熱処理なしのキャノーラタンパク質単離物「Ｃ２００Ｃａ」の製造
キャノーラタンパク質ミセル塊の沈殿による上澄み液を処理して、水性の酸性環境に可溶性であるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００８年８月１８日出願の米国特許仮出願第６１／１３６，１９３号から米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、キャノーラタンパク質単離物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６Ａ１号およびＷＯ０２／０８９５９７）および２００４年６月９日出願の米国特許出願第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３Ａ１号）に記載の方法によって油糧種子粗粉から形成することができる。この手順は、塩水溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させるステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈し、タンパク質のミセルの形成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて非晶質、粘着性で、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）（ＰＭＭ）を形成するステップと、タンパク質ミセル塊を、少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する上澄み液から回収するステップとを含む多数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いる場合、タンパク質含量は、乾燥重量基準で測定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００３】
本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００４】
米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の手順は、基本的に回分式手順である。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４−００３９１７４Ａ１号およびＷＯ０３／０４３４３９）および２００５年３月５日出願の米国特許出願第１０／４９６，０７１号（米国特許出願公開第２００３−００１５９１０Ａ１号）では、キャノーラタンパク質単離物を作るための連続プロセスが記載されている。それによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液と連続的に混合し、その混合物を、パイプを通して輸送し、同時にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質のミセルの形成をもたらし、そのタンパク質のミセルを連続的に沈降させ、同時に所望の量のＰＭＭが沈降容器に蓄積するまで上澄み液を連続的にあふれさせる。ＰＭＭを沈降容器から回収し、乾燥させることができる。ＰＭＭは、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する。上記のように、あふれた上澄み液を処理してそこからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００５】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４−００３４２００Ａ１号およびＷＯ０３／０８８７６０）および２００５年４月２９日出願の米国特許出願第１０／５１０，７６６号（米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８Ａ１号）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを形成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。
【０００６】
この点について、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する。したがって、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質であり、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、２Ｓタンパク質は、約１４０００ダルトンの分子量を有し、７Ｓタンパク質は約１４５０００ダルトンの分子量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９００００ダルトンの分子質を有する。
【０００７】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００５年１月２１日出願の米国特許第１１／０３８，０８６号（米国特許公開（Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第２００５−０１８１１１２ Ａ１号およびＷＯ２００５／０６７７２９）および２００８年６月２０日出願の同第１２／２１３，５００号では、上澄み液を加熱処理して７Ｓタンパク質を沈殿させ、２Ｓタンパク質が豊富なタンパク質水溶液を得る手順が記載されている。このタンパク質水溶液を乾燥させて２Ｓが豊富なキャノーラタンパク質単離物を得ることができる。このキャノーラタンパク質単離物により、例えば、特にキャノーラタンパク質単離物の添加により透明度が損なわれない酸性ｐＨ値で、タンパク質で強化した飲料を調製することを可能にする、広範囲の酸性ｐＨ値にわたる溶解度および水性媒体における透明度を含めた多くの利益がもたらされる。
【０００８】
キャノーラは、菜種（ｒａｐｅｓｅｅｄ）またはアブラナ（ｏｉｌ ｓｅｅｄ ｒａｐｅ）としても知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３−００１５９１０号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４−００３４２００号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５−０１８１１１２号
【発明の概要】
【００１０】
２Ｓタンパク質が豊富なキャノーラタンパク質単離物と等しい特性の製品を、熱処理ステップなしで調製できることが今や分かった。熱処理ステップを省くことにより、７Ｓタンパク質を上澄み液から除去する必要がないため、色および味覚が改善し、全体の収率が増加する。得られたキャノーラタンパク質単離物は、低ｐＨの水中で完全に可溶性、透明および熱安定性であるだけではなく、一般的にフィチン酸が少ない。低ｐＨの溶液における熱安定性は、高温充填用途（ｈｏｔ ｆｉｌｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）などの熱処理を許す。キャノーラタンパク質単離物は、タンパク質の沈殿をもたらすことなく、人間が消費するための製品、特に、ソフトドリンクおよびスポーツドリンク、ならびに他の水系のタンパク質強化などに有用である。キャノーラタンパク質単離物は、ペットフードおよび養殖（ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ）などの人間以外の動物の食品用途にも有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によると、乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊の沈殿による上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウム沈殿物を形成させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して透明な溶液を得るステップと、
場合により、透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、
場合により、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
上澄み液は、カルシウム塩の添加の前に中間濃度まで部分的に濃縮することができる。形成する沈殿物を除去し、得られた溶液を上記のように酸性化し、最終濃度までさらに濃縮し、次いで、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１３】
あるいは、上澄み液は、最初に最終濃度まで濃縮することができ、カルシウム塩を濃縮上澄み液に添加し、得られた沈殿物を除去し、溶液を酸性化し、次いで、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１４】
上記の方法の別の変法では、沈殿物が形成しないように最初に少量のカルシウム塩を上澄み液に添加し、溶液を酸性化し、中間濃度まで部分的に濃縮し、追加量のカルシウム塩を部分濃縮上澄み液に添加すると、沈殿物が形成する。
【００１５】
沈殿物を除去し、溶液をその最終濃度まで濃縮し、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１６】
上記の手順では、沈殿物の除去を省略することも選択肢の１つであり、それにより、製品中により高いフィチン酸塩含量がもたらされる。このような手順では、カルシウム塩を上澄み液、部分濃縮上澄み液または完全濃縮上澄み液に添加し、沈殿物は除去しない。酸性化により沈殿物の再可溶化がもたらされる。
【００１７】
さらなる選択肢は、酸性化を省略し、自然ｐＨで溶液の処理を行うことである。この選択肢では、カルシウム塩を、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に添加して沈殿物を形成させ、沈殿物を除去する。次いで、得られた溶液を、上記のように酸性化ステップなしで処理する。
【００１８】
上澄み液をカルシウム塩の添加の前に部分的に濃縮し、沈殿物の除去後に完全に濃縮する場合、上澄み液は、最初に約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで濃縮し、次いで、沈殿物の除去後に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌの濃度まで濃縮する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、カルシウム塩は、二段階で添加することができる。この実施形態では、沈殿物の形成をもたらすのに不十分な少量のカルシウムを上澄み液に添加して、約１ｍＳ〜約３．５ｍＳ、好ましくは約１ｍＳ〜約２ｍＳの導電率を得る。
【００２０】
得られた溶液を上記の条件下で酸性化し、部分的に濃縮する。カルシウム塩の残り（ｂａｌａｎｃｅ）を部分濃縮溶液に添加して、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得ると、沈殿物の形成がもたらされる。次いで、沈殿物を除去する。次いで、得られた透明な溶液を上記の条件下で濃縮する。
【００２１】
本発明の方法に従って製造されるキャノーラタンパク質単離物は、タンパク質単離物の従来の用途、例えば、加工食品および飲料のタンパク質強化、油の乳化、焼いた食品における組織形成剤（ｂｏｄｙ ｆｏｒｍｅｒ）およびガスを閉じ込める製品における発泡剤などで使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質単離物は、肉類似食品において有用なタンパク繊維に形成することができ、つなぎとして卵白が使用される食品において卵白代替物または増量剤として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の用途は、ペットフード、動物飼料ならびに工業および化粧品用途ならびにパーソナルケア製品におけるものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の概略説明
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００２３】
塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、かなりの量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後のイオン強度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液のイオン強度は、当該塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００２４】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に要する希釈度がより大きくなることを考慮して、約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが通常好ましい。
【００２５】
回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。
【００２６】
この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方で存在するタンパク質のいくらかの変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。
【００２７】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約１０℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。
【００２８】
食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する。この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。
【００２９】
可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３０】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。
【００３１】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３２】
塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００３３】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００３４】
キャノーラタンパク質の最終単離物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色の観点から、改善することができる。色素の除去に透析濾過を使用することもできる。
【００３５】
このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。
【００３６】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。
【００３７】
水のみの使用では、塩水溶液よりも油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液による油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。
【００３８】
別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液により油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００３９】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。
【００４０】
タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。
【００４１】
濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。
【００４２】
周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、かなりの割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。
【００４３】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度（ｍｏｌａｒｉｔｙ）およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、タンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜などの、異なる分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する分離膜を使用して行うことができる。
【００４４】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００４５】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０°〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。
【００４６】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。
【００４７】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記着色除去操作の代替として、ある着色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００４８】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００４９】
任意選択の着色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、微生物負荷を減らすために低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液を、約５５°〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に冷却することができる。
【００５０】
濃縮ステップおよび任意選択の透析濾過ステップで使用する温度、ならびに低温殺菌ステップを行うかどうかに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０°で約６０℃まで、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を減少させ、引き続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水による希釈時にミセル形成が起こらない温度を超えて加熱すべきではない。
【００５１】
次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択の透析濾過ステップ、任意選択の着色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、その濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を得るのに必要な容積を有する冷水と混合することによって希釈してミセル形成を行う。ミセル経路によって得ようとするキャノーラタンパク質の割合および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。一般に、より低い希釈レベルでは、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相中に残留する。
【００５２】
ミセル経路によって最も高い割合のタンパク質を得ることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約５倍〜約２５倍、好ましくは約１０倍〜約２０倍で希釈する。
【００５３】
濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般的に約１°〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有するが、その理由は、使用する希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）ではこれらのより冷たい温度で、改善された収率のタンパク質ミセル塊形状のタンパク質単離物が得られるからである。
【００５４】
回分操作では、濃縮タンパク質溶液のバッチを、上記のように所望の容積を有する冷水の静止体（ｓｔａｔｉｃ ｂｏｄｙ）に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈および結果として生じるイオン強度の減少は、ミセル形状の離散したタンパク質小滴の形態を取る高度に会合したタンパク質分子の雲様塊の形成を引き起こす。回分式手順では、タンパク質のミセルは、冷水体中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成する。沈降は、遠心分離などによって促進する（ａｓｓｉｓｔｅｄ）ことができる。このように誘導された沈降により、タンパク質ミセル塊の液体含量が減少し、それにより、水分含量は一般的に全ミセル塊の約７０重量％〜約９５重量％から、一般的に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにしてミセル塊の水分含量が減少すると、ミセル塊の吸蔵塩含量も減少し、結果として乾燥単離物の塩含量も減少する。
【００５５】
あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型パイプの一方の入口に連続的に通すと同時に、希釈水をＴ字型パイプの他方の入口に供給して、パイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な速度で、Ｔ字型パイプ中に供給する。
【００５６】
濃縮タンパク質溶液および希釈水のパイプ中での混合により、タンパク質のミセルの形成が開始され、混合物はＴ字型パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったときに、この沈降容器から上澄み液をあふれさせる。混合物は、好ましくは、液体内の乱流を最小化するように、沈降容器中の液体中に供給する。
【００５７】
連続手順では、タンパク質のミセルは、沈降容器中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底に蓄積するまでこの手順を続け、その後すぐに（ｗｈｅｒｅｕｐｏｎ）蓄積したＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代わりに、遠心分離によってＰＭＭを連続的に分離することができる。
【００５８】
少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へのタンパク質溶液の濃縮に関するプロセスのパラメータの組み合わせ、および約１０〜約２０の希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）の使用により、上記米国特許で論じた既知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれを使用して達成されるよりも、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル塊形状のタンパク質回収に関して、より高い収率、多くの場合、有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）高い収率が得られ、しかもタンパク質含量に関してずっと高い純度の単離物が得られる。
【００５９】
回分プロセスと比較して、キャノーラタンパク質単離物の回収のために連続プロセスを利用することにより、同じレベルのタンパク質抽出に関して、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ抽出ステップにおいて、著しく高い温度を使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順よりも汚染の機会が少なく、より高い製品品質が得られ、より小型の装置でプロセスを行うことができる。
【００６０】
沈降したＰＭＭは、沈降した塊からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿った形態で使用することも、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にすることもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０ｗｔ％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を使用した場合、脂肪性油糧種子粗粉から単離した乾燥ＰＭＭも残留脂肪含量が低く、それは約１ｗｔ％未満になり得る。
【００６１】
上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、ＰＭＭは、主として、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する７Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６２】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップでは沈殿しない、かなりの量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理して、そこからキャノーラタンパク質単離物を回収する。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物は、主として、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する、２Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６３】
本発明では、カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを、以下に記載の手段によって最初に濃縮または部分的に濃縮することができる上澄み液に添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは８ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得る。上澄み液に添加された塩化カルシウムは、その濃縮水溶液などの任意の所望の形態でもよい。
【００６４】
塩化カルシウムの添加は、フィチン酸をフィチン酸カルシウムの形態で上澄み液から沈殿させ（ｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇ）、上澄み液のグロブリンおよびアルブミン画分の両方を保持する効果を有する。沈殿した（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）フィチン酸塩を、遠心分離および／または濾過などにより上澄み液から回収して、透明な溶液を得る。所望であれば、沈殿した（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）フィチン酸塩は除去しなくてもよく、その場合、さらなる処理により、より高いフィチン酸塩含量を有する製品が生じる。
【００６５】
次いで、溶液のｐＨを、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜３．２の値に調整する。ｐＨ調整は、塩酸の添加などの任意の好都合な手段によって行うことができる。所望であれば、酸性化ステップは、本明細書に記載の様々な選択肢から省略することができる。
【００６６】
ｐＨ調整した透明な溶液は、まだ濃縮していないならば、濃縮してそのタンパク質濃度を増加させる。このような濃縮は、塩、炭水化物、色素およびタンパク質供給源材料から抽出された他の低分子量物質を含めた低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、かなりの割合のキャノーラタンパク質を溶液中に保持する、適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜を使用した、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行う。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する限外濾過膜を使用することができる。このような上澄み液の濃縮は、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も減少させる。上澄み液は、一般的に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記したように、回分様式または連続操作で行うことができる。
【００６７】
上澄み液をカルシウム塩の添加の前に部分的に濃縮し、沈殿物の除去後に完全に濃縮する場合、上澄み液は、最初に約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで濃縮し、次いで、沈殿物の除去後に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌの濃度まで濃縮する。
【００６８】
本発明の一実施形態では、カルシウム塩は二段階で添加することができる。この実施形態では、沈殿物の形成をもたらすのに不十分な少量のカルシウムを上澄み液に添加して、約１ｍＳ〜約３．５ｍＳ、好ましくは約１ｍＳ〜約２ｍＳの導電率を得る。
【００６９】
得られた溶液を上記の条件下で酸性化し、部分的に濃縮する。カルシウム塩の残り（ｂａｌａｎｃｅ）を部分濃縮溶液に添加すると、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率が得られ、沈殿物の形成が起こる。次いで、沈殿物を除去する。次いで、得られた透明な溶液を上記の条件下で濃縮する。
【００７０】
次いで、濃縮上澄み液は、水を使用した透析濾過ステップに供することができる。水は、その自然ｐＨ、透析濾過されているタンパク質溶液と等しいｐＨまたは中間の任意のｐＨでもよい。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、上澄み水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望であれば、透析濾過は、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜などの分離膜を使用して行うことができる。
【００７１】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００７２】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記着色除去操作の代替法として、ある着色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００７３】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００７４】
濃縮され、場合により透析濾過され、場合により着色除去の処理を受けたタンパク質溶液は、噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にする。乾燥したキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．を超える、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。キャノーラタンパク質単離物は、一般的にフィチン酸含量が少なく、一般的に約１．５重量％未満である。
【００７５】
本発明で製造するキャノーラタンパク質単離物は、アルブミンおよびグロブリン画分の両方を含有し、酸性の水環境に可溶性であり、単離物を、炭酸および非炭酸の両方の飲料への組込に理想的なものにして、飲料にタンパク質強化をもたらす。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲の酸性ｐＨ値を有する。本発明で提供するキャノーラタンパク質単離物は、例えば１２液量オンスの量当たり少なくとも約５ｇのキャノーラタンパク質単離物など、任意の好都合な量でこのような飲料に添加して、このような飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。添加されたキャノーラタンパク質単離物は、飲料に完全に溶解し、熱処理後でさえ飲料の透明度を損なわない。キャノーラタンパク質単離物は、水への溶解による飲料の液戻し（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の前に、乾燥した飲料とブレンドすることができる。
【実施例】
【００７６】
例１：
この例では、カルシウム塩を上澄み液に添加し、沈殿物を除去し、次いで、溶液を酸性化し、さらに処理する、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造方法を説明する。
【００７７】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００７８】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」まで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。濃縮タンパク質溶液を６０℃で「ｌ」分間（複数可）低温殺菌して、「ｎ」重量％のタンパク質含量を有する低温殺菌された濃縮タンパク質溶液「ｍ」ｋｇを得た。
【００７９】
「ｏ」℃の濃縮された溶液を、「ｑ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｐ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離によって、濾過したタンパク質溶液の「ｒ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｔ」Ｃ３０７Ｃという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００８０】
３つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｔ」を以下の表Ｉに示す。
【００８１】
【表１】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿による上澄み液に対して行った。
【００８２】
上澄み液「ｕ」Ｌを、塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｘ」重量％のタンパク質濃度の、フィチン酸塩含量が低下した清澄なタンパク質溶液「ｗ」Ｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下した清澄なタンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｙ」に調整し、「ａａ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｚ」Ｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ａｂ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の逆浸透精製（ＲＯ）水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ａｃ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｄ」ｗｔ％であった。濃縮物の「ａｅ」Ｌ部分を、ｐＨ３および「ａｇ」ＢＶ／ｈｒの速度で総容積（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）（ＢＶ）「ａｆ」Ｌの粒状活性炭に通すことにより着色減少ステップに供した。次いで、着色が減少し、「ａｉ」重量％のタンパク質含量を有するＧＡＣ処理した溶液「ａｈ」Ｌを噴霧乾燥させ、「ｔ」Ｃ２００ＣａＣという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。Ｃ２００ＣａＣは、「ａｊ」（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の残り「ａｋ」を、さらなる精製ステップなしで噴霧乾燥させて、「ａｌ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、「ｔ」Ｃ２００Ｃａという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた最終生成物を形成した。３つの実験についてのパラメータ「ｔ」〜「ａｌ」を以下の表ＩＩに示す。
【００８３】
【表２】
例２：
この例では、さらなる処理なしで乾燥させた場合に、カルシウム塩の上澄み液への添加により形成した沈殿物を酸性化およびさらなる処理の前に除去しない、本発明の一実施形態による単離物を生成するはずの濃縮キャノーラタンパク質溶液の製造を説明する。
【００８４】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００８５】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」ｋｇまで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。濃縮タンパク質溶液を６０℃で１分間低温殺菌して、「ｍ」重量％のタンパク質含量を含有する低温殺菌された濃縮タンパク質溶液「ｌ」ｋｇを得た。
【００８６】
「ｎ」℃の低温殺菌された濃縮された溶液を、「ｐ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｏ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｑ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｒ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｓ」Ｃ３００という名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００８７】
１つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｓ」を以下の表ＩＩＩに示す。
【００８８】
【表３】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿による上澄み液に対して行った。
【００８９】
「ｕ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｔ」Ｌを、塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整し、結果として濁りが形成した。次いで、タンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｗ」に調整し、サンプルを透明化した。次いで、この溶液の一定分量「ｘ」Ｌを、「ｚ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｙ」Ｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ａａ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水により透析濾過した。「ａｃ」重量％のタンパク質を含有する透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）「ａｂ」ｋｇを得た。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過されたタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｄ」ｗｔ％であった。１つの実験についてのパラメータ「ｓ」〜「ａｄ」を以下の表ＩＶに示す。
【００９０】
【表４】
例３：
この例では、さらなる処理なしで乾燥させた場合に、カルシウム塩を部分濃縮上澄み液に添加し、沈殿物を除去し、サンプルを酸性化する本発明の一実施形態に従って、単離物を生成するはずの濃縮キャノーラタンパク質溶液の製造を説明する。
【００９１】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００９２】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」ｋｇまで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００９３】
「ｌ」℃の濃縮された溶液を、「ｎ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｍ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｏ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｐ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｑ」Ｃ３０２という名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００９４】
１つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｑ」を以下の表Ｖに示す。
【００９５】
【表５】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による部分濃縮上澄み液に対して行った。
【００９６】
「ｓ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｒ」Ｌを、「ｔ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積減少率（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）７まで濃縮した。次いで、「ｕ」Ｌの容積および「ｖ」重量％のタンパク質含量を有する部分濃縮上澄み液を、タンパク質の３．５重量％の塩化カルシウムの添加により「ｗ」ｍＳの導電率に調整し、結果として濁りが形成した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｙ」重量％のタンパク質含量の、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された、部分濃縮タンパク質溶液「ｘ」Ｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された、部分濃縮タンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｚ」に調整し、上澄み液の最初の濃縮に使用した同じ膜（ｓａｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ）を使用して限外濾過によって「ａａ」Ｌまでさらに濃縮した。次いで、濃縮された溶液を、「ａｂ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水を用いて同じ膜で透析濾過した。透析濾過した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）は透明であり、「ａｃ」ｋｇの重量および「ａｄ」重量％のタンパク質含量を有しており、結果として、収率は濾過したタンパク質溶液の「ａｅ」ｗｔ％であった。
【００９７】
１つの実験についてのパラメータ「ｒ」〜「ａｅ」を以下の表ＶＩに示す。
【００９８】
【表６】
例４：
この例では、カルシウム塩を上澄み液ならびに部分濃縮上澄み液に添加し、第２の添加後に形成した沈殿物を除去する、本発明の一実施形態によるキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【００９９】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【０１００】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」まで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。次いで、濃縮タンパク質溶液を、濃縮ステップに使用したのと同じ膜で、「ｌ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の「ｃ」Ｍ ＮａＣｌにより透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ｍ」重量％のタンパク質を含有していた。
【０１０１】
「ｎ」℃の濃縮された溶液を、「ｐ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｏ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｑ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｒ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｓ」Ｃ３０７Ｃという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【０１０２】
２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｓ」を以下の表ＶＩＩに示す。
【０１０３】
【表７】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、上澄み液およびＰＭＭ沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による部分濃縮上澄み液に対して行った。
【０１０４】
「ｕ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｔ」Ｌを、タンパク質の重量当たり２．５％の塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整すると、濁りは形成しなかった。次いで、溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｗ」に調整した。塩化カルシウム処理し、ｐＨを調整した上澄み液「ｘ」Ｌを、「ｙ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積減少率（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）７まで濃縮した。次いで、「ｚ」Ｌの容積および「ａａ」重量％のタンパク質含量を有する部分濃縮上澄み液を、タンパク質の２．５重量％の塩化カルシウムの添加により「ａｂ」ｍＳの導電率に調整し、結果として濁りが形成した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿した物質を除去し、結果として、「ａｄ」重量％のタンパク質含量の、清澄化された部分濃縮タンパク質溶液「ａｃ」Ｌを得た。次いで、清澄化された部分濃縮タンパク質溶液を、上澄み液の最初の濃縮に使用したのと同じ膜を使用して限外濾過によって「ａｅ」Ｌまでさらに濃縮した。次いで、濃縮された溶液を、同じ膜で「ａｆ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ａｇ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｈ」ｗｔ％であった。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の一定分量「ａｉ」ｋｇを、ｐＨ３および「ａｋ」ＢＶ／ｈｒの速度で粒状活性炭の「ａｊ」Ｌ ＢＶに通すことにより着色減少ステップに供した。次いで、着色が減少し、「ａｍ」重量％のタンパク質含量を有するＧＡＣ処理した溶液「ａｌ」ｋｇを噴霧乾燥させ、「ｓ」Ｃ２００ＣａＣという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。Ｃ２００ＣａＣは、「ａｎ」％ｗｔ（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の残りの「ａｏ」を、さらなる精製ステップなしで噴霧乾燥させて、「ａｐ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、「ｓ」Ｃ２００Ｃａという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた最終生成物を形成した。
【０１０５】
２つの実験についてのパラメータ「ｓ」〜「ａｐ」を以下の表ＶＩＩＩに示す。
【０１０６】
【表８】
例５：
この例では、酸性化ステップがない、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【０１０７】
キャノーラ粗粉「ａ」グラムを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」ｍｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化し、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有するタンパク質溶液「ｄ」ｍｌを得た。タンパク質抽出溶液の一定分量「ｆ」ｍｌを、「ｈ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するセルロース膜での濃縮により、容積を「ｇ」ｍｌに減少させた。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｉ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【０１０８】
「ｊ」℃の濃縮された溶液を、「ｌ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｋ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を遠心分離により回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。
【０１０９】
実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｍ」を以下の表ＩＸに示す。
【０１１０】
【表９】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、上澄み液に対して行った。
【０１１１】
「ｎ」ｍｌ上澄み液を、濃縮された溶液からの（ｆｒｏｍ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）塩化カルシウムの添加により導電率「ｏ」ｍＳに調整した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｑ」重量％の濃度の、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化されたタンパク質溶液「ｐ」ｍｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された上澄み液を、「ｓ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するセルロース膜を使用して限外濾過によって容積を「ｒ」ｍｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ｔ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ｕ」重量％のタンパク質を含有し、「ｖ」ｍｌの容積を有していた。この溶液を、さらなる精製ステップなしで凍結乾燥させ、「ｗ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する最終生成物を形成させた。実験についてのパラメータ「ｎ」〜「ｗ」を以下の表Ｘに示す。
【０１１２】
【表１０】
凍結乾燥した生成物を自然ｐＨの水中で再可溶化した。透明度の指標として、６００ｎｍ（Ａ６００）での吸光度を測定した。次いで、溶液を半分に分割し、半分をｐＨ３に調整し、残りの半分はｐＨ６に調整した。それぞれのＡ６００を再び読み取った。得られた結果を以下の表ＸＩに示す。
【０１１３】
【表１１】
全てのサンプルは視覚的に透明であった。
開示の概要
本開示を要約すると、ＰＭＭ形成および沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による上澄み液の熱処理により製造される２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物と等しい特性の、２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物が製造される。本発明の範囲内で、改変が可能である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００８年８月１８日出願の米国特許仮出願第６１／１３６，１９３号から米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、キャノーラタンパク質単離物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６Ａ１号およびＷＯ０２／０８９５９７）および２００４年６月９日出願の米国特許出願第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３Ａ１号）に記載の方法によって油糧種子粗粉から形成することができる。この手順は、塩水溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させるステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈し、タンパク質のミセルの形成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて非晶質、粘着性で、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）（ＰＭＭ）を形成するステップと、タンパク質ミセル塊を、少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する上澄み液から回収するステップとを含む多数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いる場合、タンパク質含量は、乾燥重量基準で測定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００３】
本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００４】
米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の手順は、基本的に回分式手順である。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４−００３９１７４Ａ１号およびＷＯ０３／０４３４３９）および２００５年３月５日出願の米国特許出願第１０／４９６，０７１号（米国特許出願公開第２００３−００１５９１０Ａ１号）では、キャノーラタンパク質単離物を作るための連続プロセスが記載されている。それによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液と連続的に混合し、その混合物を、パイプを通して輸送し、同時にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質のミセルの形成をもたらし、そのタンパク質のミセルを連続的に沈降させ、同時に所望の量のＰＭＭが沈降容器に蓄積するまで上澄み液を連続的にあふれさせる。ＰＭＭを沈降容器から回収し、乾燥させることができる。ＰＭＭは、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する。上記のように、あふれた上澄み液を処理してそこからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００５】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４−００３４２００Ａ１号およびＷＯ０３／０８８７６０）および２００５年４月２９日出願の米国特許出願第１０／５１０，７６６号（米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８Ａ１号）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを形成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。
【０００６】
この点について、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する。したがって、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質であり、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、２Ｓタンパク質は、約１４０００ダルトンの分子量を有し、７Ｓタンパク質は約１４５０００ダルトンの分子量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９００００ダルトンの分子質を有する。
【０００７】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００５年１月２１日出願の米国特許第１１／０３８，０８６号（米国特許公開（Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第２００５−０１８１１１２ Ａ１号およびＷＯ２００５／０６７７２９）および２００８年６月２０日出願の同第１２／２１３，５００号では、上澄み液を加熱処理して７Ｓタンパク質を沈殿させ、２Ｓタンパク質が豊富なタンパク質水溶液を得る手順が記載されている。このタンパク質水溶液を乾燥させて２Ｓが豊富なキャノーラタンパク質単離物を得ることができる。このキャノーラタンパク質単離物により、例えば、特にキャノーラタンパク質単離物の添加により透明度が損なわれない酸性ｐＨ値で、タンパク質で強化した飲料を調製することを可能にする、広範囲の酸性ｐＨ値にわたる溶解度および水性媒体における透明度を含めた多くの利益がもたらされる。
【０００８】
キャノーラは、菜種（ｒａｐｅｓｅｅｄ）またはアブラナ（ｏｉｌ ｓｅｅｄ ｒａｐｅ）としても知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３−００１５９１０号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４−００３４２００号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５−０１８１１１２号
【発明の概要】
【００１０】
２Ｓタンパク質が豊富なキャノーラタンパク質単離物と等しい特性の製品を、熱処理ステップなしで調製できることが今や分かった。熱処理ステップを省くことにより、７Ｓタンパク質を上澄み液から除去する必要がないため、色および味覚が改善し、全体の収率が増加する。得られたキャノーラタンパク質単離物は、低ｐＨの水中で完全に可溶性、透明および熱安定性であるだけではなく、一般的にフィチン酸が少ない。低ｐＨの溶液における熱安定性は、高温充填用途（ｈｏｔ ｆｉｌｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）などの熱処理を許す。キャノーラタンパク質単離物は、タンパク質の沈殿をもたらすことなく、人間が消費するための製品、特に、ソフトドリンクおよびスポーツドリンク、ならびに他の水系のタンパク質強化などに有用である。キャノーラタンパク質単離物は、ペットフードおよび養殖（ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ）などの人間以外の動物の食品用途にも有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によると、乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊の沈殿による上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウム沈殿物を形成させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して透明な溶液を得るステップと、
場合により、透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、
場合により、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
上澄み液は、カルシウム塩の添加の前に中間濃度まで部分的に濃縮することができる。形成する沈殿物を除去し、得られた溶液を上記のように酸性化し、最終濃度までさらに濃縮し、次いで、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１３】
あるいは、上澄み液は、最初に最終濃度まで濃縮することができ、カルシウム塩を濃縮上澄み液に添加し、得られた沈殿物を除去し、溶液を酸性化し、次いで、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１４】
上記の方法の別の変法では、沈殿物が形成しないように最初に少量のカルシウム塩を上澄み液に添加し、溶液を酸性化し、中間濃度まで部分的に濃縮し、追加量のカルシウム塩を部分濃縮上澄み液に添加すると、沈殿物が形成する。
【００１５】
沈殿物を除去し、溶液をその最終濃度まで濃縮し、場合により透析濾過し、乾燥させる。
【００１６】
上記の手順では、沈殿物の除去を省略することも選択肢の１つであり、それにより、製品中により高いフィチン酸塩含量がもたらされる。このような手順では、カルシウム塩を上澄み液、部分濃縮上澄み液または完全濃縮上澄み液に添加し、沈殿物は除去しない。酸性化により沈殿物の再可溶化がもたらされる。
【００１７】
さらなる選択肢は、酸性化を省略し、自然ｐＨで溶液の処理を行うことである。この選択肢では、カルシウム塩を、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に添加して沈殿物を形成させ、沈殿物を除去する。次いで、得られた溶液を、上記のように酸性化ステップなしで処理する。
【００１８】
上澄み液をカルシウム塩の添加の前に部分的に濃縮し、沈殿物の除去後に完全に濃縮する場合、上澄み液は、最初に約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで濃縮し、次いで、沈殿物の除去後に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌの濃度まで濃縮する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、カルシウム塩は、二段階で添加することができる。この実施形態では、沈殿物の形成をもたらすのに不十分な少量のカルシウムを上澄み液に添加して、約１ｍＳ〜約３．５ｍＳ、好ましくは約１ｍＳ〜約２ｍＳの導電率を得る。
【００２０】
得られた溶液を上記の条件下で酸性化し、部分的に濃縮する。カルシウム塩の残り（ｂａｌａｎｃｅ）を部分濃縮溶液に添加して、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得ると、沈殿物の形成がもたらされる。次いで、沈殿物を除去する。次いで、得られた透明な溶液を上記の条件下で濃縮する。
【００２１】
本発明の方法に従って製造されるキャノーラタンパク質単離物は、タンパク質単離物の従来の用途、例えば、加工食品および飲料のタンパク質強化、油の乳化、焼いた食品における組織形成剤（ｂｏｄｙ ｆｏｒｍｅｒ）およびガスを閉じ込める製品における発泡剤などで使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質単離物は、肉類似食品において有用なタンパク繊維に形成することができ、つなぎとして卵白が使用される食品において卵白代替物または増量剤として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の用途は、ペットフード、動物飼料ならびに工業および化粧品用途ならびにパーソナルケア製品におけるものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の概略説明
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００２３】
塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、かなりの量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後のイオン強度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液のイオン強度は、当該塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００２４】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に要する希釈度がより大きくなることを考慮して、約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが通常好ましい。
【００２５】
回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。
【００２６】
この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方で存在するタンパク質のいくらかの変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。
【００２７】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約１０℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。
【００２８】
食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する。この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。
【００２９】
可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３０】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。
【００３１】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３２】
塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００３３】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００３４】
キャノーラタンパク質の最終単離物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色の観点から、改善することができる。色素の除去に透析濾過を使用することもできる。
【００３５】
このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。
【００３６】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。
【００３７】
水のみの使用では、塩水溶液よりも油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液による油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。
【００３８】
別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液により油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００３９】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。
【００４０】
タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。
【００４１】
濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。
【００４２】
周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、かなりの割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。
【００４３】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度（ｍｏｌａｒｉｔｙ）およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、タンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜などの、異なる分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する分離膜を使用して行うことができる。
【００４４】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００４５】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０°〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。
【００４６】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。
【００４７】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記着色除去操作の代替として、ある着色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００４８】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００４９】
任意選択の着色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、微生物負荷を減らすために低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液を、約５５°〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に冷却することができる。
【００５０】
濃縮ステップおよび任意選択の透析濾過ステップで使用する温度、ならびに低温殺菌ステップを行うかどうかに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０°で約６０℃まで、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を減少させ、引き続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水による希釈時にミセル形成が起こらない温度を超えて加熱すべきではない。
【００５１】
次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択の透析濾過ステップ、任意選択の着色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、その濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を得るのに必要な容積を有する冷水と混合することによって希釈してミセル形成を行う。ミセル経路によって得ようとするキャノーラタンパク質の割合および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。一般に、より低い希釈レベルでは、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相中に残留する。
【００５２】
ミセル経路によって最も高い割合のタンパク質を得ることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約５倍〜約２５倍、好ましくは約１０倍〜約２０倍で希釈する。
【００５３】
濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般的に約１°〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有するが、その理由は、使用する希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）ではこれらのより冷たい温度で、改善された収率のタンパク質ミセル塊形状のタンパク質単離物が得られるからである。
【００５４】
回分操作では、濃縮タンパク質溶液のバッチを、上記のように所望の容積を有する冷水の静止体（ｓｔａｔｉｃ ｂｏｄｙ）に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈および結果として生じるイオン強度の減少は、ミセル形状の離散したタンパク質小滴の形態を取る高度に会合したタンパク質分子の雲様塊の形成を引き起こす。回分式手順では、タンパク質のミセルは、冷水体中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成する。沈降は、遠心分離などによって促進する（ａｓｓｉｓｔｅｄ）ことができる。このように誘導された沈降により、タンパク質ミセル塊の液体含量が減少し、それにより、水分含量は一般的に全ミセル塊の約７０重量％〜約９５重量％から、一般的に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにしてミセル塊の水分含量が減少すると、ミセル塊の吸蔵塩含量も減少し、結果として乾燥単離物の塩含量も減少する。
【００５５】
あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型パイプの一方の入口に連続的に通すと同時に、希釈水をＴ字型パイプの他方の入口に供給して、パイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な速度で、Ｔ字型パイプ中に供給する。
【００５６】
濃縮タンパク質溶液および希釈水のパイプ中での混合により、タンパク質のミセルの形成が開始され、混合物はＴ字型パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったときに、この沈降容器から上澄み液をあふれさせる。混合物は、好ましくは、液体内の乱流を最小化するように、沈降容器中の液体中に供給する。
【００５７】
連続手順では、タンパク質のミセルは、沈降容器中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底に蓄積するまでこの手順を続け、その後すぐに（ｗｈｅｒｅｕｐｏｎ）蓄積したＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代わりに、遠心分離によってＰＭＭを連続的に分離することができる。
【００５８】
少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へのタンパク質溶液の濃縮に関するプロセスのパラメータの組み合わせ、および約１０〜約２０の希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）の使用により、上記米国特許で論じた既知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれを使用して達成されるよりも、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル塊形状のタンパク質回収に関して、より高い収率、多くの場合、有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）高い収率が得られ、しかもタンパク質含量に関してずっと高い純度の単離物が得られる。
【００５９】
回分プロセスと比較して、キャノーラタンパク質単離物の回収のために連続プロセスを利用することにより、同じレベルのタンパク質抽出に関して、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ抽出ステップにおいて、著しく高い温度を使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順よりも汚染の機会が少なく、より高い製品品質が得られ、より小型の装置でプロセスを行うことができる。
【００６０】
沈降したＰＭＭは、沈降した塊からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿った形態で使用することも、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にすることもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０ｗｔ％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を使用した場合、脂肪性油糧種子粗粉から単離した乾燥ＰＭＭも残留脂肪含量が低く、それは約１ｗｔ％未満になり得る。
【００６１】
上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、ＰＭＭは、主として、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する７Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６２】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップでは沈殿しない、かなりの量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理して、そこからキャノーラタンパク質単離物を回収する。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物は、主として、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分組成物を有する、２Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６３】
本発明では、カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを、以下に記載の手段によって最初に濃縮または部分的に濃縮することができる上澄み液に添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは８ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得る。上澄み液に添加された塩化カルシウムは、その濃縮水溶液などの任意の所望の形態でもよい。
【００６４】
塩化カルシウムの添加は、フィチン酸をフィチン酸カルシウムの形態で上澄み液から沈殿させ（ｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇ）、上澄み液のグロブリンおよびアルブミン画分の両方を保持する効果を有する。沈殿した（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）フィチン酸塩を、遠心分離および／または濾過などにより上澄み液から回収して、透明な溶液を得る。所望であれば、沈殿した（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）フィチン酸塩は除去しなくてもよく、その場合、さらなる処理により、より高いフィチン酸塩含量を有する製品が生じる。
【００６５】
次いで、溶液のｐＨを、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜３．２の値に調整する。ｐＨ調整は、塩酸の添加などの任意の好都合な手段によって行うことができる。所望であれば、酸性化ステップは、本明細書に記載の様々な選択肢から省略することができる。
【００６６】
ｐＨ調整した透明な溶液は、まだ濃縮していないならば、濃縮してそのタンパク質濃度を増加させる。このような濃縮は、塩、炭水化物、色素およびタンパク質供給源材料から抽出された他の低分子量物質を含めた低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、かなりの割合のキャノーラタンパク質を溶液中に保持する、適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜を使用した、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行う。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する限外濾過膜を使用することができる。このような上澄み液の濃縮は、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も減少させる。上澄み液は、一般的に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記したように、回分様式または連続操作で行うことができる。
【００６７】
上澄み液をカルシウム塩の添加の前に部分的に濃縮し、沈殿物の除去後に完全に濃縮する場合、上澄み液は、最初に約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで濃縮し、次いで、沈殿物の除去後に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌの濃度まで濃縮する。
【００６８】
本発明の一実施形態では、カルシウム塩は二段階で添加することができる。この実施形態では、沈殿物の形成をもたらすのに不十分な少量のカルシウムを上澄み液に添加して、約１ｍＳ〜約３．５ｍＳ、好ましくは約１ｍＳ〜約２ｍＳの導電率を得る。
【００６９】
得られた溶液を上記の条件下で酸性化し、部分的に濃縮する。カルシウム塩の残り（ｂａｌａｎｃｅ）を部分濃縮溶液に添加すると、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率が得られ、沈殿物の形成が起こる。次いで、沈殿物を除去する。次いで、得られた透明な溶液を上記の条件下で濃縮する。
【００７０】
次いで、濃縮上澄み液は、水を使用した透析濾過ステップに供することができる。水は、その自然ｐＨ、透析濾過されているタンパク質溶液と等しいｐＨまたは中間の任意のｐＨでもよい。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、上澄み水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望であれば、透析濾過は、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有する膜などの分離膜を使用して行うことができる。
【００７１】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００７２】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記着色除去操作の代替法として、ある着色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００７３】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００７４】
濃縮され、場合により透析濾過され、場合により着色除去の処理を受けたタンパク質溶液は、噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にする。乾燥したキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．を超える、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。キャノーラタンパク質単離物は、一般的にフィチン酸含量が少なく、一般的に約１．５重量％未満である。
【００７５】
本発明で製造するキャノーラタンパク質単離物は、アルブミンおよびグロブリン画分の両方を含有し、酸性の水環境に可溶性であり、単離物を、炭酸および非炭酸の両方の飲料への組込に理想的なものにして、飲料にタンパク質強化をもたらす。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲の酸性ｐＨ値を有する。本発明で提供するキャノーラタンパク質単離物は、例えば１２液量オンスの量当たり少なくとも約５ｇのキャノーラタンパク質単離物など、任意の好都合な量でこのような飲料に添加して、このような飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。添加されたキャノーラタンパク質単離物は、飲料に完全に溶解し、熱処理後でさえ飲料の透明度を損なわない。キャノーラタンパク質単離物は、水への溶解による飲料の液戻し（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の前に、乾燥した飲料とブレンドすることができる。
【実施例】
【００７６】
例１：
この例では、カルシウム塩を上澄み液に添加し、沈殿物を除去し、次いで、溶液を酸性化し、さらに処理する、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造方法を説明する。
【００７７】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００７８】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」まで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。濃縮タンパク質溶液を６０℃で「ｌ」分間（複数可）低温殺菌して、「ｎ」重量％のタンパク質含量を有する低温殺菌された濃縮タンパク質溶液「ｍ」ｋｇを得た。
【００７９】
「ｏ」℃の濃縮された溶液を、「ｑ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｐ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離によって、濾過したタンパク質溶液の「ｒ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｔ」Ｃ３０７Ｃという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００８０】
３つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｔ」を以下の表Ｉに示す。
【００８１】
【表１】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿による上澄み液に対して行った。
【００８２】
上澄み液「ｕ」Ｌを、塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｘ」重量％のタンパク質濃度の、フィチン酸塩含量が低下した清澄なタンパク質溶液「ｗ」Ｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下した清澄なタンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｙ」に調整し、「ａａ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｚ」Ｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ａｂ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の逆浸透精製（ＲＯ）水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ａｃ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｄ」ｗｔ％であった。濃縮物の「ａｅ」Ｌ部分を、ｐＨ３および「ａｇ」ＢＶ／ｈｒの速度で総容積（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）（ＢＶ）「ａｆ」Ｌの粒状活性炭に通すことにより着色減少ステップに供した。次いで、着色が減少し、「ａｉ」重量％のタンパク質含量を有するＧＡＣ処理した溶液「ａｈ」Ｌを噴霧乾燥させ、「ｔ」Ｃ２００ＣａＣという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。Ｃ２００ＣａＣは、「ａｊ」（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の残り「ａｋ」を、さらなる精製ステップなしで噴霧乾燥させて、「ａｌ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、「ｔ」Ｃ２００Ｃａという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた最終生成物を形成した。３つの実験についてのパラメータ「ｔ」〜「ａｌ」を以下の表ＩＩに示す。
【００８３】
【表２】
例２：
この例では、さらなる処理なしで乾燥させた場合に、カルシウム塩の上澄み液への添加により形成した沈殿物を酸性化およびさらなる処理の前に除去しない、本発明の一実施形態による単離物を生成するはずの濃縮キャノーラタンパク質溶液の製造を説明する。
【００８４】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００８５】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」ｋｇまで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。濃縮タンパク質溶液を６０℃で１分間低温殺菌して、「ｍ」重量％のタンパク質含量を含有する低温殺菌された濃縮タンパク質溶液「ｌ」ｋｇを得た。
【００８６】
「ｎ」℃の低温殺菌された濃縮された溶液を、「ｐ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｏ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｑ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｒ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｓ」Ｃ３００という名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００８７】
１つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｓ」を以下の表ＩＩＩに示す。
【００８８】
【表３】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿による上澄み液に対して行った。
【００８９】
「ｕ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｔ」Ｌを、塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整し、結果として濁りが形成した。次いで、タンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｗ」に調整し、サンプルを透明化した。次いで、この溶液の一定分量「ｘ」Ｌを、「ｚ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｙ」Ｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ａａ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水により透析濾過した。「ａｃ」重量％のタンパク質を含有する透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）「ａｂ」ｋｇを得た。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過されたタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｄ」ｗｔ％であった。１つの実験についてのパラメータ「ｓ」〜「ａｄ」を以下の表ＩＶに示す。
【００９０】
【表４】
例３：
この例では、さらなる処理なしで乾燥させた場合に、カルシウム塩を部分濃縮上澄み液に添加し、沈殿物を除去し、サンプルを酸性化する本発明の一実施形態に従って、単離物を生成するはずの濃縮キャノーラタンパク質溶液の製造を説明する。
【００９１】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【００９２】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」ｋｇまで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００９３】
「ｌ」℃の濃縮された溶液を、「ｎ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｍ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｏ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｐ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｑ」Ｃ３０２という名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【００９４】
１つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｑ」を以下の表Ｖに示す。
【００９５】
【表５】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、ＰＭＭ沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による部分濃縮上澄み液に対して行った。
【００９６】
「ｓ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｒ」Ｌを、「ｔ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積減少率（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）７まで濃縮した。次いで、「ｕ」Ｌの容積および「ｖ」重量％のタンパク質含量を有する部分濃縮上澄み液を、タンパク質の３．５重量％の塩化カルシウムの添加により「ｗ」ｍＳの導電率に調整し、結果として濁りが形成した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｙ」重量％のタンパク質含量の、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された、部分濃縮タンパク質溶液「ｘ」Ｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された、部分濃縮タンパク質溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｚ」に調整し、上澄み液の最初の濃縮に使用した同じ膜（ｓａｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ）を使用して限外濾過によって「ａａ」Ｌまでさらに濃縮した。次いで、濃縮された溶液を、「ａｂ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水を用いて同じ膜で透析濾過した。透析濾過した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）は透明であり、「ａｃ」ｋｇの重量および「ａｄ」重量％のタンパク質含量を有しており、結果として、収率は濾過したタンパク質溶液の「ａｅ」ｗｔ％であった。
【００９７】
１つの実験についてのパラメータ「ｒ」〜「ａｅ」を以下の表ＶＩに示す。
【００９８】
【表６】
例４：
この例では、カルシウム塩を上澄み液ならびに部分濃縮上澄み液に添加し、第２の添加後に形成した沈殿物を除去する、本発明の一実施形態によるキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【００９９】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを得た。部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してタンパク質溶液をさらに清澄化し、結果として「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。
【０１００】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で「ｉ」まで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。次いで、濃縮タンパク質溶液を、濃縮ステップに使用したのと同じ膜で、「ｌ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の「ｃ」Ｍ ＮａＣｌにより透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ｍ」重量％のタンパク質を含有していた。
【０１０１】
「ｎ」℃の濃縮された溶液を、「ｐ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｏ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により、濾過したタンパク質溶液の「ｑ」ｗｔ％の収率で回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｒ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｓ」Ｃ３０７Ｃという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。
【０１０２】
２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｓ」を以下の表ＶＩＩに示す。
【０１０３】
【表７】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、上澄み液およびＰＭＭ沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による部分濃縮上澄み液に対して行った。
【０１０４】
「ｕ」重量％のタンパク質含量を有する上澄み液「ｔ」Ｌを、タンパク質の重量当たり２．５％の塩化カルシウムの添加により導電率「ｖ」ｍＳに調整すると、濁りは形成しなかった。次いで、溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ「ｗ」に調整した。塩化カルシウム処理し、ｐＨを調整した上澄み液「ｘ」Ｌを、「ｙ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積減少率（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）７まで濃縮した。次いで、「ｚ」Ｌの容積および「ａａ」重量％のタンパク質含量を有する部分濃縮上澄み液を、タンパク質の２．５重量％の塩化カルシウムの添加により「ａｂ」ｍＳの導電率に調整し、結果として濁りが形成した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿した物質を除去し、結果として、「ａｄ」重量％のタンパク質含量の、清澄化された部分濃縮タンパク質溶液「ａｃ」Ｌを得た。次いで、清澄化された部分濃縮タンパク質溶液を、上澄み液の最初の濃縮に使用したのと同じ膜を使用して限外濾過によって「ａｅ」Ｌまでさらに濃縮した。次いで、濃縮された溶液を、同じ膜で「ａｆ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３のＲＯ水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ａｇ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ａｈ」ｗｔ％であった。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の一定分量「ａｉ」ｋｇを、ｐＨ３および「ａｋ」ＢＶ／ｈｒの速度で粒状活性炭の「ａｊ」Ｌ ＢＶに通すことにより着色減少ステップに供した。次いで、着色が減少し、「ａｍ」重量％のタンパク質含量を有するＧＡＣ処理した溶液「ａｌ」ｋｇを噴霧乾燥させ、「ｓ」Ｃ２００ＣａＣという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた。Ｃ２００ＣａＣは、「ａｎ」％ｗｔ（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の残りの「ａｏ」を、さらなる精製ステップなしで噴霧乾燥させて、「ａｐ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、「ｓ」Ｃ２００Ｃａという名称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を与えた最終生成物を形成した。
【０１０５】
２つの実験についてのパラメータ「ｓ」〜「ａｐ」を以下の表ＶＩＩＩに示す。
【０１０６】
【表８】
例５：
この例では、酸性化ステップがない、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【０１０７】
キャノーラ粗粉「ａ」グラムを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」ｍｌに添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化し、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有するタンパク質溶液「ｄ」ｍｌを得た。タンパク質抽出溶液の一定分量「ｆ」ｍｌを、「ｈ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するセルロース膜での濃縮により、容積を「ｇ」ｍｌに減少させた。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｉ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【０１０８】
「ｊ」℃の濃縮された溶液を、「ｌ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｋ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、粘稠な粘着性沈殿塊（ＰＭＭ）を遠心分離により回収した。乾燥したＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。
【０１０９】
実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｍ」を以下の表ＩＸに示す。
【０１１０】
【表９】
次いで、本出願に記載の塩化カルシウムの添加を、上澄み液に対して行った。
【０１１１】
「ｎ」ｍｌ上澄み液を、濃縮された溶液からの（ｆｒｏｍ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）塩化カルシウムの添加により導電率「ｏ」ｍＳに調整した。次いで、この溶液を遠心分離および／または濾過して沈殿したフィチン酸塩物質を除去し、結果として、「ｑ」重量％の濃度の、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化されたタンパク質溶液「ｐ」ｍｌを得た。次いで、フィチン酸塩含量が低下し、清澄化された上澄み液を、「ｓ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）を有するセルロース膜を使用して限外濾過によって容積を「ｒ」ｍｌに減少させた。次いで、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で「ｔ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の水により透析濾過した。透析濾過した濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は、「ｕ」重量％のタンパク質を含有し、「ｖ」ｍｌの容積を有していた。この溶液を、さらなる精製ステップなしで凍結乾燥させ、「ｗ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する最終生成物を形成させた。実験についてのパラメータ「ｎ」〜「ｗ」を以下の表Ｘに示す。
【０１１２】
【表１０】
凍結乾燥した生成物を自然ｐＨの水中で再可溶化した。透明度の指標として、６００ｎｍ（Ａ６００）での吸光度を測定した。次いで、溶液を半分に分割し、半分をｐＨ３に調整し、残りの半分はｐＨ６に調整した。それぞれのＡ６００を再び読み取った。得られた結果を以下の表ＸＩに示す。
【０１１３】
【表１１】
全てのサンプルは視覚的に透明であった。
開示の概要
本開示を要約すると、ＰＭＭ形成および沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による上澄み液の熱処理により製造される２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物と等しい特性の、２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物が製造される。本発明の範囲内で、改変が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液に、カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウム沈殿物を形成させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、約５０ｇ／Ｌ以下の濃度まで部分的に濃縮するステップと、
前記部分濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得て、前記部分濃縮上澄み液からフィチン酸カルシウムを沈殿させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項３】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、濃縮上澄み液を生成するステップと、
前記濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
得られた溶液からフィチン酸カルシウムを除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
前記透明な、場合によりｐＨ調整した溶液（ｃｌｅａｒ ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｐＨ−ａｄｊｕｓｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより、場合により透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記透明な、場合によりｐＨ調整したタンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項４】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
初期量のカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを、キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液に添加して、約１〜約３．５、好ましくは約１〜約２ｍＳであり、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすには不十分な導電率を得るステップと、
得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、酸性化溶液を形成させるステップと、
前記酸性化溶液を約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで部分的に濃縮するステップと、
さらなる量のカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、沈殿物を形成させるステップと、
得られた溶液から前記沈殿物を除去して、透明なｐＨ調整した溶液を得るステップと、
前記透明なｐＨ調整した溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明なキャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項５】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、上澄み液からフィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成するステップと、
前記透明なｐＨを調整した溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項６】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、約５０ｇ／Ｌ以下の濃度まで部分的に濃縮するステップと、
前記部分濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得て、前記部分濃縮上澄み液からフィチン酸カルシウムを沈殿させるステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成させるステップと、
ｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明なキャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項７】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、濃縮上澄み液を生成するステップと、
前記濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成させるステップと、
場合により、前記透明なｐＨ調整した溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記透明なｐＨ調整したタンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により製造されるキャノーラタンパク質単離物。
【請求項９】
請求項８に記載のキャノーラタンパク質単離物が溶解している酸性溶液。
【請求項１】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液に、カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウム沈殿物を形成させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、約５０ｇ／Ｌ以下の濃度まで部分的に濃縮するステップと、
前記部分濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得て、前記部分濃縮上澄み液からフィチン酸カルシウムを沈殿させるステップと、
沈殿したフィチン酸カルシウムを得られた溶液から除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
場合によりｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項３】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、濃縮上澄み液を生成するステップと、
前記濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
得られた溶液からフィチン酸カルシウムを除去して、透明な溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整するステップと、
前記透明な、場合によりｐＨ調整した溶液（ｃｌｅａｒ ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｐＨ−ａｄｊｕｓｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより、場合により透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記透明な、場合によりｐＨ調整したタンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項４】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
初期量のカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを、キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液に添加して、約１〜約３．５、好ましくは約１〜約２ｍＳであり、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすには不十分な導電率を得るステップと、
得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、酸性化溶液を形成させるステップと、
前記酸性化溶液を約５０ｇ／Ｌ以下のタンパク質濃度まで部分的に濃縮するステップと、
さらなる量のカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約４ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、沈殿物を形成させるステップと、
得られた溶液から前記沈殿物を除去して、透明なｐＨ調整した溶液を得るステップと、
前記透明なｐＨ調整した溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明なキャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項５】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約５ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約８〜約１０ｍＳの導電率を得て、上澄み液からフィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成するステップと、
前記透明なｐＨを調整した溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、
場合により、前記透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項６】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、約５０ｇ／Ｌ以下の濃度まで部分的に濃縮するステップと、
前記部分濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２ｍＳ〜約３０ｍＳ、好ましくは約４ｍＳ〜約１０ｍＳの導電率を得て、前記部分濃縮上澄み液からフィチン酸カルシウムを沈殿させるステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成させるステップと、
ｐＨ調整した前記透明な溶液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、透明な濃縮キャノーラタンパク質溶液を生成するステップと、
場合により、前記透明なキャノーラタンパク質溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項７】
乾燥重量基準で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
キャノーラタンパク質ミセル塊（ｃａｎｏｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）の沈殿による上澄み液を、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約５００ｇ／Ｌ、より好ましくは約１００〜約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮して、濃縮上澄み液を生成するステップと、
前記濃縮上澄み液にカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを添加して、約２〜約３０ｍＳ、好ましくは約４〜約１０ｍＳの導電率を得て、フィチン酸カルシウムの沈殿を引き起こすステップと、
前記フィチン酸カルシウム沈殿物を除去することなく、得られた溶液のｐＨを、塩酸の添加などにより、約２．０〜約４．０、好ましくは約２．９〜約３．２に調整して、前記沈殿物を溶解させ、透明なｐＨ調整した溶液を形成させるステップと、
場合により、前記透明なｐＨ調整した溶液を、数倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のｐＨ３の水などにより透析濾過するステップと、
場合により、粒状活性炭処理などの着色除去ステップを行うステップと、
前記透明なｐＨ調整したタンパク質溶液を乾燥させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により製造されるキャノーラタンパク質単離物。
【請求項９】
請求項８に記載のキャノーラタンパク質単離物が溶解している酸性溶液。
【公表番号】特表２０１２−５０００１１（Ｐ２０１２−５０００１１Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３２７５（Ｐ２０１１−５２３２７５）
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１１４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２００３８
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１１４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２００３８
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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