疎水性基を有する環状グルカン誘導体およびその製造方法
【課題】 医薬、試薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途に有用な、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】 疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した新規な環状グルカン誘導体を提供することにより、本発明の上記課題を解決した。
【解決手段】 疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した新規な環状グルカン誘導体を提供することにより、本発明の上記課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高重合度環状グルカンの側鎖に疎水性基を有する環状グルカン誘導体、およびその製造方法に関する。本発明はまた、この環状グルカン誘導体を含む医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムに関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の環状構造を有するグルカンとして、α−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造のみを有するグルカンである、シクロデキストリン類が知られている。これらシクロデキストリン類は、一般に澱粉にシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を作用させて合成され、その重合度は通常６から８である。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ（１９９３）Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ： ｖｏｌ．４０ １０３−１１６は、これ以上の重合度を有するα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造のみを有するグルカンが、ＣＧＴａｓｅにより合成されることを報告しているが、最も大きなものでも重合度は１３である。このようなシクロデキストリン類は、環状分子特性を利用して低分子活性物質を包接できる点でよく知られている。しかし、シクロデキストリン類は、一般に油類の炭化水素系溶媒に溶解せず、界面活性剤、分散液形態の医薬、化粧品用組成物および食品用組成物への使用が制限されるというのが現状である。
【０００３】
これらの化合物の特性を変更するため、重合度６〜８のシクロデキストリンの水酸基をアルキル基またはフッ化アルキル基で置換することが知られている（例えば、特許文献１および２参照）。しかし、この低重合度のシクロデキストリン類はそもそも、水溶液中における立体構造の自由度が極めて低く、平面的な環状構造しかとれないため、環内に包接できる分子は限られ、分散液形態の医薬および化粧品用組成物への適用は、限界がある。
【０００４】
このように、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体はいまだに存在せず、医薬、化学、食品、保健、およびエレクトロニクスの業界において非常に重要であり、その開発は渇望されている。
【特許文献１】日本国特許第２７４９５６５号公報
【特許文献２】特開平９−２４１３０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、医薬、試薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途に有用な、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、高重合度環状グルカンのアルコール性水酸基をトシル基で置換でき、このトシル基が脂肪酸ナトリウムと交換できることを発見し、これを利用して高重合度環状グルカンに側鎖として疎水性基を導入した本発明の環状グルカン誘導体を提供することにより、上記課題を解決した。
【０００７】
本発明者らはまた、上記環状グルカン誘導体が水の表面張力を有意に低下させることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明者らはさらに、上記環状グルカン誘導体を含む組成物が、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明者はまた、上記環状グルカン誘導体を含む組成物を利用する、新しい診断、治療、鑑別方法を見出し、本発明を完成した。
【００１０】
このように、本発明では以下を提供する。
（１）重合度１４以上の環状グルカンからなる主鎖と、疎水性基からなる１または２以上の側鎖とを有し、該側鎖が連結基を介して該主鎖に結合している環状グルカン誘導体。
（２）上記疎水性基が、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはトシル基である、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（３）上記疎水性基が、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基である、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（４） 前記親水性部位が、重合度１４以上の環状グルカンのみからなる、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
（５）上記環状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであって、該グルカンが、
（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、および
（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカン、
からなる群より選択される、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（６）上記側鎖が、アミド結合、エーテル結合、またはエステル結合により環状グルカンに結合している、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（７）上記環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、エステル結合によってフッ素置換または無置換の脂肪酸に結合している、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（８）以下の構造式で表される環状グルカン誘導体：
【００１１】
【化２】
【００１２】
ここで、ｎ個のモノマーユニットは、それぞれ独立しており、ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在し；
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり；
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−であり；
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基であり；
ｎは、１４〜５０００である、環状グルカン誘導体。
（９）項（８）に記載の環状グルカン誘導体であって、ｎ個のＲ２およびｎ個のＲ３のすべてが水酸基である、誘導体。
（１０）環状グルカン誘導体の製造方法であって、
重合度１４以上の環状グルカンにトシル基を導入してトシル化誘導体を得る工程、および
該トシル化誘導体に置換もしくは無置換の脂肪酸エステルを反応させて、エステル誘導体を得る工程、
を包含する方法。
（１１）以下の工程： ａ）直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類に、Ｄ酵素を反応させて、高重合度環状グルカンを得る工程；
ｂ）アルカリ水溶液中で、該高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つと該塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得る工程；
ｃ）該トシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、該トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させて、疎水性基が結合した環状グルカン誘導体を得る工程、
を包含する、環状グルカン誘導体の製造方法。
（１２）上記工程ｂ）において、上記高重合度環状グルカンと、上記塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンの全アルコール性水酸基のうち少なくとも３％以上がトシル基で置換される反応条件下で接触させる、項（１１）に記載の方法。
（１３）上記工程ｃ）において、上記トシル基含有環状グルカン誘導体と、上記脂肪酸ナトリウムとを、上記トシル基と上記脂肪酸ナトリウムとの交換率が少なくとも５０％となる反応条件下で接触させる、項（１１）に記載の方法。
（１４）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、医薬。
（１５）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、界面活性剤。
（１６）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、化粧品用組成物。
（１７）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、磁気記録媒体用フィルム。
（１８）非磁性支持体上に１層以上の磁性体層を備えた磁気記録媒体において、該磁性体層、または該磁性体層上に設けた保護層の表面に、項（１７）に記載のフィルムを形成させた、磁気記録媒体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することができる。
【００１４】
本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を含む組成物は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１６】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１７】
本明細書において「グルカン」とは、Ｄ−グルコースから成る多糖類の総称を意味する。本発明の「グルカン」には、澱粉、グリコーゲン、ラミナラン、セルロース、リケニン、デキストラン、ニゲランなどの貯蔵多糖類、構造多糖類、代謝の副産物が含まれる。
【００１８】
本明細書において「高重合度環状グルカン」とは、従来の重合度６〜８の環状グルカンであるα−、β−、またはγ−シクロデキストリンより重合度が高く、α−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを意味する。本発明において、好ましい高重合度環状グルカンは、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであり、代表例として、（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、または（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカンなどが挙げられる。
【００１９】
本明細書において「モノマーユニット」または「グルコースモノマーユニット」とは、高重合度環状グルカンを構成する、グルコースまたはグルコース誘導体からなるモノマーユニットを意味する。
【００２０】
本明細書において、「重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位」とは、高重合度環状グルカンに、必要に応じて疎水性基以外の置換基が導入された部分構造を意味する。すなわち、本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基からなる側鎖以外の部分を意味する。この親水性部位において、環状グルカンに必要に応じて導入される置換基の例としては、親水性のレセプター、リガンド、色素などが挙げられるが、これらに限定されない。レセプターの例には、例えば抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント類、レクチンなどの受容体タンパク質、核酸などが含まれる。リガンドの例には、例えば抗原、酵素基質、ホルモン類、ハプテン類、ビタミン類、アルカロイド類、核酸、単糖類、多糖類などが含まれる。これらの置換基は、公知の方法により環状グルカンの任意の位置に導入される。
【００２１】
本明細書において「疎水性基」とは、上記高重合度環状グルカンの側鎖として導入した場合に、その化合物が水の表面張力を低下させ界面活性を発現するような官能基全てを意味する。本発明の疎水性基として、トシル基、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基および置換された炭素環基などが挙げられるが、これらに限定されない。これら官能基は、以下の（有機化学）の節で詳細に定義される。
【００２２】
本明細書において「環状グルカン誘導体」とは、上で定義した疎水性基が、上で定義した高重合度環状グルカンあるいは重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位に結合して得られる化合物全てを意味する。本発明の「環状グルカン誘導体」との用語は、本明細書において「エステル交換後の高重合度環状グルカン」との用語と互換可能に使用される。
【００２３】
本明細書において「トシル基含有環状グルカン誘導体」とは、上で定義した疎水性基の群のうちのトシル基が高重合度環状グルカンに結合して得られる化合物全てを意味する。本発明の「トシル基含有環状グルカン誘導体」との用語は、本明細書において「トシル化高重合度環状グルカン」との用語と互換可能に使用される。
【００２４】
本明細書において「（疎水性基が高重合度環状グルカンに）結合した」とは、アミド結合、エーテル結合およびエステル結合からなる群から選択される誘導体化を意味する。これらの誘導体化は、用途に応じて、当業者により適宜選択され得る。必要に応じて、誘導体化の方法の１つとして、通常、澱粉の修飾に用いられる方法が用いられる（生物化学実験法１９，「澱粉・関連糖質実験法」：中村ら、学会出版センター、１９８６年 ２７３〜３０３頁）。
【００２５】
本明細書において「フッ素置換率」との用語は、フッ素置換前のアルキル基の全水素原子数に対するフッ素原子で置換された割合（百分率）を意味する。
【００２６】
（有機化学）
本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の１または２以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。
【００２７】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例は、Ｃ３〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ９アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１１アルキルまたはＣ３〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ１３アルキル、Ｃ３〜Ｃ１４アルキル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキル、Ｃ３〜Ｃ１６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１７アルキル、Ｃ３〜Ｃ１８アルキル、Ｃ３〜Ｃ１９アルキル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ３〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を３〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００２８】
本明細書において「フッ化アルキル（基）」とは、上で定義したアルキル基内の少なくとも１個の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基を意味し、特にアルキル基を構成する水素原子全てがフッ素原子で置換されたアルキル基を「ペルフルオロアルキル基」または「パーフルオロアルキル基」といい、これに対して、一部の水素原子がフッ素原子で置換され、水素原子が残存するアルキル基を「フルオロヒドロアルキル基」または「ヒドロフルオロアルキル基」という。
【００２９】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロヘキシルなどが例示される。
【００３０】
本明細書において「アルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルケニル、Ｃ３〜Ｃ５アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ７アルケニル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ９アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９アルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ３〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を３〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ３〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００３１】
本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルのＨが置換されたシクロアルケニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルケニルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたシクロアルケニル、であり得る。例えば、好ましいシクロアルケニルとしては、１−シクロペンテニル、２−シクロヘキセニルなどが例示される。
【００３２】
本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルキニル、Ｃ３〜Ｃ５アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８アルキニル、Ｃ３〜Ｃ９アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１３アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１４アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１７アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１８アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１９アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００３３】
本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１Ｏ−で表される（ここで、ｎは１以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシのＨが置換されたアルコキシをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１１アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１３アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１４アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１５アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１７アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１８アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１９アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ２０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルコキシであり得る。
【００３４】
本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であって、前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基のＨが置換された炭素環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フェニル基から水素原子が１個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。
【００３５】
本明細書において「ハロゲン」とは、周期表７Ｂ族に属するフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などの元素の１価の基をいう。
【００３６】
本明細書において「水酸基」とは、−ＯＨで表される基をいう。本明細書において、「水酸基」との用語は、「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」との用語と互換可能に使用され得る。
【００３７】
本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（アシル基）で置換した基であり、好ましくは、−ＣＯＮＨ２で表される。
【００３８】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。
【００３９】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
【００４０】
本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシおよび炭素環基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒは、それぞれ独立して、水素、ハロゲンおよびアルキルからなる群より選択され得る。より好ましくは、置換基Ｒは、フッ素である。
【００４１】
（好ましい実施形態の説明）
以下に、本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００４２】
１つの局面において、本発明は、疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を提供する。このような疎水性基の導入により、本発明の環状グルカン誘導体の油類への溶解度が向上し、優れた界面活性特性を得ることができる。本発明の環状グルカン誘導体は、シクロデキストリン類に比べはるかに高重合度の環状グルカン部位を有するため、包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を持ち合わせることができる。これにより、本発明の環状グルカン誘導体は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途に有用となる。
【００４３】
以下に、本発明の環状グルカン誘導体を製造する際の原料である、高重合度環状グルカンの構造、性質および製造方法について、説明する。
【００４４】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンであり、具体的には、例えば、図１に模式的に示される種々のグルカンが挙げられる。図１において、水平の直線および曲線は、α−１，４−グルコシド結合でつながったグルカンの鎖を示し、垂直の矢印は、α−１，６−グルコシド結合を示す（以下の模式図における水平の直線および曲線、ならびに垂直の矢印も同様である）。
【００４５】
上記のように、本発明で使用する高重合度環状グルカンには、環状構造のみを有するグルカンと、さらに環状構造に加えて非環状構造を有するグルカンとが含まれる。そしてこの環状構造には、α−１，４−グルコシド結合のみで構成される場合と、α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合で構成される場合とがある。少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を環状構造内部もしくは非環状構造部分に有するグルカンは、アミロペクチンのような分枝構造を有するグルカンを基質とした場合に生じる。
【００４６】
環状構造のみを有するグルカンは、環状構造に加えて非環状構造を有するグルカンをα−１，４−グルコシド結合及びα−１，６−グルコシド結合を非還元性末端から切断するグルコアミラーゼ処理して得られる。あるいは直鎖状のα−１，４−グルカンまたは分枝構造を有するグルカンを基質として用いて、直接得られる。
【００４７】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、以下の性質を有する。
（１）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるグルコアミラーゼ（東洋紡（株））を作用させると、それ以上分解されない成分（グルコアミラーゼ耐性成分）が残る。その成分は、脱リン酸化酵素（シグマ社）を作用させた後にさらにグルコアミラーゼを作用させても分解されない。
（２）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる場合がある。
（３）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、エンド型アミラーゼであるα−アミラーゼにより分解される。
【００４８】
本発明で使用する高重合度環状グルカンのうち、α−１，６−グルコシド結合を有せず、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン（以下、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンという）は、以下の性質を有する。
（１）還元性末端、非還元性末端が、いずれも検出できない。
（２）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（東洋紡（株））では分解されない。
（３）澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）とプルラナーゼ（株式会社林原生化学研究所）の併用、もしくはイソアミラーゼとプルラナーゼとβ−アミラーゼの併用でも分解されない。
（４）澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）により完全に分解される。
（５）細菌糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）で加水分解し、ＨＰＬＣで分析すると、グルコース、マルトース、及び若干量のマルトトリオースのみが得られる。すなわち、α−１，４−グルコシド結合以外の結合は存在しない。
【００４９】
本発明で使用する高重合度環状グルカンのうち、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合とにより構成される環状構造のみを有するグルカン（以下、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンという）は、以下の性質を有する。
（１）還元性末端、非還元性末端が、いずれも検出できない。
（２）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（東洋紡（株））では分解されない。
（３）澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。
（４）澱粉中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。また、同エンド型α−アミラーゼを、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンに作用させた場合の最小リミットデキストリンは、イソマルトシルマルトース（ＩＭＭ）であることが知られている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ， ｐ４０−４５（１９８８））。上記本発明のα−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンをエンド型αーアミラーゼで処理することによって、ＩＭＭが検出される。
【００５０】
本発明で使用する高重合度環状グルカンの環状構造を構成するグルコースの数は、少なくとも１４個であり、好ましくは１７個以上、より好ましくは２２個以上、さらにより好ましくは５０個以上であり、上限は、約５０００個である。α−１，６−グルコシド結合を有する場合、その数は少なくとも１個あればよく、通常１〜５００個、好ましくは１〜１００個である。
【００５１】
上記還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９８１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：９４：２０５−２１３の改変パークジョンソン法により、非還元性末端の定量はＨｉｚｕｋｕｒｉら（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：６３：２６１−２６４の迅速スミス分解法により行い得る。
【００５２】
上記エキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ、あるいは、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、あるいは、エンド型アミラーゼであるα−アミラーゼによる分解は、例えば、本発明で使用する高重合度環状グルカンを、０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、１００μｌをとり、上記分解酵素をそれぞれ適当量加え、３０−４５℃で数時間反応させる。この反応物を、ＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）にかけ、分析し得る。溶出は、例えば、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ，酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ、４５分−８５０ｍＭ、４７分−８５０ｍＭの条件で行い、重合度および生じる糖を分析し得る。
【００５３】
本発明で使用する高重合度環状グルカンからの上記グルコアミラーゼ耐性成分の検出は、次のように行い得る。例えば、本発明の高重合度環状グルカン１００ｍｇを５ｍｌの蒸留水に溶解させ、グルコアミラーゼを終濃度１０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で一夜反応させる。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去した後、１０倍量のエタノールを添加し、残存する多糖を遠心分離による沈澱として回収する。沈澱をさらに１ｍｌの蒸留水に溶解し、グルコアミラーゼを終濃度５０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で１時間反応させ、１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去する。これに１０倍量エタノールを添加し沈澱を得る。本発明のグルカンの原料が一部リン酸基により修飾されている澱粉などの原料の場合は、得られた沈澱を１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３ｍＭのＺｎＣｌ２を含む）に溶解し、２０単位の脱リン酸化酵素（ウシ由来、Ｓｉｇｍａ製）を添加し、４０℃で２４時間反応させた後、１０倍量エタノールを添加し、沈澱を回収する。再度蒸留水に溶解し、グルコアミラーゼを終濃度５０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で１時間反応させ、１０倍量のエタノールを添加し、グルコアミラーゼ耐性成分を沈澱として得ることができる。
【００５４】
本発明の高重合度環状グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分の定量は、以下のように行い得る。試料高重合度環状グルカン１０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液８ｍｌを用いてすばやく希釈する。この希釈液を９００μｌずつ４試料採り、それぞれの試料に、１００μｌの蒸留水、グルコアミラーゼ液、枝切り酵素とグルコアミラーゼとの混合液、およびエンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼとの混合液をそれぞれ加えて、４０℃で４時間反応させる。反応終了後、生じたグルコースを、市販のグルコース定量キットを用いて測定することにより、試料グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を計算により求めることができる。詳細は、実施例で説明する。
【００５５】
本発明で使用する高重合度環状グルカンの環状構造部分の重合度は、クロマトグラフィーを用いて測定し得る。一般的に、環状多糖は同じ重合度の直鎖多糖とはクロマトグラフィーにおける挙動が異なることが知られており、この性質を用いて、環状であることの証明、及び環状多糖の重合度の決定が行われ得る。例えば、Ｄ酵素を用いて反応させて得られた本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンを上記のＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システムで分離し、シングルピークの画分を取得し得る。得られた画分を、例えば、０．１ＮのＨＣｌで１００℃、３０分間処理し、この環状構造部分を部分的に加水分解したのち、分解により生じた種々の重合度の直鎖のグルカンをＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システムを用いて分析し、重合度を決定し得る。詳細な分析方法は、実施例で述べる。
【００５６】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを生成し得る酵素とを反応させて得られる。このような活性を有する酵素であれば、いかなる酵素も使用し得る。本発明においては、Ｄ酵素を用いることが好ましい。
【００５７】
Ｄ酵素は最初、馬鈴薯から発見されたが、種々の植物、および大腸菌などの微生物に存在していることがわかっている。この大腸菌などの微生物の酵素はアミロマルターゼあるいは４−α−グルカノトランスフェラーゼと称される。従って、Ｄ酵素はその起源は問わず、これら酵素をコードする遺伝子を大腸菌などの宿主をもちいて発現せしめたものであっても使用し得る。ここでは、馬鈴薯および大腸菌からのＤ酵素の精製方法を例として開示するが、これに限られない。
【００５８】
馬鈴薯から、Ｄ酵素を精製する方法は、Ｔａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６（１９９３）に記載されている。まず、馬鈴薯塊茎を５ｍＭのメルカプトエタノールを含む適当な緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離して、０．４５μｍのメンブレンを通した後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけ、例えば、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）に１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄する。Ｄ酵素は、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶出する。これを、緩衝液Ａに対して透析し、５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含む溶液をＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムにロードし、緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析を行う。透析内液を緩衝液Ａで平衡化したＰＬ−ＳＡＸカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕ．Ｋ．）にロードし、緩衝液Ａ中のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭ−４００ｍＭに変化させて溶出し、Ｄ酵素活性画分を集める。上記の方法で馬鈴薯からＤ酵素を精製し得る。酵素活性の測定は、実施例において詳述する。
【００５９】
前出のＴａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６ （１９９３）には、馬鈴薯Ｄ酵素のｃＤＮＡ配列（同１３９４頁、Ｆｉｇ．３）、Ｄ酵素の組換プラスミドの作成（同１３９２頁）、該組換えプラスミドの大腸菌における発現、および組換え大腸菌からのＤ酵素の精製が開示されており、組換え法で作成されるＤ酵素も当然に使用され得る。大腸菌からＤ酵素を精製する方法は、例えば、まず、Ｄ酵素の生産株である大腸菌ＴＧ−１株をＬＢ液体培地を用いて３７℃で対数増殖期まで培養後、マルトースを終濃度１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、さらに３７℃で２時間培養する。遠心分離で集めた菌体を、上記緩衝液Ａに懸濁して超音波処理、遠心分離を行い、菌体抽出液を得る。次に、例えば、緩衝液Ａで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにロードし、緩衝液Ａ中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭに変化させて溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集める。活性画分に、終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えて放置し、遠心分離で不溶性の沈澱を除去し、上清を１Ｍの硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムにロードする。緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集める。この画分を、緩衝液Ａに対して透析後、透析内液を緩衝液Ａで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａの中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素を精製する。
【００６０】
Ｄ酵素は、上記のようにして精製され得るが、澱粉分子内のα−１，４−グルコシド結合に作用するエンド型のアミラーゼ類が検出されなければ、上記いずれの精製段階の粗酵素であっても、本発明で使用する高重合度環状グルカンの合成に使用し得る。
【００６１】
また、本発明に用いる酵素は、精製酵素、粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（たとえば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）が使用され得る。
【００６２】
本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンのみを得たい場合には、アミロース、澱粉枝切り物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロース、マルトオリゴ糖などのα−１，４−グルコシド結合のみからなる直鎖のα−１，４−グルカンに、本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素を作用させて製造し得る。
【００６３】
また、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどのα−１，６−分岐構造を有する糖類を原料にする場合で、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンのみを得たい場合には、本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えば、Ｄ酵素を直接原料に反応させて製造し得る。あるいは、α−１，６−グルコシド結合を切断するが、α−１，４−グルコシド結合を切断しない酵素、例えばイソアミラーゼ、プルラナーゼの存在下または非存在下で、上記糖類を本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素と反応させて製造し得る。
【００６４】
例えば、図２に示すように、還元末端（１１）を有するアミロース（１２）とＤ酵素とを反応させて、上記α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を作成した後、グルコアミラーゼを添加して、非環状グルカンを非還元末端から順次加水分解する。次にエタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６５】
あるいは、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）とα−１，６−グルコシド結合を切断するイソアミラーゼとＤ酵素とを同時に反応させて、上記α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を作成した後、グルコアミラーゼを添加して非還元末端から順次加水分解を行う。次にエタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６６】
あるいは、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）にＤ酵素を反応させることにより、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）と、α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン（１８）と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合および少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）とを調製した後、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼを反応させる。さらに、プルラナーゼを反応させ得る。次いで、エタノールを添加して、環状グルカンを沈殿させ、この沈殿を回収した後凍結乾燥することにより、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６７】
さらに、本発明の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（以下、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンという）は、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどのα−１，６−分岐構造を有する原料に、本発明のグルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素を作用させて製造し得る。
【００６８】
例えば、図３に示すように、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）にＤ酵素を反応させて、上記の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）と、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）と、α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン（１８）とを作製した後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、上記の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とにより構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）を分離し得る。このグルカン（１５）に、グルコアミラーゼを添加して非環状構造部分を非還元末端から順次加水分解する。加水分解後に、エタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造のみで形成されるグルカン（１６）を得る。
【００６９】
本発明に用いられ得る直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれを有する糖類としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉枝きり物、澱粉部分加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成澱粉、およびこれらの誘導体などが挙げられる。これらは、単独でもよく、あるいは組み合わせても使用し得る。ここで、澱粉枝きり物とは、澱粉にあるα−１，４−グルコシド結合以外の結合を酵素的に全部あるいは一部を切断して得られる物をいう。また、澱粉部分加水分解物とは、澱粉にあるα−１，４−グルコシド結合の一部を酵素的に、もしくは化学的に切断して得られるものをいい、例えば、重合度が１００程度以上のアミロペクチン、重合度が２２程度以上のアミロースなどが原料として用いられ得る。
【００７０】
また、本発明に用いられ得る直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれを有する糖類と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを生成し得る酵素との反応は、ホスホリラーゼおよびグルコース−１−リン酸の存在下で行い得る。ホスホリラーゼは、グルコース−１−リン酸が過剰に存在する場合には、α−１，４−グルカン鎖の伸張反応を触媒する。このため、上記原料のα−１，４−グルカン鎖が、上記酵素の環状化反応を受けるには充分な長さを有していない場合には、ホスホリラーゼおよびグルコース−１−リン酸を共存させることにより、本発明のグルカンの収量を増加させることが可能である。
【００７１】
さらに、原料には、上記澱粉あるいは澱粉の部分分解物の誘導体も用い得る。例えば、上記澱粉のアルコール性の水酸基の少なくとも１つが、イオン結合、エーテル化（カルボキシメチル化、ヒドリキシアルキル化等）、エステル化（リン酸化、アセチル化、硫酸化等）、架橋化またはグラフト化された誘導体なども用いられ得る。さらに、これらの２種以上の混合物も原料として用い得る。
【００７２】
上記原料と本発明に使用し得る酵素との反応は、本発明の高重合度環状グルカンが生成するｐＨ、温度などの条件であれば、いずれをも使用し得る。
【００７３】
Ｄ酵素を例にとれば、反応のｐＨは、通常、３から１０、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは４から９、さらに好ましくは、６から８である。温度は、約１０℃から９０℃、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約２０℃から６０℃、さらに好ましくは、３０℃から４０℃の範囲である。耐熱性の微生物などから得られる酵素を用いる場合は、５０℃から９０℃の高温で使用し得る。上記原料の濃度（基質濃度）も、使用する基質の重合度、反応条件を考慮して決定し得る。通常、０．１％から３０％程度、反応速度、効率、基質溶液の取り扱い易さなどの点から、好ましくは０．１％から１０％、さらに好ましくは溶解度などを考慮すると０．５％から５％である。使用する酵素の量は、反応時間、基質の濃度との関係で、決定され、通常は、約１時間から４８時間で反応が終了するように酵素量を選ぶのが好ましく、基質１ｇあたり、通常５０〜１０，０００単位、好ましくは７０〜２，５００単位、より好ましくは４００〜２，０００単位である。
【００７４】
本発明の高重合度環状グルカンは、それ自体は公知の手法を適用して分離、精製し得る。例えば、本発明の高重合度環状グルカンは、上記の反応が終了した後、溶媒による沈澱、膜による分離、クロマトグラフィーによる分離などにより、分離、精製され得る。好ましくは、反応液を加熱して、あるいはそのまま精製する。本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンは、エキソ型のβ−アミラーゼあるいはグルコアミラーゼを添加して、残存する直鎖のα−１，４−グルカンを分解して得られる。澱粉などの分枝多糖を原料として用いた場合には、エキソ型のβ−アミラーゼあるいはグルコアミラーゼと、α−１，６−グルコシド結合を切断する酵素とを併用して、環状α−１，４−グルカンのみが残るように反応させる。その後、溶媒を用いる沈澱、膜分離、クロマト分離などの分離、精製手段が適用され得る。
【００７５】
このようにして得られた高重合度環状グルカンは、そのまま親水性部位として用いてもよく、必要に応じて、さらに親水性置換基を導入して親水性部位として用いてもよい。親水性置換基を導入する場合、その置換基が導入される位置は高重合度環状グルカンの任意の位置であり得る。例えば、環状グルカンを構成するグルコースモノマーユニットのいずれかの２位、３位または６位の水酸基のうちの１つに対して親水性置換基を導入することが可能である。２位、３位または６位の水酸基のうちの２つに対して親水性置換基を導入してもよく、２位、３位および６位のすべての水酸基に対して親水性置換基を導入してもよい。
【００７６】
ただし、環状グルカンを構成するすべてのグルコース単位の２位、３位および６位のすべての水酸基に親水性置換基を導入すると、疎水性基を導入することがなくなる。従って、親水性置換基は、疎水性基の導入が予定される位置以外の位置において導入される。
【００７７】
このようにして得られる、高重合度環状グルカンを含む親水性部位に疎水性基を化学的に結合させることにより、本発明の環状グルカン誘導体が得られる。本発明の環状グルカン誘導体は、好ましくは、例えば、具体的に以下の構造式：
【００７８】
【化３】
【００７９】
で表すことができる。
ここで、上記式においてｎ個のモノマーはそれぞれ互いに独立して選択される。すなわち、単一種類のグルコース誘導体モノマーがｎ個重合されていることを必要とするものではない。１種類のモノマーがｎ個重合されたホモポリマー構造であってもよいが、２種類のモノマーが共重合した構造であってもよい。あるいは、３種類以上のモノマーが共重合した構造であってもよい。
【００８０】
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表す。ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在する。存在する基−Ｌ−Ｒ４の数は、１つの実施形態では、１分子中に２以上であり、好ましくは、５以上であり、より好ましくは、１０以上である。基−Ｌ−Ｒ４の数は、高重合度環状グルカンの全水酸基に対する比率として、全水酸基の１％以上であることが好ましく、全水酸基の２％以上であることがより好ましく、全水酸基の３％以上であることがさらに好ましい。また、全水酸基の５０％以下であることが好ましく、全水酸基の２０％以下であることがより好ましく、全水酸基の１０％以下であることがさらに好ましい。
【００８１】
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基である。
【００８２】
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−である。
【００８３】
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基である。
【００８４】
ｎは、１４〜５０００である。
【００８５】
１つの実施形態では、この化合物は、以下の式の化合物であり得る：
【００８６】
【化４】
【００８７】
ここで、Ｌは連結基を表し、具体例としては例えば、Ｌは−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−などであり、Ｒ４は疎水性基を表し、具体例としては例えば、Ｒ４はＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり、Ｒ５は、水酸基またはトシル基であり、ｎは１４〜５０００である。ｍのｎに対する割合は、好ましくは１〜５０％、より好ましくは２〜２０％、さらに好ましくは３〜１０％である。
【００８８】
好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンに結合される疎水性基として、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはそれらの混合物が使用される。これにより、確実に良好な界面活性を得ることができる。さらに、アルキル基またはフッ化アルキル基を高重合度環状グルカンに結合させる場合、結合の際の立体的障害を考慮すると、これらアルキル基またはフッ化アルキル基は、鎖長とは無関係に、直鎖であることが好ましい。
【００８９】
より好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンに結合される疎水性基として、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基が使用される。これにより、特に優れた界面活性を得ることができる。
【００９０】
また好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンへの疎水性基の結合は、アミド結合、エーテル結合およびエステル結合からなる群から選択される。このように、比較的安定した化学結合を採用することにより、医薬、試薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途における使用の間、途中で結合が分解することなく、安定した状態で本発明の環状グルカン誘導体の機能および活性を持続させることができる。上記結合の中でも、特に上記高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、フッ素置換または無置換の脂肪酸とのエステル結合によって誘導体化されていることが好ましい。
【００９１】
（側鎖の導入方法）
本発明の高重合度環状グルカン誘導体は、グルコースの水酸基、例えば、上述した方法で得られた高重合度環状グルカンにトシル基を導入し、導入されたトシル基を（置換もしくは無置換）脂肪酸エステルでエステル交換することにより得られる。
【００９２】
本発明の１局面において、本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体は、アルカリ水溶液中で、前述の方法によって合成された高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、高重合度環状グルカンが有する少なくとも１個のアルコール性水酸基と塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得（以下、この工程を高重合度環状グルカンのトシル化という；図１１のスキーム１および２参照）、このトシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させる（以下、この工程をトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応という；図１４のスキーム３および４参照）ことによって得ることができる。
【００９３】
上記高重合度環状グルカンのトシル化は、より具体的に、以下のようにして行われる。まず、前述の方法で得られた高重合度環状グルカンをＮａＯＨ水溶液などのアルカリ水溶液に溶解させ、その水溶液に塩化ｐ−トルエンスルホニル（略称：ｐ−ＴｓＣｌ）を添加する。このとき、ｐ−ＴｓＣｌは、アルカリ水溶液に溶解しないため、高重合度環状グルカンの環内の疎水性環境に包接されたｐ−ＴｓＣｌのみが反応に関わると考えられる。従って、撹拌状態が包接錯体の形成に影響を及ぼすため、反応の進行に大きく影響を与えると考えられる。また反応の進行に影響を及ぼす他の因子としては、撹拌温度、撹拌時間および反応溶液の濃度が挙げられる。この反応溶液濃度が反応の進行に影響を及ぼす理由としては、アルカリ水溶液がトシル化反応の際に発生するＨＣｌをトラップして反応を促進することが挙げられる。当業者は、このような撹拌状態、撹拌温度、撹拌時間および反応溶液の濃度を自在に変化させることで、用途に応じた所望のトシル化度を得ることができる。目的のトシル化高重合度環状グルカンの精製は、目的物を含むアルカリ水溶液を希塩酸で中和し、トシル化反応の副生成物であるＮａＣｌ塩をゲル濾過クロマトグラフィーまたは透析により除去し、水をエバポレーションで減圧除去し、真空乾燥することによって行われる。
【００９４】
トシル化の確認は、トシル基特有のＳ＝Ｏ基に基づく吸収に着目し、ＵＶスペクトル法によって行うことができる（図１２）。また、このトシル化度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうちトシル基で置換された割合は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法により容易に算出することができる。図１３のトシル化した高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ａ＋ｂ）のプロトン積分計算値とｄのプロトン積分計算値との比率により算出することができる。
【００９５】
上で得られたトシル化高重合度環状グルカンのトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応は、より具体的に以下のようにして行われる。トシル化高重合度環状グルカンを適切な溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ））に溶解し、その溶液に脂肪酸ナトリウムまたはフッ化脂肪酸ナトリウムを添加し、約７０〜９０℃の温度で、窒素気流下において、数時間撹拌することによって行われる。エステル交換後の最終目的物の精製は、まず、反応溶液にアセトンなどの溶媒を添加し、最終目的物を沈殿させ、この沈殿物を水に溶解し、適度な時間にわたり透析することにより、未反応物の脂肪酸ナトリウム塩またはフッ化脂肪酸ナトリウム塩および副生成物のｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（略称：ＴｓＮａ）を除去し、凍結乾燥することによって行われる。
【００９６】
エステル交換の確認は、脂肪酸のアルキル基特有のＣＨ伸縮振動およびエステル基特有のＣ＝Ｏ伸縮振動に着目し、ＩＲスペクトル法によって行うことができる（図１５）。また、このエステル交換度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうち脂肪酸またはフッ化脂肪酸で置換された割合は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法により容易に算出することができる。図１６のエステル交換後の高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ｄ＋ｅ）のプロトン積分計算値とｃのプロトン積分計算値との比率により算出することができる。
【００９７】
トシル化後の高重合度環状グルカンおよびエステル交換後の高重合度環状グルカンについての界面活性については、これらをそれぞれ超純水に分散または溶解させ、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ ｐｌａｔｅ法を用いた表面張力測定により評価することができる（図１７）。
【００９８】
エステル交換後の高重合度環状グルカンの水中における分散体についての物性については、動的光散乱により調べることができる（図１８）。
【００９９】
また、エステル交換後の高重合度環状グルカンの水中における分散体の視覚的観察は、透過型電子顕微鏡を用いて行うことができる（図１９）。
【０１００】
（界面活性剤）
本発明の環状グルカン誘導体は、親水性の環状グルカン部分と疎水性の側鎖とを有するため、環状グルカンとしての性能を維持しながら、さらに界面活性剤としての性能を発揮し得る。界面活性剤としての性能の観点から、環状グルカン誘導体のグルカンの重合度は、１４〜５０００が好ましく、１７〜１００がより好ましい。さらに好ましくは２２〜５０である。また、疎水性基の数としては、環状グルカン誘導体に存在するグルコース残基のうち、１〜５０％に疎水性基が導入されていることが好ましく、２〜２０％がより好ましく、３〜１０％がさらに好ましい。疎水性基の種類としては、アルキル基または置換されたアルキル基が好ましく、アルキルまたはパーフルオロアルキルがより好ましい。直鎖のアルキル基または直鎖のパーフルオロアルキル基がさらに好ましい。アルキル基または置換されたアルキル基の鎖長は、Ｃ３〜Ｃ２０が好ましく、より好ましくはＣ３〜Ｃ１２であり、さらに好ましくはＣ３〜Ｃ８である。
【０１０１】
本発明の環状グルカン誘導体は、単独でそのまま界面活性剤として用いてもよく、また他の界面活性剤と組み合わせてもよい。
【０１０２】
本発明の環状グルカン誘導体からなる界面活性剤には、例えば、以下の特徴的な利点がある。
【０１０３】
１）親水部の分子量が大きい界面活性剤であるため、数分子でミセルを形成できる。一方で、ミセルの大きさが直径数百ｎｍにもなる、巨大なミセルを形成することもできる。これはナノ粒子としての利用、乳化剤としての利用が考えられる。
【０１０４】
２）本発明の環状グルカンは、置換基を導入できる水酸基が多いため、導入できる疎水基の数が多い。このため、疎水基の置換度を変えるだけで、親水性基と疎水性基のバランス（ＨＬＢ値）の幅が広い、一連の界面活性剤が得られる。
【０１０５】
３）親水部の分子量が大きい界面活性剤であり、親水部にさらに親水性基を導入しても、界面活性剤としての性質を維持できる。そのため、親水性基として、レセプター、リガンドなどを導入することにより、分子認識能を持つ界面活性剤が得られる。この界面活性剤をミセルあるいは泡として溶媒中に分散させて用いることで、レセプターやリガンドに結合する物質が存在する位置に集積させることができる。この性質は、例えば検査技術、診断技術として応用できる。
【０１０６】
４）本発明の環状グルカン誘導体は、包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にするという分子認識能を持つ。このため、包接能を持つ界面活性剤が得られる。さらに、本発明の環状グルカン誘導体をＬＢ膜にすることにより特定の物質を認識する素子を作ることができる。
【０１０７】
５）本発明の環状グルカン誘導体をαーアミラーゼなどの酵素で分解し、親水部を破壊することにより界面活性剤の機能の制御（乳化・ミセル状態のコントロール）が可能となる。
【０１０８】
６）上記のことはまた、生分解性の界面活性剤が合成可能なことを意味する。これは、環境上好ましい性質である。というのも、界面活性剤は難分解性なものが多く、環境上問題となることが多いからである。この性質は一方で、医薬・化粧品として利用する上でも好ましい性質である。
【０１０９】
（医薬・化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、残さタンパク質又は脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１１０】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１１１】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１１２】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１１３】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１１４】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する本発明の環状グルカン誘導体を含む組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０１１５】
本発明の処置方法において使用される環状グルカン誘導体を含む組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１１６】
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。
【０１１７】
（保健・食品）
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。
【０１１８】
（磁気記録媒体）
本発明はさらに、近年の磁気記録媒体の記録密度の増加に対応して、磁気ディスクの最外層に適用される潤滑剤としても利用することができる。磁気記録媒体は電子計算機、ワードプロセッサ等の外部メモリーとして用いられ、ハードディスク装置やフロッピー（登録商標）ディスク等が挙げられる。ディスクの大きさとしては、その用途により１〜１４インチのものがある。ハードディスク装置の場合は、１枚または数枚のディスクを重ねることで大きな記録容量を確保している。こうしたディスクは、支持体である基板（Ａｌ、Ｃｕ等の金属の合金、ガラス等のセラミックス、または、ポリカーボネート、ポリスチレン等の有機高分子材料）、磁性体層（Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ等を中心とした合金、または、その酸化物）、保護層（カーボン、ＳｉＣ、ＳｉＯ２等）、そして、本発明のフッ素化合物を含有した膜で構成されている。必要に応じて基板と磁性体層との間、または、磁性体層と保護層との間に、これらの密着性等を改善する目的で新たな層（例えばＮｉ、Ｃｒ、およびＺｎ系の錯体、酸化物、リン系の金属錯体等）を設ける場合がある。
【０１１９】
磁気記録媒体の保護層の上に形成される本発明の膜は、膜厚３０ｎｍ以下が望ましい。これは厚すぎるとヘッドとディスクの間に働く静止摩擦係数が大きくなる恐れがあるからである。また、１ｎｍ未満では十分な効果が得られない。
【０１２０】
このような薄膜を形成するには、膜形成材料を直接塗布するのではなく、適当な溶剤に溶解し、それを浸漬塗布などによって形成する方法が、膜の厚さを制御し易いので好ましい。また、用いた溶剤の沸点や気化熱により後処理の方法は異なるが常温、または、若干の加温、あるいは常圧、減圧下で乾燥し、溶剤を除去する必要がある。この時、気化熱の大きな溶剤を用いると、空気中の水分を当該膜中に取り込む恐れがあるので、溶剤としては気化熱の小さなものが望ましい。
【実施例】
【０１２１】
以下に、本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体について、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２２】
（実施例１：Ｄ酵素の調製）
Ｔａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６（１９９３）に記載されている方法でＤ酵素を精製した。まず、馬鈴薯塊茎を５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液（緩衝液Ａ）中でホモジナイズし、遠心分離して、０．４５μｍのメンブレンを通した後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１６Ｘ１００ｍｍ ファルマシア）にかけ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した。Ｄ酵素は、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶出した。溶出後、緩衝液Ａに対して透析し、最終濃度が５００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加えた。この溶液をＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラム（１０Ｘ１００ｍｍ）にロードし、緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行った。Ｄ酵素活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析を行い、透析液をＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マイクロコンセントレーターを用いて濃縮し、ＰＬ−ＳＡＸ ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕ．Ｋ．）にかけ、緩衝液Ａ中１５０−４００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配をかけて溶出し、活性画分を集めて上記Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マイクロコンセントレーターで濃縮した。
【０１２３】
酵素活性の測定は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１％（ｗ／ｖ）マルトトリオース、および酵素を含む１００μｌの反応混合液を３７℃、１０分間、反応させ、反応液を沸騰水中で３分間加熱して、反応を停止し、反応により遊離したグルコースをグルコースオキシダーゼを用いる方法（Ｂａｒｈａｍら（１９７２）Ａｎａｌｙｓｔ９７：１４２）により定量した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生じる酵素量を１単位とした。
【０１２４】
（実施例２：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３０，０００）５００ｍｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １０ｍｌに完全に溶解させた後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、蒸留水２０ｍｌ、１Ｎ−塩酸１０ｍｌを順に加えアミロース溶液をつくった。このアミロース溶液に馬鈴薯由来Ｄ酵素２００単位を加えて３０℃において２４時間反応させた。
【０１２５】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃、５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素蛋白質を除いた。上清にβアミラーゼ約１００単位およびグルコアミラーゼ１００単位を加えて５０℃において３時間反応させた後、１０倍量のエタノールを加えて、沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥し、粉末約４００ｍｇを得た。
【０１２６】
（実施例３：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販の可溶性澱粉５００ｍｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １０ｍｌに完全に溶解させた後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、蒸留水２０ｍｌ、１Ｎ−塩酸１０ｍｌを順に加え澱粉溶液をつくった。この澱粉溶液に市販のイソアミラーゼ１０単位と馬鈴薯由来Ｄ酵素２００単位とを加えて３０℃において２４時間反応させた。
【０１２７】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃、５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素蛋白質を除いた。上清にβアミラーゼ約１００単位およびグルコアミラーゼ１００単位を加えて５０℃において３時間反応させた後、１０倍量のエタノールを加えて、環状アミロースを沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの粉末約１５０ｍｇを得た。
【０１２８】
（実施例４：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３２０，０００）２０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに完全に溶解させた後、実施例１で精製したＤ酵素６８単位を含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ．７．０）９ｍｌを添加し、３０℃で１０分、２０分、３０分、２時間、６時間、および１８時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離により変性した酵素タンパク質を除いた。上清１ｍｌに５単位のグルコアミラーゼを添加し４０度で４時間反応させ非環状のアミロースを除いた。再び反応液を１００℃で１０分間加熱したのち、遠心分離により変性した酵素タンパクを除き、その上清２５０μｌに１０倍量のエタノールを加えて環状グルカンを沈殿させた。
【０１２９】
（実施例５：α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることの確認）
（１）還元性末端、非還元性末端の定量
実施例２で得られた粉末の還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９８１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：９４：２０５−２１３のパークジョンソン変法により行った。非還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：６３：２６１−２６４の迅速スミス分解法により行った。その結果、還元性末端、非還元性末端は、両者とも検出できなかった。
【０１３０】
（２）エキソ型酵素およびα−１，６−グルコシド結合分解酵素による消化
実施例２で得られた粉末を、０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、本物質水溶液１００μｌに、以下に示した澱粉分解酵素それぞれ１単位を加え４０℃で２時間反応させた。この反応物をＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）により分析した。溶出は流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ，酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．３）、４５分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、４７分−８５０ｍＭの条件で行った。その結果を図４に示す。
【０１３１】
図４に示したように、実施例２で得られた粉末は、澱粉分子の非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）では分解されなかった。また、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）とプルラナーゼ（株式会社林原生化学研究所）の併用、もしくはイソアミラーゼとプルラナーゼとβ−アミラーゼとの併用でも分解されなかった。しかしこの粉末は、澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）により完全に分解された。
【０１３２】
（３）エンド型酵素による消化
実施例２で得られた粉末を０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、この水溶液１００μｌに、細菌糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）１単位を加え、４０℃で２時間反応させた。この反応物をＨＰＬＣで分析したところ、グルコース、マルトース、および若干量のマルトトリオースのみが得られた。このことから、上記実施例２で得られた粉末には、α−１，４−グルコシド結合以外の結合は存在しないことが証明され、得られた粉末が、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることがわかった。
【０１３３】
同様の確認を行った結果、実施例３および４で得られた粉末も、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることがわかった。
【０１３４】
（実施例６：α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの重合度の測定）
一般的に、環状多糖は同じ重合度の直鎖多糖と種々のクロマトグラフィーにおける挙動が異なることが知られている。この性質を用いて、環状であることの証明および環状多糖の重合度の決定を行った。
【０１３５】
（１）特定の重合度を有するα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの精製 実施例２で得られた物質は種々の重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの混合物であると考えられるので、上記特定の重合度を有する環状グルカンの精製を行った。
【０１３６】
図５−１には、実施例２で得られた物質１００μｇを、ＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（装置および溶出条件は前記と同じ）により分析した際の溶出パターンを示す。図５−２には、同じ溶出条件における、直鎖α−１，４−グルカンの溶出パターンを示す。
【０１３７】
この図５−１に示される検出可能な最も早く溶出されたピークをＡ、それに続くピークをそれぞれＢ、Ｃ、Ｄ・・・Ｌとし、このうちＧからＬのピークを分取し、精製した。
【０１３８】
（２）酸加水分解物の分析
分取したＧからＬのピークをそれぞれ０．１ＮのＨＣｌで１００℃、３０分間、加水分解した。この条件は部分加水分解の条件である。分解物をＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（装置および溶出条件は実施例５と同じ）で分析した。図６に、これらの結果を示す。
【０１３９】
上記ピークＧの画分は、酸による部分加水分解を受け、グルコースおよび重合度２から２３の直鎖α−１，４−グルカンに分解された。
【０１４０】
酸分解前のピークＧは、直鎖のα−１，４−グルカンの重合度２０の辺りに溶出されており、分解物の方が分解前の物より高重合度の位置に溶出されるという現象が見いだされた。この現象はそのほかのＨからＬのピークにおいても見いだされ、このことは、ＧからＬのピークがα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであることを示唆していると考えられる。
【０１４１】
前述の部分加水分解の実験において検出された最も重合度の大きな直鎖のα−１，４−グルカンが、それぞれのピークのα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度をあらわすと考えられる。従って、ピークのＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌの重合度は、順にそれぞれ、２３、２４、２５、２６、２７および２８であることが解った。また、この結果から推定すると、最小の重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであるピークＡの重合度は、１７であると考えられる。
【０１４２】
他方、より高重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分析し得る。実施例４において、それぞれの反応時間に得られた、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの粉末を２５０ｕｌの蒸留水に溶解し、その全量をＳｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｏｓｅ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）を連結したカラムにロードし、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を用いて溶出させた。
【０１４３】
その結果、図７に示したように、Ｄ酵素の反応時間が１０分のサンプルでは、生成されたα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの平均分子量は約７０，０００であった。Ｄ酵素の反応時間が長くなるにつれ、生成されているα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの分子量は低下している。しかし、反応時間６時間以降は、平均分子量が約１５，０００から変化しておらず、これ以上の低分子化は起こらなかった。なお、環状グルカンの分子量は、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値である。
【０１４４】
このように、Ｄ酵素により生成されるα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度は、基質として用いるアミロースの重合度、Ｄ酵素量、反応時間により、１７から数百の範囲で任意にコントロールが可能であることがわかった。
【０１４５】
（実施例７：本発明のグルカンの調製）
市販のワキシーコーンスターチ４０ｍｇを２ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に懸濁した後、実施例１で精製したＤ酵素６８０単位を含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８ｍｌを添加し、３０℃で４０時間反応させた。
【０１４６】
反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離により変性した酵素タンパクを除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、グルカンを沈澱させた。次いで、得られた沈殿を凍結乾燥し、本発明のグルカンの粉末約４０ｍｇを得た。この粉末は、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンと、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンと、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみで構成された環状構造と非環状構造部分とを有するグルカンとの混合物であった。
【０１４７】
（実施例８：本発明の少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を環状構造部分または非環状構造部分に有するグルカンの調製）
実施例７で得た沈澱をゲル濾過クロマトグラフィーで分画した。沈澱を２５０μｌの蒸留水に溶解し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）を連結したカラムにその全量をロードした。次いで、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を用いて溶出を行った。図８に示すように、ボイドボリュームに溶出されていたアミロペクチンはＤ酵素の反応により低分子化され、平均分子量が約３０，０００であるピークＩおよび平均分子量が約３，０００であるピークＩＩの２種類の成分が生成した。このうち分子量約３０００であるピークＩＩは、主としてα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであった。一方、平均分子量が約３０，０００であるピークＩは、α−１，６−グルコシド結合を有するグルカンであった。ピークＩの画分を分取し、これに１０倍量のエタノールを加えてα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンを沈澱させた。沈澱は遠心分離して回収後、凍結乾燥した。このようにしてα−１，６−グルコシド結合を有するグルカン２０ｍｇを得た。なお、環状グルカンの分子量は、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値である。
【０１４８】
（実施例９：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
５ｍＭのアデノシンモノフォストフェートを含む１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌにマルトヘキサオース２０ｍｇおよびグルコース１リン酸２００ｍｇを溶解させ、さらに、実施例１で調製したＤ酵素２０単位とホスホリラーゼａ（Ｓｉｇｍａ）１ｍｇとを加えて３０℃で２時間反応させた。
【０１４９】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃で５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素タンパク質を除いた。上清にグルコアミラーゼ５０単位を加えて、直鎖状のアミロースをグルコースまで分解した後、１０倍量のエタノールを加えて、環状アミロースを沈殿させた。この沈殿には、約３０ｍｇのα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンが含まれていた。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、この沈殿中に存在するグルコース１リン酸を除去した。
【０１５０】
（実施例１０：実施例８の物質が少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分を含むことの確認）
グルコアミラーゼは、澱粉などのグルカンの非還元末端から順次α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素である。速度は遅いが、非還元末端からα−１，６−グルコシド結合を加水分解し得ることが知られている。図９に示したように、環状構造を有しないアミロースおよびアミロペクチンは、グルコアミラーゼにより完全にグルコース（１７）にまで分解される。しかし、分子内に環状構造を有するグルカン（１５）および（１３）は、その非環状構造部分のみがグルコアミラーゼにより分解され、環状構造部分は、グルコアミラーゼでは分解を受けない物質（以下、グルコアミラーゼ耐性成分という）として残る。さらに、このグルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉枝切り酵素に対する感受性によって、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカン（１６）とα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）とに分類することができる。即ち、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されないグルコアミラーゼ耐性成分は、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）であると考えられる。一方、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されるグルコアミラーゼ耐性成分は、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカン（１６）であると考えられる。しかし、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されない、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）は、エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼを併用することにより完全にグルコースまで分解され得る。これらの性質を利用することにより、試料グルカンの中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量することが可能となる。
【０１５１】
この方法を用いて、実施例８で得られたグルカンおよびアミロペクチンの環状構造の定量を行った。表１に、この方法を用いて、実施例８で得られたグルカンおよびアミロペクチンの環状構造の定量を行った結果を示す。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
実施例８で得られた物質１０ｍｇまたはアミロペクチン１０ｍｇを、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液８ｍｌを用いて、すばやく希釈した。この希釈液を９００μｌずつ４本のチューブに分注した。次いで、それぞれのチューブに（１）蒸留水、（２）グルコアミラーゼ液、（３）枝切り酵素とグルコアミラーゼの混合液、および（４）エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼの混合液をそれぞれ１００μｌ加えて４０℃、４時間反応させた。反応終了後、生成したグルコースを市販のグルコース定量キットを用いて測定した。そして、試料グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を、それぞれ以下の計算式により求めた。
【０１５４】
【数１】
【０１５５】
ここで、ｃ、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ、（１）、（２）、（３）、および（４）の反応液から生じたグルコース量である。この結果から、実施例８で得られた物質は、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含む環状構造を有するグルカンを含んでいることがわかった。
【０１５６】
（実施例１１：実施例８の物質の環状構造部分の重合度の測定）
実施例８で得た物質１０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた後、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌ、蒸留水８ｍｌ、および２００単位のグルコアミラーゼを添加し、４０℃で１時間反応させた。１００℃で１０分間加熱した後、変性した酵素を遠心分離によって除去した。上清に１０倍のエタノールを添加して多糖を沈澱させた後、沈殿を乾燥した。得られた多糖を１ｍｌの蒸留水に溶解させた。この溶液に５０単位のグルコアミラーゼを添加し、４０℃で１時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱した後、変性した酵素を遠心分離により除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、生じた沈澱を乾燥させて、グルコアミラーゼ耐性成分（環状構造部分）の粉末１．１ｍｇを得た。
【０１５７】
上記のようにして得られたグルコアミラーゼ耐性成分を、０．４％（ｗ／ｖ）になるように蒸留水に溶解した後、Ｄｉｏｎｅｘ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）を用いて分析した。溶出は、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．３）、４５分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、４７分−８５０ｍＭの条件で行った。
【０１５８】
重合度を比較するためのマーカーとして、直鎖のα−１，４−グルカン、および、実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンも同じ条件で分析した。
【０１５９】
図１０に示したように、得られたグルコアミラーゼ耐性成分では、直鎖のα−１，４−グルカンおよびα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンにおいて得られたようにきれいな分離パターンが得られなかった。これは、このグルコアミラーゼ耐性成分が様々な個数のα−１，６−グルコシド結合を含んでいることを示唆している。しかし、最も小さいと考えられるピーク（矢印）が、直鎖のα−１，４−グルカンの重合度１５の位置に対応すること、および実施例６で示したように、環状構造を有するグルカンは同じ重合度の直鎖状グルカンよりも速く溶出されることを考えると、最も小さいと考えられる、少なくとも１つのα−１，６結合を有する環状構造部分の重合度は、少なくとも１５であると考えられた。
【０１６０】
（実施例１２：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼの調製）
Ｔｅｒａｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ｖｏｌ．６５，９１０−９１５（１９９９）の方法に従って、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼを調製した。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼの大腸菌におけ発現プラスミドｐＦＱＧ８で形質転換された大腸菌ＴＧ−１株を終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３７℃で１８時間培養し、遠心分離を行い集菌した。得られた菌体を３００ｍｌの１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｂ）で２
回洗浄し、次いで６０ｍｌの緩衝液Ｂに分散させた。超音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を７０℃、３０分加熱し、遠心分離した上清をＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼ液とした。
【０１６１】
アミロマルターゼの活性は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、１０％（ｗ／ｖ）マルトトリオースにアミロマルターゼを７０℃で１０分間作用させたときに生じるグルコースを定量することにより測定した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１ユニットとし、活性のユニットを算出した。
【０１６２】
（実施例１３：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼによるα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３０，０００）１２５ｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １リットルに完全に溶解アミロース溶液をつくった。このアミロース溶液を２５リットルの水に添加し、ＨＣｌによりｐＨを５．５に調整後、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼ９２０単位を加え、６０℃、４時間反応させた。ＨＣｌにより反応液のｐＨを３に調整し、９０℃、３０分間加熱することにより反応を停止した。ＮａＯＨにより反応液のｐＨを５に調整後、βアミラーゼ８，０００単位加えて５０℃、１５時間反応させた。反応液を０．４５μｍのフィルターによりろ過した透過液に、終濃度７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加えることにより、高重合度環状グルカンを沈殿としてろ過により回収した。得られた沈殿を水に溶解し、凍結乾燥により乾燥させ、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカン約４０ｇを得た。こうして得られた高重合度環状グルカンを、実施例４に示したＤＩＯＮＥＸ社製の糖分析システムで分析したところ、重合度２２以上の高重合度環状グルカンの混合物であった。この高重合度環状グルカンを１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、終濃度４０％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加え、重合度約５０以上の高重合度環状グルカンを沈殿としてろ過により除いた。このろ液に終濃度７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加え、ろ過により沈殿を回収した。得られた沈殿を水に溶解後、凍結乾燥により乾燥させ、重合度２２〜５０の高重合度環状グルカン約３０ｇを得た。
【０１６３】
（実施例１４：本発明のトシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１３と同様の方法で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する重合度２２〜５０の高重合度環状グルカン（略称：ＣＡ）１ｇをナス型フラスコに仕込み、ここに０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌを加え、溶解し、撹拌しながらその水溶液に塩化ｐ−トルエンスルホニル（略称：ｐ−ＴｓＣｌ）１ｇを添加した（図１１のスキーム１および２を参照）。０℃で２時間撹拌した後、濾過によって未反応のｐ−ＴｓＣｌを除去し、水溶液をＨＣｌ水溶液で中和した。このトシル化反応の副生成物であるＮａＣｌ塩を一晩かけて透析により除去し、水を凍結乾燥して白色固体を得た（１．０ｇ、収率８４％）。
【０１６４】
ＵＶスペクトル法により、トシル基特有のＳ＝Ｏ基に基づく吸収が存在することからトシル化が進行したことを確認した（図１２）。また、図１３のトシル化した高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ａ＋ｂ）のプロトン積分計算値とdのプロトン
積分計算値との比率から、トシル化度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうちトシル基で置換された割合を、約４．９％と算出した。
【０１６５】
（実施例１５：置換度の異なるトシル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１４のトシル化の反応条件で、反応温度、時間、攪拌速度を変えて行った。結果を表２に示す。このように、反応条件を変えることにより、トシル基の置換度を変えることができた。
【表２】
（実施例１６：本発明のアルキル基が高重合度環状グルカンに結合したアルキル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１４で得られたトシル化高重合度環状グルカンのトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応を、以下のようにして行った（図１４のスキーム３および４を参照）。まず、トシル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ） １ｇおよびラウリン酸ナトリウム １ｇを、ＤＭＳＯに溶解し、８０℃の温度で、窒素気流下において、５時間撹拌した。次いで、この反応溶液に激しく攪拌したアセトンを添加して生じた沈殿を濾過した後、水に溶解し、一晩にわたり透析することにより、未反応物のラウリン酸ナトリウム塩および副生成物のｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムを除去し、凍結乾燥して白色固体を得た（０．４ｇ、収率８０％）。
【０１６６】
この白色固体のＩＲスペクトル測定（ＫＢｒ法）により、脂肪酸のアルキル基特有のＣＨ伸縮振動およびエステル基特有のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが出現したことから、エステル交換反応が進行したことを確認した（図１５）。また、図１６のエステル交換後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ｄ＋ｅ）のプロトン積分計算値とｃのプロトン積分計算値との比率から、エステル交換度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうち脂肪酸で置換された割合を、３．３％と算出した。
【０１６７】
トシル化前の高重合度環状グルカン（ＣＡ）、トシル化後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）およびエステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）をそれぞれ超純水に分散または溶解させ、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ ｐｌａｔｅ法を用いた表面張力測定を行った（図１７）。図１７より、トシル化前の高重合度環状グルカン（ＣＡ）は、濃度が上昇しても水の表面張力が全く変化しないのに対し、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の場合、濃度上昇と共に表面張力が大きく低下することがわかった。この結果より、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）は、優れた界面活性を有することが示唆された。また、トシル化後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）は、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）に比べ表面張力の低下は小さいが、界面活性を有することが示唆された。
【０１６８】
エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ） ０．４重量％溶液の水中における分散体（０．６ｍＭ）の物性を、動的光散乱により調べた結果を図１８に示す。図１８より、６〜２０ｎｍの直径を有するミセル様分子集合体の存在を確認した。
【０１６９】
また、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン０．４重量％溶液の水中における分散体について、透過型電子顕微鏡（フリーズレプリカ法）を用いて視覚的観察を行った（図１９）。その結果、動的光散乱のデータを符合するサイズの粒子の存在を複数確認した。
【０１７０】
エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン４．０重量％溶液の水中における分散体について、透過型電子顕微鏡を用いて視覚的観察を行った(図２０)。その結果、直径７０〜２００ｎｍの球状のミセルが確認された。
【０１７１】
（実施例１７：本発明のアルキル基が高重合度環状グルカンに結合したアルキル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１６のラウリン酸ナトリウムの代わりにミリスチン酸ナトリウムを用いること以外、実施例１６と同様の方法によって、ミリスチン酸基を含有する環状グルカンが得られた。
【０１７２】
（実施例１８：本発明のフッ化アルキル基が高重合度環状グルカンに結合したフッ化アルキル基含有環状グルカン誘導体の調製方法）
実施例１６のラウリン酸ナトリウムの代わりにペルフルオロ酪酸ナトリウムを用いること以外、実施例１６と同様の方法によって、本発明のフッ化アルキル基含有環状グルカン誘導体が得られた。
【０１７３】
（実施例１９：本発明のアルキル基含有環状グルカン誘導体とゲスト化合物との複合体形成）
ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅを０．４重量％の濃度で水に分散させた溶液に、ヨウ素溶液（０．１重量％ＫＩ、０．０１重量％Ｉ２、０．００４Ｎ ＨＣｌ）を滴下したところ、茶褐色の溶液が得られた。このことは、ヨウ素がＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのＣＡ部分に包接されたことを示しており、ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅがゲスト化合物との複合体形成能を有していることを示していた。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によれば、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することができる。
【０１７５】
本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を含む組成物は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】本発明で使用される高重合度環状グルカンの模式図である。
【図２】アミロースまたはアミロペクチンにＤ酵素を作用させ、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンを得る一連の過程を示す模式図である。
【図３】アミロペクチンにＤ酵素を反応させ、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を持つ環状構造のみで形成されるグルカンを得る一連の過程を示す模式図である。
【図４】本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンを種々の糖分解酵素で消化したときの溶出パターンである。
【図５】５−１は、実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの溶出パターンであり、５−２は、直鎖のα−１，４−グルカンの溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図６】各ピークＧ−Ｌの部分加水分解および非分解物の溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図７】実施例４で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンのゲル濾過による溶出パターンである。
【図８】Ｄ酵素を作用させる前、および、作用させた後のワキシーコーンスターチのゲル濾過による溶出パターンである。
【図９】実施例８で得られたグルカン中の非環状構造部分、少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量する過程を示す模式図である。
【図１０】実施例８で得られた少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンの環状構造部分、直鎖のα−１，４−グルカン、および実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図１１】本発明のトシル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）の合成模式図（スキーム１）および合成スキーム（スキーム２）を示す。
【図１２】本発明のＣＡおよびＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅのＵＶスペクトル図を示す。
【図１３】本発明のＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１４】本発明のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の合成模式図（スキーム３）および合成スキーム（スキーム４）を示す。
【図１５】本発明のＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅおよびＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのＩＲスペクトル図を示す。
【図１６】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１７】本発明のＣＡ、ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅおよびＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのそれぞれの水溶液についての表面張力測定データの比較を示す。
【図１８】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（０．６ｍＭ）の動的光散乱データを示す。
【図１９】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（０．４重量％）の透過型電子顕微鏡（フリーズレプリカ法）写真を示す。
【図２０】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（４．０重量％）の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【符号の説明】
【０１７７】
１１ 還元末端
１２ アミロース
１３ α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン
１４ アミロペクチン
１５ 少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン
１６ 少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造のみで形成されるグルカン
１７ グルコース
１８ α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高重合度環状グルカンの側鎖に疎水性基を有する環状グルカン誘導体、およびその製造方法に関する。本発明はまた、この環状グルカン誘導体を含む医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムに関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の環状構造を有するグルカンとして、α−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造のみを有するグルカンである、シクロデキストリン類が知られている。これらシクロデキストリン類は、一般に澱粉にシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を作用させて合成され、その重合度は通常６から８である。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ（１９９３）Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ： ｖｏｌ．４０ １０３−１１６は、これ以上の重合度を有するα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造のみを有するグルカンが、ＣＧＴａｓｅにより合成されることを報告しているが、最も大きなものでも重合度は１３である。このようなシクロデキストリン類は、環状分子特性を利用して低分子活性物質を包接できる点でよく知られている。しかし、シクロデキストリン類は、一般に油類の炭化水素系溶媒に溶解せず、界面活性剤、分散液形態の医薬、化粧品用組成物および食品用組成物への使用が制限されるというのが現状である。
【０００３】
これらの化合物の特性を変更するため、重合度６〜８のシクロデキストリンの水酸基をアルキル基またはフッ化アルキル基で置換することが知られている（例えば、特許文献１および２参照）。しかし、この低重合度のシクロデキストリン類はそもそも、水溶液中における立体構造の自由度が極めて低く、平面的な環状構造しかとれないため、環内に包接できる分子は限られ、分散液形態の医薬および化粧品用組成物への適用は、限界がある。
【０００４】
このように、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体はいまだに存在せず、医薬、化学、食品、保健、およびエレクトロニクスの業界において非常に重要であり、その開発は渇望されている。
【特許文献１】日本国特許第２７４９５６５号公報
【特許文献２】特開平９−２４１３０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、医薬、試薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途に有用な、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、高重合度環状グルカンのアルコール性水酸基をトシル基で置換でき、このトシル基が脂肪酸ナトリウムと交換できることを発見し、これを利用して高重合度環状グルカンに側鎖として疎水性基を導入した本発明の環状グルカン誘導体を提供することにより、上記課題を解決した。
【０００７】
本発明者らはまた、上記環状グルカン誘導体が水の表面張力を有意に低下させることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明者らはさらに、上記環状グルカン誘導体を含む組成物が、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明者はまた、上記環状グルカン誘導体を含む組成物を利用する、新しい診断、治療、鑑別方法を見出し、本発明を完成した。
【００１０】
このように、本発明では以下を提供する。
（１）重合度１４以上の環状グルカンからなる主鎖と、疎水性基からなる１または２以上の側鎖とを有し、該側鎖が連結基を介して該主鎖に結合している環状グルカン誘導体。
（２）上記疎水性基が、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはトシル基である、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（３）上記疎水性基が、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基である、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（４） 前記親水性部位が、重合度１４以上の環状グルカンのみからなる、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
（５）上記環状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであって、該グルカンが、
（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、および
（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカン、
からなる群より選択される、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（６）上記側鎖が、アミド結合、エーテル結合、またはエステル結合により環状グルカンに結合している、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（７）上記環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、エステル結合によってフッ素置換または無置換の脂肪酸に結合している、項（１）に記載の環状グルカン誘導体。
（８）以下の構造式で表される環状グルカン誘導体：
【００１１】
【化２】
【００１２】
ここで、ｎ個のモノマーユニットは、それぞれ独立しており、ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在し；
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり；
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−であり；
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基であり；
ｎは、１４〜５０００である、環状グルカン誘導体。
（９）項（８）に記載の環状グルカン誘導体であって、ｎ個のＲ２およびｎ個のＲ３のすべてが水酸基である、誘導体。
（１０）環状グルカン誘導体の製造方法であって、
重合度１４以上の環状グルカンにトシル基を導入してトシル化誘導体を得る工程、および
該トシル化誘導体に置換もしくは無置換の脂肪酸エステルを反応させて、エステル誘導体を得る工程、
を包含する方法。
（１１）以下の工程： ａ）直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類に、Ｄ酵素を反応させて、高重合度環状グルカンを得る工程；
ｂ）アルカリ水溶液中で、該高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つと該塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得る工程；
ｃ）該トシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、該トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させて、疎水性基が結合した環状グルカン誘導体を得る工程、
を包含する、環状グルカン誘導体の製造方法。
（１２）上記工程ｂ）において、上記高重合度環状グルカンと、上記塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンの全アルコール性水酸基のうち少なくとも３％以上がトシル基で置換される反応条件下で接触させる、項（１１）に記載の方法。
（１３）上記工程ｃ）において、上記トシル基含有環状グルカン誘導体と、上記脂肪酸ナトリウムとを、上記トシル基と上記脂肪酸ナトリウムとの交換率が少なくとも５０％となる反応条件下で接触させる、項（１１）に記載の方法。
（１４）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、医薬。
（１５）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、界面活性剤。
（１６）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、化粧品用組成物。
（１７）項（１）に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、磁気記録媒体用フィルム。
（１８）非磁性支持体上に１層以上の磁性体層を備えた磁気記録媒体において、該磁性体層、または該磁性体層上に設けた保護層の表面に、項（１７）に記載のフィルムを形成させた、磁気記録媒体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することができる。
【００１４】
本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を含む組成物は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１６】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１７】
本明細書において「グルカン」とは、Ｄ−グルコースから成る多糖類の総称を意味する。本発明の「グルカン」には、澱粉、グリコーゲン、ラミナラン、セルロース、リケニン、デキストラン、ニゲランなどの貯蔵多糖類、構造多糖類、代謝の副産物が含まれる。
【００１８】
本明細書において「高重合度環状グルカン」とは、従来の重合度６〜８の環状グルカンであるα−、β−、またはγ−シクロデキストリンより重合度が高く、α−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを意味する。本発明において、好ましい高重合度環状グルカンは、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであり、代表例として、（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、または（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカンなどが挙げられる。
【００１９】
本明細書において「モノマーユニット」または「グルコースモノマーユニット」とは、高重合度環状グルカンを構成する、グルコースまたはグルコース誘導体からなるモノマーユニットを意味する。
【００２０】
本明細書において、「重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位」とは、高重合度環状グルカンに、必要に応じて疎水性基以外の置換基が導入された部分構造を意味する。すなわち、本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基からなる側鎖以外の部分を意味する。この親水性部位において、環状グルカンに必要に応じて導入される置換基の例としては、親水性のレセプター、リガンド、色素などが挙げられるが、これらに限定されない。レセプターの例には、例えば抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント類、レクチンなどの受容体タンパク質、核酸などが含まれる。リガンドの例には、例えば抗原、酵素基質、ホルモン類、ハプテン類、ビタミン類、アルカロイド類、核酸、単糖類、多糖類などが含まれる。これらの置換基は、公知の方法により環状グルカンの任意の位置に導入される。
【００２１】
本明細書において「疎水性基」とは、上記高重合度環状グルカンの側鎖として導入した場合に、その化合物が水の表面張力を低下させ界面活性を発現するような官能基全てを意味する。本発明の疎水性基として、トシル基、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基および置換された炭素環基などが挙げられるが、これらに限定されない。これら官能基は、以下の（有機化学）の節で詳細に定義される。
【００２２】
本明細書において「環状グルカン誘導体」とは、上で定義した疎水性基が、上で定義した高重合度環状グルカンあるいは重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位に結合して得られる化合物全てを意味する。本発明の「環状グルカン誘導体」との用語は、本明細書において「エステル交換後の高重合度環状グルカン」との用語と互換可能に使用される。
【００２３】
本明細書において「トシル基含有環状グルカン誘導体」とは、上で定義した疎水性基の群のうちのトシル基が高重合度環状グルカンに結合して得られる化合物全てを意味する。本発明の「トシル基含有環状グルカン誘導体」との用語は、本明細書において「トシル化高重合度環状グルカン」との用語と互換可能に使用される。
【００２４】
本明細書において「（疎水性基が高重合度環状グルカンに）結合した」とは、アミド結合、エーテル結合およびエステル結合からなる群から選択される誘導体化を意味する。これらの誘導体化は、用途に応じて、当業者により適宜選択され得る。必要に応じて、誘導体化の方法の１つとして、通常、澱粉の修飾に用いられる方法が用いられる（生物化学実験法１９，「澱粉・関連糖質実験法」：中村ら、学会出版センター、１９８６年 ２７３〜３０３頁）。
【００２５】
本明細書において「フッ素置換率」との用語は、フッ素置換前のアルキル基の全水素原子数に対するフッ素原子で置換された割合（百分率）を意味する。
【００２６】
（有機化学）
本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の１または２以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。
【００２７】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例は、Ｃ３〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ９アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１１アルキルまたはＣ３〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ１３アルキル、Ｃ３〜Ｃ１４アルキル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキル、Ｃ３〜Ｃ１６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１７アルキル、Ｃ３〜Ｃ１８アルキル、Ｃ３〜Ｃ１９アルキル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ３〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を３〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００２８】
本明細書において「フッ化アルキル（基）」とは、上で定義したアルキル基内の少なくとも１個の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基を意味し、特にアルキル基を構成する水素原子全てがフッ素原子で置換されたアルキル基を「ペルフルオロアルキル基」または「パーフルオロアルキル基」といい、これに対して、一部の水素原子がフッ素原子で置換され、水素原子が残存するアルキル基を「フルオロヒドロアルキル基」または「ヒドロフルオロアルキル基」という。
【００２９】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロヘキシルなどが例示される。
【００３０】
本明細書において「アルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルケニル、Ｃ３〜Ｃ５アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ７アルケニル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ９アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９アルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ３〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を３〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ３〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００３１】
本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルのＨが置換されたシクロアルケニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルケニルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたシクロアルケニル、であり得る。例えば、好ましいシクロアルケニルとしては、１−シクロペンテニル、２−シクロヘキセニルなどが例示される。
【００３２】
本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルキニル、Ｃ３〜Ｃ５アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８アルキニル、Ｃ３〜Ｃ９アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１３アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１４アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１７アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１８アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１９アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００３３】
本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１Ｏ−で表される（ここで、ｎは１以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシのＨが置換されたアルコキシをいう。本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基の具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１１アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１３アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１４アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１５アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１７アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１８アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１９アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ２０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ４置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ５置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１２置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１３置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１４置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１５置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１６置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１７置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１８置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ１９置換されたアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ２０置換されたアルコキシであり得る。
【００３４】
本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であって、前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基のＨが置換された炭素環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フェニル基から水素原子が１個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。
【００３５】
本明細書において「ハロゲン」とは、周期表７Ｂ族に属するフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などの元素の１価の基をいう。
【００３６】
本明細書において「水酸基」とは、−ＯＨで表される基をいう。本明細書において、「水酸基」との用語は、「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」との用語と互換可能に使用され得る。
【００３７】
本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（アシル基）で置換した基であり、好ましくは、−ＣＯＮＨ２で表される。
【００３８】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。
【００３９】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
【００４０】
本発明の環状グルカン誘導体の疎水性基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシおよび炭素環基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒは、それぞれ独立して、水素、ハロゲンおよびアルキルからなる群より選択され得る。より好ましくは、置換基Ｒは、フッ素である。
【００４１】
（好ましい実施形態の説明）
以下に、本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００４２】
１つの局面において、本発明は、疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を提供する。このような疎水性基の導入により、本発明の環状グルカン誘導体の油類への溶解度が向上し、優れた界面活性特性を得ることができる。本発明の環状グルカン誘導体は、シクロデキストリン類に比べはるかに高重合度の環状グルカン部位を有するため、包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を持ち合わせることができる。これにより、本発明の環状グルカン誘導体は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途に有用となる。
【００４３】
以下に、本発明の環状グルカン誘導体を製造する際の原料である、高重合度環状グルカンの構造、性質および製造方法について、説明する。
【００４４】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンであり、具体的には、例えば、図１に模式的に示される種々のグルカンが挙げられる。図１において、水平の直線および曲線は、α−１，４−グルコシド結合でつながったグルカンの鎖を示し、垂直の矢印は、α−１，６−グルコシド結合を示す（以下の模式図における水平の直線および曲線、ならびに垂直の矢印も同様である）。
【００４５】
上記のように、本発明で使用する高重合度環状グルカンには、環状構造のみを有するグルカンと、さらに環状構造に加えて非環状構造を有するグルカンとが含まれる。そしてこの環状構造には、α−１，４−グルコシド結合のみで構成される場合と、α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合で構成される場合とがある。少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を環状構造内部もしくは非環状構造部分に有するグルカンは、アミロペクチンのような分枝構造を有するグルカンを基質とした場合に生じる。
【００４６】
環状構造のみを有するグルカンは、環状構造に加えて非環状構造を有するグルカンをα−１，４−グルコシド結合及びα−１，６−グルコシド結合を非還元性末端から切断するグルコアミラーゼ処理して得られる。あるいは直鎖状のα−１，４−グルカンまたは分枝構造を有するグルカンを基質として用いて、直接得られる。
【００４７】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、以下の性質を有する。
（１）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるグルコアミラーゼ（東洋紡（株））を作用させると、それ以上分解されない成分（グルコアミラーゼ耐性成分）が残る。その成分は、脱リン酸化酵素（シグマ社）を作用させた後にさらにグルコアミラーゼを作用させても分解されない。
（２）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる場合がある。
（３）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、エンド型アミラーゼであるα−アミラーゼにより分解される。
【００４８】
本発明で使用する高重合度環状グルカンのうち、α−１，６−グルコシド結合を有せず、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン（以下、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンという）は、以下の性質を有する。
（１）還元性末端、非還元性末端が、いずれも検出できない。
（２）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（東洋紡（株））では分解されない。
（３）澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）とプルラナーゼ（株式会社林原生化学研究所）の併用、もしくはイソアミラーゼとプルラナーゼとβ−アミラーゼの併用でも分解されない。
（４）澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）により完全に分解される。
（５）細菌糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）で加水分解し、ＨＰＬＣで分析すると、グルコース、マルトース、及び若干量のマルトトリオースのみが得られる。すなわち、α−１，４−グルコシド結合以外の結合は存在しない。
【００４９】
本発明で使用する高重合度環状グルカンのうち、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合とにより構成される環状構造のみを有するグルカン（以下、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンという）は、以下の性質を有する。
（１）還元性末端、非還元性末端が、いずれも検出できない。
（２）非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（東洋紡（株））では分解されない。
（３）澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。
（４）澱粉中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により、分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。また、同エンド型α−アミラーゼを、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンに作用させた場合の最小リミットデキストリンは、イソマルトシルマルトース（ＩＭＭ）であることが知られている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ， ｐ４０−４５（１９８８））。上記本発明のα−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンをエンド型αーアミラーゼで処理することによって、ＩＭＭが検出される。
【００５０】
本発明で使用する高重合度環状グルカンの環状構造を構成するグルコースの数は、少なくとも１４個であり、好ましくは１７個以上、より好ましくは２２個以上、さらにより好ましくは５０個以上であり、上限は、約５０００個である。α−１，６−グルコシド結合を有する場合、その数は少なくとも１個あればよく、通常１〜５００個、好ましくは１〜１００個である。
【００５１】
上記還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９８１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：９４：２０５−２１３の改変パークジョンソン法により、非還元性末端の定量はＨｉｚｕｋｕｒｉら（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：６３：２６１−２６４の迅速スミス分解法により行い得る。
【００５２】
上記エキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ、あるいは、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、あるいは、エンド型アミラーゼであるα−アミラーゼによる分解は、例えば、本発明で使用する高重合度環状グルカンを、０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、１００μｌをとり、上記分解酵素をそれぞれ適当量加え、３０−４５℃で数時間反応させる。この反応物を、ＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）にかけ、分析し得る。溶出は、例えば、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ，酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ、４５分−８５０ｍＭ、４７分−８５０ｍＭの条件で行い、重合度および生じる糖を分析し得る。
【００５３】
本発明で使用する高重合度環状グルカンからの上記グルコアミラーゼ耐性成分の検出は、次のように行い得る。例えば、本発明の高重合度環状グルカン１００ｍｇを５ｍｌの蒸留水に溶解させ、グルコアミラーゼを終濃度１０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で一夜反応させる。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去した後、１０倍量のエタノールを添加し、残存する多糖を遠心分離による沈澱として回収する。沈澱をさらに１ｍｌの蒸留水に溶解し、グルコアミラーゼを終濃度５０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で１時間反応させ、１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去する。これに１０倍量エタノールを添加し沈澱を得る。本発明のグルカンの原料が一部リン酸基により修飾されている澱粉などの原料の場合は、得られた沈澱を１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３ｍＭのＺｎＣｌ２を含む）に溶解し、２０単位の脱リン酸化酵素（ウシ由来、Ｓｉｇｍａ製）を添加し、４０℃で２４時間反応させた後、１０倍量エタノールを添加し、沈澱を回収する。再度蒸留水に溶解し、グルコアミラーゼを終濃度５０単位／ｍｌとなるように添加し、４０℃で１時間反応させ、１０倍量のエタノールを添加し、グルコアミラーゼ耐性成分を沈澱として得ることができる。
【００５４】
本発明の高重合度環状グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分の定量は、以下のように行い得る。試料高重合度環状グルカン１０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液８ｍｌを用いてすばやく希釈する。この希釈液を９００μｌずつ４試料採り、それぞれの試料に、１００μｌの蒸留水、グルコアミラーゼ液、枝切り酵素とグルコアミラーゼとの混合液、およびエンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼとの混合液をそれぞれ加えて、４０℃で４時間反応させる。反応終了後、生じたグルコースを、市販のグルコース定量キットを用いて測定することにより、試料グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を計算により求めることができる。詳細は、実施例で説明する。
【００５５】
本発明で使用する高重合度環状グルカンの環状構造部分の重合度は、クロマトグラフィーを用いて測定し得る。一般的に、環状多糖は同じ重合度の直鎖多糖とはクロマトグラフィーにおける挙動が異なることが知られており、この性質を用いて、環状であることの証明、及び環状多糖の重合度の決定が行われ得る。例えば、Ｄ酵素を用いて反応させて得られた本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンを上記のＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システムで分離し、シングルピークの画分を取得し得る。得られた画分を、例えば、０．１ＮのＨＣｌで１００℃、３０分間処理し、この環状構造部分を部分的に加水分解したのち、分解により生じた種々の重合度の直鎖のグルカンをＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システムを用いて分析し、重合度を決定し得る。詳細な分析方法は、実施例で述べる。
【００５６】
本発明で使用する高重合度環状グルカンは、直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを生成し得る酵素とを反応させて得られる。このような活性を有する酵素であれば、いかなる酵素も使用し得る。本発明においては、Ｄ酵素を用いることが好ましい。
【００５７】
Ｄ酵素は最初、馬鈴薯から発見されたが、種々の植物、および大腸菌などの微生物に存在していることがわかっている。この大腸菌などの微生物の酵素はアミロマルターゼあるいは４−α−グルカノトランスフェラーゼと称される。従って、Ｄ酵素はその起源は問わず、これら酵素をコードする遺伝子を大腸菌などの宿主をもちいて発現せしめたものであっても使用し得る。ここでは、馬鈴薯および大腸菌からのＤ酵素の精製方法を例として開示するが、これに限られない。
【００５８】
馬鈴薯から、Ｄ酵素を精製する方法は、Ｔａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６（１９９３）に記載されている。まず、馬鈴薯塊茎を５ｍＭのメルカプトエタノールを含む適当な緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離して、０．４５μｍのメンブレンを通した後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけ、例えば、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）に１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄する。Ｄ酵素は、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶出する。これを、緩衝液Ａに対して透析し、５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含む溶液をＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムにロードし、緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析を行う。透析内液を緩衝液Ａで平衡化したＰＬ−ＳＡＸカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕ．Ｋ．）にロードし、緩衝液Ａ中のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭ−４００ｍＭに変化させて溶出し、Ｄ酵素活性画分を集める。上記の方法で馬鈴薯からＤ酵素を精製し得る。酵素活性の測定は、実施例において詳述する。
【００５９】
前出のＴａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６ （１９９３）には、馬鈴薯Ｄ酵素のｃＤＮＡ配列（同１３９４頁、Ｆｉｇ．３）、Ｄ酵素の組換プラスミドの作成（同１３９２頁）、該組換えプラスミドの大腸菌における発現、および組換え大腸菌からのＤ酵素の精製が開示されており、組換え法で作成されるＤ酵素も当然に使用され得る。大腸菌からＤ酵素を精製する方法は、例えば、まず、Ｄ酵素の生産株である大腸菌ＴＧ−１株をＬＢ液体培地を用いて３７℃で対数増殖期まで培養後、マルトースを終濃度１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、さらに３７℃で２時間培養する。遠心分離で集めた菌体を、上記緩衝液Ａに懸濁して超音波処理、遠心分離を行い、菌体抽出液を得る。次に、例えば、緩衝液Ａで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにロードし、緩衝液Ａ中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭに変化させて溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集める。活性画分に、終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えて放置し、遠心分離で不溶性の沈澱を除去し、上清を１Ｍの硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムにロードする。緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素活性画分を集める。この画分を、緩衝液Ａに対して透析後、透析内液を緩衝液Ａで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａの中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭに変化させることにより溶出を行い、Ｄ酵素を精製する。
【００６０】
Ｄ酵素は、上記のようにして精製され得るが、澱粉分子内のα−１，４−グルコシド結合に作用するエンド型のアミラーゼ類が検出されなければ、上記いずれの精製段階の粗酵素であっても、本発明で使用する高重合度環状グルカンの合成に使用し得る。
【００６１】
また、本発明に用いる酵素は、精製酵素、粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（たとえば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）が使用され得る。
【００６２】
本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンのみを得たい場合には、アミロース、澱粉枝切り物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロース、マルトオリゴ糖などのα−１，４−グルコシド結合のみからなる直鎖のα−１，４−グルカンに、本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素を作用させて製造し得る。
【００６３】
また、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどのα−１，６−分岐構造を有する糖類を原料にする場合で、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンのみを得たい場合には、本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えば、Ｄ酵素を直接原料に反応させて製造し得る。あるいは、α−１，６−グルコシド結合を切断するが、α−１，４−グルコシド結合を切断しない酵素、例えばイソアミラーゼ、プルラナーゼの存在下または非存在下で、上記糖類を本発明の高重合度環状グルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素と反応させて製造し得る。
【００６４】
例えば、図２に示すように、還元末端（１１）を有するアミロース（１２）とＤ酵素とを反応させて、上記α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を作成した後、グルコアミラーゼを添加して、非環状グルカンを非還元末端から順次加水分解する。次にエタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６５】
あるいは、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）とα−１，６−グルコシド結合を切断するイソアミラーゼとＤ酵素とを同時に反応させて、上記α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を作成した後、グルコアミラーゼを添加して非還元末端から順次加水分解を行う。次にエタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６６】
あるいは、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）にＤ酵素を反応させることにより、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）と、α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン（１８）と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合および少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）とを調製した後、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼを反応させる。さらに、プルラナーゼを反応させ得る。次いで、エタノールを添加して、環状グルカンを沈殿させ、この沈殿を回収した後凍結乾燥することにより、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）を得る。
【００６７】
さらに、本発明の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（以下、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンという）は、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどのα−１，６−分岐構造を有する原料に、本発明のグルカンに使用し得る上記酵素、例えばＤ酵素を作用させて製造し得る。
【００６８】
例えば、図３に示すように、還元末端（１１）を有するアミロペクチン（１４）にＤ酵素を反応させて、上記の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）と、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）と、α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン（１８）とを作製した後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、上記の少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とにより構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン（１５）を分離し得る。このグルカン（１５）に、グルコアミラーゼを添加して非環状構造部分を非還元末端から順次加水分解する。加水分解後に、エタノールを加えて環状グルカンを沈澱として回収したのち凍結乾燥し、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造のみで形成されるグルカン（１６）を得る。
【００６９】
本発明に用いられ得る直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれを有する糖類としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉枝きり物、澱粉部分加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成澱粉、およびこれらの誘導体などが挙げられる。これらは、単独でもよく、あるいは組み合わせても使用し得る。ここで、澱粉枝きり物とは、澱粉にあるα−１，４−グルコシド結合以外の結合を酵素的に全部あるいは一部を切断して得られる物をいう。また、澱粉部分加水分解物とは、澱粉にあるα−１，４−グルコシド結合の一部を酵素的に、もしくは化学的に切断して得られるものをいい、例えば、重合度が１００程度以上のアミロペクチン、重合度が２２程度以上のアミロースなどが原料として用いられ得る。
【００７０】
また、本発明に用いられ得る直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれを有する糖類と、少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカンを生成し得る酵素との反応は、ホスホリラーゼおよびグルコース−１−リン酸の存在下で行い得る。ホスホリラーゼは、グルコース−１−リン酸が過剰に存在する場合には、α−１，４−グルカン鎖の伸張反応を触媒する。このため、上記原料のα−１，４−グルカン鎖が、上記酵素の環状化反応を受けるには充分な長さを有していない場合には、ホスホリラーゼおよびグルコース−１−リン酸を共存させることにより、本発明のグルカンの収量を増加させることが可能である。
【００７１】
さらに、原料には、上記澱粉あるいは澱粉の部分分解物の誘導体も用い得る。例えば、上記澱粉のアルコール性の水酸基の少なくとも１つが、イオン結合、エーテル化（カルボキシメチル化、ヒドリキシアルキル化等）、エステル化（リン酸化、アセチル化、硫酸化等）、架橋化またはグラフト化された誘導体なども用いられ得る。さらに、これらの２種以上の混合物も原料として用い得る。
【００７２】
上記原料と本発明に使用し得る酵素との反応は、本発明の高重合度環状グルカンが生成するｐＨ、温度などの条件であれば、いずれをも使用し得る。
【００７３】
Ｄ酵素を例にとれば、反応のｐＨは、通常、３から１０、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは４から９、さらに好ましくは、６から８である。温度は、約１０℃から９０℃、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約２０℃から６０℃、さらに好ましくは、３０℃から４０℃の範囲である。耐熱性の微生物などから得られる酵素を用いる場合は、５０℃から９０℃の高温で使用し得る。上記原料の濃度（基質濃度）も、使用する基質の重合度、反応条件を考慮して決定し得る。通常、０．１％から３０％程度、反応速度、効率、基質溶液の取り扱い易さなどの点から、好ましくは０．１％から１０％、さらに好ましくは溶解度などを考慮すると０．５％から５％である。使用する酵素の量は、反応時間、基質の濃度との関係で、決定され、通常は、約１時間から４８時間で反応が終了するように酵素量を選ぶのが好ましく、基質１ｇあたり、通常５０〜１０，０００単位、好ましくは７０〜２，５００単位、より好ましくは４００〜２，０００単位である。
【００７４】
本発明の高重合度環状グルカンは、それ自体は公知の手法を適用して分離、精製し得る。例えば、本発明の高重合度環状グルカンは、上記の反応が終了した後、溶媒による沈澱、膜による分離、クロマトグラフィーによる分離などにより、分離、精製され得る。好ましくは、反応液を加熱して、あるいはそのまま精製する。本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンは、エキソ型のβ−アミラーゼあるいはグルコアミラーゼを添加して、残存する直鎖のα−１，４−グルカンを分解して得られる。澱粉などの分枝多糖を原料として用いた場合には、エキソ型のβ−アミラーゼあるいはグルコアミラーゼと、α−１，６−グルコシド結合を切断する酵素とを併用して、環状α−１，４−グルカンのみが残るように反応させる。その後、溶媒を用いる沈澱、膜分離、クロマト分離などの分離、精製手段が適用され得る。
【００７５】
このようにして得られた高重合度環状グルカンは、そのまま親水性部位として用いてもよく、必要に応じて、さらに親水性置換基を導入して親水性部位として用いてもよい。親水性置換基を導入する場合、その置換基が導入される位置は高重合度環状グルカンの任意の位置であり得る。例えば、環状グルカンを構成するグルコースモノマーユニットのいずれかの２位、３位または６位の水酸基のうちの１つに対して親水性置換基を導入することが可能である。２位、３位または６位の水酸基のうちの２つに対して親水性置換基を導入してもよく、２位、３位および６位のすべての水酸基に対して親水性置換基を導入してもよい。
【００７６】
ただし、環状グルカンを構成するすべてのグルコース単位の２位、３位および６位のすべての水酸基に親水性置換基を導入すると、疎水性基を導入することがなくなる。従って、親水性置換基は、疎水性基の導入が予定される位置以外の位置において導入される。
【００７７】
このようにして得られる、高重合度環状グルカンを含む親水性部位に疎水性基を化学的に結合させることにより、本発明の環状グルカン誘導体が得られる。本発明の環状グルカン誘導体は、好ましくは、例えば、具体的に以下の構造式：
【００７８】
【化３】
【００７９】
で表すことができる。
ここで、上記式においてｎ個のモノマーはそれぞれ互いに独立して選択される。すなわち、単一種類のグルコース誘導体モノマーがｎ個重合されていることを必要とするものではない。１種類のモノマーがｎ個重合されたホモポリマー構造であってもよいが、２種類のモノマーが共重合した構造であってもよい。あるいは、３種類以上のモノマーが共重合した構造であってもよい。
【００８０】
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表す。ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在する。存在する基−Ｌ−Ｒ４の数は、１つの実施形態では、１分子中に２以上であり、好ましくは、５以上であり、より好ましくは、１０以上である。基−Ｌ−Ｒ４の数は、高重合度環状グルカンの全水酸基に対する比率として、全水酸基の１％以上であることが好ましく、全水酸基の２％以上であることがより好ましく、全水酸基の３％以上であることがさらに好ましい。また、全水酸基の５０％以下であることが好ましく、全水酸基の２０％以下であることがより好ましく、全水酸基の１０％以下であることがさらに好ましい。
【００８１】
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基である。
【００８２】
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−である。
【００８３】
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基である。
【００８４】
ｎは、１４〜５０００である。
【００８５】
１つの実施形態では、この化合物は、以下の式の化合物であり得る：
【００８６】
【化４】
【００８７】
ここで、Ｌは連結基を表し、具体例としては例えば、Ｌは−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−などであり、Ｒ４は疎水性基を表し、具体例としては例えば、Ｒ４はＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり、Ｒ５は、水酸基またはトシル基であり、ｎは１４〜５０００である。ｍのｎに対する割合は、好ましくは１〜５０％、より好ましくは２〜２０％、さらに好ましくは３〜１０％である。
【００８８】
好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンに結合される疎水性基として、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはそれらの混合物が使用される。これにより、確実に良好な界面活性を得ることができる。さらに、アルキル基またはフッ化アルキル基を高重合度環状グルカンに結合させる場合、結合の際の立体的障害を考慮すると、これらアルキル基またはフッ化アルキル基は、鎖長とは無関係に、直鎖であることが好ましい。
【００８９】
より好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンに結合される疎水性基として、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基が使用される。これにより、特に優れた界面活性を得ることができる。
【００９０】
また好ましい実施形態において、高重合度環状グルカンへの疎水性基の結合は、アミド結合、エーテル結合およびエステル結合からなる群から選択される。このように、比較的安定した化学結合を採用することにより、医薬、試薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムなどの用途における使用の間、途中で結合が分解することなく、安定した状態で本発明の環状グルカン誘導体の機能および活性を持続させることができる。上記結合の中でも、特に上記高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、フッ素置換または無置換の脂肪酸とのエステル結合によって誘導体化されていることが好ましい。
【００９１】
（側鎖の導入方法）
本発明の高重合度環状グルカン誘導体は、グルコースの水酸基、例えば、上述した方法で得られた高重合度環状グルカンにトシル基を導入し、導入されたトシル基を（置換もしくは無置換）脂肪酸エステルでエステル交換することにより得られる。
【００９２】
本発明の１局面において、本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体は、アルカリ水溶液中で、前述の方法によって合成された高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、高重合度環状グルカンが有する少なくとも１個のアルコール性水酸基と塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得（以下、この工程を高重合度環状グルカンのトシル化という；図１１のスキーム１および２参照）、このトシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させる（以下、この工程をトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応という；図１４のスキーム３および４参照）ことによって得ることができる。
【００９３】
上記高重合度環状グルカンのトシル化は、より具体的に、以下のようにして行われる。まず、前述の方法で得られた高重合度環状グルカンをＮａＯＨ水溶液などのアルカリ水溶液に溶解させ、その水溶液に塩化ｐ−トルエンスルホニル（略称：ｐ−ＴｓＣｌ）を添加する。このとき、ｐ−ＴｓＣｌは、アルカリ水溶液に溶解しないため、高重合度環状グルカンの環内の疎水性環境に包接されたｐ−ＴｓＣｌのみが反応に関わると考えられる。従って、撹拌状態が包接錯体の形成に影響を及ぼすため、反応の進行に大きく影響を与えると考えられる。また反応の進行に影響を及ぼす他の因子としては、撹拌温度、撹拌時間および反応溶液の濃度が挙げられる。この反応溶液濃度が反応の進行に影響を及ぼす理由としては、アルカリ水溶液がトシル化反応の際に発生するＨＣｌをトラップして反応を促進することが挙げられる。当業者は、このような撹拌状態、撹拌温度、撹拌時間および反応溶液の濃度を自在に変化させることで、用途に応じた所望のトシル化度を得ることができる。目的のトシル化高重合度環状グルカンの精製は、目的物を含むアルカリ水溶液を希塩酸で中和し、トシル化反応の副生成物であるＮａＣｌ塩をゲル濾過クロマトグラフィーまたは透析により除去し、水をエバポレーションで減圧除去し、真空乾燥することによって行われる。
【００９４】
トシル化の確認は、トシル基特有のＳ＝Ｏ基に基づく吸収に着目し、ＵＶスペクトル法によって行うことができる（図１２）。また、このトシル化度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうちトシル基で置換された割合は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法により容易に算出することができる。図１３のトシル化した高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ａ＋ｂ）のプロトン積分計算値とｄのプロトン積分計算値との比率により算出することができる。
【００９５】
上で得られたトシル化高重合度環状グルカンのトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応は、より具体的に以下のようにして行われる。トシル化高重合度環状グルカンを適切な溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ））に溶解し、その溶液に脂肪酸ナトリウムまたはフッ化脂肪酸ナトリウムを添加し、約７０〜９０℃の温度で、窒素気流下において、数時間撹拌することによって行われる。エステル交換後の最終目的物の精製は、まず、反応溶液にアセトンなどの溶媒を添加し、最終目的物を沈殿させ、この沈殿物を水に溶解し、適度な時間にわたり透析することにより、未反応物の脂肪酸ナトリウム塩またはフッ化脂肪酸ナトリウム塩および副生成物のｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（略称：ＴｓＮａ）を除去し、凍結乾燥することによって行われる。
【００９６】
エステル交換の確認は、脂肪酸のアルキル基特有のＣＨ伸縮振動およびエステル基特有のＣ＝Ｏ伸縮振動に着目し、ＩＲスペクトル法によって行うことができる（図１５）。また、このエステル交換度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうち脂肪酸またはフッ化脂肪酸で置換された割合は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法により容易に算出することができる。図１６のエステル交換後の高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ｄ＋ｅ）のプロトン積分計算値とｃのプロトン積分計算値との比率により算出することができる。
【００９７】
トシル化後の高重合度環状グルカンおよびエステル交換後の高重合度環状グルカンについての界面活性については、これらをそれぞれ超純水に分散または溶解させ、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ ｐｌａｔｅ法を用いた表面張力測定により評価することができる（図１７）。
【００９８】
エステル交換後の高重合度環状グルカンの水中における分散体についての物性については、動的光散乱により調べることができる（図１８）。
【００９９】
また、エステル交換後の高重合度環状グルカンの水中における分散体の視覚的観察は、透過型電子顕微鏡を用いて行うことができる（図１９）。
【０１００】
（界面活性剤）
本発明の環状グルカン誘導体は、親水性の環状グルカン部分と疎水性の側鎖とを有するため、環状グルカンとしての性能を維持しながら、さらに界面活性剤としての性能を発揮し得る。界面活性剤としての性能の観点から、環状グルカン誘導体のグルカンの重合度は、１４〜５０００が好ましく、１７〜１００がより好ましい。さらに好ましくは２２〜５０である。また、疎水性基の数としては、環状グルカン誘導体に存在するグルコース残基のうち、１〜５０％に疎水性基が導入されていることが好ましく、２〜２０％がより好ましく、３〜１０％がさらに好ましい。疎水性基の種類としては、アルキル基または置換されたアルキル基が好ましく、アルキルまたはパーフルオロアルキルがより好ましい。直鎖のアルキル基または直鎖のパーフルオロアルキル基がさらに好ましい。アルキル基または置換されたアルキル基の鎖長は、Ｃ３〜Ｃ２０が好ましく、より好ましくはＣ３〜Ｃ１２であり、さらに好ましくはＣ３〜Ｃ８である。
【０１０１】
本発明の環状グルカン誘導体は、単独でそのまま界面活性剤として用いてもよく、また他の界面活性剤と組み合わせてもよい。
【０１０２】
本発明の環状グルカン誘導体からなる界面活性剤には、例えば、以下の特徴的な利点がある。
【０１０３】
１）親水部の分子量が大きい界面活性剤であるため、数分子でミセルを形成できる。一方で、ミセルの大きさが直径数百ｎｍにもなる、巨大なミセルを形成することもできる。これはナノ粒子としての利用、乳化剤としての利用が考えられる。
【０１０４】
２）本発明の環状グルカンは、置換基を導入できる水酸基が多いため、導入できる疎水基の数が多い。このため、疎水基の置換度を変えるだけで、親水性基と疎水性基のバランス（ＨＬＢ値）の幅が広い、一連の界面活性剤が得られる。
【０１０５】
３）親水部の分子量が大きい界面活性剤であり、親水部にさらに親水性基を導入しても、界面活性剤としての性質を維持できる。そのため、親水性基として、レセプター、リガンドなどを導入することにより、分子認識能を持つ界面活性剤が得られる。この界面活性剤をミセルあるいは泡として溶媒中に分散させて用いることで、レセプターやリガンドに結合する物質が存在する位置に集積させることができる。この性質は、例えば検査技術、診断技術として応用できる。
【０１０６】
４）本発明の環状グルカン誘導体は、包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にするという分子認識能を持つ。このため、包接能を持つ界面活性剤が得られる。さらに、本発明の環状グルカン誘導体をＬＢ膜にすることにより特定の物質を認識する素子を作ることができる。
【０１０７】
５）本発明の環状グルカン誘導体をαーアミラーゼなどの酵素で分解し、親水部を破壊することにより界面活性剤の機能の制御（乳化・ミセル状態のコントロール）が可能となる。
【０１０８】
６）上記のことはまた、生分解性の界面活性剤が合成可能なことを意味する。これは、環境上好ましい性質である。というのも、界面活性剤は難分解性なものが多く、環境上問題となることが多いからである。この性質は一方で、医薬・化粧品として利用する上でも好ましい性質である。
【０１０９】
（医薬・化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、残さタンパク質又は脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１１０】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１１１】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１１２】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１１３】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１１４】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する本発明の環状グルカン誘導体を含む組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０１１５】
本発明の処置方法において使用される環状グルカン誘導体を含む組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１１６】
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。
【０１１７】
（保健・食品）
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。
【０１１８】
（磁気記録媒体）
本発明はさらに、近年の磁気記録媒体の記録密度の増加に対応して、磁気ディスクの最外層に適用される潤滑剤としても利用することができる。磁気記録媒体は電子計算機、ワードプロセッサ等の外部メモリーとして用いられ、ハードディスク装置やフロッピー（登録商標）ディスク等が挙げられる。ディスクの大きさとしては、その用途により１〜１４インチのものがある。ハードディスク装置の場合は、１枚または数枚のディスクを重ねることで大きな記録容量を確保している。こうしたディスクは、支持体である基板（Ａｌ、Ｃｕ等の金属の合金、ガラス等のセラミックス、または、ポリカーボネート、ポリスチレン等の有機高分子材料）、磁性体層（Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ等を中心とした合金、または、その酸化物）、保護層（カーボン、ＳｉＣ、ＳｉＯ２等）、そして、本発明のフッ素化合物を含有した膜で構成されている。必要に応じて基板と磁性体層との間、または、磁性体層と保護層との間に、これらの密着性等を改善する目的で新たな層（例えばＮｉ、Ｃｒ、およびＺｎ系の錯体、酸化物、リン系の金属錯体等）を設ける場合がある。
【０１１９】
磁気記録媒体の保護層の上に形成される本発明の膜は、膜厚３０ｎｍ以下が望ましい。これは厚すぎるとヘッドとディスクの間に働く静止摩擦係数が大きくなる恐れがあるからである。また、１ｎｍ未満では十分な効果が得られない。
【０１２０】
このような薄膜を形成するには、膜形成材料を直接塗布するのではなく、適当な溶剤に溶解し、それを浸漬塗布などによって形成する方法が、膜の厚さを制御し易いので好ましい。また、用いた溶剤の沸点や気化熱により後処理の方法は異なるが常温、または、若干の加温、あるいは常圧、減圧下で乾燥し、溶剤を除去する必要がある。この時、気化熱の大きな溶剤を用いると、空気中の水分を当該膜中に取り込む恐れがあるので、溶剤としては気化熱の小さなものが望ましい。
【実施例】
【０１２１】
以下に、本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体について、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２２】
（実施例１：Ｄ酵素の調製）
Ｔａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８，１３９１−１３９６（１９９３）に記載されている方法でＤ酵素を精製した。まず、馬鈴薯塊茎を５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液（緩衝液Ａ）中でホモジナイズし、遠心分離して、０．４５μｍのメンブレンを通した後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１６Ｘ１００ｍｍ ファルマシア）にかけ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した。Ｄ酵素は、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶出した。溶出後、緩衝液Ａに対して透析し、最終濃度が５００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加えた。この溶液をＰｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラム（１０Ｘ１００ｍｍ）にロードし、緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行った。Ｄ酵素活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析を行い、透析液をＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マイクロコンセントレーターを用いて濃縮し、ＰＬ−ＳＡＸ ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕ．Ｋ．）にかけ、緩衝液Ａ中１５０−４００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配をかけて溶出し、活性画分を集めて上記Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マイクロコンセントレーターで濃縮した。
【０１２３】
酵素活性の測定は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１％（ｗ／ｖ）マルトトリオース、および酵素を含む１００μｌの反応混合液を３７℃、１０分間、反応させ、反応液を沸騰水中で３分間加熱して、反応を停止し、反応により遊離したグルコースをグルコースオキシダーゼを用いる方法（Ｂａｒｈａｍら（１９７２）Ａｎａｌｙｓｔ９７：１４２）により定量した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生じる酵素量を１単位とした。
【０１２４】
（実施例２：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３０，０００）５００ｍｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １０ｍｌに完全に溶解させた後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、蒸留水２０ｍｌ、１Ｎ−塩酸１０ｍｌを順に加えアミロース溶液をつくった。このアミロース溶液に馬鈴薯由来Ｄ酵素２００単位を加えて３０℃において２４時間反応させた。
【０１２５】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃、５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素蛋白質を除いた。上清にβアミラーゼ約１００単位およびグルコアミラーゼ１００単位を加えて５０℃において３時間反応させた後、１０倍量のエタノールを加えて、沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥し、粉末約４００ｍｇを得た。
【０１２６】
（実施例３：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販の可溶性澱粉５００ｍｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １０ｍｌに完全に溶解させた後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、蒸留水２０ｍｌ、１Ｎ−塩酸１０ｍｌを順に加え澱粉溶液をつくった。この澱粉溶液に市販のイソアミラーゼ１０単位と馬鈴薯由来Ｄ酵素２００単位とを加えて３０℃において２４時間反応させた。
【０１２７】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃、５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素蛋白質を除いた。上清にβアミラーゼ約１００単位およびグルコアミラーゼ１００単位を加えて５０℃において３時間反応させた後、１０倍量のエタノールを加えて、環状アミロースを沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥し、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの粉末約１５０ｍｇを得た。
【０１２８】
（実施例４：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３２０，０００）２０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに完全に溶解させた後、実施例１で精製したＤ酵素６８単位を含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ．７．０）９ｍｌを添加し、３０℃で１０分、２０分、３０分、２時間、６時間、および１８時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離により変性した酵素タンパク質を除いた。上清１ｍｌに５単位のグルコアミラーゼを添加し４０度で４時間反応させ非環状のアミロースを除いた。再び反応液を１００℃で１０分間加熱したのち、遠心分離により変性した酵素タンパクを除き、その上清２５０μｌに１０倍量のエタノールを加えて環状グルカンを沈殿させた。
【０１２９】
（実施例５：α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることの確認）
（１）還元性末端、非還元性末端の定量
実施例２で得られた粉末の還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９８１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：９４：２０５−２１３のパークジョンソン変法により行った。非還元性末端の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：６３：２６１−２６４の迅速スミス分解法により行った。その結果、還元性末端、非還元性末端は、両者とも検出できなかった。
【０１３０】
（２）エキソ型酵素およびα−１，６−グルコシド結合分解酵素による消化
実施例２で得られた粉末を、０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、本物質水溶液１００μｌに、以下に示した澱粉分解酵素それぞれ１単位を加え４０℃で２時間反応させた。この反応物をＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）により分析した。溶出は流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ，酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．３）、４５分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、４７分−８５０ｍＭの条件で行った。その結果を図４に示す。
【０１３１】
図４に示したように、実施例２で得られた粉末は、澱粉分子の非還元性末端のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエキソ型アミラーゼであるβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社）およびグルコアミラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）では分解されなかった。また、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所）とプルラナーゼ（株式会社林原生化学研究所）の併用、もしくはイソアミラーゼとプルラナーゼとβ−アミラーゼとの併用でも分解されなかった。しかしこの粉末は、澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）により完全に分解された。
【０１３２】
（３）エンド型酵素による消化
実施例２で得られた粉末を０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、この水溶液１００μｌに、細菌糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社）１単位を加え、４０℃で２時間反応させた。この反応物をＨＰＬＣで分析したところ、グルコース、マルトース、および若干量のマルトトリオースのみが得られた。このことから、上記実施例２で得られた粉末には、α−１，４−グルコシド結合以外の結合は存在しないことが証明され、得られた粉末が、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることがわかった。
【０１３３】
同様の確認を行った結果、実施例３および４で得られた粉末も、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンであることがわかった。
【０１３４】
（実施例６：α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの重合度の測定）
一般的に、環状多糖は同じ重合度の直鎖多糖と種々のクロマトグラフィーにおける挙動が異なることが知られている。この性質を用いて、環状であることの証明および環状多糖の重合度の決定を行った。
【０１３５】
（１）特定の重合度を有するα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの精製 実施例２で得られた物質は種々の重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの混合物であると考えられるので、上記特定の重合度を有する環状グルカンの精製を行った。
【０１３６】
図５−１には、実施例２で得られた物質１００μｇを、ＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（装置および溶出条件は前記と同じ）により分析した際の溶出パターンを示す。図５−２には、同じ溶出条件における、直鎖α−１，４−グルカンの溶出パターンを示す。
【０１３７】
この図５−１に示される検出可能な最も早く溶出されたピークをＡ、それに続くピークをそれぞれＢ、Ｃ、Ｄ・・・Ｌとし、このうちＧからＬのピークを分取し、精製した。
【０１３８】
（２）酸加水分解物の分析
分取したＧからＬのピークをそれぞれ０．１ＮのＨＣｌで１００℃、３０分間、加水分解した。この条件は部分加水分解の条件である。分解物をＤＩＯＮＥＸ社の糖分析システム（装置および溶出条件は実施例５と同じ）で分析した。図６に、これらの結果を示す。
【０１３９】
上記ピークＧの画分は、酸による部分加水分解を受け、グルコースおよび重合度２から２３の直鎖α−１，４−グルカンに分解された。
【０１４０】
酸分解前のピークＧは、直鎖のα−１，４−グルカンの重合度２０の辺りに溶出されており、分解物の方が分解前の物より高重合度の位置に溶出されるという現象が見いだされた。この現象はそのほかのＨからＬのピークにおいても見いだされ、このことは、ＧからＬのピークがα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであることを示唆していると考えられる。
【０１４１】
前述の部分加水分解の実験において検出された最も重合度の大きな直鎖のα−１，４−グルカンが、それぞれのピークのα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度をあらわすと考えられる。従って、ピークのＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌの重合度は、順にそれぞれ、２３、２４、２５、２６、２７および２８であることが解った。また、この結果から推定すると、最小の重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであるピークＡの重合度は、１７であると考えられる。
【０１４２】
他方、より高重合度のα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分析し得る。実施例４において、それぞれの反応時間に得られた、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの粉末を２５０ｕｌの蒸留水に溶解し、その全量をＳｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｏｓｅ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）を連結したカラムにロードし、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を用いて溶出させた。
【０１４３】
その結果、図７に示したように、Ｄ酵素の反応時間が１０分のサンプルでは、生成されたα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの平均分子量は約７０，０００であった。Ｄ酵素の反応時間が長くなるにつれ、生成されているα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの分子量は低下している。しかし、反応時間６時間以降は、平均分子量が約１５，０００から変化しておらず、これ以上の低分子化は起こらなかった。なお、環状グルカンの分子量は、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値である。
【０１４４】
このように、Ｄ酵素により生成されるα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの重合度は、基質として用いるアミロースの重合度、Ｄ酵素量、反応時間により、１７から数百の範囲で任意にコントロールが可能であることがわかった。
【０１４５】
（実施例７：本発明のグルカンの調製）
市販のワキシーコーンスターチ４０ｍｇを２ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に懸濁した後、実施例１で精製したＤ酵素６８０単位を含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８ｍｌを添加し、３０℃で４０時間反応させた。
【０１４６】
反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離により変性した酵素タンパクを除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、グルカンを沈澱させた。次いで、得られた沈殿を凍結乾燥し、本発明のグルカンの粉末約４０ｍｇを得た。この粉末は、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンと、本発明のα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンと、本発明のα−１，４−グルコシド結合のみで構成された環状構造と非環状構造部分とを有するグルカンとの混合物であった。
【０１４７】
（実施例８：本発明の少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を環状構造部分または非環状構造部分に有するグルカンの調製）
実施例７で得た沈澱をゲル濾過クロマトグラフィーで分画した。沈澱を２５０μｌの蒸留水に溶解し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）を連結したカラムにその全量をロードした。次いで、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を用いて溶出を行った。図８に示すように、ボイドボリュームに溶出されていたアミロペクチンはＤ酵素の反応により低分子化され、平均分子量が約３０，０００であるピークＩおよび平均分子量が約３，０００であるピークＩＩの２種類の成分が生成した。このうち分子量約３０００であるピークＩＩは、主としてα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンであった。一方、平均分子量が約３０，０００であるピークＩは、α−１，６−グルコシド結合を有するグルカンであった。ピークＩの画分を分取し、これに１０倍量のエタノールを加えてα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンを沈澱させた。沈澱は遠心分離して回収後、凍結乾燥した。このようにしてα−１，６−グルコシド結合を有するグルカン２０ｍｇを得た。なお、環状グルカンの分子量は、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値である。
【０１４８】
（実施例９：本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
５ｍＭのアデノシンモノフォストフェートを含む１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌにマルトヘキサオース２０ｍｇおよびグルコース１リン酸２００ｍｇを溶解させ、さらに、実施例１で調製したＤ酵素２０単位とホスホリラーゼａ（Ｓｉｇｍａ）１ｍｇとを加えて３０℃で２時間反応させた。
【０１４９】
反応液を遠心分離後、上清を１００℃で５分間処理し、再び遠心分離して変性した酵素タンパク質を除いた。上清にグルコアミラーゼ５０単位を加えて、直鎖状のアミロースをグルコースまで分解した後、１０倍量のエタノールを加えて、環状アミロースを沈殿させた。この沈殿には、約３０ｍｇのα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンが含まれていた。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、この沈殿中に存在するグルコース１リン酸を除去した。
【０１５０】
（実施例１０：実施例８の物質が少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分を含むことの確認）
グルコアミラーゼは、澱粉などのグルカンの非還元末端から順次α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素である。速度は遅いが、非還元末端からα−１，６−グルコシド結合を加水分解し得ることが知られている。図９に示したように、環状構造を有しないアミロースおよびアミロペクチンは、グルコアミラーゼにより完全にグルコース（１７）にまで分解される。しかし、分子内に環状構造を有するグルカン（１５）および（１３）は、その非環状構造部分のみがグルコアミラーゼにより分解され、環状構造部分は、グルコアミラーゼでは分解を受けない物質（以下、グルコアミラーゼ耐性成分という）として残る。さらに、このグルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉枝切り酵素に対する感受性によって、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカン（１６）とα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）とに分類することができる。即ち、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されないグルコアミラーゼ耐性成分は、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）であると考えられる。一方、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されるグルコアミラーゼ耐性成分は、α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカン（１６）であると考えられる。しかし、枝切り酵素およびグルコアミラーゼの併用によって分解されない、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン（１３）は、エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼを併用することにより完全にグルコースまで分解され得る。これらの性質を利用することにより、試料グルカンの中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量することが可能となる。
【０１５１】
この方法を用いて、実施例８で得られたグルカンおよびアミロペクチンの環状構造の定量を行った。表１に、この方法を用いて、実施例８で得られたグルカンおよびアミロペクチンの環状構造の定量を行った結果を示す。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
実施例８で得られた物質１０ｍｇまたはアミロペクチン１０ｍｇを、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液８ｍｌを用いて、すばやく希釈した。この希釈液を９００μｌずつ４本のチューブに分注した。次いで、それぞれのチューブに（１）蒸留水、（２）グルコアミラーゼ液、（３）枝切り酵素とグルコアミラーゼの混合液、および（４）エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼの混合液をそれぞれ１００μｌ加えて４０℃、４時間反応させた。反応終了後、生成したグルコースを市販のグルコース定量キットを用いて測定した。そして、試料グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を、それぞれ以下の計算式により求めた。
【０１５４】
【数１】
【０１５５】
ここで、ｃ、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ、（１）、（２）、（３）、および（４）の反応液から生じたグルコース量である。この結果から、実施例８で得られた物質は、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含む環状構造を有するグルカンを含んでいることがわかった。
【０１５６】
（実施例１１：実施例８の物質の環状構造部分の重合度の測定）
実施例８で得た物質１０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた後、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌ、蒸留水８ｍｌ、および２００単位のグルコアミラーゼを添加し、４０℃で１時間反応させた。１００℃で１０分間加熱した後、変性した酵素を遠心分離によって除去した。上清に１０倍のエタノールを添加して多糖を沈澱させた後、沈殿を乾燥した。得られた多糖を１ｍｌの蒸留水に溶解させた。この溶液に５０単位のグルコアミラーゼを添加し、４０℃で１時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱した後、変性した酵素を遠心分離により除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、生じた沈澱を乾燥させて、グルコアミラーゼ耐性成分（環状構造部分）の粉末１．１ｍｇを得た。
【０１５７】
上記のようにして得られたグルコアミラーゼ耐性成分を、０．４％（ｗ／ｖ）になるように蒸留水に溶解した後、Ｄｉｏｎｅｘ社の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）を用いて分析した。溶出は、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．３）、４５分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、４７分−８５０ｍＭの条件で行った。
【０１５８】
重合度を比較するためのマーカーとして、直鎖のα−１，４−グルカン、および、実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンも同じ条件で分析した。
【０１５９】
図１０に示したように、得られたグルコアミラーゼ耐性成分では、直鎖のα−１，４−グルカンおよびα−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンにおいて得られたようにきれいな分離パターンが得られなかった。これは、このグルコアミラーゼ耐性成分が様々な個数のα−１，６−グルコシド結合を含んでいることを示唆している。しかし、最も小さいと考えられるピーク（矢印）が、直鎖のα−１，４−グルカンの重合度１５の位置に対応すること、および実施例６で示したように、環状構造を有するグルカンは同じ重合度の直鎖状グルカンよりも速く溶出されることを考えると、最も小さいと考えられる、少なくとも１つのα−１，６結合を有する環状構造部分の重合度は、少なくとも１５であると考えられた。
【０１６０】
（実施例１２：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼの調製）
Ｔｅｒａｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ｖｏｌ．６５，９１０−９１５（１９９９）の方法に従って、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼを調製した。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼの大腸菌におけ発現プラスミドｐＦＱＧ８で形質転換された大腸菌ＴＧ−１株を終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３７℃で１８時間培養し、遠心分離を行い集菌した。得られた菌体を３００ｍｌの１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｂ）で２
回洗浄し、次いで６０ｍｌの緩衝液Ｂに分散させた。超音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を７０℃、３０分加熱し、遠心分離した上清をＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼ液とした。
【０１６１】
アミロマルターゼの活性は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、１０％（ｗ／ｖ）マルトトリオースにアミロマルターゼを７０℃で１０分間作用させたときに生じるグルコースを定量することにより測定した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１ユニットとし、活性のユニットを算出した。
【０１６２】
（実施例１３：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼによるα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの調製）
市販のアミロース（平均分子量３０，０００）１２５ｇを１Ｎ−ＮａＯＨ １リットルに完全に溶解アミロース溶液をつくった。このアミロース溶液を２５リットルの水に添加し、ＨＣｌによりｐＨを５．５に調整後、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３９２３株由来アミロマルターゼ９２０単位を加え、６０℃、４時間反応させた。ＨＣｌにより反応液のｐＨを３に調整し、９０℃、３０分間加熱することにより反応を停止した。ＮａＯＨにより反応液のｐＨを５に調整後、βアミラーゼ８，０００単位加えて５０℃、１５時間反応させた。反応液を０．４５μｍのフィルターによりろ過した透過液に、終濃度７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加えることにより、高重合度環状グルカンを沈殿としてろ過により回収した。得られた沈殿を水に溶解し、凍結乾燥により乾燥させ、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカン約４０ｇを得た。こうして得られた高重合度環状グルカンを、実施例４に示したＤＩＯＮＥＸ社製の糖分析システムで分析したところ、重合度２２以上の高重合度環状グルカンの混合物であった。この高重合度環状グルカンを１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、終濃度４０％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加え、重合度約５０以上の高重合度環状グルカンを沈殿としてろ過により除いた。このろ液に終濃度７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加え、ろ過により沈殿を回収した。得られた沈殿を水に溶解後、凍結乾燥により乾燥させ、重合度２２〜５０の高重合度環状グルカン約３０ｇを得た。
【０１６３】
（実施例１４：本発明のトシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１３と同様の方法で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する重合度２２〜５０の高重合度環状グルカン（略称：ＣＡ）１ｇをナス型フラスコに仕込み、ここに０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌを加え、溶解し、撹拌しながらその水溶液に塩化ｐ−トルエンスルホニル（略称：ｐ−ＴｓＣｌ）１ｇを添加した（図１１のスキーム１および２を参照）。０℃で２時間撹拌した後、濾過によって未反応のｐ−ＴｓＣｌを除去し、水溶液をＨＣｌ水溶液で中和した。このトシル化反応の副生成物であるＮａＣｌ塩を一晩かけて透析により除去し、水を凍結乾燥して白色固体を得た（１．０ｇ、収率８４％）。
【０１６４】
ＵＶスペクトル法により、トシル基特有のＳ＝Ｏ基に基づく吸収が存在することからトシル化が進行したことを確認した（図１２）。また、図１３のトシル化した高重合度環状グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ａ＋ｂ）のプロトン積分計算値とdのプロトン
積分計算値との比率から、トシル化度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうちトシル基で置換された割合を、約４．９％と算出した。
【０１６５】
（実施例１５：置換度の異なるトシル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１４のトシル化の反応条件で、反応温度、時間、攪拌速度を変えて行った。結果を表２に示す。このように、反応条件を変えることにより、トシル基の置換度を変えることができた。
【表２】
（実施例１６：本発明のアルキル基が高重合度環状グルカンに結合したアルキル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１４で得られたトシル化高重合度環状グルカンのトシル基と脂肪酸ナトリウムとのエステル交換反応を、以下のようにして行った（図１４のスキーム３および４を参照）。まず、トシル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ） １ｇおよびラウリン酸ナトリウム １ｇを、ＤＭＳＯに溶解し、８０℃の温度で、窒素気流下において、５時間撹拌した。次いで、この反応溶液に激しく攪拌したアセトンを添加して生じた沈殿を濾過した後、水に溶解し、一晩にわたり透析することにより、未反応物のラウリン酸ナトリウム塩および副生成物のｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムを除去し、凍結乾燥して白色固体を得た（０．４ｇ、収率８０％）。
【０１６６】
この白色固体のＩＲスペクトル測定（ＫＢｒ法）により、脂肪酸のアルキル基特有のＣＨ伸縮振動およびエステル基特有のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが出現したことから、エステル交換反応が進行したことを確認した（図１５）。また、図１６のエステル交換後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図の（ｄ＋ｅ）のプロトン積分計算値とｃのプロトン積分計算値との比率から、エステル交換度、つまり高重合度環状グルカンの全水酸基のうち脂肪酸で置換された割合を、３．３％と算出した。
【０１６７】
トシル化前の高重合度環状グルカン（ＣＡ）、トシル化後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）およびエステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）をそれぞれ超純水に分散または溶解させ、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ ｐｌａｔｅ法を用いた表面張力測定を行った（図１７）。図１７より、トシル化前の高重合度環状グルカン（ＣＡ）は、濃度が上昇しても水の表面張力が全く変化しないのに対し、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の場合、濃度上昇と共に表面張力が大きく低下することがわかった。この結果より、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）は、優れた界面活性を有することが示唆された。また、トシル化後の高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）は、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）に比べ表面張力の低下は小さいが、界面活性を有することが示唆された。
【０１６８】
エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ） ０．４重量％溶液の水中における分散体（０．６ｍＭ）の物性を、動的光散乱により調べた結果を図１８に示す。図１８より、６〜２０ｎｍの直径を有するミセル様分子集合体の存在を確認した。
【０１６９】
また、エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン０．４重量％溶液の水中における分散体について、透過型電子顕微鏡（フリーズレプリカ法）を用いて視覚的観察を行った（図１９）。その結果、動的光散乱のデータを符合するサイズの粒子の存在を複数確認した。
【０１７０】
エステル交換後のラウリル化高重合度環状グルカン４．０重量％溶液の水中における分散体について、透過型電子顕微鏡を用いて視覚的観察を行った(図２０)。その結果、直径７０〜２００ｎｍの球状のミセルが確認された。
【０１７１】
（実施例１７：本発明のアルキル基が高重合度環状グルカンに結合したアルキル基含有環状グルカン誘導体の調製）
実施例１６のラウリン酸ナトリウムの代わりにミリスチン酸ナトリウムを用いること以外、実施例１６と同様の方法によって、ミリスチン酸基を含有する環状グルカンが得られた。
【０１７２】
（実施例１８：本発明のフッ化アルキル基が高重合度環状グルカンに結合したフッ化アルキル基含有環状グルカン誘導体の調製方法）
実施例１６のラウリン酸ナトリウムの代わりにペルフルオロ酪酸ナトリウムを用いること以外、実施例１６と同様の方法によって、本発明のフッ化アルキル基含有環状グルカン誘導体が得られた。
【０１７３】
（実施例１９：本発明のアルキル基含有環状グルカン誘導体とゲスト化合物との複合体形成）
ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅを０．４重量％の濃度で水に分散させた溶液に、ヨウ素溶液（０．１重量％ＫＩ、０．０１重量％Ｉ２、０．００４Ｎ ＨＣｌ）を滴下したところ、茶褐色の溶液が得られた。このことは、ヨウ素がＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのＣＡ部分に包接されたことを示しており、ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅがゲスト化合物との複合体形成能を有していることを示していた。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によれば、油類への溶解度が良好で、優れた界面活性特性を有し、しかも包接される化合物の構造にあわせて環状立体構造を変化させ、低分子量から高分子量の多種多様な化合物の包接を可能にする分子認識ホスト分子として優れた性質を有する高重合度環状グルカンを基本骨格とした新しい環状グルカン誘導体およびその製造方法を提供することができる。
【０１７５】
本発明の疎水性基が高重合度環状グルカンに結合した環状グルカン誘導体を含む組成物は、医薬、界面活性剤、化粧品用組成物、食品用組成物および磁気記録媒体用フィルムとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】本発明で使用される高重合度環状グルカンの模式図である。
【図２】アミロースまたはアミロペクチンにＤ酵素を作用させ、α−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンを得る一連の過程を示す模式図である。
【図３】アミロペクチンにＤ酵素を反応させ、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を持つ環状構造のみで形成されるグルカンを得る一連の過程を示す模式図である。
【図４】本発明のα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンを種々の糖分解酵素で消化したときの溶出パターンである。
【図５】５−１は、実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンの溶出パターンであり、５−２は、直鎖のα−１，４−グルカンの溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図６】各ピークＧ−Ｌの部分加水分解および非分解物の溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図７】実施例４で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する高重合度環状グルカンのゲル濾過による溶出パターンである。
【図８】Ｄ酵素を作用させる前、および、作用させた後のワキシーコーンスターチのゲル濾過による溶出パターンである。
【図９】実施例８で得られたグルカン中の非環状構造部分、少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有する環状構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量する過程を示す模式図である。
【図１０】実施例８で得られた少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンの環状構造部分、直鎖のα−１，４−グルカン、および実施例２で得られたα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンの溶出パターンである。各ピーク状の数字は、重合度を示す。
【図１１】本発明のトシル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅ）の合成模式図（スキーム１）および合成スキーム（スキーム２）を示す。
【図１２】本発明のＣＡおよびＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅのＵＶスペクトル図を示す。
【図１３】本発明のＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１４】本発明のラウリル化高重合度環状グルカン（ＣＡ−ｌａｕｒａｔｅ）の合成模式図（スキーム３）および合成スキーム（スキーム４）を示す。
【図１５】本発明のＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅおよびＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのＩＲスペクトル図を示す。
【図１６】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１７】本発明のＣＡ、ＣＡ−ｔｏｓｙｌａｔｅおよびＣＡ−ｌａｕｒａｔｅのそれぞれの水溶液についての表面張力測定データの比較を示す。
【図１８】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（０．６ｍＭ）の動的光散乱データを示す。
【図１９】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（０．４重量％）の透過型電子顕微鏡（フリーズレプリカ法）写真を示す。
【図２０】本発明のＣＡ−ｌａｕｒａｔｅの水中における分散体（４．０重量％）の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【符号の説明】
【０１７７】
１１ 還元末端
１２ アミロース
１３ α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカン
１４ アミロペクチン
１５ 少なくとも１４個のα−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造を分子内に１つ有するグルカン
１６ 少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合により構成される環状構造のみで形成されるグルカン
１７ グルコース
１８ α−１，４−グルコシド結合のみにより構成される環状構造と非環状構造部分とを有するグルカン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位と、疎水性基からなる１または２以上の側鎖とを有し、該側鎖が連結基を介して該主鎖に結合している環状グルカン誘導体。
【請求項２】
前記疎水性基が、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはトシル基である、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項３】
前記疎水性基が、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基である、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項４】
前記親水性部位が、重合度１４以上の環状グルカンのみからなる、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項５】
前記環状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであって、該グルカンが、
（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、および
（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカン、
からなる群より選択される、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項６】
前記側鎖が、アミド結合、エーテル結合、またはエステル結合により環状グルカンに結合している、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項７】
前記環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、エステル結合によってフッ素置換または無置換の脂肪酸に結合している、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項８】
以下の構造式で表される環状グルカン誘導体：
【化１】
ここで、ｎ個のモノマーユニットは、それぞれ独立しており、ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在し；
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり；
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−であり；
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基であり；
ｎは、１４〜５０００である、環状グルカン誘導体。
【請求項９】
請求項８に記載の環状グルカン誘導体であって、ｎ個のＲ２およびｎ個のＲ３のすべてが水酸基である、誘導体。
【請求項１０】
環状グルカン誘導体の製造方法であって、
重合度１４以上の環状グルカンにトシル基を導入してトシル化誘導体を得る工程、および
該トシル化誘導体に置換もしくは無置換の脂肪酸エステルを反応させて、エステル誘導体を得る工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類に、Ｄ酵素を反応させて、高重合度環状グルカンを得る工程；
ｂ）アルカリ水溶液中で、該高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つと該塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得る工程；
ｃ）該トシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、該トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させて、疎水性基が結合した環状グルカン誘導体を得る工程、
を包含する、環状グルカン誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記工程ｂ）において、前記高重合度環状グルカンと、前記塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンの全アルコール性水酸基のうち少なくとも３％以上がトシル基で置換される反応条件下で接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ｃ）において、前記トシル基含有環状グルカン誘導体と、前記脂肪酸ナトリウムとを、前記トシル基と前記脂肪酸ナトリウムとの交換率が少なくとも５０％となる反応条件下で接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、医薬。
【請求項１５】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、界面活性剤。
【請求項１６】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、化粧品用組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、磁気記録媒体用フィルム。
【請求項１８】
非磁性支持体上に１層以上の磁性体層を備えた磁気記録媒体において、該磁性体層、または該磁性体層上に設けた保護層の表面に、請求項１７に記載のフィルムを形成させた、磁気記録媒体。
【請求項１】
重合度１４以上の環状グルカンを含む親水性部位と、疎水性基からなる１または２以上の側鎖とを有し、該側鎖が連結基を介して該主鎖に結合している環状グルカン誘導体。
【請求項２】
前記疎水性基が、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基、あるいはトシル基である、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項３】
前記疎水性基が、少なくとも５０％のフッ素置換率を有するＣ３〜Ｃ２０の直鎖のフルオロヒドロアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖のペルフルオロアルキル基である、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項４】
前記親水性部位が、重合度１４以上の環状グルカンのみからなる、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項５】
前記環状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合により構成される重合度１４以上の環状構造を分子内に１つ有するグルカンであって、該グルカンが、
（ｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造に加えて非環状構造を有するグルカン、
（ｉｉｉ）α−１，４−グルコシド結合のみで構成される環状構造のみを有するグルカン、および
（ｉｖ）α−１，４−グルコシド結合と少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合とで構成される環状構造のみを有するグルカン、
からなる群より選択される、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項６】
前記側鎖が、アミド結合、エーテル結合、またはエステル結合により環状グルカンに結合している、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項７】
前記環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが、エステル結合によってフッ素置換または無置換の脂肪酸に結合している、請求項１に記載の環状グルカン誘導体。
【請求項８】
以下の構造式で表される環状グルカン誘導体：
【化１】
ここで、ｎ個のモノマーユニットは、それぞれ独立しており、ｎ個のＲ１は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ２は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ｎ個のＲ３は、それぞれ独立して−Ｌ−Ｒ４またはＲ５を表し、ただし、１分子中に少なくとも１つの−Ｌ−Ｒ４が存在し；
Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基、またはＣ３〜Ｃ２０の直鎖または分枝鎖のフッ化アルキル基であり；
Ｌは、それぞれ独立して、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＳＯ２−、−ＳＣＯ−または−ＯＣＯ−であり；
Ｒ５は、それぞれ独立して、水酸基またはトシル基であり；
ｎは、１４〜５０００である、環状グルカン誘導体。
【請求項９】
請求項８に記載の環状グルカン誘導体であって、ｎ個のＲ２およびｎ個のＲ３のすべてが水酸基である、誘導体。
【請求項１０】
環状グルカン誘導体の製造方法であって、
重合度１４以上の環状グルカンにトシル基を導入してトシル化誘導体を得る工程、および
該トシル化誘導体に置換もしくは無置換の脂肪酸エステルを反応させて、エステル誘導体を得る工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）直鎖のα−１，４−グルカンまたはこれらを含む糖類に、Ｄ酵素を反応させて、高重合度環状グルカンを得る工程；
ｂ）アルカリ水溶液中で、該高重合度環状グルカンと、塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンが有するアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つと該塩化ｐ−トルエンスルホニルとが反応し得る条件下で、接触させて、トシル基が高重合度環状グルカンに結合したトシル基含有環状グルカン誘導体を得る工程；
ｃ）該トシル基含有環状グルカン誘導体と、フッ素置換または無置換の脂肪酸ナトリウムとを、該トシル基と該脂肪酸ナトリウムとが交換反応し得る条件下で、接触させて、疎水性基が結合した環状グルカン誘導体を得る工程、
を包含する、環状グルカン誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記工程ｂ）において、前記高重合度環状グルカンと、前記塩化ｐ−トルエンスルホニルとを、該高重合度環状グルカンの全アルコール性水酸基のうち少なくとも３％以上がトシル基で置換される反応条件下で接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ｃ）において、前記トシル基含有環状グルカン誘導体と、前記脂肪酸ナトリウムとを、前記トシル基と前記脂肪酸ナトリウムとの交換率が少なくとも５０％となる反応条件下で接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、医薬。
【請求項１５】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、界面活性剤。
【請求項１６】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、化粧品用組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の環状グルカン誘導体またはそれらの混合物を含む、磁気記録媒体用フィルム。
【請求項１８】
非磁性支持体上に１層以上の磁性体層を備えた磁気記録媒体において、該磁性体層、または該磁性体層上に設けた保護層の表面に、請求項１７に記載のフィルムを形成させた、磁気記録媒体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００６−８３３８０（Ｐ２００６−８３３８０Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４０５０９（Ｐ２００５−２４０５０９）
【出願日】平成１７年８月２２日（２００５．８．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２２日（２００５．８．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]