番号Ｔ１０６４）は、米国ダコ社から購入した。
【００８２】
組織切片を脱パラフィン化して水に戻し、沸騰水浴中でＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ、米国、カタログ番号Ｓ１６９９）を用いた抗原回収手順に２０分間かけた。組織切片は、徐々に冷却した後、室温にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ［ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１］）の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ、米国、カタログ番号Ａ７０３０）溶液と３０分間インキュベーションすることによって特異的結合を阻害した。洗浄した後、各組織切片に対して、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡを含有するポリクローナルＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２断片）の４０μｇ／ｍＬ溶液（約５０μＬ）を添加し、４℃の加湿チャンバー中で一晩インキュベーションし洗浄した。固有ペルオキシダーゼ活性は、製造業者のガイドラインに従って既製のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ダコ、米国、カタログ番号Ｓ２００１）と一緒にインキュベーションすることによって阻害した。徹底的に洗浄した後、製造業者の指示書に従ってＨＲＰ−ＬＳＡＢ ２ｓｙｓｔｅｍ（ダコ、米国、カタログ番号Ｋ０６７５）及びＬｉｑｕｉｄ ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ダコ、米国、カタログ番号Ｋ３４６５）を用いることによって、腫瘍特異的反応を検出した。顕微鏡分析に先立って、ヘマトキシリン−エオシンによる対比染色を実施した。
【実施例７】
【００８３】
細胞増殖試験におけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞に対する効果
ＨｅＬａ細胞に対するポリクローナル抗血清の細胞傷害効果を測定するために、テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）を用いた比色分析法［ミトコンドリア活性用の基質として着色ホルマザンに還元される（Ｒｏｄｅ、２００４）］を使用した。
【００８４】
ＨｅＬａ細胞［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２］は、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：Ｂｉｏ Ｗｈｉｔａｋｅｒ）及び４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（シグマ、米国）を添加したＬ−グルタミン（２ｍＭ）含有の最小必須培地（ＭＥＭ：シグマ）中で日常的に保存された。培養物を含む２５ｃｍ２又は７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ、米国）を、加湿５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にてインキュベーションした。必要に応じて、ＨｅＬａ細胞を標準的なトリプシン処理法により継代培養した（Ｍｏｒｇａｎ及びＤａｒｌｉｎｇ、１９９３）。培地を吸引濾過により除去し、細胞をＦＣＳ非含有培地で洗浄し、３７℃にてトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中における１％トリプシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、シグマ）３ｍＬで５分間インキュベーションした。剥がれた細胞は、完全培地（元の培養物２５ｃｍ２当たり５ｍＬ）で洗浄し、１×１０５細胞／ｍＬの濃度で完全培地に再懸濁した。トリパンブルー色素排除法（２）により測定し、細胞生存率が９５％を上回る細胞だけを試験に使用した。
【００８５】
細胞増殖試験は、９６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，ドイツ）中で行った。表１で概説したように、ＨｅＬａ細胞懸濁液（１×１０５細胞／ｍＬ）を多チャンネルピペットを用いたプレートの各ウェルに入れた。細胞を付着させるために、マイクロプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて２４時間インキュベーションした。吸引濾過により培地を除去し、細胞をＦＣＳ非含有のＭＥＭ培地で２回洗浄した。ポリクローナル抗血清は、濾過滅菌し、選択された培地（１ウェルにつき１００μＬ）で適切に希釈してから、表１に記載したように多チャンネルピペットを用いてＨｅＬａ細胞含有のマイクロプレート（少なくとも４枚のレプリカ）に加えた。マイクロプレートは、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて２４、４８又は７２時間インキュベーションした後、ＭＴＳ／ＰＭＳ検出試薬を添加した。
【００８６】
ポリクローナル抗血清の複数ロット（Ｒ０２／０２、Ｒ０８／０２及びＲ０９／０２）を細胞増殖試験用に選択した。血清は、１％ＦＣＳ含有若しくは０．１％ＦＣＳ含有のＭＥＭ培地又はＦＣＳ非含有の培地（０％ＦＣＳ）で１／２０に希釈し、０．２２μｍの膜濾過により滅菌した。希釈物はその都度、調製した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
ＨｅＬａ細胞培養物に対するポリクローナル抗血清添加の効果を測定するために、プロメガＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ 非放射アッセイ（プロメガ、米国、カタログ番号Ｇ５４２１；Ｂａｒｌｔｒｏｐ、１９９１；Ｃｏｒｙ、１９９１）を用いた。溶液は製造業者の指示書に従って調製した。ストックＭＴＳ（プロメガ、米国）及びＰＭＳ（ＩＣＮ、米国）を、ＤＰＢＳ（シグマ）にそれぞれ２．０ｍｇ／ｍＬ及び０．９２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。溶液は、０．２２μｍの滅菌膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ、カタログ番号１６５３４）に通して濾過し、遮光チューブ中で−２０℃にて保存した。ＭＴＳとＰＭＳ検出試薬は、滅菌条件下にて２０：１の割合（ＭＴＳ：ＰＭＳ）で使用直前に混合し、細胞培養物に１：５の割合（試薬２０μＬ／各培地１００μＬ）で添加した。ＭＴＳ／ＰＭＳの添加後、マイクロプレートを、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて４時間インキュベーションした。発色は、インキュベーションの間、コンピュータ連結Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＳマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１時間毎に４９２ｎｍでモニターした。
【００８９】
得られた結果は、完全ＭＥＭ培地中で増殖する細胞に比較してポリクローナル抗血清による処理細胞の代謝活性が減少していることを示していた（図１６を参照されたい）。この効果は、ＡＰＵ血清で処理した場合の細胞数又は代謝活性の低下によるか又は両効果によって説明可能であった。しかし顕微鏡観察した場合、ポリクローナル抗血清による処理細胞は、明確なストレス傾向を示した。ポリクローナル抗血清にさらしたＨｅＬａ細胞培養物では、明らかな細胞質の空洞化（図１７ｄ）及び膜の変化（図１７ｂ）が認められた。
【実施例８】
【００９０】
Ｈ３−チミジン細胞増殖アッセイにおけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞培養物に対する効果
ＨｅＬａ細胞に対するポリクローナル抗血清の細胞傷害効果を測定するために、ＤＮＡ合成中のＨ３−チミジン取り込みに基づく方法を用いた。１０％ウシ胎仔血清を添加したＬ−グルタミン（２ｍＭ）含有の最小必須培地（イーグル）及び調節イーグルＢＳＳ［２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｇ／ｌ）含有］中でＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）を増殖させ、３７℃の５％ＣＯ２中において単層の付着細胞を得た。トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により細胞を剥がした。細胞濃度を３２００細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁し、９６ウェルプレートへ分散させ（２００μｌ／ウェル）、３７℃にて５％ＣＯ２中で５日間インキュベーションした。
【００９１】
５日目に培地を捨て、ウシ胎仔血清非含有の培地（２００μｌ／ウェル、４組）中にポリクローナル抗血清（ロットＣ０９０２）から得たプロテインＧ精製免疫グロブリンの異なる希釈液（６０、３０、１５、７．５、３．２５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて５％ＣＯ２中で２４時間インキュベーションした。
【００９２】
次いで細胞を収穫し、９６ウェルウェルプレートβ線計測器を用いてＨ３−チミジン取り込み量を計測した。各４組に対する平均ｃ．ｐ．ｍ．±標準偏差（ＳＤ）値を計算した。
【００９３】
得られた結果は、ポリクローナル抗血清からの精製免疫グロブリン処理細胞の場合、対照に比べてＨ３−チミジン取り込み量の減少を示した。この効果は用量依存的であった（１８図を参照されたい）。
【実施例９】
【００９４】
汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清による線維芽細胞の増殖阻害
４ｍＭＬ−グルタミン添加のイスコベ型（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）修飾ダルベッコ培地［１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（９０％）及びウシ胎仔血清（１０％）を含むように調節］中で線維芽細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＤ−９８６Ｓｋ）を増殖させ、３７℃の５％ＣＯ２中において単層の付着細胞を得た。
【００９５】
次いで、トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により細胞を剥がした。細胞を３２００細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁し、９６ウェルプレートへ分散させ（２００μｌ／ウェル）、３７℃にて５％ＣＯ２中で５日間インキュベーションした。５日目に培地を捨て、ウシ胎仔血清非含有の培地（２００μｌ／ウェル、４組）中にポリクローナル抗血清（ロットＣ０９０２）からのプロテインＧ精製免疫グロブリンの異なる希釈液（６０、３０、１５、７．５、３．２５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて５％ＣＯ２中で２４時間インキュベーションした。通常の血清（ロットＣ０４０２）から得られたプロテインＧ精製免疫グロブリンを対照として用いた。次いで、上清を捨て、完全培地（２００μｌ／ウェル）を加え、細胞は１６時間３７℃にて５％ＣＯ２中でＨ３−チミジン（１μＣｉ／ウェル）により放射線を当てた。
【００９６】
最後に細胞を収穫し、９６ウェルプレートβ線計測器を用いてＨ３−チミジン取り込み量を計測した。各４組に対する平均ｃ．ｐ．ｍ．±標準偏差（ＳＤ）値を計算した。
得られた結果によれば、対照に比べて、ポリクローナル抗血清から得られた精製免疫グロブリン処理細胞の場合、Ｈ３−チミジン取り込み量に差はなかった（図１９を参照されたい）。
【実施例１０】
【００９７】
ヒト線維芽細胞の免疫化学染色
反応性又は対照血清を混合したヒト線維芽細胞の免疫化学染色（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＤ−９８６Ｓｋ）を図２０に示す。固定された細胞を、抗イディオタイプ血清とインキュベーションしてダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させ、核をマイヤーヘマトキシリンにより染色する（図２０Ａを参照されたい）か、又は対照血清とインキュベーションしてダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させ核をマイヤーヘマトキシリンにより染色した（図２０Ｂを参照されたい）。抗イディオタイプ血清又は対照血清と細胞をインキュベーションしたいずれの場合でも、細胞膜の特異的染色は観察されなかった。どちらの状況でもポリクローナル抗血清を用いた研究に際して予期されたように、核に対するバックグラウンド染色が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の結腸腺癌である。倍率：４０倍。
【図２】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の結腸腺癌である。倍率：４０倍。
【図３】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図４】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図５】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図６】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の乳癌である。倍率：４０倍。
【図７】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の乳癌である。倍率：４０倍。
【図８】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の前立腺癌である。倍率：４０倍。
【図９】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の前立腺癌である。倍率：４０倍。
【図１０】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の肺腺癌である。倍率：４０倍。
【図１１】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の小腸正常組織である。倍率：４０倍。
【図１２】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の胃正常組織である。倍率：４０倍。
【図１３】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の前立腺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１４】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の前立腺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１５】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の肺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１６】ポリクローナル抗血清（ロット０９／０２及び０８／０２）のＨｅＬａ細胞に対するインビトロ効果の図である。ＨｅＬａ細胞を播種し、培地で２０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２及び０８／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた平均吸光度を示す。２４時間後、プレートにＭＴＳ／ＰＭＳ試薬を添加し、４時間インキュベーションした後に吸光度を記録した。
【図１７】ＭＥＭ／１％ＦＣＳ中で増殖させたＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。図１７Ａは、細胞をＭＥＭ／１％ＦＣＳ中で増殖させた（１０倍）。図１７Ｂは、細胞をＡＰＵ血清ロットＲ０９／０２（ＭＥＭ／１％ＦＣＳで２０倍希釈）に２４時間曝露させた（１０倍）。図１７Ｃは、ＭＥＭ／１％ＦＣＳ中のＨｅＬａ細胞の詳細である（４０倍）。図１７Ｄは、Ｒ０９／０２を用いたＭＥＭ／１％ＦＣＳ中のＨｅＬａ細胞である（４０倍）。
【図１８】Ｈ３−チミジン取り込み試験におけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞に対するインビトロ効果の図である。ＨｅＬａ細胞を播種し、培地で４０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた取り込み値を示す。２４時間後、プレートに完全ＭＥＭ及びＨ３−チミジンを添加し、１６時間インキュベーションした後にＨ３−チミジンの取り込みを記録した。
【図１９】汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清による線維芽細胞の増殖阻害の図である。線維芽細胞を播種し、培地で４０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた取り込み値を示す。対照として正常血清（ロットＣ０４０２）を使用した。２４時間後、プレートに完全ＭＥＭ及びＨ３−チミジンを添加し、１６時間インキュベーションした後にＨ３−チミジンの取り込みを記録した。
【図２０】図２０Ａ：反応性血清を用いたヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６−Ｓｋ、ＡＴＣＣ）の免疫組織化学的染色を示す。固定した細胞を抗イディオタイプ血清とともにインキュベーションした。ダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させた。マイヤーのヘマトキシリンで核を染色した。図２０Ｂ：対照血清を用いたヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６−Ｓｋ、ＡＴＣＣ）の免疫組織化学的染色を示す。固定した細胞を対照血清とともにインキュベーションした。ダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させた。マイヤーのヘマトキシリンで核を染色した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、ことによって入手可能な、汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清に関する。更に本発明は、がん、特に、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸癌、胃癌、若しくは膀胱癌の改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造するための、ポリクローナル抗血清の使用を提供する。更に本発明は、治療を必要とする被験者に、更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて投与されるべき医薬組成物を製造するための、本発明のポリクローナル抗血清の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ合衆国では２００３年にがんの新規症例が約１００万人診断され、その疾患により約５０万人が死亡している。このようにがんは、合衆国及び世界中で第２の主要死因である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００３；Ｓｔｅｒｎ、２００４）。化学療法、外科手術、又は放射線療法のような従来のがん治療法は、それら治療法がしばしば非特異的及び不正確であるため、有効性がほとんど限定されている（Ｋｉｍｂａｌｌ、１９９３）。しかしながら、多くの症例では、腫瘍は遺伝子を特異的に発現しており、その産物は悪性状態を誘発又は維持するために必要である。これらのタンパク質は、有効な抗がん療法を開発及び確立するための抗原マーカーとして役立つことができる。抗原は免疫応答を誘導することが知られている。これらの抗原はタンパク質、多糖、脂質、又は糖脂質であり、リンパ球、即ちＢ細胞及びＴ細胞により「異物」として認識される。上記抗原へリンパ球が曝露されることによって急速な細胞の分裂及び分化が誘導され、曝露されたリンパ球クローンを形成する。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、次いで形質細胞は抗原と選択的に結合する抗体を産生する。モノクローナル抗体はＢリンパ球の単一クローンの産物であるが、ポリクローナル抗体はＢリンパ球の数種のクローンにより産生される。
【０００３】
ポリクローナル抗体は、ウサギをマウスの内皮細胞でワクチン接種することによって、マウスにおいてアポトーシスを誘発し、腫瘍増殖支持をブロックするために首尾よく使用されてきた。このアプローチから、強力な抗血管新生活性を有するポリクローナル免疫グロブリンが産生された。ポリクローナル抗体は、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示し、インビボ腫瘍放射性イメージングにおいて有用性を実証した（Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉ、２００３）。Ｏｋａｊｉらも、結腸癌の血管新生及び転移に対する自己免疫による阻害効果について報告している（２００４）。この研究では、Ｃｏｌｏｎ−２６がんの肝類洞内皮細胞を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスが免疫され、転移の発生を著しく阻害する予防的及び治療的抗腫瘍免疫を誘導した。免疫グロブリン応答は、抗体のサブクラスＩｇＭ及びＩｇＧが関与していた。さらに、特許出願ＷＯ０１／８９５６３号は、アレルギーを治療するための精製ポリクローナル抗体の使用を想定し、記載している。特に、複合タンパク質であることが多いアレルゲンの場合、ポリクローナル抗体による治療が明らかに有益であり、モノクローナル抗体の使用より好ましいことが開示されている。
【０００４】
Ａｂｅｌｅｖによれば、抗原は以下の４群に区別することができる：（ｉ）同種のウイルス性腫瘍に対して同一のウイルス性腫瘍抗原；（ｉｉ）患者及び腫瘍に対して特異的な発がん性腫瘍抗原；（ｉｉｉ）個々の種の腫瘍全てでは異なるが、同一ウイルスを原因とするさまざまな腫瘍では同じである移植型同種抗原又は腫瘍特異的移植抗原；並びに（ｉｖ）胚性抗原。発がんの過程で細胞は脱分化するため、胚性状態の遺伝子発現を獲得し得る。したがって、生物の胚発生に特異的な胚性抗原が、これらのがん細胞中に見出される。そのような抗原は、腫瘍に対して生物を免疫し、抗がん治療を確立するために使用することができる。最も有望な胚性抗原は、α−フェトプロテイン及びがん胎児抗原（ＣＥＡ）である。α−フェトプロテインは、胎児における主要な輸送タンパク質であり、特に臨床検査室におけるがん及び胎児の欠陥の血清マーカーとして（Ｔａｔａｒｉｎｏｖ、１９６５；Ａｂｅｌｅｖ、１９７１；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ、２００３）、並びに頸頭部癌に対する特異的免疫療法のための標的として（Ｋａｓｓ、２００２）役立つ。ＣＥＡは糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）との類似性を有する。ＣＥＡは最初、胎児結腸及び結腸腺癌に存在する抗原として同定されたが、健常な成人結腸には存在しなかった。ＣＥＡは、膵臓癌、胃癌、及び乳癌に対して最も繁用されているマーカーの１つであり、結腸直腸癌のマーカーとして最も頻繁に使用されている。ＣＥＡは、例えば特異的抗体組成物に対する治療標的としても役立つ。
【０００５】
前記特徴を有する胚性抗原は、がんの検出及びモニタリングに極めて重要になってきたが、腫瘍細胞上の胚性抗原の存在に関する情報及び理解は依然として著しく不足している。ＷＯ９９／５３９５２号は、胚性組織に特異的に由来する汎用腫瘍抗原に対する特異的抗血清の産生方法を提供する。対応する抗血清が、（悪性）腫瘍を検出するための診断ツールとして提唱された。
【０００６】
先行技術には、特異的がん関連エピトープに対するモノクローナル抗体のいくつかが記載されている。例としては、特に、乳癌の治療に使用されるＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２に対するモノクローナル抗体である。抗ヒト乳癌抗体として使用されるモノクローナル抗体は、特に、ＥＰ−Ａ２ ０ １５３ １１４号又はＷＯ８９／０６６９２号に記載されている。しかしながら、ある種の欠点に関連して、モノクローナル抗体の使用は最適ではないとも記載されている。これは、モノクローナル抗体が非常に特異的な単一抗原エピトープに対するものであるという事実による。したがって、標的が複雑な性質を有し、分子レベルで未解明であるか、又は１つの標的だけでなく１群の異なる標的が関与している場合は、モノクローナル抗体は標的を非常に低い親和性で認識するか又は全く認識せず、そのため次善の策としてしか使用されないであろう。したがって、単一のモノクローナル抗体が、がん細胞上の少数ではないおそらく関連のあるエピトープ全体をカバーするとは考えられない。このことは例えば、明確なシグナルを得るために、２種類以上のモノクローナル抗体を使用する必要がある免疫学的試験によっても例示されている。
【０００７】
したがって、当該技術分野において、増殖性疾患、特にがんの効果的な改善、予防、及び／又は治療を提供する治療の手段並びに方法に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ａｂｅｌｅｖ、１９７１、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：２９５−３５７．
【非特許文献２】米国癌協会、２００３、『がんの正確な情報』．
【非特許文献３】Ａｒｎｏｎら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、１：４２９−４４９．
【非特許文献４】Ｂａｒｌｔｒｏｐら、１９９１、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１：６１１．
【非特許文献５】Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９（４７０８）：８１−３．
【非特許文献６】Ｃｏｒｙら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍ．３：２０７−１２．
【非特許文献７】Ｃｕｍｂｅｒら、１９８５、Ｍｅｔｈ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１２：２０７−２２５．
【非特許文献８】Ｄａｖｏｌら、２００４、Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．３（２）：１１２−２１．
【非特許文献９】Ｅｃｋｅｌｍａｎら、１９８０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：３０３６−４２．
【非特許文献１０】Ｆａｎｇｅｒら、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１１）：３７５−８０．
【非特許文献１１】Ｆｌｅｃｈｎｅｒ、１９７３、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、９：７４１−７４５．
【非特許文献１２】Ｇｈｏｓｅら、１９７２、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、３：４９５−４９９．
【非特許文献１３】Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１４（１）：５−７．
【非特許文献１４】Ｈａｍａｎｎら、２００２、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、３：４０．
【非特許文献１５】Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８、『抗体：実験室マニュアル』、コールドスプリングハーバー研究所出版
【非特許文献１６】Ｈａｒｒｉｓ、２００４、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．５（５）：２９２−３０２．
【非特許文献１７】Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９７５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５：１１７５−１１８１．
【非特許文献１８】Ｋａｓｓら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（１７）：５０４９−５０５７．
【非特許文献１９】Ｋｉｍｂａｌｌ、１９９３、『生物学』、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ．Ｂｒｏｗｎ編．
【非特許文献２０】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．７（２）：２３３−４２．
【非特許文献２１】Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７（５２５９）：６８０−５．
【非特許文献２２】Ｌｉｕ Ｙｕａｎｆａｎｇら、１９９１、『ＩＵＰＡＣレポート』、４２７−４６２．
【非特許文献２３】Ｍｏｒｇａｎ及びＤａｒｌｉｎｇ、１９９３、『動物細胞培養』、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社編．
【非特許文献２４】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉら、２００３、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２：１２４３−１２５５．
【非特許文献２５】Ｏｋａｊｉら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５：８５−９０．
【非特許文献２６】Ｏｓａｗａら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ、１：３７３−３８８．
【非特許文献２７】『レミントンの薬学』１９９０、第１８版増補版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ著、Ｍａｃｋ出版社、ペンシルバニア州イーストン．
【非特許文献２８】Ｒｏｄｅら、２００４、『アポトーシス、細胞死、及び細胞増殖マニュアル』、第３版、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ．
【非特許文献２９】Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉら、２００３、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：２６６７−７７．
【非特許文献３０】Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０（１）：７６−８５．
【非特許文献３１】Ｓｔａｎ、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１１５−１２１．
【非特許文献３２】Ｓｔｅｒｎ、２００４、『がんと向き合う』、ＭａｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ編．
【非特許文献３３】Ｓｚｅｋｅｒｋｅら、１９７２、Ｎｅｏｐｌａｓｍ、１９：２１１−２１５．
【非特許文献３４】Ｔａｔａｒｉｎｏｖ、１９６５、Ｖｏｐ．Ｋｈｉｍ．ＳＳＲ、１１：２０−２４．
【非特許文献３５】Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、『モノクローナル抗体−毒素結合体：特効薬に向けて』、１６８．
【非特許文献３６】Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１：３９１−６．
【非特許文献３７】Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６５７．
【非特許文献３８】Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８、『モノクローナル抗体療法』、第４５巻、Ｋａｒｇｅｒ編．
【発明の開示】
【０００８】
したがって、本発明の基礎にある技術的課題は、上記必要性を満たすこと、及び多数のさまざまな種類のがんの治療を提供すること、又は両者を同時に満たすことである。
したがって、本発明は、以下の工程：
（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同一遺伝系を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、ことによって得られるポリクローナル抗血清を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において「ポリクローナル抗血清」という用語は、ポリクローナル抗体又は多重特異的抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、抗イディオタイプ抗体、及び上記のエピトープ結合断片に関するものである。ポリクローナル又は多重特異的抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、抗イディオタイプ抗体、及びエピトープ結合断片は、本明細書に概説した工程（ｉｖ）で単離されるように得られた血清中に含まれるか、又は当該技術分野において公知の対応する方法、特にＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、『抗体』（１９８８）に記載の方法を用いて更に精製することができる。本明細書において「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、即ち免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を表す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であってもよい。
【００１０】
「非ヒト脊椎動物においてインビボ液性応答を誘導する」という語句は、非ヒト脊椎動物における免疫応答の発現、特に非ヒト脊椎動物の胚性組織又はその精製画分に対する抗体反応の発現に関するものである。抗体反応は、胚性組織を用いた抗原刺激に対する１次及び２次抗体反応を含む。したがって、「インビボ液性応答を誘導する」という語句は、胚性組織に含まれる複数の抗原に対する抗体の産生に関与する免疫反応の発現に関するものである。本明細書の実施例で説明するように、非ヒト、好ましくは非ヒト脊椎動物の胚性組織は、特にホモジナイズされたマウス胎仔、例えば１２日齢の胎仔から得られる組織又は細胞であってもよい。したがって、本明細書で使用した（工程（ｉ））「非ヒト胚性組織」という用語は、最も好ましい態様では、ホモジナイズされた胎仔（又は胚性組織）から得られる単離細胞を含む。最も好ましくは、使用すべき「胚性組織細胞」は、いかなる組織塊を含まない。対応の更なる詳細は、本明細書の非限定的実施例、特に実施例１から得ることができる。本明細書で説明するように、本発明の好ましい態様では、「胚性組織」／「胚性組織細胞」は、マウス、最も好ましくはＣＢＡ／ＣａＪマウスに由来する。対応の免疫用胚性細胞は、好ましくは１０〜１４日齢のマウス胎仔であり、最も好ましくは１２日齢のマウス胎仔である。
【００１１】
「遺伝系」という用語は、本発明によれば、非ヒト脊椎動物において免疫応答を誘導するために使用すべき胚性組織／胚性細胞は少なくとも同一種であるという事実に関する。したがって、マウス由来胚性組織を使用する場合、工程（ｉ）の対応の免疫応答は、マウスにおいて誘導されるべきである。最も好ましくは、「同一遺伝系」という用語は、対応の免疫応答が誘導される動物と同種であるか、又は遺伝的に同一背景を有する動物が胚性組織の供給源として使用されるという事実に対応する。例えば実施例で説明するように、非ヒト胚性組織の供給源としてＣＢＡ／ＣａＪマウスを使用し、単離胚性組織で免疫するために同一系統（ＣＢＡ／ＣａＪ）のマウスを使用することが想定され、例示される。
【００１２】
医薬組成物の好ましい態様では、免疫されるべき非ヒト動物はマウスであり、最も好ましい態様ではマウスはＣＢＡ系マウスである。ＣＢＡ系マウスは当該技術分野で公知であり、例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国から入手可能である。ＣＢＡ系は、特にＣＢＡ／Ｈ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＪ、及びＣＢＡ／Ｎマウスを含む。実施例で示すように、ＣＢＡ／ＣａＪマウス、特にＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからストック番号０００６５４で入手可能なマウスが最も好ましい。しかしながら、本明細書に記載の「非ヒト脊椎動物」は、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、及びロバから成る群より選択してもよい。しかし、脊椎動物はマウスであることが最も好ましい。
【００１３】
本発明の更に好ましい態様は、ポリクローナル抗血清が精製ポリクローナル抗血清である医薬組成物又は使用に関するものである。
「精製ポリクローナル抗血清」という用語は、当該技術分野において公知の標準的方法を用いて精製された単離ポリクローナル抗体又はその断片に関する。しかしながら、前記用語は、「免疫」精製された抗体調製物にも関するものであり、本明細書に記載の方法の工程（ｉｖ）で得られるポリクローナル抗血清は、非胚性（すなわち産後）器官、器官溶解物、又は非胚性器官若しくは器官溶解物由来の細胞と接触させられる。好ましくは、前記の非胚性（すなわち産後）器官、器官溶解物、又は非胚性器官若しくは器官溶解物由来の細胞は、インビボ腫瘍応答が誘導されるか又は誘導された動物と同種の非ヒト動物に由来するものである。そのような精製は、当該技術分野に熟練した者に公知の望ましくない交差反応性を回避するために好適な混合、吸着、又はインキュベーション方法によって行うことができる。好ましくは、精製方法は、実施例３に記載の方法に従って行われる。
【００１４】
具体的には、「精製ポリクローナル抗血清」という用語は、単離ポリクローナル抗体又はその断片に関するものであり、均一になるまで、特に、純度が少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のレベルまで精製されている。ポリクローナル抗血清の純度は、当該技術分野で公知の方法によって、最も好ましくは本発明の実施例に記載の方法によって確認することができる。したがって、好ましくは、本発明の精製ポリクローナル抗血清調製物が含む無関係な夾雑タンパク質又はタンパク質断片は５％未満である。最も好ましくは、前記調製物が含む無関係な夾雑タンパク質又はタンパク質断片は２％未満である。
【００１５】
好ましくは、ポリクローナル抗血清は、免疫グロブリンを含む画分のような抗血清画分を含む。ポリクローナル抗血清の画分は、ＩｇＧ画分であるか、又はＦ（ａｂ’）２断片画分であるか若しくはその画分を含むことが最も好ましく有益である。
【００１６】
ポリクローナル抗血清を分画するためのさまざまな代替方法が存在し、当該技術分野に熟練した者に公知である。簡便な技法の一つに、例えばプロテインＧ又はプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィの使用が挙げられる。典型的にはカラムは、５ｍｌ又は１０ｍｌの充填されたプロテインＡ又はＧアガロースを含有する。カラムのサイズは、プロテインＡ／Ｇの結合能及び処理される抗血清の量によって決定される。プロテインＡ及びプロテインＧは、結合されるアガロース１ｍｌあたり約２０ｍｌのＩｇＧと結合する。
【００１７】
「Ｆａｂ断片」という用語は、抗原結合活性を含有する抗体断片を表す。抗体分子の２つの同一領域に相当し、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと組み合わされた完全な軽鎖を含有する。ジスルフィド結合したヘテロ２量体であり、その各鎖は１の免疫グロブリンＣドメイン及び１のＶドメインを含有し、両方のＶドメインの並置によって抗原結合部位が形成される。「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、抗体分子の２つの抗原結合領域が連結状態にある抗体断片を表す。この場合、重鎖の残りの部分はいくつかの小断片に切断される。Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、元の抗体と全く同一の抗原結合特異性を有するが、いかなるエフェクター分子又は細胞とも相互作用し得ない。
【００１８】
抗体画分、抗体調製物、及び／又は抗体断片の産生（得られた血清から出発）に関するいくつかのアプローチが文献に報告されている。例えば、米国特許第４，８４９，３５２号は、固定化パパインを用いて抗体を消化し、次いで免疫アフィニティーにより断片を精製することによる両Ｆａｂ断片の産生について記載している。また、固定化パパインを用いて抗体を消化し、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｃ小断片を得、次いでゲル濾過により免疫グロブリンを精製することによるＦ（ａｂ’）２断片の産生についても記載している。滅菌培地中で全血を用いてＦａｂ断片を産生する方法を記載する米国特許第５，７３３，７４２号には別のアプローチが示されおり、ここでは、好ましくは精製された、遊離又は固定化酵素に全血を直接接触させる。続いて、細胞残渣を遠心分離により除去し、得られた断片を分離及び回収し、次いで好ましくは免疫アフィニティーにより精製する。米国特許第４，８１４，４３３号は、Ｆａｂ断片を産生する更なるアプローチを示しており、パパイン不含Ｆａｂを得るための手順を記載している。次いで、Ｆｃ断片及びハイブリッド化合物が保持された、プロテインＡを有するカラムに溶液を通過させることによって断片を精製する。更なる方法は、ペプシンによる消化、及び硫酸アンモニウム又はナトリウムを用いた断片分画の沈殿を包含するが、通常、硫酸塩を用いた沈殿とその後の抗体画分の消化によって抗体による事前分離が行われる。
【００１９】
ポリクローナル抗血清の最も重要な臨床的使用は、がんの改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造することにある。したがって、本発明のポリクローナル抗血清は、がんを治療及び／又は改善する方法において被験者へ使用することもできる。好ましい態様では、被験者はヒト患者である。
【００２０】
したがって本発明の１つの側面では、担癌被験者を改善、予防、又は治療するためのポリクローナル抗血清の使用であり、被験者の癌腫又はがん細胞は本発明のポリクローナル抗血清に結合する抗原を発現する。治療は、特に治療効果を十分発揮する量のポリクローナル抗体を担癌被験者に投与することを含む。本発明の別の側面は、標識されたポリクローナル抗体の投与である。当業者であれば、化学療法剤、アポトーシス剤、ＤＮＡの発現を阻害する薬剤、又は放射性薬剤のような抗体に使用可能な標識の種類を熟知している。当該技術分野で公知の多数の治療薬のなかでも、放射性同位体、抗炎症剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカイン、及び化学療法剤から成る群より選択される治療薬が好ましい。
【００２１】
したがって、更なる側面では、本発明によるポリクローナル抗体／ポリクローナル抗血清、又はその断片を、それを必要とする患者に投与することができ、ここで、前記血清又は得られた抗体（断片）調製物に含まれる抗体タンパク質又はその断片は治療剤と結合している。抗体を化学療法剤に結合させる方法は前述のとおりである。好適な化学療法剤は、当該技術分野に熟練した者に公知であり、限定されるものではないが、ダウノマイシン、アドリアマイシン、エトポシド、シクロホスファミド、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルヂノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、メルファラン、リシン、アブリン、及びカリケアマイシンが含まれる。
【００２２】
これら薬剤は、２官能性又はヘテロ２官能性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、２−イミノチオラン、カルボジイミド若しくはグルタルアルデヒドの使用などのさまざまな周知の化学的方法のいずれかを用いた化学的架橋結合によって、本発明のポリクローナル抗体又はその断片へ化学的に結合させることができる。
【００２３】
抗体又は抗体断片へ、例えばクロラムブシルを結合させる方法は、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ、１９９３；Ｇｈｏｓｅ、１９７２；及びＳｚｅｋｅｒｋｅ、１９７２に記載されている。例えばダウノマイシン及びアドリアマイシンを抗体に結合させる方法は、Ｈｕｒｗｉｔｚ、１９７５及びＡｒｎｏｎ、１９８２に記載されている。抗体−リシン結合体を調製する方法は、米国特許第４，４１４，１４８号、及びＯｓａｗａ、１９８２に記載されている。カリケアマイシンを抗体に結合させる方法は、Ｈａｍａｎｎ、２００２に認めることができる。抗体へのドキソルビシンの結合は、例えばＳｔａｎ、１９９９に由来する方法を用いることができる。さまざまな免疫毒素を産生するための更なる手法は、例えばＴｈｏｒｐｅ、１９８２；Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９１；Ｂｌａｋｅｌｙ、１９９８；Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８；又はＣｕｍｂｅｒ、１９８５に認めることができる。
【００２４】
前記の抗体又は抗体断片の１つにリシン又はアブリンなどのポリペプチドを化学的に結合させることは、２官能性又はヘテロ２官能性試薬（例えば、グルタルアルデヒド又はＮスクシミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ））を用いた化学的架橋反応のような当該技術分野で公知の方法によって行うこともできる。Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９８８及びＣｕｍｂｅｒ、１９８５を参照されたい。
【００２５】
抗体の２つの可変ドメインが互いに結合することによって形成され、それぞれが異なるエピトープに特異的な２重特異性抗体もがん療法において提唱されている。したがって、２重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位（パラトープ）を有するハイブリッド免疫グロブリンであり、例えば化学的架橋によって調製することができる（Ｂｒｅｎｎａｎ、１９８５）。がん治療用の２重特異性抗体は、腫瘍抗原に対するパラトープと、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又は他のエフェクター細胞による貪食又は溶解反応を仲介し得る細胞表面分子に対するパラトープとによって形成される（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ、２０００；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、２００４；Ｆａｎｇｅｒ、１９９１；Ｄａｖｏｌ、２００４を参照されたい）。
【００２６】
本発明に包含される、ポリクローナル抗体に結合可能な更なる治療薬は、放射性同位体又は放射性同位体を含有する薬剤である。放射性同位体のなかでも、γ線、β線、及びα線放射性同位体を使用することができる。治療用放射性同位体としては、β線放射性同位体が好ましい。使用可能な放射性標識の種類には、インジウム１１１、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、イットリウム９０、ルテチウム１７７、レニウム１８６、レニウム１８８、ビスマス２１３、コバルト、インジウムのさまざまな同位体、その他の放射性物質がある。放射性標識抗体のためのプロトコールとして、例えばＷＯ９３／０５８０４号を参照されたい。悪性腫瘍細胞への局部照射及び破壊を実現するには、レニウム１８６、レニウム１８８、ヨウ素１３１、及びイットリウム９０が特に有用なβ線同位体であることが示されている。したがって、レニウム１８６、レニウム１８８、ヨウ素１３１、及びイットリウム９０から成る群より選択される放射性同位体が、本発明のポリクローナル抗血清のタンパク質に結合される治療薬として特に好ましい。
【００２７】
したがって、放射性核種の放射線療法では、がん細胞にさまざまな放射線量を直接照射するための放射標識抗体の使用に焦点が当てられてきた（放射免疫療法）。本発明に従って得られる抗体及び抗体断片を、当該技術分野で公知の方法により放射性核種へ化学的に結合させてもよい。特に、Ｌｉｕ Ｙｕａｎｆａｎｇ、１９９１；Ｅｃｋｅｌｍａｎ、１９８０を参照されたい。
【００２８】
本発明によれば、腫瘍特異的ポリクローナル抗血清は、各種の腫瘍又は腫瘍細胞に対するさまざまな「殺傷機序」を誘発することも可能である。例えば、腫瘍細胞上で補体系を活性化することができる。免疫グロブリン分子全体、即ちポリクローナル抗体は、腫瘍細胞に局在化して補体系を活性化することができ、その結果、膜に孔を開けて細胞を溶解させる（Ｈａｒｒｉｓ、２００４）。
【００２９】
あるいは、免疫エフェクター細胞が腫瘍増殖部位に向けて誘導され、その場所で細胞傷害作用が活性化されることもある。特に、免疫グロブリン分子がエフェクター細胞を補充して活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に至ることもある。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）は、ＩｇＧのＦｃ断片に対する受容体を有するので、その付着によって標的細胞のアポトーシスを含む細胞傷害に至る一連の反応が活性化される。
【００３０】
さらに、本明細書中に記載の各種毒素又は放射性核種のような、細胞の挙動又は細胞の生存に傷害をきたす細胞傷害性の分子又は原子は、前記の腫瘍又は腫瘍細胞の部位へ送達されることもある。腫瘍細胞に対して細胞毒性薬が有するそのような特異的標的作用によって、腫瘍部位で濃度の上昇を起す可能性があるものの、全身投与による用量規制の副作用は生じない。前記複合体は一端細胞表面に付着すると細胞質内に取り込まれ、そこで細胞の酵素が抗体と薬剤又は毒素を切り離す。その薬剤又は毒素は放出と同時に細胞死を含む傷害を細胞にもたらす。例えば、腫瘍細胞に結合した放射性標識抗体は細胞で放射能を濃縮する。細胞核から至近距離での照射によってがん細胞の死滅が起きる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、１９９３）。
【００３１】
２重特異性の免疫グロブリン療法は、疾患に関連する一定の標的構造に対する免疫エフェクター機序の選択的動員に依拠する。こうして２重特異性分子は、エフェクター機序とその標的間の連結役となる。極めて多様なエフェクター機序は治療面への応用が期待され、その多くは既に高く評価されている。それらには、エフェクター分子（例えば、毒素、薬物、プロドラッグ、サイトカイン、放射性核種）の動員、エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球）の再標的化、及び担体系の標的化が含まれる。
【００３２】
本発明のポリクローナル抗血清及び／又はそれから得られる抗体は、増殖性疾患、がんの医療的介入、及び／又は腫瘍の治療において特に有効である。
本発明の明細書に記載される「がん」又は「腫瘍」という用語は、悪性増殖に関連する疾患を含む。本発明によるがん又は腫瘍は、限定されるものではないが、下記を含む。
【００３３】
１） （ｉ）鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、口腔癌及び中咽頭癌喉頭及び下咽頭の腫瘍、唾液腺腫瘍及び傍神経節腫、並びに（ｉｉ）扁平上皮細胞癌、疣状癌、肉腫様扁平上皮細胞癌、リンパ上皮腫、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺房細胞癌、腺癌及び神経内分泌腫瘍の諸変異型を含めた頸頭部癌。
【００３４】
２） （ｉ）癌腫、腺癌、大細胞（未分化）癌及び扁平上皮細胞癌を含む各種の非小細胞肺癌、並びに（ｉｉ）燕麦細胞癌、リンパ球様癌、中期癌、及び（扁平上皮癌又は腺癌の合併した）ＳＣＬＣを含む小細胞肺癌を含めた肺癌。
【００３５】
３） （ｉ）胸腺新生物、リンパ腫、胚細胞腫瘍及び癌腫を含む縦隔上前部の新生物、上腕、腸管及び心膜の嚢胞、異常上皮小体腫瘍及び甲状腺新生物；（ｉｉ）嚢腫性病変、リンパ腫、間葉性腫瘍及びがんを含む縦隔中部新生物；並びに（ｉｉｉ）神経原性腫瘍、嚢腫病変、間葉性腫瘍及び内分泌腺腫瘍を含む縦隔後部の新生物を含めた縦隔の新生物。
【００３６】
４） （ｉ）十二指腸癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、扁平上皮細胞癌、腺棘細胞腫、カルチノイド腫瘍、平滑筋肉腫、間葉性腫瘍、上皮性新生物、混合型ＨＣＣ／胆管癌、リンパ腫、及び黒色腫を含めた消化管癌。
【００３７】
５） 腎臓及び尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道及び陰茎癌、並びに移行細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、黒色腫、基底細胞癌及び間葉性腫瘍を含む泌尿生殖器系の癌。
６） 上皮内、精上皮及び非精上皮腫の癌、ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、顆粒膜細胞腫、生殖芽細胞腫、中皮腫、肉腫、精巣網及び類表皮嚢胞の腺癌、リンパ腫、並びに転移性癌を含む精巣癌。
【００３８】
７） 子宮内膜癌、子宮頚、膣及び外陰の癌、子宮体癌、妊娠性絨毛性疾患、卵巣癌、卵管癌及び腹膜癌、並びに上皮内腺癌、上皮内扁平上皮癌、悪性混合型ミュラー腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｉｘｅｄ Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ：ＭＭＴ）、絨毛性腫瘍、及び胚細胞又は間質細胞の腫瘍を含む婦人科の癌。
【００３９】
８） 乳癌、即ち、上皮内癌、非浸潤性乳管癌、及び上皮内小葉癌を含む乳房の悪性腫瘍。
９） 甲状腺腫瘍、副甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膵内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍及びカルチノイド症候群、癌腫及び腺腫を含む多発性内分泌新生物１型（ＭＥＮ １）から成る群より選択される内分泌系の癌。
【００４０】
１０） （ｉ）軟組織の肉腫；並びに（ｉｉ）紡錘細胞腫瘍、傍骨性骨肉腫、骨膜性骨肉腫、パジェト肉腫、高悪性度表在性骨肉腫及び小細胞骨肉種、骨の巨細胞腫瘍、仙骨の巨細胞腫瘍、悪性線維細胞組織腫、骨の線維肉腫、骨の悪性血管内皮腫、脊索腫、骨の小円形細胞肉腫、及び骨のリンパ腫（びまん性大細胞型リンパ腫）からなる骨の肉腫を含めた軟組織及び骨の肉腫。
【００４１】
１１） 上皮、肉腫様、及び混合型腫瘍を含む悪性中皮腫。
１２） 基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、癌関連遺伝性皮膚症（色素性乾皮症、母斑性基底細胞癌症候群、ファーガソン−スミスの多発性自然治癒性上皮腫、ムーアトーレ（Ｍｕｉｒ−Ｔｏｒｒｅ）症候群、コーデン症候群、ガードナー症候群及びカーニー症候群を含む）、並びに表皮メルケル細胞から生じる腫瘍、メルケル細胞癌、表皮ランゲルハンス細胞から生じる腫瘍、毛嚢腫瘍、脂腺腫瘍、アポクリン汗腺腫瘍、エクリン汗腺腫瘍、真皮から生じる腫瘍、リンパ網内系腫瘍及び関連病態から成る群より選択される皮膚癌。
【００４２】
１３） 上皮黒色腫及び眼内黒色腫を含む悪性黒色腫。
１４） 乏突起星細胞腫、脈絡叢の腫瘍、星状細胞腫−乏突起膠腫、星状細胞腫−上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫及び膠芽細胞腫を含む中枢神経系の新生物。
【００４３】
１５） ウィルムス腫瘍、神経芽種、横紋筋肉腫、網膜芽種、ユーイング肉腫及び抹消原始神経外胚葉腫瘍、小児の固形腫瘍、並びに睾丸腫瘍、卵巣腫瘍、縦隔腫瘍及び膣腫瘍のような悪性性腺胚細胞及び性腺外胚細胞腫瘍、並びに卵黄嚢腫瘍、胎生癌腫、精上皮腫、絨毛腫、奇形腫、奇形癌及び未分化胚細胞腫を含めた小児癌。
【００４４】
１６） （ｉ）小リンパ球性リンパ腫／Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）などの細胞性非ホジキンリンパ腫、（ｉｉ）エイズ（ＡＩＤＳ）関連リンパ種、（ｉｉｉ）未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）などのＴ細胞非ホジキンリンパ腫、（ｉｖ）ホジキン病、（ｖ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む白血病、並びに（ｖｉ）リンパ芽球性リンパ腫、非開裂型小細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫及び大細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫を含む白血病を含めたリンパ腫。
【００４５】
１７） 急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病、有毛細胞白血病、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び形質細胞腫を含めた白血病。
【００４６】
１８） カポジ肉腫及び非カポジ肉腫などのエイズ関連の悪性疾患。
最も好ましい態様では、本発明のポリクローナル抗血清の使用により、治療、改善、及び／又は予防されるべきがんは、子宮癌である。
【００４７】
さらに本発明は、がんを治療するための、本発明の医薬組成物（本明細書に規定の本発明のポリクローナル抗血清を含む）の使用に関するものであり、本発明による医薬組成物が、それを必要とする個体へ１回〜数回投与され、抗体タンパク質に連結した放射性同位体、又は化学療法剤により腫瘍細胞が破壊され、治療成績がモニターされる。前記の腫瘍治療方法は、インビボでもインビトロでも行うことができる。がんは本明細書に定義されたものである。抗体の長期適用中に免疫複合体によるアナフラキシー様ショックが誘発されることがあるため、患者にはコルチコイドなどの免疫抑制剤を併用することも想定される。
【００４８】
投与されるべき前記抗体分子又は医薬組成物若しくは製剤は、医薬的に許容される担体若しくは賦形剤を更に含んでいてもよい。「医薬的に許容される担体」とは、投与される患者に対して生理学的に許容性のある担体を意味する。医薬的に許容される担体の１例は、生理食塩水である。医薬的に許容される担体はまた、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、その他の安定剤、又は賦形剤を含む医薬的に許容される各種化合物を含んでいてもよい。他の医薬的に許容される担体及び担体製剤は周知であり、例えば一般に『レミントンの薬学』、１９９０年に記載されている。当該技術分野に熟練した者であれば、生理学的に許容性のある化合物を含む医薬的に許容される担体の選択は、例えば前記組成物の投与経路に依存することを知っているであろう。
【００４９】
本明細書において「投与する」とは、前記組成物を患者に与え、結果的に患者の体内に留まらせること意味する。そのような投与は、当業者に決定される適切ないかなる経路によっても可能である。本発明の医薬組成物は、専門家に周知のさまざまな投与経路、特に静注又は標的組織への直接注入によって適用することもできる。全身投与は、静注、脈管内、筋注、動脈内、腹腔内、経口、又は髄腔内の投与が好ましい。より局所の投与は、皮下、皮内、心内膜、葉内、髄質内、肺内、又は処置すべき組織（結合、骨、筋肉、神経、上皮組織）への直接若しくは近傍で行われてもよい。ポリクローナル抗血清を用いた治療は、治療計画の全体、又は例えば、がんに対する化学療法、更なる抗体を用いた療法若しくは標準的療法の他の形態などを含む一部であってもよい。
【００５０】
最も好ましくは、本発明の医薬組成物を静脈内に投与すべきである。
動物又はヒトの身体では、治療される腫瘍の種類又は原発部位に応じて静注又は他の経路、例えば、全身、目的の組織若しくは器官へ局部又は局所により前記抗体又は薬剤を適用することは有利なことが証明できる。例えば、びまん性であるか又は局在化しにくい腫瘍などでさまざまな器官又は器官組織が治療を必要とする場合、全身投与が望ましい。また、局所腫瘍などで新生物の増殖が局所に限られる場合、局所投与が検討されよう。したがって、本発明の医薬組成物は、がん細胞又はがん組織に近接する部位において静注又は他のいかなる適切な投与法によって適用することもできる。
【００５１】
投与経路のいかんに係わらず、本発明の医薬組成物は、後述するように又は当該技術分野に熟練した者に公知の他の従来法によって医薬的に許容される剤形として製剤化される。
【００５２】
本発明の医薬組成物における有効成分の実質投与量は変更可能であるため、特定の患者、組成物及び投与法において所望の治療的応答を起こすに十分な有効成分量が得られる。
選ばれた投与量は、使用時の本医薬組成物の活性、投与経路、投与時間、使用中の本医薬組成物の排泄速度、治療期間、本医薬組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療対象患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び既往歴、並びに医療分野で周知の要因を含む諸要因に依存するであろう。
【００５３】
本発明のある非限定的態様では、ポリクローナル抗血清は生理食塩水溶液などの緩衝液５０ｍＬに溶解した、１〜１０ｍｇ、好ましくは１．５〜５．５ｍｇ、より好ましくは２ｍｇの用量として投与される。したがって、ある投与プロトコールでは、製剤の抗体用量が１〜１０％、好ましくは２〜６％、より好ましくは４〜５％、特に好ましくは４％を含んでいてもよい。好ましくは、その溶液は、約１〜１００分、好ましくは１０〜６０分、より好ましくは約２０分かけて徐々に注入される。しかしなお、それより長い投与時間も短い投与時間も想定され、当該技術分野に熟練した者、例えば担当医師の技量の枠内にある。
【００５４】
前記用量を完全に投与し得ないようなアレルギー反応又は他の反応が生じれば、より低い用量を投与時又は以降の治療に使用することもでき、その結果、用量の期待範囲は、１回の治療あたり１〜２ｍｇとなろう。タンパク質に対するアレルギー反応のリスクを低減するため、経口又は静注ジフェンヒドラミン（２５〜５０ｍｇ）を用いた前投薬が一般に行われる。ポリクローナル抗血清の投与は、先立って行われるべき必要な手術の後に開始され、その治療期間が終了するまで続けることもできる。
【００５５】
本発明は、医薬組成物を調製するための、本明細書に記載され規定されたポリクローナル抗血清の使用も提供し、前記医薬組成物が更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて治療を必要とする被験者に投与される。
【００５６】
本発明のある態様では、使用された抗増殖薬又は薬剤は市販品である。非限定的な例として、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、ＨＣｌリポソーム注入（ＨＣｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、トポテカン、塩酸塩、ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド及びエトポシド、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。例示だけを目的にすると、抗増殖薬又は薬剤は、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗物質（それぞれ各種の葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、糖修飾類似体など）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（インターカレート剤など）、及び／又はＤＮＡ修復阻害剤であってもよい。
【００５７】
本発明で想定される化学療法剤は、作用機序に従って例えば以下のグループに分類することもできる：代謝拮抗物質／抗がん剤［各種のピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カペシタビン、ゲンシタビン及びシタラビン）及びプリン類似体、葉酸拮抗薬、並びに関連阻害剤（メルカプトトウリジン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）など）；抗増殖剤／有糸分裂阻害剤［ビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）、タキセン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、エポチロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）及びネーブルビンなどの微小管阻害剤、エピディポドフィロトキシン類（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン類、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、チトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド（ｉｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、メルクロエタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソレール、テニポシド、トリエチレンチオホスフォラミド及びエトポシド（ＶＰ１６））を含む］；抗生物質［ダクチノマイシン（アクチノマイシン Ｄ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン系、ミトキサントロン、ブレオマイシン系、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシンなど］；酵素［Ｌ−アスパラギナーゼ（身体のＬ−アスパラギンを代謝し、アスパラギンを合成する能力のない細胞で枯渇させる）］；抗血小板薬；抗増殖剤／有糸分裂阻害アルキル化剤［ナイトロジェンマスタード類（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン類及びメチルメラミン類（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソウレア類（カルマスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼンズ−ダカルバジニン（ｔｒａｚｅｎｅｓ−ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ：ＤＴＩＣ）など］：抗増殖剤／有糸分裂阻害代謝拮抗物質［葉酸類似体（メトトレキサート）など］；白金配位錯体［（シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド］；ホルモン及びホルモン類似体［エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、バイカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール］；抗凝血薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩類、その他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドクレル、アブシキマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）；遊走阻害剤；分泌抑制薬（ブレベルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び増殖阻害因子［血管内皮細胞因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤］；アンジオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド類；抗体［トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、リツキシマブ］；細胞周期阻害剤及び分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、及びプレドニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤；各種毒素（コレラ毒素、リシン、緑膿菌外毒素、百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素又はジフテリア毒素、及びカスパーゼ活性化因子など）；並びに各種クロマチン分裂阻害剤。前記化学療法剤の好ましい投与量は、現在処方される投与量と等しい。
【００５８】
最も好ましくは、抗増殖薬又は薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、パクリタキセル及びセタキセルから成る群より選択される。
他の好ましい態様では、前記の抗増殖薬又は薬剤をさらに、本発明の医薬組成物の投与前、投与中又は投与後に投与されるべきである。したがって、その抗増殖薬又は薬剤をポリクローナル抗血清の投与前後の１、２、３若しくは４週以内に投与することもできる。
【００５９】
一例として、ポリクローナル抗血清を化学療法の治療計画内で投与してもよい。その化学療法は、治療の担当医及び通常の臨床経験に従って３〜４週サイクルで行うことができる。化学療法は、２年以内で１２週ごとに１回のポリクローナル抗血清投与した後、６サイクル以内で継続することができる。
【００６０】
化学療法と抗体投与による併用療法、例えば、ある化学療法剤の投与後（例えば５日以内）に、本発明（若しくは本明細書の一部）のポリクローナル抗血清を用量２ｍｇ以内で、１、３、５、９週間、次いで８週ごとに２０分かけて静注する治療計画も想定される。担当医は常に、本発明のポリクローナル抗体／ポリクローナル抗血清の使用により治療すべき患者個人の（医療的）ニーズに応じて対応する治療計画を推定する立場にある。
【００６１】
本発明を、以下の実施例に従って例示する。
【実施例１】
【００６２】
胚性細胞の取得
近交系ＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）のメス５匹及びオス２匹（６〜８週齢）を２０×３０ｃｍのケージに入れて１２時間（午後から開始）交配させた。次いで、膣栓検出により妊娠を確認し、妊娠しているメスを分別した。この日を妊娠１日目とみなした。
【００６３】
妊娠１２日目に妊娠マウスを頚椎脱臼により殺した。死の直後に、そのマウスを解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。
【００６４】
子宮を摘出し、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）が入ったペトリ皿に移した。ピンセットとハサミを用いて胎児を胎嚢から剥がし、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で２回洗った。卵黄嚢を切除した。検出された１２の膣栓のうち７つが妊娠していた。
【００６５】
ウェルセン溶液（ＰＢＳ １０００ｍｌ［ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１］中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で洗浄した胎児は、細胞を放出するため、組織グラインダーで機械的にホモジナイズした。
【００６６】
ホモジナイズされた胎児を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）を用いて妊娠マウス２匹あたり１ｍｌで洗浄した。得られた材料を１分間静置した。遊離した細胞を滅菌シリンジ（２５Ｇ ５／８針）で吸引し、組織塊を除去した。
【００６７】
単離した細胞は、ウェルセン溶液（ＰＢＳ １Ｌ中にＮａ４ＥＤＴＡ ０．２ｇを含有）で少なくとも１００倍希釈してノイバウアー（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）改良型血球計算板を用いて計数した。
【実施例２】
【００６８】
胚特異的脾臓細胞に富む画分の取得
本明細書中における胚性細胞を４℃にて２０分間３７０×ｇで遠心した。上清を捨て、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。近交系ＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）の童貞のオス（６〜８週齢）に対して、フロイントアジュバントと細胞を混合する前記工程により得られたエマルジョン０．１ｍｌの皮下注射によって免疫した。反応性の血清を得るためには、約７０匹のオスマウスが必要であった。
【００６９】
接種して５日後に、頚椎脱臼により殺して脾臓を摘出した。
前記工程により得られた免疫マウスからの脾臓を１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）含有のペトリ皿に集め、ハサミで細片に刻んだ。次いで、単一細胞の懸濁液が得られるまで細片をポッター・エレージェン（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｅｈｊｅｎ）組織グラインダーを用いて磨りつぶした。シリンジを用いて１９Ｇ針に繰り返し通過させて細胞塊を分散させた。得られた脾臓細胞懸濁液は、２００μｍのナイロンメッシュで濾過し、１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移し、４℃にて２００×ｇで１０分間遠心した。上清は捨てた。夾雑赤血球を溶解するために、細胞ペレットに処理脾臓１個当たり塩化アンモニウム溶液（ＮＨ４Ｃｌ ０．１５Ｍ、ＫＨＣＯ３ １ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１）５ｍｌを添加し、静かに混合し、室温にて５分間インキュベーションした。インキュベーション後、得られた混合物を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心した。上清は捨てた。残った脾臓を１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄し、２０ｍｌの１９９培地に懸濁した。
【実施例３】
【００７０】
抗血清の調製
本明細書中における脾臓細胞を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨て細胞を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。生きたオスマウスに対して、前記で得られたエマルジョン０．１ｍｌの腹腔内注射によって免疫した。血清１０ｍｌを得るためにオスのマウス約５０匹へ接種した。
【００７１】
接種の４日後、それらのマウスを頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。肋骨を切断し、胸腔を開いた。肺を切除せずに入念に除けて、心臓を摘出した。胸腔から血液を集め、凝固するまで４℃にて冷蔵した。次いで、その血液を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、得られた血清を一緒にプールした。その後、５６℃での加温インキュベーションを１５〜２０分間行った。
【００７２】
正常マウスから切除した新鮮な器官の細胞とインキュベーションすることによって、望ましくない正常組織との交叉反応を回避した。そのために６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）を頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。心臓、肝臓及び腎臓細胞を切除して、それらの器官をペトリ皿に乗せ１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄した。血液を抜くために心臓を鉗子で圧し、脂肪を器官から分離した。
【００７３】
続いて、それらの器官をハサミで細片に刻み、パスツールピペットを用いて１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移した。次いで、細片を４℃にて３７０×ｇで１０分間遠心し、１９９９培地で２回洗浄した。上清は捨て、細胞を前述で得られた血液と室温にて２９〜２５分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を４℃にて３７０×ｇで２９０分間遠心し、粗い固形物を除去した。こうして得られた上清を４℃にて３５００×ｇで１０分間、最後の遠心分離にかけ、−７０℃にて保存した。
【００７４】
抗血清の更なる調製プロトコールは以下の工程を含む。
本実施例における脾臓細胞を４℃にて２００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨て、細胞を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、マウス１匹あたりの細胞濃度を０．１ｍｌ ＣＦＡ中で１０×１０６細胞とした。各用量は個別に調製した。童貞のオスマウスに対して、本明細書中におけるエマルジョン０．１ｍｌを腹腔内注射することによって免疫した。血清１０ｍｌを得るためにオスのマウス約５０匹へ接種した。最初に免疫から４日後、本明細書中において新たに取得した細胞によりマウスの免疫応答を増強させた。オスマウスに対して、本明細書中におけるエマルジョン０．１ｍｌの腹腔内注射により免疫応答を増強させた。
【００７５】
最後の接種から４日後、それらのマウスを頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて、皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。肋骨を切断し、胸腔を開いた。肺を傷付けないよう除けて、入念に心臓を摘出した。胸腔から血液を集め、凝固するまで４℃にて冷蔵した。次いで、その血液を４℃にて３７０×ｇで２０分間遠心し、得られた血清を一緒にプールした。その後、５６℃での加温インキュベーションを１５〜２０分間行った。
【００７６】
正常マウスから切除した新鮮な器官の細胞とインキュベーションすることにより、望ましくない正常組織との交叉反応を回避した。このために６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ストック番号０００６５４）を頚椎脱臼により殺し、解剖板に乗せ、仰向けに固定した。外科用ハサミを用いて皮膚及び腹膜を鼠蹊部から顎先にかけて腹側正中に沿って切開した。心臓、肝臓及び腎臓細胞を切除して得られた器官をペトリ皿に乗せ１９９培地（シグマアルドリッチ、製品番号Ｍ４５３０）で洗浄した。血液を採取するために心臓を鉗子で圧し、脂肪を器官から分離した。
【００７７】
続いて、それらの器官をハサミで細片に刻み、パスツールピペットを用いて１５ｍｌのポリプロピレン製円錐チューブに移した。次いで、細片を４℃にて３７０×ｇで１０分間遠心し、１９９９培地で２回洗浄した。上清は捨て、細胞を前述で得られた血液と室温にて２９〜２５分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を４℃にて３７０×ｇで２９０分間遠心し、粗い固形物を除去した。こうして得られた上清を４℃にて３５００×ｇで１０分間、最後の遠心分離にかけ、−７０℃にて保存した。
【実施例４】
【００７８】
ポリクローナル抗体のアフィニティー精製
本明細書中に記載したポリクローナル抗血清から出発して、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス、米国）を用い、製造業者の指示書に従ってプロテインＧ・アフィニティークロマトグラフィによるＩｇＧの精製を行った。ポリクローナル抗血清２ｍＬを、結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６ｍｌまで希釈し、１２，０００ｇで５分間遠心した。得られた上清を、結合緩衝液で平衡化したカラムに流速１ｍＬ／分でかけた。このカラムをＡｂｓ２８０ｎｍ＜０．０１となるまで結合緩衝液２０ｍＬで洗浄した。吸着したＩｇＧを、溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離した。酸に不安定な各種ＩｇＧの活性を保つため、５００μｌ画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）５０μｌを含む試験管に集めた。２８０ｎｍでのＵＶモニターに従ってＩｇＧを溶離した。一般に、ＩｇＧは最初の３ｍＬ以内で溶離した。吸光度２８０ｎｍ＞０．２を示す画分をプールし、ＰＢＳ（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１）に対して透析し、−２０oＣにて保存した。
【００７９】
本明細書中に記載した工程により得られたさまざまな精製ＩｇＧは、アガロース固定化ペプシン（ＩｎｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２調製キット、カタログ番号４４８８８、Ｐｉｅｒｃｅ社、米国）を用い、製造業者の推奨方法に若干の修正を加えてペプシンにより消化した。特に、ＩｇＧ溶液及びアガロース固定化ペプシンは、酢酸（２０ｍＭ、ｐＨ２．８）で平衡化し混合した。消化は、３７℃にて静かに撹拌しながら行った。インキュベーションの２時間後、Ｆ（ａｂ’）２断片を含む上清を分離し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を加えて、ｐＨを中性近くに高めた。Ｆ（ａｂ’）２含有画分をＰＢＳで透析し、−２０℃にて保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で示されたように約９０％のＩｇＧがＦ（ａｂ’）２に転換された。
【実施例５】
【００８０】
アフィニティー精製したポリクローナル抗体の品質試験及びタンパク質濃度の定量
ＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２調製物の品質は、Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０に従ってドデシル硫酸ナトリウム存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べた。タンパク質濃度は、ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（カタログ番号２３２２７、Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を用いたスミス、１９８５の方法に従ってビシンコニン酸により測定した。
【実施例６】
【００８１】
腫瘍特異的免疫染色
腫瘍を特異的に認識するために、ホルマリン固定パラフィン包埋した組織を免疫染色した。チェッカーボード・マルチノーマル・ブロック・スライド（カタログ番号Ｔ１０６５）及びチェッカーボード・マルチチューモア・ブロック・スライド（カタログ番号Ｔ１０６４）は、米国ダコ社から購入した。
【００８２】
組織切片を脱パラフィン化して水に戻し、沸騰水浴中でＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ、米国、カタログ番号Ｓ１６９９）を用いた抗原回収手順に２０分間かけた。組織切片は、徐々に冷却した後、室温にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ［ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ｐＨ７．３±０．１］）の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ、米国、カタログ番号Ａ７０３０）溶液と３０分間インキュベーションすることによって特異的結合を阻害した。洗浄した後、各組織切片に対して、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡを含有するポリクローナルＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２断片）の４０μｇ／ｍＬ溶液（約５０μＬ）を添加し、４℃の加湿チャンバー中で一晩インキュベーションし洗浄した。固有ペルオキシダーゼ活性は、製造業者のガイドラインに従って既製のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ダコ、米国、カタログ番号Ｓ２００１）と一緒にインキュベーションすることによって阻害した。徹底的に洗浄した後、製造業者の指示書に従ってＨＲＰ−ＬＳＡＢ ２ｓｙｓｔｅｍ（ダコ、米国、カタログ番号Ｋ０６７５）及びＬｉｑｕｉｄ ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ダコ、米国、カタログ番号Ｋ３４６５）を用いることによって、腫瘍特異的反応を検出した。顕微鏡分析に先立って、ヘマトキシリン−エオシンによる対比染色を実施した。
【実施例７】
【００８３】
細胞増殖試験におけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞に対する効果
ＨｅＬａ細胞に対するポリクローナル抗血清の細胞傷害効果を測定するために、テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）を用いた比色分析法［ミトコンドリア活性用の基質として着色ホルマザンに還元される（Ｒｏｄｅ、２００４）］を使用した。
【００８４】
ＨｅＬａ細胞［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２］は、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：Ｂｉｏ Ｗｈｉｔａｋｅｒ）及び４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（シグマ、米国）を添加したＬ−グルタミン（２ｍＭ）含有の最小必須培地（ＭＥＭ：シグマ）中で日常的に保存された。培養物を含む２５ｃｍ２又は７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ、米国）を、加湿５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にてインキュベーションした。必要に応じて、ＨｅＬａ細胞を標準的なトリプシン処理法により継代培養した（Ｍｏｒｇａｎ及びＤａｒｌｉｎｇ、１９９３）。培地を吸引濾過により除去し、細胞をＦＣＳ非含有培地で洗浄し、３７℃にてトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中における１％トリプシン、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、シグマ）３ｍＬで５分間インキュベーションした。剥がれた細胞は、完全培地（元の培養物２５ｃｍ２当たり５ｍＬ）で洗浄し、１×１０５細胞／ｍＬの濃度で完全培地に再懸濁した。トリパンブルー色素排除法（２）により測定し、細胞生存率が９５％を上回る細胞だけを試験に使用した。
【００８５】
細胞増殖試験は、９６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，ドイツ）中で行った。表１で概説したように、ＨｅＬａ細胞懸濁液（１×１０５細胞／ｍＬ）を多チャンネルピペットを用いたプレートの各ウェルに入れた。細胞を付着させるために、マイクロプレートを５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて２４時間インキュベーションした。吸引濾過により培地を除去し、細胞をＦＣＳ非含有のＭＥＭ培地で２回洗浄した。ポリクローナル抗血清は、濾過滅菌し、選択された培地（１ウェルにつき１００μＬ）で適切に希釈してから、表１に記載したように多チャンネルピペットを用いてＨｅＬａ細胞含有のマイクロプレート（少なくとも４枚のレプリカ）に加えた。マイクロプレートは、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて２４、４８又は７２時間インキュベーションした後、ＭＴＳ／ＰＭＳ検出試薬を添加した。
【００８６】
ポリクローナル抗血清の複数ロット（Ｒ０２／０２、Ｒ０８／０２及びＲ０９／０２）を細胞増殖試験用に選択した。血清は、１％ＦＣＳ含有若しくは０．１％ＦＣＳ含有のＭＥＭ培地又はＦＣＳ非含有の培地（０％ＦＣＳ）で１／２０に希釈し、０．２２μｍの膜濾過により滅菌した。希釈物はその都度、調製した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
ＨｅＬａ細胞培養物に対するポリクローナル抗血清添加の効果を測定するために、プロメガＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ 非放射アッセイ（プロメガ、米国、カタログ番号Ｇ５４２１；Ｂａｒｌｔｒｏｐ、１９９１；Ｃｏｒｙ、１９９１）を用いた。溶液は製造業者の指示書に従って調製した。ストックＭＴＳ（プロメガ、米国）及びＰＭＳ（ＩＣＮ、米国）を、ＤＰＢＳ（シグマ）にそれぞれ２．０ｍｇ／ｍＬ及び０．９２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。溶液は、０．２２μｍの滅菌膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ、カタログ番号１６５３４）に通して濾過し、遮光チューブ中で−２０℃にて保存した。ＭＴＳとＰＭＳ検出試薬は、滅菌条件下にて２０：１の割合（ＭＴＳ：ＰＭＳ）で使用直前に混合し、細胞培養物に１：５の割合（試薬２０μＬ／各培地１００μＬ）で添加した。ＭＴＳ／ＰＭＳの添加後、マイクロプレートを、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃にて４時間インキュベーションした。発色は、インキュベーションの間、コンピュータ連結Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＳマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１時間毎に４９２ｎｍでモニターした。
【００８９】
得られた結果は、完全ＭＥＭ培地中で増殖する細胞に比較してポリクローナル抗血清による処理細胞の代謝活性が減少していることを示していた（図１６を参照されたい）。この効果は、ＡＰＵ血清で処理した場合の細胞数又は代謝活性の低下によるか又は両効果によって説明可能であった。しかし顕微鏡観察した場合、ポリクローナル抗血清による処理細胞は、明確なストレス傾向を示した。ポリクローナル抗血清にさらしたＨｅＬａ細胞培養物では、明らかな細胞質の空洞化（図１７ｄ）及び膜の変化（図１７ｂ）が認められた。
【実施例８】
【００９０】
Ｈ３−チミジン細胞増殖アッセイにおけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞培養物に対する効果
ＨｅＬａ細胞に対するポリクローナル抗血清の細胞傷害効果を測定するために、ＤＮＡ合成中のＨ３−チミジン取り込みに基づく方法を用いた。１０％ウシ胎仔血清を添加したＬ−グルタミン（２ｍＭ）含有の最小必須培地（イーグル）及び調節イーグルＢＳＳ［２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｇ／ｌ）含有］中でＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）を増殖させ、３７℃の５％ＣＯ２中において単層の付着細胞を得た。トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により細胞を剥がした。細胞濃度を３２００細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁し、９６ウェルプレートへ分散させ（２００μｌ／ウェル）、３７℃にて５％ＣＯ２中で５日間インキュベーションした。
【００９１】
５日目に培地を捨て、ウシ胎仔血清非含有の培地（２００μｌ／ウェル、４組）中にポリクローナル抗血清（ロットＣ０９０２）から得たプロテインＧ精製免疫グロブリンの異なる希釈液（６０、３０、１５、７．５、３．２５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて５％ＣＯ２中で２４時間インキュベーションした。
【００９２】
次いで細胞を収穫し、９６ウェルウェルプレートβ線計測器を用いてＨ３−チミジン取り込み量を計測した。各４組に対する平均ｃ．ｐ．ｍ．±標準偏差（ＳＤ）値を計算した。
【００９３】
得られた結果は、ポリクローナル抗血清からの精製免疫グロブリン処理細胞の場合、対照に比べてＨ３−チミジン取り込み量の減少を示した。この効果は用量依存的であった（１８図を参照されたい）。
【実施例９】
【００９４】
汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清による線維芽細胞の増殖阻害
４ｍＭＬ−グルタミン添加のイスコベ型（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）修飾ダルベッコ培地［１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（９０％）及びウシ胎仔血清（１０％）を含むように調節］中で線維芽細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＤ−９８６Ｓｋ）を増殖させ、３７℃の５％ＣＯ２中において単層の付着細胞を得た。
【００９５】
次いで、トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により細胞を剥がした。細胞を３２００細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁し、９６ウェルプレートへ分散させ（２００μｌ／ウェル）、３７℃にて５％ＣＯ２中で５日間インキュベーションした。５日目に培地を捨て、ウシ胎仔血清非含有の培地（２００μｌ／ウェル、４組）中にポリクローナル抗血清（ロットＣ０９０２）からのプロテインＧ精製免疫グロブリンの異なる希釈液（６０、３０、１５、７．５、３．２５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて５％ＣＯ２中で２４時間インキュベーションした。通常の血清（ロットＣ０４０２）から得られたプロテインＧ精製免疫グロブリンを対照として用いた。次いで、上清を捨て、完全培地（２００μｌ／ウェル）を加え、細胞は１６時間３７℃にて５％ＣＯ２中でＨ３−チミジン（１μＣｉ／ウェル）により放射線を当てた。
【００９６】
最後に細胞を収穫し、９６ウェルプレートβ線計測器を用いてＨ３−チミジン取り込み量を計測した。各４組に対する平均ｃ．ｐ．ｍ．±標準偏差（ＳＤ）値を計算した。
得られた結果によれば、対照に比べて、ポリクローナル抗血清から得られた精製免疫グロブリン処理細胞の場合、Ｈ３−チミジン取り込み量に差はなかった（図１９を参照されたい）。
【実施例１０】
【００９７】
ヒト線維芽細胞の免疫化学染色
反応性又は対照血清を混合したヒト線維芽細胞の免疫化学染色（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＤ−９８６Ｓｋ）を図２０に示す。固定された細胞を、抗イディオタイプ血清とインキュベーションしてダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させ、核をマイヤーヘマトキシリンにより染色する（図２０Ａを参照されたい）か、又は対照血清とインキュベーションしてダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させ核をマイヤーヘマトキシリンにより染色した（図２０Ｂを参照されたい）。抗イディオタイプ血清又は対照血清と細胞をインキュベーションしたいずれの場合でも、細胞膜の特異的染色は観察されなかった。どちらの状況でもポリクローナル抗血清を用いた研究に際して予期されたように、核に対するバックグラウンド染色が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の結腸腺癌である。倍率：４０倍。
【図２】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の結腸腺癌である。倍率：４０倍。
【図３】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図４】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図５】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の胃癌である。倍率：４０倍。
【図６】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の乳癌である。倍率：４０倍。
【図７】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の乳癌である。倍率：４０倍。
【図８】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の前立腺癌である。倍率：４０倍。
【図９】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の前立腺癌である。倍率：４０倍。
【図１０】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号０２２１４５）の肺腺癌である。倍率：４０倍。
【図１１】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の小腸正常組織である。倍率：４０倍。
【図１２】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の胃正常組織である。倍率：４０倍。
【図１３】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の前立腺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１４】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の前立腺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１５】ポリクローナル抗血清のＦ（ａｂ）’２画分を用いて染色したＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｂｌｏｃｋ（ダコ、ロット番号００１２１）の肺正常組織である。倍率：４０倍。
【図１６】ポリクローナル抗血清（ロット０９／０２及び０８／０２）のＨｅＬａ細胞に対するインビトロ効果の図である。ＨｅＬａ細胞を播種し、培地で２０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２及び０８／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた平均吸光度を示す。２４時間後、プレートにＭＴＳ／ＰＭＳ試薬を添加し、４時間インキュベーションした後に吸光度を記録した。
【図１７】ＭＥＭ／１％ＦＣＳ中で増殖させたＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。図１７Ａは、細胞をＭＥＭ／１％ＦＣＳ中で増殖させた（１０倍）。図１７Ｂは、細胞をＡＰＵ血清ロットＲ０９／０２（ＭＥＭ／１％ＦＣＳで２０倍希釈）に２４時間曝露させた（１０倍）。図１７Ｃは、ＭＥＭ／１％ＦＣＳ中のＨｅＬａ細胞の詳細である（４０倍）。図１７Ｄは、Ｒ０９／０２を用いたＭＥＭ／１％ＦＣＳ中のＨｅＬａ細胞である（４０倍）。
【図１８】Ｈ３−チミジン取り込み試験におけるポリクローナル抗血清のＨｅＬａ細胞に対するインビトロ効果の図である。ＨｅＬａ細胞を播種し、培地で４０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた取り込み値を示す。２４時間後、プレートに完全ＭＥＭ及びＨ３−チミジンを添加し、１６時間インキュベーションした後にＨ３−チミジンの取り込みを記録した。
【図１９】汎用腫瘍抗原に対するポリクローナル抗血清による線維芽細胞の増殖阻害の図である。線維芽細胞を播種し、培地で４０倍希釈したポリクローナル抗血清のロット０９／０２を処理した９６ウェルプレートから得られた取り込み値を示す。対照として正常血清（ロットＣ０４０２）を使用した。２４時間後、プレートに完全ＭＥＭ及びＨ３−チミジンを添加し、１６時間インキュベーションした後にＨ３−チミジンの取り込みを記録した。
【図２０】図２０Ａ：反応性血清を用いたヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６−Ｓｋ、ＡＴＣＣ）の免疫組織化学的染色を示す。固定した細胞を抗イディオタイプ血清とともにインキュベーションした。ダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させた。マイヤーのヘマトキシリンで核を染色した。図２０Ｂ：対照血清を用いたヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６−Ｓｋ、ＡＴＣＣ）の免疫組織化学的染色を示す。固定した細胞を対照血清とともにインキュベーションした。ダコＬＳＡＢ ２キットを用いて反応させた。マイヤーのヘマトキシリンで核を染色した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同じ系統（本明細書中において「同一遺伝系」）を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；
（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；
（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同じ系統（遺伝系）を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして
（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、
ことによって得られるポリクローナル抗血清を含む、医薬組成物。
【請求項２】
がんの改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造するための、請求項１で特徴付けられた方法により得られるポリクローナル抗血清の使用。
【請求項３】
免疫されるべき非ヒト動物がマウスである、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
マウスがＣＢＡ系のマウスである、請求項１若しくは３に記載の医薬組成物又は請求項２若しくは３に記載の使用。
【請求項５】
ポリクローナル抗血清が精製ポリクローナル抗血清である、請求項１、３若しくは４に記載の医薬組成物、又は請求項２、３若しくは４に記載の使用。
【請求項６】
ポリクローナル抗血清が抗血清の画分を含む、請求項１、３、４若しくは５に記載の医薬組成物、又は請求項２、３、４若しくは５に記載の使用。
【請求項７】
ポリクローナル抗血清の画分がＩｇＧ画分であるか、あるいはＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ断片画分であるか又はそれらを含む、請求項６に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項８】
ポリクローナル抗体又はその断片が治療剤に結合している、請求項７に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項９】
治療剤が、エトポシド、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カリケアマイシン、リシン、アブリン、又は放射性核種から成る群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１０】
被験者のがんを治療方法及び／又は改善する方法であって、以下の工程：前記治療又は前記改善を必要とする被験者に、請求項１、３、４、５、６、７、８、若しくは９のいずれか１項に規定された医薬組成物の医薬的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
被験者がヒトの患者である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんが、頸頭部癌、肺癌、縦隔の新生物、消化管癌、泌尿生殖器癌、精巣癌、婦人科癌、乳癌、内分泌系癌、軟部組織及び骨の肉腫、悪性中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、中枢神経系の新生物、小児癌、リンパ腫、白血病、又はエイズ関連の悪性疾患である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の使用又は請求項１０若しくは１１に記載の方法。
【請求項１３】
がんが子宮癌である、請求項１２に記載の使用又は方法。
【請求項１４】
ポリクローナル抗血清又は医薬組成物が、治療を必要とする被験者に更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて投与されるべきである、請求項２〜９、１２、１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
更なる抗増殖薬又は薬剤が、請求項１、３〜９のいずれか１項に規定された医薬組成物の投与前、投与中、又は投与後に投与されるべきである、請求項１４に記載の使用又は方法。
【請求項１６】
抗増殖薬又は薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、及びドセタキセルから成る群より選択される、請求項１４又は１５に記載の使用又は方法。
【請求項１】
以下の工程：
（ｉ） 非ヒト脊椎動物と同じ系統（本明細書中において「同一遺伝系」）を有する非ヒト脊椎動物の胚性組織に対してインビボ液性応答を誘導し；
（ｉｉ） 免疫した前記非ヒト脊椎動物から脾臓を取り出し、前記脾臓から個々の脾臓細胞／リンパ球を単離し；
（ｉｉｉ） 工程（ｉ）の非ヒト脊椎動物と同じ系統（遺伝系）を有する更なる非ヒト脊椎動物において工程（ｉｉ）で得られた単離脾臓細胞／リンパ球懸濁液に対して第２のインビボ液性応答を誘導し；そして
（ｉｖ） 前記動物から目的とするポリクローナル抗血清を単離する、
ことによって得られるポリクローナル抗血清を含む、医薬組成物。
【請求項２】
がんの改善、予防、及び／又は治療のための医薬組成物を製造するための、請求項１で特徴付けられた方法により得られるポリクローナル抗血清の使用。
【請求項３】
免疫されるべき非ヒト動物がマウスである、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
マウスがＣＢＡ系のマウスである、請求項１若しくは３に記載の医薬組成物又は請求項２若しくは３に記載の使用。
【請求項５】
ポリクローナル抗血清が精製ポリクローナル抗血清である、請求項１、３若しくは４に記載の医薬組成物、又は請求項２、３若しくは４に記載の使用。
【請求項６】
ポリクローナル抗血清が抗血清の画分を含む、請求項１、３、４若しくは５に記載の医薬組成物、又は請求項２、３、４若しくは５に記載の使用。
【請求項７】
ポリクローナル抗血清の画分がＩｇＧ画分であるか、あるいはＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ断片画分であるか又はそれらを含む、請求項６に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項８】
ポリクローナル抗体又はその断片が治療剤に結合している、請求項７に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項９】
治療剤が、エトポシド、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カリケアマイシン、リシン、アブリン、又は放射性核種から成る群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１０】
被験者のがんを治療方法及び／又は改善する方法であって、以下の工程：前記治療又は前記改善を必要とする被験者に、請求項１、３、４、５、６、７、８、若しくは９のいずれか１項に規定された医薬組成物の医薬的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
被験者がヒトの患者である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんが、頸頭部癌、肺癌、縦隔の新生物、消化管癌、泌尿生殖器癌、精巣癌、婦人科癌、乳癌、内分泌系癌、軟部組織及び骨の肉腫、悪性中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、中枢神経系の新生物、小児癌、リンパ腫、白血病、又はエイズ関連の悪性疾患である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の使用又は請求項１０若しくは１１に記載の方法。
【請求項１３】
がんが子宮癌である、請求項１２に記載の使用又は方法。
【請求項１４】
ポリクローナル抗血清又は医薬組成物が、治療を必要とする被験者に更なる抗増殖薬又は薬剤と組み合わせて投与されるべきである、請求項２〜９、１２、１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
更なる抗増殖薬又は薬剤が、請求項１、３〜９のいずれか１項に規定された医薬組成物の投与前、投与中、又は投与後に投与されるべきである、請求項１４に記載の使用又は方法。
【請求項１６】
抗増殖薬又は薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、及びドセタキセルから成る群より選択される、請求項１４又は１５に記載の使用又は方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５４２３２５（Ｐ２００８−５４２３２５Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１４０２５（Ｐ２００８−５１４０２５）
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５２６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２８７１５
【国際公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【出願人】（５０５１７１９６４）ウィドネス・カンパニー・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５２６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２８７１５
【国際公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【出願人】（５０５１７１９６４）ウィドネス・カンパニー・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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