神経再生及び機能回復のためのシグマリガンド
神経変性疾患における神経再生及び機能回復を容易にするために有用な方法及び組成物を開示する。該方法及び組成物はシグマ受容体リガンドを利用し、該リガンドは好ましくはＡＧＹ−９４８０６又はその塩若しくは溶媒和物である。これらの分子は虚血性脳卒中、糖尿病性末梢神経障害、がん治療によって誘発される神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、ハンチントン病又はパーキンソン病によって起こるような神経変性疾患を治療又は予防する薬剤とともに又は単独で投与することができる。他の方法において、シグマ受容体リガンドは機能回復を容易にするために脳卒中後に投与される。シグマ受容体リガンドの投与はより早期の機能回復をもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００４年６月１４日出願の米国出願番号１０／８６８，４２３の一部継続出願でありその出願に基づく優先権を主張し、該出願は、２００３年６月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／４７８，７３５、２００３年６月１２日出願の６０／４７８，３２９、２００３年８月２６日出願の６０／４９８，１３２、及び２００４年３月１２日出願の６０／５５２，６１３の利益を主張し、並びに、２００４年６月１４日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９３９、公開番号ＷＯ２００４／１１０３８７Ａ２の継続出願であり、それら全てを引用によりそれらの全体を本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患を有する被験者において神経再生を達成するための治療方法に関するものである。特に、本発明は、神経変性疾患後の被験者において神経再生及び機能回復を容易にするためのシグマ受容体リガンドの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シグマ受容体の存在は、ベンゾモルファンの精神異常作用を説明するために、Ｍａｒｔｉｎら（１９７６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９７：５１７−５３２によって提唱された。当初、シグマ受容体は新規オピオイド受容体であると考えられていた。しかしながら、ベンゾモルファンのシグマ受容体への結合は、古典的オピオイド受容体アンタゴニストであるナロキソンによって拮抗されない。更に、ベンゾモルファンは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体複合体上のフェンシクリジン受容体とは異なる部位に結合する。従って、シグマ受容体は独特の受容体として確立されている。
【０００４】
シグマ受容体は、シグマ−１及びシグマ−２という名の二つのサブタイプからなる。Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ（１９９０）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５２７：２２４−２５３は、二つの推定シグマ受容体サブタイプの特徴を初めて定義した。これら二つの部位間の主な薬理学的相違点は、結合部位に対するベンゾモルファン麻酔薬の（＋）異性体の親和性にある。（＋）ＳＫＦ１０，０４７（ＮＡＮＭ）及び（＋）ペンタゾシンなどのこれら化合物は、シグマ−１部位に対してシグマ−２部位に対してよりもほぼ２桁高い親和性を示す。ベンゾモルファンの（−）異性体は、これら二つの部位間でほとんど選択性を示さない。二つの部位間で注目される他の相違点は、ＮＣＢ−２０、ＰＣ１２及びＮＧ１０８−１５のような細胞株におけるシグマ−２部位の優勢である（Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ；Ｑｕｉｒｉｏｎら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３：８５−８６）。シグマ−１受容体は同定され、クローン化されているが、シグマ−２受容体は未だにそうではない（Ｌａｎｇａら、（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６）。シグマ受容体の内在リガンドは知られていない。
【０００５】
脳におけるシグマ−１受容体のサブセルラー分布には、海馬、皮質層及び嗅球が含まれる。シグマ−１は２６ｋＤａタンパク質であり、受容体をコードする遺伝子はクローン化されている。疎水性プロット分析は、シグマ−１受容体が二つの膜貫通セグメントを有することを示唆している。更に、シグマ−１受容体は他の公知の哺乳動物タンパク質と相同性がない。
【０００６】
両方のタイプのシグマ受容体は、末梢組織のみならず中枢神経系でも発現する。従って、受容体に対するリガンドは神経変性疾患の治療及び予防に用いることができるであろう。そのため、脳シグマ受容体は活発な研究の対象となっている（Ｓｏｎｄｅｒｓら（１９８８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１：３７−４０）。一般に、シグマ受容体は、精神病薬、抗うつ薬及び神経ステロイドのような幅広いリガンドに対して無差別に結合する。これらはうつ病の行動モデルのみならず健忘症の動物モデルにおいても学習及び記憶に重要な役割を果たすことが示されている。非常に多くの研究は、脳虚血の動物モデルにおいてシグマ受容体リガンドの強い神経保護特性を示している。これらシグマリガンドのうちのいくつかの神経保護メカニズムは、シグマ受容体もＮＭＤＡ受容体チャネル複合体のフェンシクリジン（ＰＣＰ）結合部位もこうした作用に貢献することが報告されているため、論争になっている。
【０００７】
神経変性疾患は神経細胞の機能障害及び細胞死を特徴とし、脳、脊髄及び末梢神経系によって媒介される機能の喪失をもたらす。こうした障害は社会に大きな影響をもつ。例えば、およそ４〜５百万人のアメリカ人がアルツハイマー病として知られる慢性神経変性疾患に悩まされている。慢性神経変性疾患の他の例には、糖尿病性末梢神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病及びパーキンソン病が含まれる。正常な脳の加齢も正常な神経機能の喪失に関連しており、ある種のニューロンの減少を必然的に伴い得る。
【０００８】
脳卒中は米国における死亡原因の第３位であり、神経科の入院患者の半数を占める。損傷を受けた脳の領域によって、脳卒中は昏睡、麻痺、言語問題及び痴呆を引き起こし得る。脳梗塞の主な原因は、血管内血栓、脳塞栓、低血圧、高血圧性出血、及び無酸素症／低酸素症である。しかしながら、成人の脳は、可塑性及び機能再構築のための能力を生涯にわたって、たとえ脳卒中又は脳虚血の後であっても、保持している。ニューロン結合は継続的に改築される。脳の障害部分を代償する脳の潜在的能力は、脳卒中のリハビリテーションのための適切さを有する。脳卒中患者の神経画像診断はある程度の機能再構築を示唆している。このように、脳可塑性の１つの側面は、脳卒中患者において、感覚入力、体験及び学習によってニューロン結合を修飾することができること、そして脳は、機能的及び構造的再構築、ある事象に対する神経反応の上方制御又は下方制御、側枝発芽及び代償性シナプス形成並びに神経発生による新規な機能的及び構造的結合の確立によって、対応できることである。
【０００９】
しかしながら、脳の可塑性に対する環境因子の効果に加えて、薬物や薬物と環境因子との相互作用は考慮すべき他の側面である。したがって、神経再生及び機能回復を補助するために脳可塑性を利用する中枢神経系疾患及び他の病態を治療するための新規薬物、そして、新規方法に対する必要性が存在し続けている。本発明は、これら及び他の必要性を満たすものである。
【００１０】
いくつかのシグマ受容体リガンドは、薬物の神経保護活性に関する試験における予測モデルにおいて神経保護性である（即ち、神経細胞死及びその結果として起こる機能喪失から保護する）ことがわかっている。例えば、シグマ受容体リガンド オピプラモールは、アレチネズミにおいて虚血から保護することがわかっており、ＮＭＤＡ型グルタメート受容体を調節することがわかっている。更に、ＢＭＹ−１４８０２、カラミフェン及びハロペリドールを含めた他のシグマリガンドは、ＮＭＤＡによって誘発される毒性及び発作に対して保護効果を提供できることと一致した特性をｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて発揮し（Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２６：４６１−４６５）、いくつかのシグマリガンドは、虚血によって誘導される海馬スライス標本からのグルタメート放出をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することがわかった（Ｄ．Ｌｏｂｎｅｒら（１９９０）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．，１１７：１６９−１７４）。
【００１１】
米国特許第５，７３６，５４６号は、シグマ受容体のリガンドのある種の１，４−（ジフェニルアルキル）ピペラジン誘導体について開示する。その中の化合物のうちの１つ、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジンは、現在ＳＡ４５０３又はＡＧＹ−９４８０６としても知られている。Ｎａｋａｚａｗａら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３２：３３７−３４３は、ＡＧＹ−９４８０６が選択的シグマ−１アゴニストであり、ラットの初代神経細胞カルチャーにおいて低酸素症／低血糖症で誘発される神経毒性を有意に抑制したことを報告している。この神経保護作用は、シグマ−１受容体は神経変性の治療に有用であり得るとの示唆を著者らにもたらした（３４２頁参照）。Ｓｅｎｄａら、（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３４２：１０５−１１１は、ＡＧＹ−９４８０６が培養ラット網膜神経細胞においてグルタメートの神経毒性に対して活性があることを発見したと更に報告している。著者らは、シグマ−１受容体アゴニストは、中心及び分岐網膜動脈閉塞、真性糖尿病、加齢に関連した黄斑変性、異常ヘモグロビン症並びにさまざまなタイプの緑内障などの虚血による神経細胞死を伴う網膜疾患に対して有用であり得ることを示唆している。現在ＡＧＹ−９４８０６はうつ病治療用に臨床開発されており、痴呆症及び薬物依存症の治療に潜在的用途があると注目されてもいる。
【００１２】
米国特許第５，６６５，７２５号は、シグマ受容体のリガンドのある種のピペリジン誘導体を開示する。これらの化合物は、不安、精神病、てんかん、けいれん、ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ｍｏｔｏｒ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ、健忘症、脳血管疾患、アルツハイマー型老年性痴呆症及びパーキンソン病の治療に有用であるといわれている。これらの化合物のうちの１つ、１’−［４−［１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１−ブチル］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］は、Ｌｕ２８−１７９又はシラメシンとしても知られている。これは選択的シグマ−２アゴニストであり、シグマ−１受容体に対する活性も示す（Ｐｅｒｒｅｇａａｒｄ Ｊ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８：１９９８−２００８）。国際特許出願、公開番号ＷＯ９９／２４４３６号は、前記化合物のハロゲン化水素塩、特に塩酸塩は、良好なバイオアベイラビリティを有することを更に開示する。
【特許文献１】米国特許第５，６６５，７２５号
【特許文献２】米国特許第５，７３６，５４６号
【特許文献３】公開番号ＷＯ９９／２４４３６号
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９７：５１７−５３２（１９７６）
【非特許文献２】Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５２７：２２４−２５３（１９９０）
【非特許文献３】Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ；Ｑｕｉｒｉｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３：８５−８６（１９９２）
【非特許文献４】Ｌａｎｇａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６（２００３）
【非特許文献５】Ｓｏｎｄｅｒｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１：３７−４０（１９８８）
【非特許文献６】Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２６：４６１−４６５（１９９１）
【非特許文献７】Ｄ．Ｌｏｂｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．，１１７：１６９−１７４（１９９０）
【非特許文献８】Ｎａｋａｚａｗａら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３２：３３７−３４３（１９９８）
【非特許文献９】Ｓｅｎｄａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３４２：１０５−１１１（１９９８）
【非特許文献１０】Ｐｅｒｒｅｇａａｒｄ Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８：１９９８−２００８（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このように、先行技術は、シグマリガンドが神経変性疾患を有する被験者の治療において神経保護剤として有用であり得ることを示唆している。
【００１４】
今回、予想外にも、ある種のシグマリガンドは神経変性疾患を患う被験者において機能回復を容易にすることがわかった。したがって、シグマリガンドは、神経障害後の神経変性疾患の治療において神経再生剤として有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、神経変性疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。本発明のシグマ受容体リガンドは機能回復及び神経再生を促進する。これらの分子は単独で又は追加の薬剤と組み合わせて送達することができ、虚血性脳卒中又は神経を傷つける他の傷害原因によるような神経変性疾患を治療するための神経再生剤として用いられる。
【００１６】
したがって、１つの側面では、本発明は、それを必要とする被験者の神経変性疾患を治療又は予防するための方法に関する。この方法は、医薬的に有効量のシグマ受容体のリガンドを被験者に投与することを含む。
【００１７】
したがって、本発明は、それを必要とする哺乳動物被験者の神経変性疾患を、神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすように治療するための方法を提供し、この方法は医薬的に有効量のシグマ受容体リガンドを被験者に投与することを含む。
【００１８】
他の側面では、本発明は、哺乳動物被験者において神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすための医薬の製造におけるシグマリガンドの使用を提供する。
【００１９】
更に他の側面では、本発明は、神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすように哺乳動物被験者を治療するためのシグマリガンドを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
神経変性疾患は、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、糖尿病性末梢神経障害、がん治療によって誘発される神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病又はパーキンソン病であり得るが、好ましくは虚血性脳卒中、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である。更に、本発明は、追加の活性物質の投与方法を提供する。本発明のリガンドは、医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物で投与することができる。賦形剤は、経口投与に好適であり得る。したがって、組成物は錠剤、カプセル、又は軟ゲルカプセルの形態であり得る。
【００２１】
あるいは、賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、又は皮下投与に好適な液体であり得る。あるいは、賦形剤は経皮投与、又は口腔内投与に好適であり得る。シグマ受容体リガンドは、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジン（ＡＧＹ−９４８０６）又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。
【００２２】
本発明は、脳卒中、脊髄虚血、脊髄損傷及び外傷性脳損傷のような中枢神経系障害患者のリハビリテーションのための方法及び組成物を提供する。本発明は、シグマ受容体リガンド、好ましくはＡＧＹ−９４８０６を脳卒中後約４８時間以内に、１〜３カ月間、好ましくは最長１年、より好ましくは継続的に患者に投与した場合、患者の機能障害状態を回復させるという発見に基づいている。リガンドは単独で又は追加の薬剤と組み合わせて送達することができる。ＡＧＹ−９４８０６は、例えば治療期間中毎日投与することができる。
【００２３】
したがって、１つの側面では、本発明は、医薬的に有効量のシグマ受容体リガンドを脳卒中症状の発現直後１〜３カ月間被験者に投与することを含む、被験者の脳卒中を治療する方法に関する。シグマ受容体リガンドは、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジン（ＡＧＹ−９４８０６）又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物、例えばＡＧＹ−９４８０６のＨＣｌ塩又は二塩酸塩、であることが好ましい。
【００２４】
本発明の他の側面では、被験者へのシグマリガンドの投与は、神経変性疾患後、特に虚血性脳卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の後、少なくとも２４時間、例えば少なくとも４８時間、１週間、１カ月又は３カ月に開始する。シグマリガンドは、治療開始から反復して、例えば毎日、例えば１週間、２週間、１カ月、３カ月、１年又はそれより長期間、投与することができる。例えば、治療は、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の後、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間、少なくとも１週間に開始し、１カ月、３カ月、６カ月又は１年間継続することができる。
【００２５】
被験者の治療は医師の指示の下で実施することができる。治療期間中、医師は、被験者の神経再生の徴候を評価することができる。この徴候は、脳若しくは脊髄の機能回復又は構造変化の徴候であり得る。したがって、例えば、医師は、被験者の１つ以上の機能反応を治療の直前又は開始時、及び治療後再び測定することができる。したがって、治療は神経再生（又は機能回復）の徴候が得られるまで継続することができる。
【００２６】
以下により詳細に記載するように、機能回復の徴候は、例えば運動技量、認知技量、言語又は感覚による認識力及び機能の回復であり得る。運動技量の回復及び認知技量の回復について特に言及することができる。神経再生の徴候は、脳又は脊髄における構造変化の徴候でもあり得る。
【００２７】
本発明の他の側面では、患者の神経変性疾患の治療に用いて神経再生（又は機能回復）を容易にする包装キットが提供される。キットには、ＡＧＹ−９４８０６又はその塩若しくは溶媒和物の医薬製剤、保存中及び投与前に医薬製剤を収容する容器、並びに神経再生（又は機能回復）を容易にするための神経変性疾患の治療に有効な方法で薬物投与を実施するための使用説明書、例えば包装挿入物又はラベル上の取扱説明書が含まれる。医薬製剤は本明細書に記載の如何なる製剤、例えば単位用量のシグマ受容体リガンドを含有する経口剤形であり得、単位用量は疾患の治療に治療上有効な用量である。
【００２８】
本発明のこれら及び他の側面は、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。更に、ある種の手順又は組成物についてより詳細に記載したさまざまな参考文献が本明細書中に記載されており、したがってその全体が引用により組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
詳細な説明
Ｉ．定義
特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲を含めた本願で使用する以下の用語は下記の定義を有する。明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するように、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈がその他を明示していない限りは複数の指示対象も含むことに注意しなければならない。標準的化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ及びＳｕｎｄｂｅｒｇ（１９９２）『応用有機化学 第３版』Ｖｏｌ．Ａ及びＢ、Ｐｌｅｎｕｍ出版、ニューヨーク、を含めた参考資料に見出すことができる。本発明の実践には、特に他であることを明記しない限り、質量スペクトル法、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用の方法を当該分野の技術の範囲内で採用するであろう。
【００３０】
「アゴニスト」という用語は、他の分子の活性又はシグマ受容体部位の活性を高める化合物、薬物、酵素アクチベーター又はホルモンのような分子を意味する。
【００３１】
「アンタゴニスト」という用語は、他の分子の作用又はシグマ受容体部位の活性を減少させるか又は妨げる化合物、薬物、酵素インヒビター、又はホルモンのような分子を意味する。
【００３２】
「脳卒中」という用語は、原因にかかわらず、広く、脳への血流低下に関連した神経脱落の発症を意味する。潜在的原因には、限定されるものではないが、血栓症、出血及び塞栓形成が挙げられる。血栓、塞栓、及び全身性低血圧は、脳虚血エピソードの最も一般的な原因である。他の障害は、高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤破裂、血管腫、血液疾患、心不全、心停止、心臓ショック、敗血症性ショック、頭部外傷、脊髄外傷、発作、腫瘍に由来する出血、又は他の失血によって引き起こされ得る。
【００３３】
「虚血エピソード」とは、組織への血液供給不足をもたらす如何なる状況をも意味する。虚血が脳卒中を伴う場合、それは以下に定義するように全脳虚血又は局所脳虚血であり得る。「虚血性脳卒中」という用語は、より詳細には、限定的なもので、血流閉塞によって起こるある種の脳卒中を意味する。「虚血性脳卒中」という用語には、外科手術によって生ずるもの含めた心停止、脳卒中、及び多発梗塞性痴呆症の後の脳虚血が含まれる。脳虚血エピソードは脳への血液供給不足によって生ずる。やはり中枢神経系の一部である脊髄は、同様に、血流減少によって生ずる虚血による影響を受けやすい。
【００３４】
「局所脳虚血」とは、中枢神経系に関して本明細書で用いるように、脳又は脊髄に血液を供給する１つの動脈の閉塞によって生ずる状態であって、その動脈によって供給される領域の細胞に障害をもたらすところの状態を意味する。
【００３５】
「全脳虚血」とは、中枢神経系に関して本明細書で用いるように、脳全体、前脳、又は脊髄への全般的な血流減少によって生ずる状態を意味し、これらの組織全体で選択的に損傷を受けやすい領域に神経細胞死を引き起こす。これらの症例のそれぞれにおいて病状は、臨床的相関現象がそうであるように、全く異なっている。局所脳虚血モデルは局所脳梗塞患者にあてはまり、一方、全脳虚血モデルは心停止、及び全身性低血圧の他の原因に類似している。
【００３６】
「神経保護剤」とは、本明細書において初期の障害部位からの神経障害の広がりを阻害する能力を含めた、神経細胞死を軽減させるのに有効な化合物を意味する。
【００３７】
「マイクロアレイ」という用語は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドグラス、ビーズのような基板上に、あるいは他の好適な固体支持体に、所望の密度で、合成又は付着又は沈着させた個別のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを意味する。
【００３８】
「有効量」又は「医薬的に有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供する、毒性はないが十分な量の薬剤を意味する。その結果は、徴候、症状、若しくは疾患の原因の軽減及び／又は緩和、あるいは生体系の他の所望の変化であり得る。例えば、治療用途の「有効量」とは、虚血性脳卒中によって生ずるもののような神経変性疾患において臨床的に有意な減少を提供するのに必要とされる本明細書に開示したシグマ受容体リガンドを含む組成物の量である。個々の症例において適切な「有効」量は通常の実験を用いて当業者が決定することができる。
【００３９】
本明細書において「治療する」又は「治療」という用語は互換的に用いられ、神経変性疾患の進展の遅延、及び／又は進展する若しくは進展すると予想されるそのような症状の重篤度の低下を示すことを意味する。この用語には、存在する神経変性症状を改善すること、更なる症状を予防すること、及び症状の基礎となる代謝原因を改善又は予防することが更に含まれる。
【００４０】
「医薬的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」とは、生物学的その他の理由で有害ではない材料を意味する。即ち、望ましくない生体作用を引き起こさず、組成物に含有される成分と有害な方法で相互作用することなく、その材料を個人に投与することができる。
【００４１】
「生理学的ｐＨ」又は「生理学的に許容範囲のｐＨ」とは、およそ７．２以上８．０以下の範囲、より典型的にはおよそ７．２以上７．６以下の範囲のｐＨを意味する。
【００４２】
本明細書において「被験者」という用語は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、哺乳動物クラスのあらゆるメンバーが挙げられる：ヒト、チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種のようなヒト以外の霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、豚のような家畜；ウサギ、イヌ、及びネコのような家畜；ラット、マウス及びモルモットなどのような齧歯動物を含めた実験動物。非哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、トリ、サカナなどが挙げられる。この用語は特定の年齢又は性別を意味するものではない。
【００４３】
化合物の「医薬的に許容可能な塩」という用語は、医薬的に許容可能であり、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。そのような塩には、例えば以下が含まれる：
（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩；又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプト酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、３級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成される酸付加塩；
（２）親化合物中に存在する酸性プロトンを金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はアルミニウムイオンで置換するか；又は有機塩基を配位させて形成する塩。許容可能な有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルタミンなどが含まれる。許容可能な無機塩基には、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどが含まれる。医薬的に許容可能な塩への言及には、その溶媒添加型又は結晶型、特に溶媒和物又は多形体が含まれることを理解すべきである。溶媒和物は、化学量論的な又は非化学量論的な量の溶媒を含有し、結晶化の過程で形成されることが多い。水和物は溶媒が水の場合に形成され、アルコラートは溶媒がアルコールの場合に形成される。多形体には、ある化合物と同一元素組成の異なる結晶パッキング配置が含まれる。多形体は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学特性及び電気特性、安定性、及び溶解度を有する。再結晶溶媒、結晶化速度、及び保存温度のようなさまざまな因子により、唯一の結晶形を優位にすることができる。
【００４４】
「任意の」又は「場合により」という用語は、その後に記載された事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載には事象又は状況が起こる場合と起こらない場合を含む。例えば、「場合により追加の薬物」という用語は、患者にシグマ受容体リガンド以外の薬物を投与してもしなくてもよいことを意味する。本明細書において「追加の薬物」とは、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に好適な、所望の局所又は全身作用を誘導する化学材料又は化合物を意味する。一般に、これには以下が含まれる：食欲抑制剤；多くのペニシリン類及びセファロスポリン類を含めた抗生物質及び抗ウイルス薬のような抗感染症薬；鎮痛薬及び鎮痛薬の組み合わせ；抗不整脈薬；抗関節炎薬；抗喘息薬；抗コリン作動薬；抗けいれん薬；抗糖尿病薬；止瀉薬；抗蠕虫薬；抗ヒスタミン剤；抗炎症剤；抗偏頭痛薬；制嘔吐剤；抗新生物薬；パーキンソン病治療薬；鎮痒薬；抗精神病薬；解熱剤；アンチセンス薬；鎮痙薬；カルシウムチャネルブロッカー及びピンドロールを含めたβ−ブロッカーのような心血管薬；抗高血圧剤；中枢神経系刺激薬；うっ血除去薬を含めた感冒薬；利尿薬；Ｈ２−受容体アンタゴニストを含めた胃腸薬；交感神経様作用薬；コルチコステロイドを含めたエストラジオール及び他のステロイドのようなホルモン；睡眠薬；免疫抑制剤；筋弛緩剤；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静剤；精神安定剤；血栓溶解薬；神経保護薬；ラジカルスカベンジャ及び血管拡張薬。
【００４５】
本明細書において「機能的リハビリテーション」という用語は、理学療法、作業療法などを意味する。リハビリテーションの開始の前に、同時に又は後に薬物治療を開始することが期待される。
【００４６】
ＩＩ．シグマ受容体
エンリッチ環境（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）実験のマイクロアレイ解析からシグマ受容体を同定した。更に、本発明は、神経変性疾患を有する被験者において、中枢神経系疾患を治療するため並びに神経細胞の生存及び再生を刺激するためにシグマ受容体の発現を調節する化合物の同定方法を提供する。マイクロアレイ解析により、皮質虚血後及び虚血後環境エンリッチ化脳組織に、正常な又は非エンリッチ環境の発現と比較して、示差的に発現をする遺伝子を同定し説明する。
【００４７】
更に、本発明は、上記遺伝子発現に変化を示す被験者の治療方法を提供する。その際、治療的介入は細胞生成及び脳のその後の機能回復促進をもたらす。発明者らは、標準条件では中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後に損傷を受けやすい領域でシグマ受容体の発現が低下し、被験者をエンリッチ環境条件に曝すとＭＣＡＯ後に増加することを見出した。脳の耐性領域においてもＭＣＡＯ後に増加が検出されている。したがって、局所脳虚血又は全脳虚血を患う被験者に対して、障害後、シグマ受容体リガンドを機能回復を容易にするのに十分な期間投与する。医薬的介入は、より早い機能回復をもたらす。
【００４８】
１つの側面では、アレイ又はマイクロアレイを用いて目的の遺伝子発現を得ることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定し、次に標識標的オリゴヌクレオチドを含有するサンプルとハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションパターンを生じさせる。ハイブリダイゼーション後、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに利用する蛍光又は３３Ｐのような放射能の測定値を解析し、標的とプローブとのハイブリダイゼーションレベルを決定する。情報は、遺伝子機能、遺伝子スプライシングの決定、疾患の遺伝的根拠の理解、疾患の診断、治療剤の活性の発現及びモニタリング、多型の有無の検出などに有用である（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：２１５０−５５）。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドは生体サンプルのＲＮＡ又はＤＮＡから得ることができる。一般に、オリゴヌクレオチドは、通常天然供給源に由来するＲＮＡから逆転写されたＤＮＡであり、ＲＮＡは全ＲＮＡ、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、増幅ＲＮＡなどであり得る。開始ｍＲＮＡサンプルは、酵母のような単細胞生物を含めた生理学的供給源、真核生物供給源、又は植物及び動物、特に哺乳動物を含めた多細胞生物並びに哺乳動物由来の臓器、組織及び細胞、例えば体液（血液、尿、唾液、粘液、胃液など）、培養細胞、生検材料、又は他の組織標本由来であり得る。細胞、組織、臓器又は生物全体からＲＮＡを単離する方法は当業者に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバー出版）に記載されている。特に、被験者の内側、吻側、前頭側、海馬及び線条体領域由来のような脳由来のＲＮＡは、マイクロアレイ実験に使用するために精製し、クローニングする。
【００４９】
アレイと接触させてハイブリダイゼーションパターンを生じたサンプル中の核酸の遺伝的プロファイルに関する定量情報を決定するために、そして標識サンプル核酸が由来する生理学的供給源について決定するために、ハイブリダイゼーションパターンを用いることができる。データは、サンプル核酸が由来する生理学的供給源に関する情報、例えば生理学的供給源である組織又は細胞で発現した遺伝子の種類、及び特に量的な各遺伝子の発現レベルを提供する。
【００５０】
ＭＣＡＯを受けた後、エンリッチ環境に曝されたラットは線条体及び前頭葉において１型シグマ受容体ｍＲＮＡの上方制御を示し、内側皮質において受容体の下方制御を示すことが発見された。前頭葉は、感覚運動機能の制御に関与している。したがって、虚血後リハビリテーション段階における薬理学的介入の役割がある。このように、シグマ受容体アゴニストのようなシグマ受容体リガンドの投与は、脳卒中後の被験者の機能回復を向上させることができる。更に、薬物とエンリッチ環境のような環境因子との相互作用を用いて機能回復を向上させることができる。
【００５１】
理論に拘束されるものではないが、シグマリガンドは、強化又は刺激的環境の効果を模倣することによって神経再生及び機能回復を容易にすると考えられる。
【００５２】
ＩＩＩ．シグマ受容体リガンド
シグマ受容体リガンドは、神経変性疾患を治療するため、及び神経変性疾患からの機能回復を向上させるための、方法及び組成物に用いることができる。
【００５３】
対象とする方法に用途を見出すことができるシグマ受容体のリガンドがいくつか知られている。例えば、Ｍａｎａｌｌａｃｋ，Ｄ．Ｔ．ら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４４：２３１−２３５は、シグマ結合部位に対する親和性を有するフェンシクリジン化合物について開示しており、大きなＮ−アルキル置換基、例えばベンジル又はフェニルエチルによってシグマ部位親和性が向上することを示した。Ｌａｒｇｅｎｔ，Ｂ．Ｌ．ら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３２：７７２−７８４は、いくつかのピペリジン誘導体及びピペラジン誘導体がシグマ受容体活性を有することを教示し、より親油性の置換基を含有する化合物はシグマ受容体結合部位に対してより大きな親和性を提供することを示唆している。コカイン関連化合物はシグマ受容体結合活性を有することがＳｈａｒｋｅｙ，Ｊ．ら、（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４９：１７１−１７４によって示されている。欧州特許出願第３６２，００１号は、シグマ受容体に対して特異的親和性を有するα，α−ジ置換Ｎ−シクロアルキルアルキルアミンについて記載しており、欧州特許出願第４４５，０１３号は、シグマ受容体に対して特異的親和性を有するＮ−シクロアルキルアルキルアミンについて記載している。これらの欧州特許出願に記載されたシグマ受容体リガンドは、精神病及び胃腸の不快感の治療に有用である。ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０３２４３号には、シグマ受容体に対して特異的アンタゴニスト活性を有する１−シクロアルキルピペリジンに関する記載が含まれており、これは精神病及びジスキネジアの治療に有用である。ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９０９４号には、抗精神病薬であるアルキルピペリジン又はピロリジンに由来するエーテルに関する記載が含まれている。シグマ受容体リガンドである、更なる置換ピペリジン及び置換ピペラジンが、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２４１１６号に開示されている。１，４−（ジフェニルアルキル）ピペラジン誘導体のシグマ受容体親和性、並びに痴呆症、うつ病及び精神分裂病のような脳機能障害に対するそれらの使用について米国特許第５，７３６，５４６号に記載されている。米国特許第６，０８７，３４６号は、ある種のフェニルアルキル−アミン、アミノテトラリン、ピペラジン、ピペリジン、及び関連化合物がシグマ受容体に結合し、中枢神経系疾患、神経障害、胃腸障害、薬物乱用、アンギナ、偏頭痛、高血圧及びうつ病の治療に使用できることを開示する。他のシグマ受容体リガンドには、ＢＭＹ−１４８０２、カラミフェン及びハロペリドールが含まれ、これらはＮＭＤＡによって誘発される毒性及び発作に対してｉｎ ｖｉｖｏ保護効果を有することがわかっている（Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．、２６：４６１−４６５）。更なるシグマ受容体リガンドには、例えば、３ＰＰ−ＨＣｌ、ハロペリドール、アリル−ノルメタゾシン（ＳＫＦ１００４７ともいう）、ノルメタゾシン、Ｕ−５０４８８酒石酸塩、カルベタペンタン、シクラゾシン、イフェンプロジル、ＤＴＧ（１，３−ジ−２トリルグアニジン）、Ｌ６９３、４０９、ＰＴＰＰ、４ＰＰＢＰ（４−フェニル−１−（４−フェニルブチル）ピペリジンマレイン酸塩）、ＢＤ１０６３、ＩＰＡＢヨードベンザミド、ＳＭ−２１、ＢＤ１００８が含まれる。
【００５４】
ＩＶ．シグマ受容体リガンドの同定方法
シグマ受容体リガンドである化合物の同定方法は当該技術分野に公知である。シグマ受容体リガンドである化合物を同定するために用いられる１つの方法は、細胞、組織又は好ましくは細胞抽出物又はシグマ受容体を含有する他の調製物を、受容体活性に適合する緩衝液中でいくつかの既知濃度の試験化合物と接触させておくこと、そしてリガンド結合及び／又は受容体活性についてアッセイすることを含む。この方法は、順次又は多重形式で実施することができる。Ｌａｎｇａ Ｆ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６に記載されているように、公知の特異的リガンドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイの使用により、シグマ−１受容体又はシグマ−２受容体に対するリガンド親和性を決定することができる。本明細書の開示に基づいて当業者に明らかとなるように、シグマ受容体のリガンドである化合物を決定するための他の方法を採用することができる。
【００５５】
シグマリガンドは、ＡＧＹ−９４８０６（以下の化合物ＩＶ）又はその塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。しかしながら、以下の化合物は全てシグマ受容体リガンドである：
【００５６】
【化１】
【００５７】
【化１】
【００５８】
【化１】
【００５９】
他の方法において、上で同定したシグマ受容体リガンド及び公知リガンド又はアナログの分子形状の構造研究に基づいた理論的ドラッグデザインを用いて、３次元構造がシグマ受容体の活性部位と相補的な化合物を同定することができる。これらの化合物は、分子力学計算、分子動力学計算、条件がＮＭＲ分光法によって決定される条件付き分子動力学計算、距離行列がＮＭＲ分光法によって部分的に決定される距離幾何学法、Ｘ線回折、又は中性子回折技術を含めたさまざまな技術によって決定することができる。これら全ての技術において、シグマ受容体と相互作用することが知られているリガンドの存在下又は非存在下において構造を決定することができる。
【００６０】
このようにして同定され、又は設計されたシグマ受容体リガンドは、次に神経変性疾患を治療及び／又は予防する能力について試験することができる。１つの方法では、例えば、シグマ−１（受託番号ＮＭ＿００５８６６、ＮＭ＿１４７１５７、ＮＭ＿１４７１５８、ＮＭ＿１４７１５９、及びＮＭ＿１４７１６０）、シグマ−２、又は組換えシグマ受容体などのシグマ受容体を調節する能力について化合物を試験する。これらのスクリーニングで同定されたリード化合物は、より活性なアナログを合成するための基礎として役立つことができる。リード化合物及び／又はそれらから作製された活性アナログは、脳卒中、てんかん及び神経変性疾患のような神経障害の治療に有効な医薬組成物中に製剤化することができる。
【００６１】
Ｖ．シグマ受容体リガンドの合成
いくつかのシグマ受容体リガンドが市販されている。例えばフルボキサミン（米国特許第４，０８５，２２５号）、４−ＩＢＤ（Ｊｏｈｎら（１９９９）Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６：３７７−３８２）、Ｐｒｅ−０８４（米国特許第５，２２３，５３０号）、ＡＧＹ−９４８０６（米国特許第５，７３６，５４６号）、シラメシン（米国特許第５，６６５，７２５号）、ＯＰＣ−１４５２３（米国特許第５，５５６，８５７号）、ＢＤ−７３７（米国特許第５，１３０，３３０号及び米国特許第５，７３９，１５８号）、イグメシン（米国特許第５，０３４，４１９号）など、多くの調製法が特許及び化学文献に記載されている。
【００６２】
ＶＩ．神経再生及び機能回復
本発明の１つの態様では、シグマ受容体リガンドＩ〜ＩＸ、又はその塩若しくは溶媒和物を、脳卒中後、治療に要する十分な期間、例えば約１週間〜約１カ月又は約１２カ月投与するか、あるいは所望の治療効果が観察されるまで継続的に投与する、被験者の治療方法が提供される。シグマ受容体リガンドはＡＧＹ−９４８０６、又はその塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。本発明の他の側面では、シグマ受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６、又はその塩若しくは溶媒和物を、脳卒中後、治療に要する十分な期間、例えば約１週間〜約１カ月又は約１２カ月投与するか、あるいは所望の治療効果が観察されるまで継続的に投与し、そして、中枢神経系障害の不都合な結果からの患者の機能回復が向上するように更に被験者をエンリッチ環境のような恵まれた刺激環境、及び機能的リハビリテーションに曝す、被験者の治療方法が提供される。
【００６３】
神経組織の障害領域の機能が、正常ではこれまでその特定の役割を果たさなかった他の領域に取って代わられ、神経機能における変化が行動又は行動能力に変化をもたらすことになったときに、機能回復は起こる。機能回復は神経可塑性としても言及される。したがって、脳の機能回復は、機能的及び構造的再構築、ある事象に対する神経反応の上方制御又は下方制御、並びに、側枝発芽及び代償性シナプス形成並びに神経発生による、新規な機能的及び構造的結合の確立を意味する。
【００６４】
患者の機能回復の向上は、例えば、姿勢、バランス、把握、又は歩行のような患者の運動技量の感覚運動及び反射機能、認知技量、言語、及び／又は知覚、並びに視覚能、味覚、嗅覚、及び自己刺激感応を含めた機能、が本発明にしたがいシグマ受容体リガンドを投与した結果として向上することを評価するための機能／行動試験を用いることによって評価することができる。他の側面では、患者の機能回復は、軸策束の長さ、障害部位における神経再生の増加を測定すること、樹状突起の形態及びスパイン数などを評価することを含めた組織学的解析によって決定することができる。更に他の側面では、患者の機能回復向上は、神経機能に変化をもたらす脳の構造変化を測定する非侵襲性技術を用いることによって決定することができる。したがって、電気生理学的測定（脳波計（ＥＥＧ）又は誘発電位（ＥＲＰ））、筋電図測定（ＥＭＧ）、神経化学測定（ＣＳＦ代謝産物）、末梢測定（循環ベータエンドルフィンレベル）、放射線測定（ＣＴスキャン、ＭＲＩ）及び臨床的測定（瞳孔光反射、姿勢、味覚）を用いて患者の機能回復を測定することができる。更に、上記技術を用いて、本発明の治療にうまく応答すると思われる患者を選択することができる。
【００６５】
エンリッチ又は刺激環境の効果を模倣するためにシグマ受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６を投与する。虚血後、エンリッチ又は刺激環境に収容すると、ラットにおいて脳虚血後の機能的結果を向上できることが知られている。実験的脳梗塞後、さまざまな活動の機会及び他のラットとの相互作用を有するエンリッチ環境に収容したラットは、標準実験室環境に収容したラットよりも良好であった。社会的相互作用とともに自由な身体活動が許されるエンリッチ環境は、梗塞体積が変化することなく、最良のパフォーマンスをもたらした。エンリッチ環境は、局所脳虚血後の脳の可塑性を促進するメカニズムを刺激することができる。刺激環境に収容したラットは、無傷の及び障害された脳の表面皮質層のスパイン密度を有意に増加させることが示されている。
【００６６】
本発明の１つの側面では、刺激環境は、社会的相互作用、運動活動、脳の電気刺激、住居の変化などを含む。例えば、被験者は、感覚運動機能を向上させるために障害肢を使用するように働きかけられることができ、ウォーキング、ストレッチング、ウェイトリフティングなどの毎日の身体的な日課に供されることができ、あるいは野球、ホッケー、サッカー、又はボードケームのようなゲームをするように働きかけられることができる。更に、被験者の住居は、脳の活性を刺激するために、例えば部屋の色を変えること、織物材料を提供すること、木やスチールなどの異なる材料から製造された品目を提供することによって変化させることができる。ある特定の患者に対して刺激環境をカスタマイズするための知識は、理学療法や作業療法の分野の当業者に公知である。
【００６７】
他の側面では、刺激環境は、脳又は脳の１領域への直接刺激を含む。米国特許第６，３３９，７２５号及び第５，６１１，３５０号に記載のように、並びに当該技術分野に公知の他の方法のように、例えば電気刺激を脳に適用することができる。あるいは、アセチルコリン、神経成長因子、神経刺激薬、神経細胞成長因子又はグリア成長因子、及び他の神経修飾剤のような薬物の局所投与によって、脳又は脳の１領域を刺激することができる。
【００６８】
当業者が認識するように、シグマリガンドを含有する用量を投与するタイミングは変化させることができる。本発明の１つの側面では、シグマ受容体リガンドは脳卒中後に投与される。リガンドの投与は、症状発症の最初の週以内、好ましくは症状発症の少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間に開始することができる。本発明の他の側面では、刺激環境への曝露と同時にシグマ受容体リガンドを患者に投与する。好ましくは、脳卒中後、患者が刺激環境に供された時点でシグマ受容体リガンドを投与し、リガンドを約１カ月〜約３カ月間投与して機能回復を容易にする。好ましくは、リガンド、及びリガンドを含む組成物を最長約１２カ月又はそれ以上投与し、より好ましくは継続的に投与する。
【００６９】
ＶＩＩ．医薬製剤及び投与様式
本明細書に記載の方法は、上記分子を含む医薬組成物を使用する。上記分子はＡＧＹ−９４８０６であることが好ましく、１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤又はビヒクル、及び、場合により他の治療用及び／又は予防用成分と組み合わせる。そのような賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの液体が含まれる。非液体製剤に好適な賦形剤も当業者に公知である。医薬的に許容可能な塩を本発明の組成物に用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれる。レミントンの『薬学』、第１８版（イーストン、ペンシルバニア：Ｍａｃｋ出版社、１９９０）中の医薬的に許容可能な賦形剤及び塩に関する徹底的な議論が利用可能である。
【００７０】
更に、湿潤剤又は乳化剤、生理的緩衝物質、界面活性剤などの補助物質がそのようなビヒクル中に存在してもよい。生理的緩衝液は、事実上、薬理学的に許容可能で、製剤に所望のｐＨ、即ち、生理学的許容範囲にあるｐＨを提供するあらゆる溶液であり得る。緩衝液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。
【００７１】
意図する投与様式によって、医薬組成物は、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末剤、液剤、懸濁剤、クリーム、軟膏、ローションなどの固体、半固体又は液体剤形であり得、正確な用量の単回投与に好適な単位剤形であることが好ましい。組成物は、有効量の選択した薬物を、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含み、加えて、他の医薬物質、添加物、希釈剤、緩衝剤などを含むことができる。
【００７２】
本発明には、異性体、異性体のラセミ混合物若しくは非ラセミ混合物、又はそれらの医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含めた本発明の化合物を、１種以上の医薬的に許容可能な担体、及び、場合により他の治療用及び／又は予防用成分とともに含む、医薬組成物が含まれる。
【００７３】
一般に、本発明の化合物は、許容される投与様式によって治療上有効量で投与されるであろう。好適な用量範囲は、治療すべき疾患の重篤度、被験者の年齢及び相対的な健康、使用化合物の有効性、投与経路及び形態、投与に対する指示、並びに関与する医師の好み及び体験などの非常に多くの因子に依存する。そのような疾患を治療する当業者は、過度の実験を行うことなく、個人的知識及び本願の開示に依存して、所定の疾患に対する本発明の化合物の治療上有効量を確定することができるであろう。
【００７４】
一般に、本発明の化合物は、経口投与（口腔内及び舌下を含む）、直腸内投与、鼻腔内投与、局所投与、肺投与、膣投与又は非経口投与（筋肉内、動脈内、クモ膜下、皮下及び静脈内を含む）に好適なものを含めた医薬製剤として、又は吸入若しくは吹入による投与に好適な形態で投与されるであろう。好ましい投与様式は、苦痛の程度によって調製できる好都合の日用量を用いた静脈内又は経口投与である。
【００７５】
固体組成物に関し、慣用の非毒性固体担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書に記載のような活性化合物、及び任意の医薬添加物を賦形剤、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに、溶解又は分散させることなどによって調製することができ、溶液又は懸濁液を形成する。所望により、投与される医薬組成物は、微量の湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエートなどを含有することもできる。そのような剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であるか明らかであろう；例えば上で引用したレミントンの『薬学』を参照されたい。
【００７６】
経口投与に関し、組成物は一般に錠剤、カプセル、軟ゲルカプセルの形態をとるか、又は水溶液又は非水溶液、懸濁液又はシロップであり得る。錠剤及びカプセルが好ましい経口投与形態である。経口用錠剤及びカプセルは、一般に、１種以上の乳糖及びコーンスターチのような通常用いられる担体を含むであろう。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も典型的には加えられる。典型的には、本発明の化合物は、経口用の、毒性のない医薬的に許容可能な、乳糖、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどの不活性担体と組み合わせることができる。更に、所望により、又は必要に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、及び着色剤を混合物に導入することもできる。好適な結合剤には、デンプン、ゼラチン、グルコース又はβ−乳糖のような天然糖、コーンシロップ、アカシア、トラガカントのような天然ゴム及び合成ゴム、又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの剤形に用いられる潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。
【００７７】
したがって、例えば、カプセルを、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物、１００ｍｇのセルロース及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムとなるように、慣用の手順によって調製することができる。非常に多くの単位カプセルを、標準のツーピース硬ゼラチンカプセルそれぞれに、１００ｍｇの粉末活性成分、１５０ｍｇの乳糖、５０ｍｇのセルロース、及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムを充填することによって、調製することもできる。又は、錠剤を、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物、１５０ｍｇの乳糖、５０ｍｇのセルロース及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムとなるように、慣用の手順で調製することができる。非常に多くの錠剤を、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物であり、他の成分は０．２ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素、５ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２５０ｍｇの微晶性セルロース、１０ｍｇのデンプン及び１００ｍｇの乳糖であり得るように、慣用の手順で調製することもできる。適切なコーティングを、嗜好性を増加させるため又は吸収を遅延させるために施してもよい。
【００７８】
懸濁液を用いる場合、活性物質を、エタノール、グリセロール、水などのような経口用の毒性のない医薬的に許容可能な不活性担体、並びに乳化剤及び懸濁剤と組み合わせることができる。所望により、着香剤、着色剤及び／又は甘味剤を同様に添加してもよい。本明細書において経口製剤に導入する他の任意成分には、限定されるものではないが、保存剤、懸濁剤、増粘剤などが含まれる。
【００７９】
非経口製剤は、溶液若しくは懸濁液、注射前に液体に可溶化若しくは懸濁化するのに好適な固体形態、又はエマルジョンとして、慣用の形態に調製することができる。滅菌注射用懸濁液は、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術分野に公知の技術にしたがって製剤化されることが好ましい。滅菌注射用製剤は、毒性のない非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁液でもよい。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。更に、溶媒又は懸濁媒体として、滅菌された固定油、脂肪酸エステル又はポリオールを慣用的に用いる。更に、非経口投与には、一定レベルの用量が維持される徐放性システム又は持続放出性システムの使用も含まれ得る。
【００８０】
非経口投与には、関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路が含まれ、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有する水性及び非水性の等張滅菌注射液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むとができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。特定の非経口経路を介した投与には、滅菌シリンジ又は持続注入システムのような他の機械装置によって推進される針又はカテーテルを通して本発明の製剤を患者の体内へ導入することを含めることができる。本発明によって提供される製剤は、シリンジ、注入器、ポンプ、又は非経口投与に関して当該技術分野で認識される他の装置を用いて投与することができる。
【００８１】
好ましくは、当該技術分野に公知の技術にしたがって、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて滅菌注射用懸濁液を製剤化する。滅菌注射製剤は、毒性のない非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁液であることもできる。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。更に、滅菌された固定油、脂肪酸エステル又はポリオールが、溶媒又は懸濁媒体として慣用的に用いられる。更に、非経口投与には、一定レベルの用量が維持される徐放性システム又は持続放出性システムの使用を含めることができる。
【００８２】
非経口投与用の本発明の製剤としては、滅菌した水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びコーン油などの植物油、ゼラチン、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。そのような剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの添加物を含有することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通したろ過によって、滅菌剤を組成物に導入することによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって滅菌することができる。それらは、滅菌水、又は他の滅菌注射用媒体を使用直前に用いて製造することもできる。
【００８３】
製剤は場合により等張性剤を含有することができる。製剤は等張性剤を含有することが好ましく、グリセリンが最も好ましい等張性剤である。グリセリンを使用する場合、その濃度は当該技術分野に公知の範囲内、例えば約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬなどである。
【００８４】
非経口製剤のｐＨは、リン酸、酢酸、ＴＲＩＳ又はＬ−アルギニンなどの緩衝剤によって制御することができる。緩衝剤の濃度は、保存のあいだｐＨを標的ｐＨ±０．２ｐＨ単位に維持するのに適しているｐＨ緩衝作用を提供することが好ましい。好ましいｐＨは、室温で測定したとき約７〜約８である。
【００８５】
他の添加物、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニックＦ６８（登録商標）（ポリオキシエチレン ポリオキシプロピレン ブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような医薬的に許容可能な可溶化剤などを、場合により製剤に添加することができ、製剤がプラスチック材料に接触する場合に有用であり得る。更に、非経口製剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗菌剤及び抗真菌剤含有することができる。
【００８６】
滅菌注射液は、１以上の本発明の化合物を必要量、上に列挙した他のさまざまな成分とともに適切な溶媒中に導入し、必要に応じてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、さまざまな滅菌活性成分を、基本分散媒体及び上に列挙したものの中で必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、先にろ過滅菌した溶液から、活性成分と更なる所望の成分との粉末を生ずる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。したがって、例えば、注射による投与に好適な非経口組成物は、１．５重量％の活性成分を１０容量％のポリエチレングリコール及び水の中で撹拌することによって調製される。溶液は塩化ナトリウムで等張にし、滅菌する。
【００８７】
あるいは、本発明の医薬組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温で固体だが直腸内温度では液体の、したがって直腸で溶解して薬物を放出するであろう好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができ。そのような材料には、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、鼻腔内エアロゾル又は吸入によって投与することもできる。そのような組成物は医薬製剤の分野で周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン又は窒素のような推進剤、及び／又は他の慣用の可溶化剤若しくは分散剤を用いて生理食塩水溶液として調製することができる。
【００８９】
局所薬物送達に好ましい製剤は軟膏及びクリームである。軟膏は、典型的にはワセリン又は他の石油誘導体を基にした半固体製剤である。選択した活性物質を含有するクリームは、当該技術分野に知られるように、水中油又は油中水の粘稠液又は半固体エマルジョンである。クリーム基剤は水洗性であり、油相、乳化剤及び水相を含有する。油相は、ときに「内部」相とも呼ばれるが、通常、ワセリン、及びセチルアルコール又はステアリルアルコールのような脂肪族アルコールで構成される；水相は、必ずしもそうではないが、油相よりも量が過剰であり、一般に保水剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、通常、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両性界面活性剤である。使用される特定の軟膏又はクリームの基剤は、当業者に認識されるであろうように、最適な薬物送達を提供するものである。他の担体又はビヒクルのように、軟膏基剤は、不活性で、安定な、刺激性のない、非感作性のものである必要がある。
【００９０】
口腔内投与用製剤には、錠剤、トローチ剤、ゲルなどが含まれる。あるいは、当業者に公知の経粘膜送達システムを用いて口腔内投与を行うことができる。本発明の化合物を、慣用の経皮薬物送達システム、即ち「経皮パッチ」、つまり、薬剤が、典型的には、体表面に貼付される薬物送達装置として働く積層構造内に含有されるものを用いて、皮膚又は粘膜組織を通して送達することもできる。そのような構造では、薬物組成物は典型的には、上部裏打ち層の下にある１つの層又は「貯蔵器」内に含有される。積層装置は、唯一の貯蔵器を含有することも複数の貯蔵器を含有することもできる。１つの態様では、貯蔵器は、薬物送達のあいだ皮膚にシステムを貼付するのに役立つ医薬的に許容可能な接触接着剤のポリマーマトリックスを含む。好適な皮膚接触接着剤の例としては、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが挙げられる。あるいは、薬物含有貯蔵器と皮膚接触接着剤は分離した異なる層に存在し、接着剤は貯蔵器の下にあり、貯蔵器は上記のようなポリマーマトリックスであるか、又は液体若しくはゲルの貯蔵器であるか、又は他の形態をとり得る。装置の上部表面として働くこの積層の裏打ち層は、積層構造の主な構造要素として機能し、装置にその柔軟性の大部分を提供する。裏打ち層に選択される材料は、活性物質及び存在する他の材料に対して実質的に不透過性である必要がある。
【００９１】
医薬的に又は治療上有効量の組成物が被験者に送達されるであろう。正確な有効量は被験者間で変化し、種、年齢、被験者の大きさ及び健康、治療される状態の性質及び程度、治療を行う医師の提言、並びに投与するために選択した治療薬又はその組み合わせに依存するであろう。したがって、所定の状態に対する有効量は慣例的な実験で決定することができる。本発明の目的に関し、一般に、治療量は、少なくとも１つの用量で、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。より大きな哺乳動物では、表示される日用量は、約１ｍｇ〜３００ｍｇで１日１回以上、より好ましくは約１０ｍｇ〜２００ｍｇの範囲であり得る。被験者に、問題となる障害の徴候、症状、あるいは原因を軽減及び／又は緩和するのに要する用量で、又は生体系の他の所望の変化を引き起こすのに要する用量で、投与することができる。
【００９２】
本発明の化合物は、特に気管及び鼻腔内投与へのエアロゾル投与用に製剤化することができる。化合物は通常粒子サイズが小さく、例えば５μ以下のオーダーであろう。そのような粒子サイズは、当該技術分野に公知の手段、例えば微粉末化によって得ることができる。活性成分は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスのような好適な推進剤を有する加圧パックで提供される。エアロゾルは、レシチンのような界面活性剤を慣用的に含有することもできる。薬物の用量は、定量バルブによって制御することができる。あるいは、活性成分を、乾燥粉末の形態で、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなデンプン誘導体及びポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などの好適な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供することができる。粉末担体は鼻腔においてゲルを形成するであろう。粉末組成物は、例えばゼラチン等のカプセル又はカートリッジ又はブリスターパックの中の単位剤形で提供することができ、そこから粉末は吸入器によって投与され得る。
【００９３】
所望により、製剤は、活性成分の徐放性投与又は放出制御投与に適した腸溶コーティングして調製することができる。
【００９４】
医薬製剤は単位剤形であることが好ましい。そのような形態では、製剤は、適量の活性成分を含有する単位用量に更に分けられる。単位剤形は包装製剤であり得、包装は包装錠剤、カプセル、及びバイアル若しくはアンプル中の粉末剤のように別個量の製剤を含有する。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ剤自体であり得、あるいは適当数のこれらのものが包装された形態であり得る。
【００９５】
ＶＩＩＩ．キット
他の側面では、本発明は、キットの形態の医薬組成物に関する。キットは、組成物を含有するためのボトル、ホイル包み、又は他のタイプの容器のような容器手段を含む。典型的には、キットは、組成物投与のための指示書を更に含む。
【００９６】
他の側面では、包装キットは、投与すべき医薬製剤、即ち神経変性疾患を治療して神経再生又は機能回復を容易にするためのシグマ受容体リガンドを含有する医薬製剤、保存中及び使用前に製剤を収容するための、好ましくは密封されている、容器、並びに疾患を治療するのに有効な様式で薬物投与を行うための使用説明書を含有する。使用説明書は、典型的には、添付文書及び／又はラベル上の取扱説明書であろう。製剤は、本明細書に記載したような好適な製剤であり得る。例えば、製剤は、シグマ受容体リガンドの単位用量を含有する経口剤形であり得る。キットは、異なる用量の同一物質からなる複数の製剤を含有することができる。キットは、異なる活性物質からなる複数の製剤を含有することもできる。
【００９７】
例えば、非経口投与用キットは、ａ）上記ＡＧＹ−９４８０６及び医薬的に許容可能な担体、ビヒクル又は希釈剤を含む医薬組成物；及び、場合により、ｂ）疾患を治療又は予防するための医薬組成物の使用方法について記載する使用説明書、を含むことができる。キットは、製剤を投与するための装置（例えばシリンジ、カテーテルなど）を更に含むことができる。経口投与用キットは、例えば個々の用量を有する紙又は段ボール箱、ガラス若しくはプラスチックのビン又はジャー、再密封可能なバッグ、あるいはブリスターパックのような容器に含有される用量製剤を含むことができる。ブリスターパックは、通常、好ましくは透明なプラスチック材料の、ホイルで覆われた比較的堅い材料のシートから成る。包装工程のあいだ、錠剤又はカプセルの大きさ及び形状の凹所がプラスチックホイル内で形成される。次に、錠剤又はカプセルはその凹所内におかれ、比較的堅い材料のシートが、凹所が形成された方向とは逆のホイルの面に対してプラスチックホイルでシールされる。その結果、錠剤又はカプセルは個々に密封される。シートの強度は、手で凹所に圧力を加え、凹所の場所でシートに開口が形成され、錠剤又はカプセルがブリスターパックから取り出せるようなものであることが好ましい。そして、錠剤又はカプセルは開口部から取り出すことができる。
【００９８】
キットに、記憶補助を提供することが望ましいかもしれない。例えば、錠剤又はカプセルの隣に数の形で、その数は、そのように特定された剤形を投与すべき処方計画の日にちに対応する。そのような記憶補助の他の例は、例えば「第１週、月曜、火曜…など…第２週、月曜、火曜…など」のようにカードに印刷されたカレンダーなどである。記憶補助の他の変形物は、例えば、ディスペンスされた日用量数を示す機械的計数機、液晶読み取り装置のついたマイクロチップ記憶装置、あるいは、可聴注意シグナル、例えば日用量を最後に摂取した日にちを音読し、及び／又は次に摂取すべき日にちを思い出させる可聴注意シグナルなど、容易に明らかであろう。
【００９９】
実施例
以下は、本発明を実施するための特定態様の例である。実施例は説明目的のためにのみ提供したものであり、如何なる場合も本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いた数値（例えば量、温度など）に関して精度を確保するために努力したが、いくらかの実験誤差及びずれは当然許容されるはずである。
【０１００】
共焦点イメージは４８８及び５４３レーザーを使用したＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ又はＰａｓｃａｌ５システムのマルチトラッキングモードにてチャンネルあたり４回平均で生成された。Ｚ−ｓｔａｃｋは対物６３ｘにて生成させ、オプティカルスライスはステップサイズ０．５ミクロンで０．８ミクロンに設定した。
【０１０１】
実施例１
神経再生（機能回復）の動物モデル
月齢３カ月の雄性ＳＨＲ（高血圧自然発症）ラットを、ＭＣＡ閉塞による脳卒中の誘導に用いる。大部分の脳卒中患者は高血圧であるため、これは好ましい系統である。動物をメトヘキシタールで麻酔し、頬骨弓上で小さな頭蓋骨切除術を行なって中大脳動脈を露出させ、これを、線条体分岐のもとに対して末端で、１０−０モノフィラメントナイロン糸を用いて閉塞させる。ラットは挿管せず、カテーテルは導入しない。ＭＣＡ閉塞後、大きな再現性のある梗塞を得、強い感覚運動欠損をもたらす。動物を６時間明所／１８時間暗所のサイクルに維持し、食餌及び水は自由摂取とする。ＭＣＡＯ後２日に、ラットに化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、又はＩＸ（０．０３〜１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下又は経口投与し、対照群には生理食塩水を２〜８週間投与する。２、４、６及び８週間目に動物を回転棒試験又は円筒試験で試験する。
【０１０２】
回転棒試験：この試験は、先に記載されたように、回転棒を横断するラットの能力によって運動動作の協調及び統合に関して迅速な評価を可能にする（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＯｈｌｓｓｏｎ、（１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ２６：６４４−６４９。棒の長さは１５００ｍｍであり、床から７５０ｍｍ上に持ち上げ、右又は左に１０ｒｐｍでそれぞれ回転させる。
各方向に６〜０のスコアをつける：
６、動物は肢を滑らさずに棒を横断する；
５、動物は２、３歩、肢を滑らせて棒を横断する；
４、動物は歩みの５０％を、肢を滑らせて棒を横断する；
３、動物は５０％より多く、肢を滑らせて棒を横断する；
２、動物は少し歩いてから棒の周囲を回転する；
１、動物は横断せずに棒の周囲を回転する；
０、動物は棒から落ちる。
【０１０３】
自発的に後ろ立ちする際の前肢の左右不同性の使用に関する円筒試験
円筒試験（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ及びＴｉｌｌｅｒｓｏｎの方法（ＣＮＳ疾患の画期的モデル：分子から治療まで。Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ、Ｈｕｍａｎａ、１９９９））を改変して用いて、円筒壁のところで後ろ立ちするための前肢の使用を定量化する。ラットは幅２０ｃｍの透明なガラス円筒内を自由に動くさまを、モニターする。後肢で立ちながら、それぞれの前肢によってなされる円筒壁への接触を、ブラインドの観察者によって記録する。各動物について合計２０回の接触を記録し、左肢に障害がある、両肢に障害がある、及び障害のない、前肢接触数を、合計接触に対する割合として計算する。ラットのベースラインは、ＭＣＡＯ前にそれぞれの前肢によってなされる接触を測定することによって達成される。
【０１０４】
回転棒試験又は円筒試験を行うと、化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、又はＩＸを投与した動物群は、第１群の対照動物よりも良好に遂行する。このように、中枢神経系障害のある動物にシグマ受容体リガンドを投与すると、機能回復が高められる。
【０１０５】
実施例２
ＡＧＹ−９４８０６は機能回復を高める
ＡＧＹ−９４８０６８（ＳＡ４５０３とも表示される）、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）−ピペラジンジヒドロクロライド、は水溶性の、効率的な脳取込みを示す選択的シグマ−１受容体アゴニストである。運動機能の回復に対するこの化合物の効果が実験的脳卒中の二つのモデルにおいて調べられた。第一のモデルにおいて、高血圧自然発症ラットは大きな皮質梗塞と重度の運動障害をもたらすｐＭＣＡＯを処置された（図１Ａ）。
【０１０６】
ＡＧＹ−９４８０６で処置したラットにおける神経再生の徴候
３５匹の高血圧自然発症ラットに永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を施し、３つの処置群に分けた。ＡＧＹ−９４８０６を０．３ｍｇ／ｋｇ（１２匹のラット）又は１．０ｍｇ／ｋｇ（１２匹のラット）の用量で、閉塞後２日に開始し、閉塞後２８日まで毎日継続して皮下投与した。対照群には（１１匹のラット）ビヒクルのみを投与した。処置開始時、及び試験中のいくつかの時点で、回転棒モデルにおけるラットのパフォーマンスを評価した。このモデルは実施例１に記載されている。これは、水平につるされた長さ１ｍの回転棒を横断することをラットに要求する。この課題は動物の感覚運動のパフォーマンスを測定する。動物の行動をビデオカメラで記録し、後に訓練技術者によって解析され、スコアを記録した。スコア範囲は０〜６であり、０は非常にパフォーマンスが悪く、６は健常動物（ＭＣＡＯなし）のパフォーマンスを示す。結果を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
０．３ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した群は、第３０日の合計平均スコアが５．２を示し、これは健常動物で予想される値に近い。
【０１０９】
したがって、この試験は、シグマ−１の選択的アゴニスト、ＡＧＹ−９４８０６を、虚血性脳卒中モデルのラットに脳卒中後２日から脳卒中後２８日までの２８日間、毎日投与する場合、機能回復、特に運動技量の回復を容易にすることを示している。梗塞サイズは影響を受けず、ビヒクル、０．３及び１．０ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した群は、それぞれ、無傷の同側性大脳半球の２４、２３及び２５．５％の測定値であった（図１Ａ）。
【０１１０】
再かん流傷害を模倣する他の実験的脳卒中モデルにおいて、ｔＭＣＡＯを９０分適用し、ラットはｔＭＣＡＯ後２日〜２８日の間ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔテストを用いて運動機能を試験された（図１Ｂ、１Ｃ）。動物はｔＭＣＡＯ後２日にＡＧＹ−９４８０６で処置された。擬手術を受けた動物は試験の間少数の間違いをし、グリッドを素早く、２〜３秒以内に、横切った。ｔＭＣＡＯ後、ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ数とグリッドを横切るに要する時間は増加し、重度の運動障害を示した。ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ数はＡＧＹ−９４８０６（１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物では検討された全ての回復時間において、ビヒクルで処置されたラットに比べて有意に少なかった、（ｐ＜０．０１；２ウエイＡＮＯＶＡ後にボンフェローニテスト）（図１Ｄ）。同様に、ＡＧＹ−９４８０６（１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は検討された全ての時間ポイントにおいて、ビヒクルで処置されたラットに比べてグリッドを約２倍早く横切った（図１Ｃ）。横切るに要する時間はビヒクルで処置された動物では２０±４でありＡＧＹ−９４８０６で処置されたラットは１０±３（ｐ＜０．０５；２ウエイＡＮＯＶＡ後にボンフェローニテスト）であった。
【０１１１】
皮質及び皮質下の組織損傷と運動機能障害をもたらすｆｌｕｉｄ ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎにより誘導された実験的外傷性脳損傷（ＴＢＩ）におけるＡＧＹ−９４８０６の使用が試験された。ＴＢＩに処せられたＷｉｓｔａｒラット衝撃後２日において１ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６を皮下投与し、その後３週間にわたって毎日処置し、１４日目と２１日目に感覚運動機能を試験した。ＡＧＹ−９４８０６で処置した動物は平均機能スコアが４．５であり、正常範囲内であり、一方ビヒクルで処置された群は有意に低いスコアで、回復１４日目及び２１日目でそれぞれ３及び２であった（ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）、（図１Ｄ）。コンポジットスコアもビヒクル処置動物での平均１８から最高スコア２４の平均２１．５に有意に改善された（図１Ｅ）。
【０１１２】
これらを併せると、これらのデータはシグマ−１受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６での処置は、処置が損傷の２日後に始まり２乃至４週間続けるときに、実験的脳損傷の３つの異なるモデルにおいて感覚運動機能を有意に改善することを示す。
【０１１３】
実施例３
ＡＧＹ−９４８０６で処置したラットにおける神経再生のさらなる徴候
円筒試験
【０１１４】
４３匹の高血圧自然発症ラットに永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を施し、３つの処置群に分けた。ＡＧＹ−９４８０６を０．１ｍｇ／ｋｇ（１４匹のラット）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（１４匹のラット）の用量で、閉塞後２日に開始し、１４日間毎日継続して経口投与した。対照群には（１５匹のラット）ビヒクルのみを投与した。処置開始時及び試験中のいくつかの時点に、円筒試験におけるラットのパフォーマンスを評価した。この試験は実施例１に記載されている。動物の感覚運動パフォーマンスを測定する。試験中のラットのパフォーマンスを、永久ＭＣＡＯ前１日、そして永久ＭＣＡＯ後１４日、２８日及び５９日に評価した。ラットが幅２０ｃｍの透明なガラス円筒内を自由に動くさまを、モニターした。後肢で立ちながら、それぞれの前肢によってなされる円筒壁への接触を、ブラインドの観察者が記録した。各動物について合計２０回の接触を記録し、左肢に障害がある、両肢に障害がある、及び障害のない前肢接触数を、合計接触に対する割合として計算した。結果を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
前肢の使用の左右不同性（左／右の％差）は永久ＭＣＡＯの結果である。ＭＣＡＯ前の動物は、左右不同性の行動を示さなかった。ビヒクルで処置した動物は、観察期間中左右不同のままであった。０．３ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した動物は、前肢の使用の左右不同性が、測定した全ての時点でＭＣＡＯ前レベルまで減少した。
【０１１７】
したがって、この試験は、シグマ−１の選択的アゴニスト、ＡＧＹ−９４８０６を、虚血性脳卒中モデルのラットに脳卒中後２日から毎日、１４日間投与すると、機能回復、特に運動技量の回復を容易にすることを示している。
【０１１８】
実施例４
シグマ−１受容体活性化は神経突起生長を高めスパイン形態を変化させる
脳卒中後の感覚運動機能の改善は生き残っている組織の可塑性を高めることに依存する。皮質ニューロン及び海馬ニューロンにおけるそれぞれインビトロでのＡＧＹ−９４８０６による処置における神経突起生長及び樹状形態が決定された。
【０１１９】
神経突起生長。初代ニューロンカルチャーを調製し、０．８×１０４細胞／ウエルの密度で９６孔プレートのＢ２７含有神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｒｕｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、３時間にわたって３７℃で５％ＣＯ２中で付着させた。神経突起生長は、所望のインキュベーション時間、異なるＡＧＹ−９４８０６濃度でニューロンをインキュベートして、誘導した。実験の終了時にニューロンカルチャーを固定し染色し、神経突起形成を光学画像システム（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量した。集団中の全ての細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて同定し、ニューロンはチュービリンの神経形に対する一次抗体及び、緑色蛍光を発する細胞体及び神経突起をもたらすフルオロフォアＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５８８を結合した二次抗体を用いた間接免疫蛍光法で標識する。神経突起生長はつぎに画像解析アルゴリズム（Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量した。
【０１２０】
初代海馬カルチャー調製。海馬初代カルチャーを調製し、２０細胞／ｍｍ２でポリリジンコートカバーグラス上にプレートし、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ（Ｂ２７、０．５ｍＭ Ｌグルタミン及び１００Ｕペニシリン／ストレプトアビジン／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ及び１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２及び５μＭシトシンアラビノシド添加、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生長させた。カルチャーは実験前にインビトロで７〜１０日間生長させた。Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ（Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）ＩＶＩの温度制御かん流システムに載置し、初代細胞カルチャーにおいてＧｉｓｓｅｌｓｓｏｎら、２００５に基づいて実施した。生長メディウムをかん流ポンプＭＳ−Ｒｅｇｌｏ（Ｉｓｍａｔｅｃ ＳＡ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて２６０μｌ／分のかん流速度により無酸素ｉＣＳＦかん流メディウムに変更した。クラーク電極（Ｃｏｎｓｏｒｔ ｚ９２１、Ｔｕｍｈｏｕｔ、ベルギー）を用いてかん流メディウムの酸素含量をモニターした。細胞死の評価はｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（１０μｇ／ｍｌ）で判定した。
【０１２１】
コマ取り顕微鏡検査法及びスパイン分類。樹状突起の形態変化はコマ取り画像法で検査した。取得及び分析はＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ−８１蛍光顕微鏡にマウントした冷却デジタルカメラ（Ｆ−ｖｉｅｗ）を制御するソフトウエアＳｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＩＳ（ＡｎａｌｙＳＩＳ Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｏｒｐ、ドイツ）を用いて実施した。専用ＧＦＰフィルター及び自然濃度フィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ． Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）を用いて光毒性及びブリーチングを最小化した。
【０１２２】
シグマ−１受容体発現はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを初代皮質ニューロンにエレクトロポレーション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｍａｘａ）により導入してノックダウンした。新鮮な分離された初代皮質ニューロン（４．８×１０６ウエル）をｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎバッファーに再懸濁した。シグマ−１受容体特異的（ＧＧＣＵＵＧＡＧＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＡ）又はスクランブル化（ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＵＣＡＡＵＵ）ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを添加し、再懸濁ニューロンをＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍ Ｇ−１３を用いてエレクトロポレートした。シグマ−１受容体ノックダウン下におけるＡＧＹ−９４８０６誘導神経突起生長を測定するために、化合物を最終濃度３μＭとなるように添加し、細胞を３日間、化合物存在下にインキュベートした。受容体ノックダウンの程度を評価するために、細胞を１００μｌリシスバッファー中で超音波処理で破砕し、４−２０％トリスグリシンゲルに流した。シグマ−１受容体タンパクレベルはラットのシグマ−１受容体配列中のアミノ酸１４４−１６２に該当するヘプチド「ＥＶＹＹＰＧＥＴＶＶＨＧＰＧＥＡＴＤＶ」を認識する選択的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで検出した。
【０１２３】
３μＭＡＧＹ−９４８０６は有意に平均神経突起長さ（図２Ａ）を、３μＭＡＧＹ−９４８０６による皮質ニューロン処置後２日及び３日において、２倍以上に増加させた（ｐ＜０．０１；Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔ）（図２Ｂ）。カルチャー中において海馬ニューロンの神経突起の生長及び分岐もまた１μＭＡＧＹ−９４８０６により高められた（データを示さない）。シグマ−１受容体（ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ））処置は有意にシグマ−１受容体タンパクレベルを、スクランブルｓｉ−ＲＮＡ配列（ｓｉ（ｓｃｒ））に比べて減少させた、（図２Ｃ、挿入）。ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ）による初代皮質ニューロンにおけるシグマ−１受容体ｍＲＮＡのノックダウンは有意に神経突起生長を、ｓｉ（ｓｃｒ）に比べて、ビヒクル処置カルチャー及びＡＧＹ−９４８０６（３μＭ）処置カルチャーの両方において、インビトロ２日後において、減少させた（図２Ｃ）。さらに、ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ）は神経突起生長に対するＡＧＹ−９４８０６の刺激効果を完全に破壊した（図２Ｄ）。
【０１２４】
従って、ＡＧＹ−９４８０６は、シグマ−１受容体の刺激を通して、神経突起生長及び分岐を高め、カルチャー中において皮質及び海馬ニューロンのスパイン形態における可塑性を誘発する。
【０１２５】
実施例５
遺伝子発現研究
ルンド大学の動物実験に関する倫理委員会は実験プロトコールを承認した。Ｍｏｌｌｅｇａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｅｊｂｙ、デンマークから入手した月齢６カ月の雄性ＳＨＲ（高血圧自然発症ラット）を、２カ月前及び術前に標準ケージ（５５０×３５０×２００ｍｍ、各ケージにラット３〜４匹）に収容し、メトヘキシタール ナトリウム（Ｂｒｉｅｔａｌ、３７℃）５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内麻酔した。小さな開頭術によって右ＭＣＡにアクセスし、線条体動脈末端で動脈を連結し、新皮質梗塞を引き起こした。平均手術時間は約２０分であり、体温は３７℃付近に維持された。術後に、ラットを個々のケージに２４時間維持した。ＭＣＡ閉塞（ＭＣＡＯ）を受けたラットは、標準環境（ＳＥ）に戻すか、又は水平及び垂直のボード、鎖、ブランコ、木製ブロック、並びに大きさ及び材質の異なる物体を備えた大きな縦型エンリッチ環境（ＥＥ）ケージ（８１５×６１０×１，２８０ｍｍ）においた。ボードと可動性物体とのあいだの距離を１週間に２回変化させた。擬似群には、ＭＣＡＯを起こさずに擬似手術を施し、標準環境においた。全ての実験群において、遺伝子発現の終点解析として回復の１２日及び６０日目を選択した。研究は６つの実験群を用いて行われ、各群は６〜８匹の動物で構成された。
【０１２６】
１２日及び６０日後に各実験群の動物を屠殺し、ＲＮＡ精製及び標的調製のために、脳の内側、吻側及び前頭葉、並びに海馬及び線条体領域の組織を単離した。ラット皮質ｃＤＮＡライブラリー由来の５０，０００クローンから成るｃＤＮＡアレイを、対象動物、標準ＭＣＡＯ動物及びエンリッチ環境動物から得た標識標的核酸とハイブリダイズさせた。得られた遺伝子発見アレイデータのバイオインフォマティクス解析後、上方制御された約３４００遺伝子を選択した。各それぞれのアレイフィルターに関する平均空ウェル値によって生クローンデータを正規化した。次にこれらの値を近似の正規性まで変換した（ｌｏｇ２＋１）。その後の統計解析のために全ての複製をプールした。各脳領域（前頭、内側、吻側、海馬及び線条体）に関し、３つの実験条件（エンリッチ環境、脳卒中及び対照）の時点を主成分分析（ＰＣＡ）で解析した。範囲外のデータポイントをデータセットから取り除いた。次に、所定の脳領域及び時点内の実験条件間のクローンの挙動に関してＡＮＯＶＡを実施した。ＡＮＯＶＡの結果は、ｐ値＜０．０５のクローンに関してフィルターをかけた。次に、このフィルターをかけたＡＮＯＶＡリストをＴｕｋｅｙ ＨＳＤ試験で解析し、クローンの発現パターンを決定した。
【０１２７】
１．８倍以上に上方制御された発現、及び変動係数（ｃｖ）＞０．２に基づいて選択した。選択したクローンをとり、ＰＣＲで増幅し、プロファイリングアレイのためにナイロンメンブレン上に再びプリントした。プロファイリングアレイは、回復期間が１２日及び６０日のさまざまな皮質及び皮質下領域由来のプローブで調査した。更なる解析のため、上方制御されたクローンを選択した。
【０１２８】
発見及びプロファイリングアレイからのデータの解析により、虚血性脳卒中の病態生理学における潜在的メカニズム経路、及びエンリッチ環境後の機能回復の細胞内メカニズムの同定が可能になった。この解析には、調節されたクローンの主成分分析、及び同様の発現プロファイルを有する調節された遺伝子のクラスター化が含まれた。主成分分析は、遺伝子クラスターのセット間で因果関係をもらたす。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に対する潜在的介入標的としての調節された遺伝子の選択には、限定されるものではないが、配列アノテーション、発現プロファイル、ＣＮＳ疾患の病理における生物学的関連性のメカニズム経路内への遺伝子の配置、特定遺伝子の調節を対象とする薬物を開発するための技術的実行可能性（即ち薬物化能力）、ＣＮＳ又は他の臓器の病理における遺伝子の公知の生物学的役割を含めた一連の基準が含まれた。
【０１２９】
ＥＥアレイデータの解析は、動物をエンリッチ環境においた場合、標準環境と比較して、線条体及び前頭葉では１型シグマ受容体ｍＲＮＡは上方制御されるが、内側皮質では１型シグマ受容体ｍＲＮＡは下方制御されることを示している。したがって、エンリッチ環境を適用して脳を刺激すると、感覚運動機能の制御に重要な脳領域において１型シグマ受容体の発現を誘導する。
【０１３０】
実施例６
シグマ−１受容体はニューロンにおいてＪＮＫ及びｐ３２シグナル伝達を活性化する
初代神経細胞カルチャーを密度が０．８×１０４細胞において９６孔ウエルプレートのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養した。細胞は１０μＭの選択的キナーゼ阻害剤（ＪＮＫ用にＳＰ６００１２５、ｐ３８用にＳＢ２０３５８０、ＥＲＫ用にＵ０１２６及びＰＩ３キナーゼ用にＬＹ２９４００２、すべてＴｏｃｒｉｓから）で１時間、プレインキュベートした後、３μＭＡＧＹ−９４８０６又はビヒクル（０．０３％ＤＭＳＯ）を添加した。カルチャー中で２日後神経突起生長を、記載のとおりに決定した。ｃ−ｊｕｎリン酸化研究のために、初代皮質ニューロンをプレートし、３μＭＡＧＹ−９４８０６で３時間後にカルチャー中で処置した。ｃ−ｊｕｎリン酸化に対する効果はＡＧＹ−９４８０６投与の５、１５及び３０分後に測定された。細胞を集め、氷上で破砕し、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＮａＦ、２０ｍｍＮａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭＮａ３ＶＯ４、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコレート、１ｍＭＰＭＳＦ、及び１：２００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ２７１４）からなるホモジェナイズバッファー中で４℃にてスピンダウンした。ｃ−ｊｕｎ及びリン酸化ｃ−ｊｕｎの両方を条件あたり２０μｇの全タンパクを含有する試料中で、抗ｃ−ｊｕｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃９１６２）又は抗リン酸化ｃ−ｊｕｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃９２６１）を、それぞれ製造者の推奨に従って１：１０００に希釈して用いて、検出した。細胞破砕物はつぎにホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を１：２０００に希釈したものとインキュベートした。免疫反応性をＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＃ＲＰＮ２１３２）を用いた強化化学ルミネッセンスにより視覚化した。
【０１３１】
対照カルチャー中で、３μＭＡＧＹ−９４８０６は無処置カルチャーと比べて２倍以上（ｐ＜０．０１；ボンフェローニ／ダンテスト）神経突起長を増加させた（図３Ａ）。ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（１０μＭ）及びｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）は、それぞれ神経突起長を６２±１μｍ及び６３±９μｍに、ＡＧＹ−９４８０６処置対照群と比べて約８０％、減少させた。これら２群における神経突起生長の程度は対応する対照群から統計的に異ならなかった。ＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０μＭ）及びＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０μＭ）は効果がなかった。さらに、ＡＧＹ−９４８０６は初代皮質ニューロン中におけるｃ−ｊｕｎリン酸化レベルを約２倍（Ｐ＜０．０５；ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ；図３Ｂ）増加させた。従って、ＡＧＹ−９４８０６媒介神経突起生長におけるシグマ−１受容体活性化はＪＮＫ／ｐ３８活性化の上流である。
【０１３２】
実施例７
錠剤の調製
式ＩＶの化合物（１０．０ｇ）を乳糖（８５．５ｇ）、ヒドロキシプロピルセルロースＨＰＣ−ＳＬ（２．０ｇ）、ヒドロキシプロピルセルロースＬ−ＨＰＣ、ＬＨ−２２（２．０ｇ）及び純水（９．０ｇ）と混合し、得られる混合物を顆粒化、乾燥及びグレーディングに供し、得られる顆粒をステアリン酸マグネシウム（０．５ｇ）と混合して錠剤製造に供し、錠剤あたり１０ｍｇの式ＩＶの化合物を含有する錠剤を得る。
【０１３３】
実施例８
被験者への投与
実施例７で調製した錠剤を時間０に被験者に与える。２４時間ごとに錠剤１錠を１週間与える。３錠目を投与した後、被験者を神経変性イベントに曝す。処置被験者は、未処置被験者に比べて重篤でない神経障害の症状を示す。
【０１３４】
本願において参照した全ての公開特許及び出版物は本明細書中にその全体が援用される。
【０１３５】
本発明の好ましい態様について説明し、記載したが、本発明の精神及び範囲を逸脱することなくさまざまな改変をすることが可能であることは認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
図面の簡単な説明
【図１】図１はＡＧＹ−９４８０６が永久及び一時的ＭＣＡ閉塞及び脳外傷による脳障害後の機能回復を高めることを説明する。永久に閉塞されたＭＣＡを有するＳＨＲラットは毎日生理食塩水（Ｖｈ）（ｎ＝７）、０．３（ｎ＝９）又は１ｍｇ／ｋｇ皮下投与（ｎ＝１０）で２８日間、閉塞から２日後に開始して、処置された。（図１Ａ）：皮質部位に位置する梗塞（左パネル、星）は、群において有意に異ならなかった（右パネル）。（図１Ｂ及び１Ｃ）：ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ ｔｅｓｔにより評価した９０分間のＭＣＡの一時的閉塞後の回復。パフォーマンスはなされたｆｏｏｔ ｆａｕｌｔの数で表示され（図１Ｂ）及び水平に吊り下げた梯子を横切るに要する時間で表示される（図１Ｃ）。生理食塩水（ｎ＝１３）、０．３（ｎ＝１５）又は１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１１）ＡＧＹ９４８０６皮下投与による処置がＭＣＡＯ後の回復の２日後から開始され毎日２８日間継続された。数値は平均±ＳＥＭである。統計的差（＊＊及び＊はｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５、２要因分散分析（２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びその後のボンフェローニテスト）。ＡＧＹ９４８０６（１．０ｍｇ／ｋｇ）による処置はこの試験における測定された全てのタイムポイントでパフォーマンスを改善した。（図１Ｄ及びＥ）：ＡＧＹ９４８０６はそれぞれ、機能回復（回転棒ｒｏｔａｔｉｎｇ ｐｏｌｅ）及び外傷による脳損傷後のコンポジットニューロスコアを高める。動物は、それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ経皮投与のＡＧＹ９４８０６（ｎ＝１０）又は生理食塩水（ｎ＝９）で処置された。メジアンは（ドット）で、第２５及び第７５パーセンタイルは（ボックス）で、最高値及び最低値は（バー）で示す。（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー）。
【０１３７】
【図２】図２はＡＧＹ−９４８０６が神経突起生長及び分岐、並びにスパインヘッドモーフィングを高めることを説明する。分離された皮質ニューロンをプレーティング時にＡＧＹ９４８０６の存在している（ＡＧＹ９４８０６）又は存在していない（コントロール）媒質で処置した。（図２Ａ）：３μＭ ＡＧＹ９４８０６を含まない及び含む媒質で処置した抗神経チューブリン抗体で染色された皮質細胞の顕微鏡写真。（図２Ｂ）：３μＭ ＡＧＹ９４８０６は、コントロールカルチャーと比較した場合、カルチャー中において処置後２日及び３日後神経突起生長を有意に高める。データは異なる日に実施された４−８ウエルを含む３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。（＊＊はｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ ｔｅｓｔ）。（図２Ｃ）：初代皮質ニューロンにおいてｓｉＲＮＡでＳｉｇ１Ｒタンパクをノックダウンすると２日目に神経突起生長が、スクランブルシークエンス（ｓｃｒ）で処置した場合と比べて、コントロールカルチャーと３μＭ ＡＧＹ９４８０６で処置したカルチャーの両方において、減少する。データは平均±ＳＤ（＊＊＊はｐ＜０．００１、スチューデント、ｔ−検定）。ＡＧＹ９４８０６はスパインヘッド形態を変える。挿入写真：Ｓｉｇ１Ｒのノックダウンはウエスタンブロット上の受容体タンパクレベルを減少する（３つのうちの１ブロットを示した）。（図２Ｄ）：初代皮質ニューロンにおいてｓｉＲＮＡでＳｉｇ１Ｒタンパクをノックダウンすると２日目に神経突起生長が、スクランブルシークエンス（ｓｃｒ）での処置に比べて、コントロールカルチャーと３μＭ ＡＧＹ９４８０６で処置したカルチャーの両方において、減少する。データは平均±ＳＤ（＊＊＊はｐ＜０．００１、スチューデント、ｔ−検定）。
【０１３８】
【図３Ａ】図３は異なるプロテインキナーゼ阻害剤の神経突起生長及びｃＪｕｎリン酸化に対する効果を説明する。（Ａ）：皮質ニューロンカルチャーを３μＭ ＡＧＹ９４８０６に対して１０μＭのＪｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤ＳＰ６００１２５、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０、１０μＭのＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２８及び１０μＭのＰＩ−３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２の添加並びに無添加で、プレーティング時に処置した。神経突起長さを処置後２日で評価した。データは４−８ウエルの３−６の独立実験からの平均±ＳＤである。ＮＳは非有意を示し＊＊はＡＧＹ９４８０６処置対照群からの有意差（ｐ＜０．０１、１要因分散分析及びその後のボンフェローニ／ダン検定）を示す。
【図３Ｂ】（Ｂ）：皮質ニューロンカルチャーを１５分間３μＭ ＡＧＹ−９４８０６並びにｃＪｕｎ及びリン酸化ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃＪｕｎ）に対する抗体でプローブされた細胞溶解物で処置した。典型的ウエスタンブロットを示した。ＡＧＹ−９４８０６は初代皮質ニューロンにおいてｃ−ｊｕｎリン酸化レベルを約２倍増加させた（ｐ＜０．０５；ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００４年６月１４日出願の米国出願番号１０／８６８，４２３の一部継続出願でありその出願に基づく優先権を主張し、該出願は、２００３年６月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／４７８，７３５、２００３年６月１２日出願の６０／４７８，３２９、２００３年８月２６日出願の６０／４９８，１３２、及び２００４年３月１２日出願の６０／５５２，６１３の利益を主張し、並びに、２００４年６月１４日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９３９、公開番号ＷＯ２００４／１１０３８７Ａ２の継続出願であり、それら全てを引用によりそれらの全体を本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患を有する被験者において神経再生を達成するための治療方法に関するものである。特に、本発明は、神経変性疾患後の被験者において神経再生及び機能回復を容易にするためのシグマ受容体リガンドの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シグマ受容体の存在は、ベンゾモルファンの精神異常作用を説明するために、Ｍａｒｔｉｎら（１９７６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９７：５１７−５３２によって提唱された。当初、シグマ受容体は新規オピオイド受容体であると考えられていた。しかしながら、ベンゾモルファンのシグマ受容体への結合は、古典的オピオイド受容体アンタゴニストであるナロキソンによって拮抗されない。更に、ベンゾモルファンは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体複合体上のフェンシクリジン受容体とは異なる部位に結合する。従って、シグマ受容体は独特の受容体として確立されている。
【０００４】
シグマ受容体は、シグマ−１及びシグマ−２という名の二つのサブタイプからなる。Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ（１９９０）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５２７：２２４−２５３は、二つの推定シグマ受容体サブタイプの特徴を初めて定義した。これら二つの部位間の主な薬理学的相違点は、結合部位に対するベンゾモルファン麻酔薬の（＋）異性体の親和性にある。（＋）ＳＫＦ１０，０４７（ＮＡＮＭ）及び（＋）ペンタゾシンなどのこれら化合物は、シグマ−１部位に対してシグマ−２部位に対してよりもほぼ２桁高い親和性を示す。ベンゾモルファンの（−）異性体は、これら二つの部位間でほとんど選択性を示さない。二つの部位間で注目される他の相違点は、ＮＣＢ−２０、ＰＣ１２及びＮＧ１０８−１５のような細胞株におけるシグマ−２部位の優勢である（Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ；Ｑｕｉｒｉｏｎら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３：８５−８６）。シグマ−１受容体は同定され、クローン化されているが、シグマ−２受容体は未だにそうではない（Ｌａｎｇａら、（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６）。シグマ受容体の内在リガンドは知られていない。
【０００５】
脳におけるシグマ−１受容体のサブセルラー分布には、海馬、皮質層及び嗅球が含まれる。シグマ−１は２６ｋＤａタンパク質であり、受容体をコードする遺伝子はクローン化されている。疎水性プロット分析は、シグマ−１受容体が二つの膜貫通セグメントを有することを示唆している。更に、シグマ−１受容体は他の公知の哺乳動物タンパク質と相同性がない。
【０００６】
両方のタイプのシグマ受容体は、末梢組織のみならず中枢神経系でも発現する。従って、受容体に対するリガンドは神経変性疾患の治療及び予防に用いることができるであろう。そのため、脳シグマ受容体は活発な研究の対象となっている（Ｓｏｎｄｅｒｓら（１９８８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１：３７−４０）。一般に、シグマ受容体は、精神病薬、抗うつ薬及び神経ステロイドのような幅広いリガンドに対して無差別に結合する。これらはうつ病の行動モデルのみならず健忘症の動物モデルにおいても学習及び記憶に重要な役割を果たすことが示されている。非常に多くの研究は、脳虚血の動物モデルにおいてシグマ受容体リガンドの強い神経保護特性を示している。これらシグマリガンドのうちのいくつかの神経保護メカニズムは、シグマ受容体もＮＭＤＡ受容体チャネル複合体のフェンシクリジン（ＰＣＰ）結合部位もこうした作用に貢献することが報告されているため、論争になっている。
【０００７】
神経変性疾患は神経細胞の機能障害及び細胞死を特徴とし、脳、脊髄及び末梢神経系によって媒介される機能の喪失をもたらす。こうした障害は社会に大きな影響をもつ。例えば、およそ４〜５百万人のアメリカ人がアルツハイマー病として知られる慢性神経変性疾患に悩まされている。慢性神経変性疾患の他の例には、糖尿病性末梢神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病及びパーキンソン病が含まれる。正常な脳の加齢も正常な神経機能の喪失に関連しており、ある種のニューロンの減少を必然的に伴い得る。
【０００８】
脳卒中は米国における死亡原因の第３位であり、神経科の入院患者の半数を占める。損傷を受けた脳の領域によって、脳卒中は昏睡、麻痺、言語問題及び痴呆を引き起こし得る。脳梗塞の主な原因は、血管内血栓、脳塞栓、低血圧、高血圧性出血、及び無酸素症／低酸素症である。しかしながら、成人の脳は、可塑性及び機能再構築のための能力を生涯にわたって、たとえ脳卒中又は脳虚血の後であっても、保持している。ニューロン結合は継続的に改築される。脳の障害部分を代償する脳の潜在的能力は、脳卒中のリハビリテーションのための適切さを有する。脳卒中患者の神経画像診断はある程度の機能再構築を示唆している。このように、脳可塑性の１つの側面は、脳卒中患者において、感覚入力、体験及び学習によってニューロン結合を修飾することができること、そして脳は、機能的及び構造的再構築、ある事象に対する神経反応の上方制御又は下方制御、側枝発芽及び代償性シナプス形成並びに神経発生による新規な機能的及び構造的結合の確立によって、対応できることである。
【０００９】
しかしながら、脳の可塑性に対する環境因子の効果に加えて、薬物や薬物と環境因子との相互作用は考慮すべき他の側面である。したがって、神経再生及び機能回復を補助するために脳可塑性を利用する中枢神経系疾患及び他の病態を治療するための新規薬物、そして、新規方法に対する必要性が存在し続けている。本発明は、これら及び他の必要性を満たすものである。
【００１０】
いくつかのシグマ受容体リガンドは、薬物の神経保護活性に関する試験における予測モデルにおいて神経保護性である（即ち、神経細胞死及びその結果として起こる機能喪失から保護する）ことがわかっている。例えば、シグマ受容体リガンド オピプラモールは、アレチネズミにおいて虚血から保護することがわかっており、ＮＭＤＡ型グルタメート受容体を調節することがわかっている。更に、ＢＭＹ−１４８０２、カラミフェン及びハロペリドールを含めた他のシグマリガンドは、ＮＭＤＡによって誘発される毒性及び発作に対して保護効果を提供できることと一致した特性をｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて発揮し（Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２６：４６１−４６５）、いくつかのシグマリガンドは、虚血によって誘導される海馬スライス標本からのグルタメート放出をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することがわかった（Ｄ．Ｌｏｂｎｅｒら（１９９０）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．，１１７：１６９−１７４）。
【００１１】
米国特許第５，７３６，５４６号は、シグマ受容体のリガンドのある種の１，４−（ジフェニルアルキル）ピペラジン誘導体について開示する。その中の化合物のうちの１つ、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジンは、現在ＳＡ４５０３又はＡＧＹ−９４８０６としても知られている。Ｎａｋａｚａｗａら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３２：３３７−３４３は、ＡＧＹ−９４８０６が選択的シグマ−１アゴニストであり、ラットの初代神経細胞カルチャーにおいて低酸素症／低血糖症で誘発される神経毒性を有意に抑制したことを報告している。この神経保護作用は、シグマ−１受容体は神経変性の治療に有用であり得るとの示唆を著者らにもたらした（３４２頁参照）。Ｓｅｎｄａら、（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３４２：１０５−１１１は、ＡＧＹ−９４８０６が培養ラット網膜神経細胞においてグルタメートの神経毒性に対して活性があることを発見したと更に報告している。著者らは、シグマ−１受容体アゴニストは、中心及び分岐網膜動脈閉塞、真性糖尿病、加齢に関連した黄斑変性、異常ヘモグロビン症並びにさまざまなタイプの緑内障などの虚血による神経細胞死を伴う網膜疾患に対して有用であり得ることを示唆している。現在ＡＧＹ−９４８０６はうつ病治療用に臨床開発されており、痴呆症及び薬物依存症の治療に潜在的用途があると注目されてもいる。
【００１２】
米国特許第５，６６５，７２５号は、シグマ受容体のリガンドのある種のピペリジン誘導体を開示する。これらの化合物は、不安、精神病、てんかん、けいれん、ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ｍｏｔｏｒ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ、健忘症、脳血管疾患、アルツハイマー型老年性痴呆症及びパーキンソン病の治療に有用であるといわれている。これらの化合物のうちの１つ、１’−［４−［１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１−ブチル］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］は、Ｌｕ２８−１７９又はシラメシンとしても知られている。これは選択的シグマ−２アゴニストであり、シグマ−１受容体に対する活性も示す（Ｐｅｒｒｅｇａａｒｄ Ｊ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８：１９９８−２００８）。国際特許出願、公開番号ＷＯ９９／２４４３６号は、前記化合物のハロゲン化水素塩、特に塩酸塩は、良好なバイオアベイラビリティを有することを更に開示する。
【特許文献１】米国特許第５，６６５，７２５号
【特許文献２】米国特許第５，７３６，５４６号
【特許文献３】公開番号ＷＯ９９／２４４３６号
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９７：５１７−５３２（１９７６）
【非特許文献２】Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５２７：２２４−２５３（１９９０）
【非特許文献３】Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ；Ｑｕｉｒｉｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３：８５−８６（１９９２）
【非特許文献４】Ｌａｎｇａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６（２００３）
【非特許文献５】Ｓｏｎｄｅｒｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１：３７−４０（１９８８）
【非特許文献６】Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２６：４６１−４６５（１９９１）
【非特許文献７】Ｄ．Ｌｏｂｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．，１１７：１６９−１７４（１９９０）
【非特許文献８】Ｎａｋａｚａｗａら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３２：３３７−３４３（１９９８）
【非特許文献９】Ｓｅｎｄａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３４２：１０５−１１１（１９９８）
【非特許文献１０】Ｐｅｒｒｅｇａａｒｄ Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３８：１９９８−２００８（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このように、先行技術は、シグマリガンドが神経変性疾患を有する被験者の治療において神経保護剤として有用であり得ることを示唆している。
【００１４】
今回、予想外にも、ある種のシグマリガンドは神経変性疾患を患う被験者において機能回復を容易にすることがわかった。したがって、シグマリガンドは、神経障害後の神経変性疾患の治療において神経再生剤として有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、神経変性疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。本発明のシグマ受容体リガンドは機能回復及び神経再生を促進する。これらの分子は単独で又は追加の薬剤と組み合わせて送達することができ、虚血性脳卒中又は神経を傷つける他の傷害原因によるような神経変性疾患を治療するための神経再生剤として用いられる。
【００１６】
したがって、１つの側面では、本発明は、それを必要とする被験者の神経変性疾患を治療又は予防するための方法に関する。この方法は、医薬的に有効量のシグマ受容体のリガンドを被験者に投与することを含む。
【００１７】
したがって、本発明は、それを必要とする哺乳動物被験者の神経変性疾患を、神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすように治療するための方法を提供し、この方法は医薬的に有効量のシグマ受容体リガンドを被験者に投与することを含む。
【００１８】
他の側面では、本発明は、哺乳動物被験者において神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすための医薬の製造におけるシグマリガンドの使用を提供する。
【００１９】
更に他の側面では、本発明は、神経再生を容易にして神経変性疾患後の機能回復をもたらすように哺乳動物被験者を治療するためのシグマリガンドを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
神経変性疾患は、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、糖尿病性末梢神経障害、がん治療によって誘発される神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病又はパーキンソン病であり得るが、好ましくは虚血性脳卒中、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である。更に、本発明は、追加の活性物質の投与方法を提供する。本発明のリガンドは、医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物で投与することができる。賦形剤は、経口投与に好適であり得る。したがって、組成物は錠剤、カプセル、又は軟ゲルカプセルの形態であり得る。
【００２１】
あるいは、賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、又は皮下投与に好適な液体であり得る。あるいは、賦形剤は経皮投与、又は口腔内投与に好適であり得る。シグマ受容体リガンドは、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジン（ＡＧＹ−９４８０６）又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。
【００２２】
本発明は、脳卒中、脊髄虚血、脊髄損傷及び外傷性脳損傷のような中枢神経系障害患者のリハビリテーションのための方法及び組成物を提供する。本発明は、シグマ受容体リガンド、好ましくはＡＧＹ−９４８０６を脳卒中後約４８時間以内に、１〜３カ月間、好ましくは最長１年、より好ましくは継続的に患者に投与した場合、患者の機能障害状態を回復させるという発見に基づいている。リガンドは単独で又は追加の薬剤と組み合わせて送達することができる。ＡＧＹ−９４８０６は、例えば治療期間中毎日投与することができる。
【００２３】
したがって、１つの側面では、本発明は、医薬的に有効量のシグマ受容体リガンドを脳卒中症状の発現直後１〜３カ月間被験者に投与することを含む、被験者の脳卒中を治療する方法に関する。シグマ受容体リガンドは、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジン（ＡＧＹ−９４８０６）又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物、例えばＡＧＹ−９４８０６のＨＣｌ塩又は二塩酸塩、であることが好ましい。
【００２４】
本発明の他の側面では、被験者へのシグマリガンドの投与は、神経変性疾患後、特に虚血性脳卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の後、少なくとも２４時間、例えば少なくとも４８時間、１週間、１カ月又は３カ月に開始する。シグマリガンドは、治療開始から反復して、例えば毎日、例えば１週間、２週間、１カ月、３カ月、１年又はそれより長期間、投与することができる。例えば、治療は、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の後、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間、少なくとも１週間に開始し、１カ月、３カ月、６カ月又は１年間継続することができる。
【００２５】
被験者の治療は医師の指示の下で実施することができる。治療期間中、医師は、被験者の神経再生の徴候を評価することができる。この徴候は、脳若しくは脊髄の機能回復又は構造変化の徴候であり得る。したがって、例えば、医師は、被験者の１つ以上の機能反応を治療の直前又は開始時、及び治療後再び測定することができる。したがって、治療は神経再生（又は機能回復）の徴候が得られるまで継続することができる。
【００２６】
以下により詳細に記載するように、機能回復の徴候は、例えば運動技量、認知技量、言語又は感覚による認識力及び機能の回復であり得る。運動技量の回復及び認知技量の回復について特に言及することができる。神経再生の徴候は、脳又は脊髄における構造変化の徴候でもあり得る。
【００２７】
本発明の他の側面では、患者の神経変性疾患の治療に用いて神経再生（又は機能回復）を容易にする包装キットが提供される。キットには、ＡＧＹ−９４８０６又はその塩若しくは溶媒和物の医薬製剤、保存中及び投与前に医薬製剤を収容する容器、並びに神経再生（又は機能回復）を容易にするための神経変性疾患の治療に有効な方法で薬物投与を実施するための使用説明書、例えば包装挿入物又はラベル上の取扱説明書が含まれる。医薬製剤は本明細書に記載の如何なる製剤、例えば単位用量のシグマ受容体リガンドを含有する経口剤形であり得、単位用量は疾患の治療に治療上有効な用量である。
【００２８】
本発明のこれら及び他の側面は、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。更に、ある種の手順又は組成物についてより詳細に記載したさまざまな参考文献が本明細書中に記載されており、したがってその全体が引用により組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
詳細な説明
Ｉ．定義
特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲を含めた本願で使用する以下の用語は下記の定義を有する。明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するように、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈がその他を明示していない限りは複数の指示対象も含むことに注意しなければならない。標準的化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ及びＳｕｎｄｂｅｒｇ（１９９２）『応用有機化学 第３版』Ｖｏｌ．Ａ及びＢ、Ｐｌｅｎｕｍ出版、ニューヨーク、を含めた参考資料に見出すことができる。本発明の実践には、特に他であることを明記しない限り、質量スペクトル法、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用の方法を当該分野の技術の範囲内で採用するであろう。
【００３０】
「アゴニスト」という用語は、他の分子の活性又はシグマ受容体部位の活性を高める化合物、薬物、酵素アクチベーター又はホルモンのような分子を意味する。
【００３１】
「アンタゴニスト」という用語は、他の分子の作用又はシグマ受容体部位の活性を減少させるか又は妨げる化合物、薬物、酵素インヒビター、又はホルモンのような分子を意味する。
【００３２】
「脳卒中」という用語は、原因にかかわらず、広く、脳への血流低下に関連した神経脱落の発症を意味する。潜在的原因には、限定されるものではないが、血栓症、出血及び塞栓形成が挙げられる。血栓、塞栓、及び全身性低血圧は、脳虚血エピソードの最も一般的な原因である。他の障害は、高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤破裂、血管腫、血液疾患、心不全、心停止、心臓ショック、敗血症性ショック、頭部外傷、脊髄外傷、発作、腫瘍に由来する出血、又は他の失血によって引き起こされ得る。
【００３３】
「虚血エピソード」とは、組織への血液供給不足をもたらす如何なる状況をも意味する。虚血が脳卒中を伴う場合、それは以下に定義するように全脳虚血又は局所脳虚血であり得る。「虚血性脳卒中」という用語は、より詳細には、限定的なもので、血流閉塞によって起こるある種の脳卒中を意味する。「虚血性脳卒中」という用語には、外科手術によって生ずるもの含めた心停止、脳卒中、及び多発梗塞性痴呆症の後の脳虚血が含まれる。脳虚血エピソードは脳への血液供給不足によって生ずる。やはり中枢神経系の一部である脊髄は、同様に、血流減少によって生ずる虚血による影響を受けやすい。
【００３４】
「局所脳虚血」とは、中枢神経系に関して本明細書で用いるように、脳又は脊髄に血液を供給する１つの動脈の閉塞によって生ずる状態であって、その動脈によって供給される領域の細胞に障害をもたらすところの状態を意味する。
【００３５】
「全脳虚血」とは、中枢神経系に関して本明細書で用いるように、脳全体、前脳、又は脊髄への全般的な血流減少によって生ずる状態を意味し、これらの組織全体で選択的に損傷を受けやすい領域に神経細胞死を引き起こす。これらの症例のそれぞれにおいて病状は、臨床的相関現象がそうであるように、全く異なっている。局所脳虚血モデルは局所脳梗塞患者にあてはまり、一方、全脳虚血モデルは心停止、及び全身性低血圧の他の原因に類似している。
【００３６】
「神経保護剤」とは、本明細書において初期の障害部位からの神経障害の広がりを阻害する能力を含めた、神経細胞死を軽減させるのに有効な化合物を意味する。
【００３７】
「マイクロアレイ」という用語は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドグラス、ビーズのような基板上に、あるいは他の好適な固体支持体に、所望の密度で、合成又は付着又は沈着させた個別のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを意味する。
【００３８】
「有効量」又は「医薬的に有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供する、毒性はないが十分な量の薬剤を意味する。その結果は、徴候、症状、若しくは疾患の原因の軽減及び／又は緩和、あるいは生体系の他の所望の変化であり得る。例えば、治療用途の「有効量」とは、虚血性脳卒中によって生ずるもののような神経変性疾患において臨床的に有意な減少を提供するのに必要とされる本明細書に開示したシグマ受容体リガンドを含む組成物の量である。個々の症例において適切な「有効」量は通常の実験を用いて当業者が決定することができる。
【００３９】
本明細書において「治療する」又は「治療」という用語は互換的に用いられ、神経変性疾患の進展の遅延、及び／又は進展する若しくは進展すると予想されるそのような症状の重篤度の低下を示すことを意味する。この用語には、存在する神経変性症状を改善すること、更なる症状を予防すること、及び症状の基礎となる代謝原因を改善又は予防することが更に含まれる。
【００４０】
「医薬的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」とは、生物学的その他の理由で有害ではない材料を意味する。即ち、望ましくない生体作用を引き起こさず、組成物に含有される成分と有害な方法で相互作用することなく、その材料を個人に投与することができる。
【００４１】
「生理学的ｐＨ」又は「生理学的に許容範囲のｐＨ」とは、およそ７．２以上８．０以下の範囲、より典型的にはおよそ７．２以上７．６以下の範囲のｐＨを意味する。
【００４２】
本明細書において「被験者」という用語は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、哺乳動物クラスのあらゆるメンバーが挙げられる：ヒト、チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種のようなヒト以外の霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、豚のような家畜；ウサギ、イヌ、及びネコのような家畜；ラット、マウス及びモルモットなどのような齧歯動物を含めた実験動物。非哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、トリ、サカナなどが挙げられる。この用語は特定の年齢又は性別を意味するものではない。
【００４３】
化合物の「医薬的に許容可能な塩」という用語は、医薬的に許容可能であり、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。そのような塩には、例えば以下が含まれる：
（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩；又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプト酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、３級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成される酸付加塩；
（２）親化合物中に存在する酸性プロトンを金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はアルミニウムイオンで置換するか；又は有機塩基を配位させて形成する塩。許容可能な有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルタミンなどが含まれる。許容可能な無機塩基には、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどが含まれる。医薬的に許容可能な塩への言及には、その溶媒添加型又は結晶型、特に溶媒和物又は多形体が含まれることを理解すべきである。溶媒和物は、化学量論的な又は非化学量論的な量の溶媒を含有し、結晶化の過程で形成されることが多い。水和物は溶媒が水の場合に形成され、アルコラートは溶媒がアルコールの場合に形成される。多形体には、ある化合物と同一元素組成の異なる結晶パッキング配置が含まれる。多形体は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学特性及び電気特性、安定性、及び溶解度を有する。再結晶溶媒、結晶化速度、及び保存温度のようなさまざまな因子により、唯一の結晶形を優位にすることができる。
【００４４】
「任意の」又は「場合により」という用語は、その後に記載された事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載には事象又は状況が起こる場合と起こらない場合を含む。例えば、「場合により追加の薬物」という用語は、患者にシグマ受容体リガンド以外の薬物を投与してもしなくてもよいことを意味する。本明細書において「追加の薬物」とは、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に好適な、所望の局所又は全身作用を誘導する化学材料又は化合物を意味する。一般に、これには以下が含まれる：食欲抑制剤；多くのペニシリン類及びセファロスポリン類を含めた抗生物質及び抗ウイルス薬のような抗感染症薬；鎮痛薬及び鎮痛薬の組み合わせ；抗不整脈薬；抗関節炎薬；抗喘息薬；抗コリン作動薬；抗けいれん薬；抗糖尿病薬；止瀉薬；抗蠕虫薬；抗ヒスタミン剤；抗炎症剤；抗偏頭痛薬；制嘔吐剤；抗新生物薬；パーキンソン病治療薬；鎮痒薬；抗精神病薬；解熱剤；アンチセンス薬；鎮痙薬；カルシウムチャネルブロッカー及びピンドロールを含めたβ−ブロッカーのような心血管薬；抗高血圧剤；中枢神経系刺激薬；うっ血除去薬を含めた感冒薬；利尿薬；Ｈ２−受容体アンタゴニストを含めた胃腸薬；交感神経様作用薬；コルチコステロイドを含めたエストラジオール及び他のステロイドのようなホルモン；睡眠薬；免疫抑制剤；筋弛緩剤；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静剤；精神安定剤；血栓溶解薬；神経保護薬；ラジカルスカベンジャ及び血管拡張薬。
【００４５】
本明細書において「機能的リハビリテーション」という用語は、理学療法、作業療法などを意味する。リハビリテーションの開始の前に、同時に又は後に薬物治療を開始することが期待される。
【００４６】
ＩＩ．シグマ受容体
エンリッチ環境（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）実験のマイクロアレイ解析からシグマ受容体を同定した。更に、本発明は、神経変性疾患を有する被験者において、中枢神経系疾患を治療するため並びに神経細胞の生存及び再生を刺激するためにシグマ受容体の発現を調節する化合物の同定方法を提供する。マイクロアレイ解析により、皮質虚血後及び虚血後環境エンリッチ化脳組織に、正常な又は非エンリッチ環境の発現と比較して、示差的に発現をする遺伝子を同定し説明する。
【００４７】
更に、本発明は、上記遺伝子発現に変化を示す被験者の治療方法を提供する。その際、治療的介入は細胞生成及び脳のその後の機能回復促進をもたらす。発明者らは、標準条件では中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後に損傷を受けやすい領域でシグマ受容体の発現が低下し、被験者をエンリッチ環境条件に曝すとＭＣＡＯ後に増加することを見出した。脳の耐性領域においてもＭＣＡＯ後に増加が検出されている。したがって、局所脳虚血又は全脳虚血を患う被験者に対して、障害後、シグマ受容体リガンドを機能回復を容易にするのに十分な期間投与する。医薬的介入は、より早い機能回復をもたらす。
【００４８】
１つの側面では、アレイ又はマイクロアレイを用いて目的の遺伝子発現を得ることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定し、次に標識標的オリゴヌクレオチドを含有するサンプルとハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションパターンを生じさせる。ハイブリダイゼーション後、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに利用する蛍光又は３３Ｐのような放射能の測定値を解析し、標的とプローブとのハイブリダイゼーションレベルを決定する。情報は、遺伝子機能、遺伝子スプライシングの決定、疾患の遺伝的根拠の理解、疾患の診断、治療剤の活性の発現及びモニタリング、多型の有無の検出などに有用である（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：２１５０−５５）。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドは生体サンプルのＲＮＡ又はＤＮＡから得ることができる。一般に、オリゴヌクレオチドは、通常天然供給源に由来するＲＮＡから逆転写されたＤＮＡであり、ＲＮＡは全ＲＮＡ、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、増幅ＲＮＡなどであり得る。開始ｍＲＮＡサンプルは、酵母のような単細胞生物を含めた生理学的供給源、真核生物供給源、又は植物及び動物、特に哺乳動物を含めた多細胞生物並びに哺乳動物由来の臓器、組織及び細胞、例えば体液（血液、尿、唾液、粘液、胃液など）、培養細胞、生検材料、又は他の組織標本由来であり得る。細胞、組織、臓器又は生物全体からＲＮＡを単離する方法は当業者に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバー出版）に記載されている。特に、被験者の内側、吻側、前頭側、海馬及び線条体領域由来のような脳由来のＲＮＡは、マイクロアレイ実験に使用するために精製し、クローニングする。
【００４９】
アレイと接触させてハイブリダイゼーションパターンを生じたサンプル中の核酸の遺伝的プロファイルに関する定量情報を決定するために、そして標識サンプル核酸が由来する生理学的供給源について決定するために、ハイブリダイゼーションパターンを用いることができる。データは、サンプル核酸が由来する生理学的供給源に関する情報、例えば生理学的供給源である組織又は細胞で発現した遺伝子の種類、及び特に量的な各遺伝子の発現レベルを提供する。
【００５０】
ＭＣＡＯを受けた後、エンリッチ環境に曝されたラットは線条体及び前頭葉において１型シグマ受容体ｍＲＮＡの上方制御を示し、内側皮質において受容体の下方制御を示すことが発見された。前頭葉は、感覚運動機能の制御に関与している。したがって、虚血後リハビリテーション段階における薬理学的介入の役割がある。このように、シグマ受容体アゴニストのようなシグマ受容体リガンドの投与は、脳卒中後の被験者の機能回復を向上させることができる。更に、薬物とエンリッチ環境のような環境因子との相互作用を用いて機能回復を向上させることができる。
【００５１】
理論に拘束されるものではないが、シグマリガンドは、強化又は刺激的環境の効果を模倣することによって神経再生及び機能回復を容易にすると考えられる。
【００５２】
ＩＩＩ．シグマ受容体リガンド
シグマ受容体リガンドは、神経変性疾患を治療するため、及び神経変性疾患からの機能回復を向上させるための、方法及び組成物に用いることができる。
【００５３】
対象とする方法に用途を見出すことができるシグマ受容体のリガンドがいくつか知られている。例えば、Ｍａｎａｌｌａｃｋ，Ｄ．Ｔ．ら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４４：２３１−２３５は、シグマ結合部位に対する親和性を有するフェンシクリジン化合物について開示しており、大きなＮ−アルキル置換基、例えばベンジル又はフェニルエチルによってシグマ部位親和性が向上することを示した。Ｌａｒｇｅｎｔ，Ｂ．Ｌ．ら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３２：７７２−７８４は、いくつかのピペリジン誘導体及びピペラジン誘導体がシグマ受容体活性を有することを教示し、より親油性の置換基を含有する化合物はシグマ受容体結合部位に対してより大きな親和性を提供することを示唆している。コカイン関連化合物はシグマ受容体結合活性を有することがＳｈａｒｋｅｙ，Ｊ．ら、（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４９：１７１−１７４によって示されている。欧州特許出願第３６２，００１号は、シグマ受容体に対して特異的親和性を有するα，α−ジ置換Ｎ−シクロアルキルアルキルアミンについて記載しており、欧州特許出願第４４５，０１３号は、シグマ受容体に対して特異的親和性を有するＮ−シクロアルキルアルキルアミンについて記載している。これらの欧州特許出願に記載されたシグマ受容体リガンドは、精神病及び胃腸の不快感の治療に有用である。ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０３２４３号には、シグマ受容体に対して特異的アンタゴニスト活性を有する１−シクロアルキルピペリジンに関する記載が含まれており、これは精神病及びジスキネジアの治療に有用である。ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９０９４号には、抗精神病薬であるアルキルピペリジン又はピロリジンに由来するエーテルに関する記載が含まれている。シグマ受容体リガンドである、更なる置換ピペリジン及び置換ピペラジンが、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２４１１６号に開示されている。１，４−（ジフェニルアルキル）ピペラジン誘導体のシグマ受容体親和性、並びに痴呆症、うつ病及び精神分裂病のような脳機能障害に対するそれらの使用について米国特許第５，７３６，５４６号に記載されている。米国特許第６，０８７，３４６号は、ある種のフェニルアルキル−アミン、アミノテトラリン、ピペラジン、ピペリジン、及び関連化合物がシグマ受容体に結合し、中枢神経系疾患、神経障害、胃腸障害、薬物乱用、アンギナ、偏頭痛、高血圧及びうつ病の治療に使用できることを開示する。他のシグマ受容体リガンドには、ＢＭＹ−１４８０２、カラミフェン及びハロペリドールが含まれ、これらはＮＭＤＡによって誘発される毒性及び発作に対してｉｎ ｖｉｖｏ保護効果を有することがわかっている（Ｍ．Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．、２６：４６１−４６５）。更なるシグマ受容体リガンドには、例えば、３ＰＰ−ＨＣｌ、ハロペリドール、アリル−ノルメタゾシン（ＳＫＦ１００４７ともいう）、ノルメタゾシン、Ｕ−５０４８８酒石酸塩、カルベタペンタン、シクラゾシン、イフェンプロジル、ＤＴＧ（１，３−ジ−２トリルグアニジン）、Ｌ６９３、４０９、ＰＴＰＰ、４ＰＰＢＰ（４−フェニル−１−（４−フェニルブチル）ピペリジンマレイン酸塩）、ＢＤ１０６３、ＩＰＡＢヨードベンザミド、ＳＭ−２１、ＢＤ１００８が含まれる。
【００５４】
ＩＶ．シグマ受容体リガンドの同定方法
シグマ受容体リガンドである化合物の同定方法は当該技術分野に公知である。シグマ受容体リガンドである化合物を同定するために用いられる１つの方法は、細胞、組織又は好ましくは細胞抽出物又はシグマ受容体を含有する他の調製物を、受容体活性に適合する緩衝液中でいくつかの既知濃度の試験化合物と接触させておくこと、そしてリガンド結合及び／又は受容体活性についてアッセイすることを含む。この方法は、順次又は多重形式で実施することができる。Ｌａｎｇａ Ｆ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８：２１８８−２１９６に記載されているように、公知の特異的リガンドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイの使用により、シグマ−１受容体又はシグマ−２受容体に対するリガンド親和性を決定することができる。本明細書の開示に基づいて当業者に明らかとなるように、シグマ受容体のリガンドである化合物を決定するための他の方法を採用することができる。
【００５５】
シグマリガンドは、ＡＧＹ−９４８０６（以下の化合物ＩＶ）又はその塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。しかしながら、以下の化合物は全てシグマ受容体リガンドである：
【００５６】
【化１】
【００５７】
【化１】
【００５８】
【化１】
【００５９】
他の方法において、上で同定したシグマ受容体リガンド及び公知リガンド又はアナログの分子形状の構造研究に基づいた理論的ドラッグデザインを用いて、３次元構造がシグマ受容体の活性部位と相補的な化合物を同定することができる。これらの化合物は、分子力学計算、分子動力学計算、条件がＮＭＲ分光法によって決定される条件付き分子動力学計算、距離行列がＮＭＲ分光法によって部分的に決定される距離幾何学法、Ｘ線回折、又は中性子回折技術を含めたさまざまな技術によって決定することができる。これら全ての技術において、シグマ受容体と相互作用することが知られているリガンドの存在下又は非存在下において構造を決定することができる。
【００６０】
このようにして同定され、又は設計されたシグマ受容体リガンドは、次に神経変性疾患を治療及び／又は予防する能力について試験することができる。１つの方法では、例えば、シグマ−１（受託番号ＮＭ＿００５８６６、ＮＭ＿１４７１５７、ＮＭ＿１４７１５８、ＮＭ＿１４７１５９、及びＮＭ＿１４７１６０）、シグマ−２、又は組換えシグマ受容体などのシグマ受容体を調節する能力について化合物を試験する。これらのスクリーニングで同定されたリード化合物は、より活性なアナログを合成するための基礎として役立つことができる。リード化合物及び／又はそれらから作製された活性アナログは、脳卒中、てんかん及び神経変性疾患のような神経障害の治療に有効な医薬組成物中に製剤化することができる。
【００６１】
Ｖ．シグマ受容体リガンドの合成
いくつかのシグマ受容体リガンドが市販されている。例えばフルボキサミン（米国特許第４，０８５，２２５号）、４−ＩＢＤ（Ｊｏｈｎら（１９９９）Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６：３７７−３８２）、Ｐｒｅ−０８４（米国特許第５，２２３，５３０号）、ＡＧＹ−９４８０６（米国特許第５，７３６，５４６号）、シラメシン（米国特許第５，６６５，７２５号）、ＯＰＣ−１４５２３（米国特許第５，５５６，８５７号）、ＢＤ−７３７（米国特許第５，１３０，３３０号及び米国特許第５，７３９，１５８号）、イグメシン（米国特許第５，０３４，４１９号）など、多くの調製法が特許及び化学文献に記載されている。
【００６２】
ＶＩ．神経再生及び機能回復
本発明の１つの態様では、シグマ受容体リガンドＩ〜ＩＸ、又はその塩若しくは溶媒和物を、脳卒中後、治療に要する十分な期間、例えば約１週間〜約１カ月又は約１２カ月投与するか、あるいは所望の治療効果が観察されるまで継続的に投与する、被験者の治療方法が提供される。シグマ受容体リガンドはＡＧＹ−９４８０６、又はその塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。本発明の他の側面では、シグマ受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６、又はその塩若しくは溶媒和物を、脳卒中後、治療に要する十分な期間、例えば約１週間〜約１カ月又は約１２カ月投与するか、あるいは所望の治療効果が観察されるまで継続的に投与し、そして、中枢神経系障害の不都合な結果からの患者の機能回復が向上するように更に被験者をエンリッチ環境のような恵まれた刺激環境、及び機能的リハビリテーションに曝す、被験者の治療方法が提供される。
【００６３】
神経組織の障害領域の機能が、正常ではこれまでその特定の役割を果たさなかった他の領域に取って代わられ、神経機能における変化が行動又は行動能力に変化をもたらすことになったときに、機能回復は起こる。機能回復は神経可塑性としても言及される。したがって、脳の機能回復は、機能的及び構造的再構築、ある事象に対する神経反応の上方制御又は下方制御、並びに、側枝発芽及び代償性シナプス形成並びに神経発生による、新規な機能的及び構造的結合の確立を意味する。
【００６４】
患者の機能回復の向上は、例えば、姿勢、バランス、把握、又は歩行のような患者の運動技量の感覚運動及び反射機能、認知技量、言語、及び／又は知覚、並びに視覚能、味覚、嗅覚、及び自己刺激感応を含めた機能、が本発明にしたがいシグマ受容体リガンドを投与した結果として向上することを評価するための機能／行動試験を用いることによって評価することができる。他の側面では、患者の機能回復は、軸策束の長さ、障害部位における神経再生の増加を測定すること、樹状突起の形態及びスパイン数などを評価することを含めた組織学的解析によって決定することができる。更に他の側面では、患者の機能回復向上は、神経機能に変化をもたらす脳の構造変化を測定する非侵襲性技術を用いることによって決定することができる。したがって、電気生理学的測定（脳波計（ＥＥＧ）又は誘発電位（ＥＲＰ））、筋電図測定（ＥＭＧ）、神経化学測定（ＣＳＦ代謝産物）、末梢測定（循環ベータエンドルフィンレベル）、放射線測定（ＣＴスキャン、ＭＲＩ）及び臨床的測定（瞳孔光反射、姿勢、味覚）を用いて患者の機能回復を測定することができる。更に、上記技術を用いて、本発明の治療にうまく応答すると思われる患者を選択することができる。
【００６５】
エンリッチ又は刺激環境の効果を模倣するためにシグマ受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６を投与する。虚血後、エンリッチ又は刺激環境に収容すると、ラットにおいて脳虚血後の機能的結果を向上できることが知られている。実験的脳梗塞後、さまざまな活動の機会及び他のラットとの相互作用を有するエンリッチ環境に収容したラットは、標準実験室環境に収容したラットよりも良好であった。社会的相互作用とともに自由な身体活動が許されるエンリッチ環境は、梗塞体積が変化することなく、最良のパフォーマンスをもたらした。エンリッチ環境は、局所脳虚血後の脳の可塑性を促進するメカニズムを刺激することができる。刺激環境に収容したラットは、無傷の及び障害された脳の表面皮質層のスパイン密度を有意に増加させることが示されている。
【００６６】
本発明の１つの側面では、刺激環境は、社会的相互作用、運動活動、脳の電気刺激、住居の変化などを含む。例えば、被験者は、感覚運動機能を向上させるために障害肢を使用するように働きかけられることができ、ウォーキング、ストレッチング、ウェイトリフティングなどの毎日の身体的な日課に供されることができ、あるいは野球、ホッケー、サッカー、又はボードケームのようなゲームをするように働きかけられることができる。更に、被験者の住居は、脳の活性を刺激するために、例えば部屋の色を変えること、織物材料を提供すること、木やスチールなどの異なる材料から製造された品目を提供することによって変化させることができる。ある特定の患者に対して刺激環境をカスタマイズするための知識は、理学療法や作業療法の分野の当業者に公知である。
【００６７】
他の側面では、刺激環境は、脳又は脳の１領域への直接刺激を含む。米国特許第６，３３９，７２５号及び第５，６１１，３５０号に記載のように、並びに当該技術分野に公知の他の方法のように、例えば電気刺激を脳に適用することができる。あるいは、アセチルコリン、神経成長因子、神経刺激薬、神経細胞成長因子又はグリア成長因子、及び他の神経修飾剤のような薬物の局所投与によって、脳又は脳の１領域を刺激することができる。
【００６８】
当業者が認識するように、シグマリガンドを含有する用量を投与するタイミングは変化させることができる。本発明の１つの側面では、シグマ受容体リガンドは脳卒中後に投与される。リガンドの投与は、症状発症の最初の週以内、好ましくは症状発症の少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間に開始することができる。本発明の他の側面では、刺激環境への曝露と同時にシグマ受容体リガンドを患者に投与する。好ましくは、脳卒中後、患者が刺激環境に供された時点でシグマ受容体リガンドを投与し、リガンドを約１カ月〜約３カ月間投与して機能回復を容易にする。好ましくは、リガンド、及びリガンドを含む組成物を最長約１２カ月又はそれ以上投与し、より好ましくは継続的に投与する。
【００６９】
ＶＩＩ．医薬製剤及び投与様式
本明細書に記載の方法は、上記分子を含む医薬組成物を使用する。上記分子はＡＧＹ−９４８０６であることが好ましく、１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤又はビヒクル、及び、場合により他の治療用及び／又は予防用成分と組み合わせる。そのような賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの液体が含まれる。非液体製剤に好適な賦形剤も当業者に公知である。医薬的に許容可能な塩を本発明の組成物に用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれる。レミントンの『薬学』、第１８版（イーストン、ペンシルバニア：Ｍａｃｋ出版社、１９９０）中の医薬的に許容可能な賦形剤及び塩に関する徹底的な議論が利用可能である。
【００７０】
更に、湿潤剤又は乳化剤、生理的緩衝物質、界面活性剤などの補助物質がそのようなビヒクル中に存在してもよい。生理的緩衝液は、事実上、薬理学的に許容可能で、製剤に所望のｐＨ、即ち、生理学的許容範囲にあるｐＨを提供するあらゆる溶液であり得る。緩衝液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。
【００７１】
意図する投与様式によって、医薬組成物は、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末剤、液剤、懸濁剤、クリーム、軟膏、ローションなどの固体、半固体又は液体剤形であり得、正確な用量の単回投与に好適な単位剤形であることが好ましい。組成物は、有効量の選択した薬物を、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含み、加えて、他の医薬物質、添加物、希釈剤、緩衝剤などを含むことができる。
【００７２】
本発明には、異性体、異性体のラセミ混合物若しくは非ラセミ混合物、又はそれらの医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含めた本発明の化合物を、１種以上の医薬的に許容可能な担体、及び、場合により他の治療用及び／又は予防用成分とともに含む、医薬組成物が含まれる。
【００７３】
一般に、本発明の化合物は、許容される投与様式によって治療上有効量で投与されるであろう。好適な用量範囲は、治療すべき疾患の重篤度、被験者の年齢及び相対的な健康、使用化合物の有効性、投与経路及び形態、投与に対する指示、並びに関与する医師の好み及び体験などの非常に多くの因子に依存する。そのような疾患を治療する当業者は、過度の実験を行うことなく、個人的知識及び本願の開示に依存して、所定の疾患に対する本発明の化合物の治療上有効量を確定することができるであろう。
【００７４】
一般に、本発明の化合物は、経口投与（口腔内及び舌下を含む）、直腸内投与、鼻腔内投与、局所投与、肺投与、膣投与又は非経口投与（筋肉内、動脈内、クモ膜下、皮下及び静脈内を含む）に好適なものを含めた医薬製剤として、又は吸入若しくは吹入による投与に好適な形態で投与されるであろう。好ましい投与様式は、苦痛の程度によって調製できる好都合の日用量を用いた静脈内又は経口投与である。
【００７５】
固体組成物に関し、慣用の非毒性固体担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書に記載のような活性化合物、及び任意の医薬添加物を賦形剤、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに、溶解又は分散させることなどによって調製することができ、溶液又は懸濁液を形成する。所望により、投与される医薬組成物は、微量の湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエートなどを含有することもできる。そのような剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であるか明らかであろう；例えば上で引用したレミントンの『薬学』を参照されたい。
【００７６】
経口投与に関し、組成物は一般に錠剤、カプセル、軟ゲルカプセルの形態をとるか、又は水溶液又は非水溶液、懸濁液又はシロップであり得る。錠剤及びカプセルが好ましい経口投与形態である。経口用錠剤及びカプセルは、一般に、１種以上の乳糖及びコーンスターチのような通常用いられる担体を含むであろう。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も典型的には加えられる。典型的には、本発明の化合物は、経口用の、毒性のない医薬的に許容可能な、乳糖、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどの不活性担体と組み合わせることができる。更に、所望により、又は必要に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、及び着色剤を混合物に導入することもできる。好適な結合剤には、デンプン、ゼラチン、グルコース又はβ−乳糖のような天然糖、コーンシロップ、アカシア、トラガカントのような天然ゴム及び合成ゴム、又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの剤形に用いられる潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。
【００７７】
したがって、例えば、カプセルを、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物、１００ｍｇのセルロース及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムとなるように、慣用の手順によって調製することができる。非常に多くの単位カプセルを、標準のツーピース硬ゼラチンカプセルそれぞれに、１００ｍｇの粉末活性成分、１５０ｍｇの乳糖、５０ｍｇのセルロース、及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムを充填することによって、調製することもできる。又は、錠剤を、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物、１５０ｍｇの乳糖、５０ｍｇのセルロース及び１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムとなるように、慣用の手順で調製することができる。非常に多くの錠剤を、用量単位が１００ｍｇの本発明の化合物であり、他の成分は０．２ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素、５ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２５０ｍｇの微晶性セルロース、１０ｍｇのデンプン及び１００ｍｇの乳糖であり得るように、慣用の手順で調製することもできる。適切なコーティングを、嗜好性を増加させるため又は吸収を遅延させるために施してもよい。
【００７８】
懸濁液を用いる場合、活性物質を、エタノール、グリセロール、水などのような経口用の毒性のない医薬的に許容可能な不活性担体、並びに乳化剤及び懸濁剤と組み合わせることができる。所望により、着香剤、着色剤及び／又は甘味剤を同様に添加してもよい。本明細書において経口製剤に導入する他の任意成分には、限定されるものではないが、保存剤、懸濁剤、増粘剤などが含まれる。
【００７９】
非経口製剤は、溶液若しくは懸濁液、注射前に液体に可溶化若しくは懸濁化するのに好適な固体形態、又はエマルジョンとして、慣用の形態に調製することができる。滅菌注射用懸濁液は、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術分野に公知の技術にしたがって製剤化されることが好ましい。滅菌注射用製剤は、毒性のない非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁液でもよい。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。更に、溶媒又は懸濁媒体として、滅菌された固定油、脂肪酸エステル又はポリオールを慣用的に用いる。更に、非経口投与には、一定レベルの用量が維持される徐放性システム又は持続放出性システムの使用も含まれ得る。
【００８０】
非経口投与には、関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路が含まれ、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有する水性及び非水性の等張滅菌注射液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むとができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。特定の非経口経路を介した投与には、滅菌シリンジ又は持続注入システムのような他の機械装置によって推進される針又はカテーテルを通して本発明の製剤を患者の体内へ導入することを含めることができる。本発明によって提供される製剤は、シリンジ、注入器、ポンプ、又は非経口投与に関して当該技術分野で認識される他の装置を用いて投与することができる。
【００８１】
好ましくは、当該技術分野に公知の技術にしたがって、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて滅菌注射用懸濁液を製剤化する。滅菌注射製剤は、毒性のない非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁液であることもできる。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。更に、滅菌された固定油、脂肪酸エステル又はポリオールが、溶媒又は懸濁媒体として慣用的に用いられる。更に、非経口投与には、一定レベルの用量が維持される徐放性システム又は持続放出性システムの使用を含めることができる。
【００８２】
非経口投与用の本発明の製剤としては、滅菌した水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びコーン油などの植物油、ゼラチン、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。そのような剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの添加物を含有することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通したろ過によって、滅菌剤を組成物に導入することによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって滅菌することができる。それらは、滅菌水、又は他の滅菌注射用媒体を使用直前に用いて製造することもできる。
【００８３】
製剤は場合により等張性剤を含有することができる。製剤は等張性剤を含有することが好ましく、グリセリンが最も好ましい等張性剤である。グリセリンを使用する場合、その濃度は当該技術分野に公知の範囲内、例えば約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬなどである。
【００８４】
非経口製剤のｐＨは、リン酸、酢酸、ＴＲＩＳ又はＬ−アルギニンなどの緩衝剤によって制御することができる。緩衝剤の濃度は、保存のあいだｐＨを標的ｐＨ±０．２ｐＨ単位に維持するのに適しているｐＨ緩衝作用を提供することが好ましい。好ましいｐＨは、室温で測定したとき約７〜約８である。
【００８５】
他の添加物、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニックＦ６８（登録商標）（ポリオキシエチレン ポリオキシプロピレン ブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような医薬的に許容可能な可溶化剤などを、場合により製剤に添加することができ、製剤がプラスチック材料に接触する場合に有用であり得る。更に、非経口製剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗菌剤及び抗真菌剤含有することができる。
【００８６】
滅菌注射液は、１以上の本発明の化合物を必要量、上に列挙した他のさまざまな成分とともに適切な溶媒中に導入し、必要に応じてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、さまざまな滅菌活性成分を、基本分散媒体及び上に列挙したものの中で必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、先にろ過滅菌した溶液から、活性成分と更なる所望の成分との粉末を生ずる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。したがって、例えば、注射による投与に好適な非経口組成物は、１．５重量％の活性成分を１０容量％のポリエチレングリコール及び水の中で撹拌することによって調製される。溶液は塩化ナトリウムで等張にし、滅菌する。
【００８７】
あるいは、本発明の医薬組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温で固体だが直腸内温度では液体の、したがって直腸で溶解して薬物を放出するであろう好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができ。そのような材料には、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、鼻腔内エアロゾル又は吸入によって投与することもできる。そのような組成物は医薬製剤の分野で周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン又は窒素のような推進剤、及び／又は他の慣用の可溶化剤若しくは分散剤を用いて生理食塩水溶液として調製することができる。
【００８９】
局所薬物送達に好ましい製剤は軟膏及びクリームである。軟膏は、典型的にはワセリン又は他の石油誘導体を基にした半固体製剤である。選択した活性物質を含有するクリームは、当該技術分野に知られるように、水中油又は油中水の粘稠液又は半固体エマルジョンである。クリーム基剤は水洗性であり、油相、乳化剤及び水相を含有する。油相は、ときに「内部」相とも呼ばれるが、通常、ワセリン、及びセチルアルコール又はステアリルアルコールのような脂肪族アルコールで構成される；水相は、必ずしもそうではないが、油相よりも量が過剰であり、一般に保水剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、通常、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両性界面活性剤である。使用される特定の軟膏又はクリームの基剤は、当業者に認識されるであろうように、最適な薬物送達を提供するものである。他の担体又はビヒクルのように、軟膏基剤は、不活性で、安定な、刺激性のない、非感作性のものである必要がある。
【００９０】
口腔内投与用製剤には、錠剤、トローチ剤、ゲルなどが含まれる。あるいは、当業者に公知の経粘膜送達システムを用いて口腔内投与を行うことができる。本発明の化合物を、慣用の経皮薬物送達システム、即ち「経皮パッチ」、つまり、薬剤が、典型的には、体表面に貼付される薬物送達装置として働く積層構造内に含有されるものを用いて、皮膚又は粘膜組織を通して送達することもできる。そのような構造では、薬物組成物は典型的には、上部裏打ち層の下にある１つの層又は「貯蔵器」内に含有される。積層装置は、唯一の貯蔵器を含有することも複数の貯蔵器を含有することもできる。１つの態様では、貯蔵器は、薬物送達のあいだ皮膚にシステムを貼付するのに役立つ医薬的に許容可能な接触接着剤のポリマーマトリックスを含む。好適な皮膚接触接着剤の例としては、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが挙げられる。あるいは、薬物含有貯蔵器と皮膚接触接着剤は分離した異なる層に存在し、接着剤は貯蔵器の下にあり、貯蔵器は上記のようなポリマーマトリックスであるか、又は液体若しくはゲルの貯蔵器であるか、又は他の形態をとり得る。装置の上部表面として働くこの積層の裏打ち層は、積層構造の主な構造要素として機能し、装置にその柔軟性の大部分を提供する。裏打ち層に選択される材料は、活性物質及び存在する他の材料に対して実質的に不透過性である必要がある。
【００９１】
医薬的に又は治療上有効量の組成物が被験者に送達されるであろう。正確な有効量は被験者間で変化し、種、年齢、被験者の大きさ及び健康、治療される状態の性質及び程度、治療を行う医師の提言、並びに投与するために選択した治療薬又はその組み合わせに依存するであろう。したがって、所定の状態に対する有効量は慣例的な実験で決定することができる。本発明の目的に関し、一般に、治療量は、少なくとも１つの用量で、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。より大きな哺乳動物では、表示される日用量は、約１ｍｇ〜３００ｍｇで１日１回以上、より好ましくは約１０ｍｇ〜２００ｍｇの範囲であり得る。被験者に、問題となる障害の徴候、症状、あるいは原因を軽減及び／又は緩和するのに要する用量で、又は生体系の他の所望の変化を引き起こすのに要する用量で、投与することができる。
【００９２】
本発明の化合物は、特に気管及び鼻腔内投与へのエアロゾル投与用に製剤化することができる。化合物は通常粒子サイズが小さく、例えば５μ以下のオーダーであろう。そのような粒子サイズは、当該技術分野に公知の手段、例えば微粉末化によって得ることができる。活性成分は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスのような好適な推進剤を有する加圧パックで提供される。エアロゾルは、レシチンのような界面活性剤を慣用的に含有することもできる。薬物の用量は、定量バルブによって制御することができる。あるいは、活性成分を、乾燥粉末の形態で、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなデンプン誘導体及びポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などの好適な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供することができる。粉末担体は鼻腔においてゲルを形成するであろう。粉末組成物は、例えばゼラチン等のカプセル又はカートリッジ又はブリスターパックの中の単位剤形で提供することができ、そこから粉末は吸入器によって投与され得る。
【００９３】
所望により、製剤は、活性成分の徐放性投与又は放出制御投与に適した腸溶コーティングして調製することができる。
【００９４】
医薬製剤は単位剤形であることが好ましい。そのような形態では、製剤は、適量の活性成分を含有する単位用量に更に分けられる。単位剤形は包装製剤であり得、包装は包装錠剤、カプセル、及びバイアル若しくはアンプル中の粉末剤のように別個量の製剤を含有する。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ剤自体であり得、あるいは適当数のこれらのものが包装された形態であり得る。
【００９５】
ＶＩＩＩ．キット
他の側面では、本発明は、キットの形態の医薬組成物に関する。キットは、組成物を含有するためのボトル、ホイル包み、又は他のタイプの容器のような容器手段を含む。典型的には、キットは、組成物投与のための指示書を更に含む。
【００９６】
他の側面では、包装キットは、投与すべき医薬製剤、即ち神経変性疾患を治療して神経再生又は機能回復を容易にするためのシグマ受容体リガンドを含有する医薬製剤、保存中及び使用前に製剤を収容するための、好ましくは密封されている、容器、並びに疾患を治療するのに有効な様式で薬物投与を行うための使用説明書を含有する。使用説明書は、典型的には、添付文書及び／又はラベル上の取扱説明書であろう。製剤は、本明細書に記載したような好適な製剤であり得る。例えば、製剤は、シグマ受容体リガンドの単位用量を含有する経口剤形であり得る。キットは、異なる用量の同一物質からなる複数の製剤を含有することができる。キットは、異なる活性物質からなる複数の製剤を含有することもできる。
【００９７】
例えば、非経口投与用キットは、ａ）上記ＡＧＹ−９４８０６及び医薬的に許容可能な担体、ビヒクル又は希釈剤を含む医薬組成物；及び、場合により、ｂ）疾患を治療又は予防するための医薬組成物の使用方法について記載する使用説明書、を含むことができる。キットは、製剤を投与するための装置（例えばシリンジ、カテーテルなど）を更に含むことができる。経口投与用キットは、例えば個々の用量を有する紙又は段ボール箱、ガラス若しくはプラスチックのビン又はジャー、再密封可能なバッグ、あるいはブリスターパックのような容器に含有される用量製剤を含むことができる。ブリスターパックは、通常、好ましくは透明なプラスチック材料の、ホイルで覆われた比較的堅い材料のシートから成る。包装工程のあいだ、錠剤又はカプセルの大きさ及び形状の凹所がプラスチックホイル内で形成される。次に、錠剤又はカプセルはその凹所内におかれ、比較的堅い材料のシートが、凹所が形成された方向とは逆のホイルの面に対してプラスチックホイルでシールされる。その結果、錠剤又はカプセルは個々に密封される。シートの強度は、手で凹所に圧力を加え、凹所の場所でシートに開口が形成され、錠剤又はカプセルがブリスターパックから取り出せるようなものであることが好ましい。そして、錠剤又はカプセルは開口部から取り出すことができる。
【００９８】
キットに、記憶補助を提供することが望ましいかもしれない。例えば、錠剤又はカプセルの隣に数の形で、その数は、そのように特定された剤形を投与すべき処方計画の日にちに対応する。そのような記憶補助の他の例は、例えば「第１週、月曜、火曜…など…第２週、月曜、火曜…など」のようにカードに印刷されたカレンダーなどである。記憶補助の他の変形物は、例えば、ディスペンスされた日用量数を示す機械的計数機、液晶読み取り装置のついたマイクロチップ記憶装置、あるいは、可聴注意シグナル、例えば日用量を最後に摂取した日にちを音読し、及び／又は次に摂取すべき日にちを思い出させる可聴注意シグナルなど、容易に明らかであろう。
【００９９】
実施例
以下は、本発明を実施するための特定態様の例である。実施例は説明目的のためにのみ提供したものであり、如何なる場合も本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いた数値（例えば量、温度など）に関して精度を確保するために努力したが、いくらかの実験誤差及びずれは当然許容されるはずである。
【０１００】
共焦点イメージは４８８及び５４３レーザーを使用したＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ又はＰａｓｃａｌ５システムのマルチトラッキングモードにてチャンネルあたり４回平均で生成された。Ｚ−ｓｔａｃｋは対物６３ｘにて生成させ、オプティカルスライスはステップサイズ０．５ミクロンで０．８ミクロンに設定した。
【０１０１】
実施例１
神経再生（機能回復）の動物モデル
月齢３カ月の雄性ＳＨＲ（高血圧自然発症）ラットを、ＭＣＡ閉塞による脳卒中の誘導に用いる。大部分の脳卒中患者は高血圧であるため、これは好ましい系統である。動物をメトヘキシタールで麻酔し、頬骨弓上で小さな頭蓋骨切除術を行なって中大脳動脈を露出させ、これを、線条体分岐のもとに対して末端で、１０−０モノフィラメントナイロン糸を用いて閉塞させる。ラットは挿管せず、カテーテルは導入しない。ＭＣＡ閉塞後、大きな再現性のある梗塞を得、強い感覚運動欠損をもたらす。動物を６時間明所／１８時間暗所のサイクルに維持し、食餌及び水は自由摂取とする。ＭＣＡＯ後２日に、ラットに化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、又はＩＸ（０．０３〜１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下又は経口投与し、対照群には生理食塩水を２〜８週間投与する。２、４、６及び８週間目に動物を回転棒試験又は円筒試験で試験する。
【０１０２】
回転棒試験：この試験は、先に記載されたように、回転棒を横断するラットの能力によって運動動作の協調及び統合に関して迅速な評価を可能にする（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＯｈｌｓｓｏｎ、（１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ２６：６４４−６４９。棒の長さは１５００ｍｍであり、床から７５０ｍｍ上に持ち上げ、右又は左に１０ｒｐｍでそれぞれ回転させる。
各方向に６〜０のスコアをつける：
６、動物は肢を滑らさずに棒を横断する；
５、動物は２、３歩、肢を滑らせて棒を横断する；
４、動物は歩みの５０％を、肢を滑らせて棒を横断する；
３、動物は５０％より多く、肢を滑らせて棒を横断する；
２、動物は少し歩いてから棒の周囲を回転する；
１、動物は横断せずに棒の周囲を回転する；
０、動物は棒から落ちる。
【０１０３】
自発的に後ろ立ちする際の前肢の左右不同性の使用に関する円筒試験
円筒試験（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ及びＴｉｌｌｅｒｓｏｎの方法（ＣＮＳ疾患の画期的モデル：分子から治療まで。Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ、Ｈｕｍａｎａ、１９９９））を改変して用いて、円筒壁のところで後ろ立ちするための前肢の使用を定量化する。ラットは幅２０ｃｍの透明なガラス円筒内を自由に動くさまを、モニターする。後肢で立ちながら、それぞれの前肢によってなされる円筒壁への接触を、ブラインドの観察者によって記録する。各動物について合計２０回の接触を記録し、左肢に障害がある、両肢に障害がある、及び障害のない、前肢接触数を、合計接触に対する割合として計算する。ラットのベースラインは、ＭＣＡＯ前にそれぞれの前肢によってなされる接触を測定することによって達成される。
【０１０４】
回転棒試験又は円筒試験を行うと、化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、又はＩＸを投与した動物群は、第１群の対照動物よりも良好に遂行する。このように、中枢神経系障害のある動物にシグマ受容体リガンドを投与すると、機能回復が高められる。
【０１０５】
実施例２
ＡＧＹ−９４８０６は機能回復を高める
ＡＧＹ−９４８０６８（ＳＡ４５０３とも表示される）、１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−（３−フェニルプロピル）−ピペラジンジヒドロクロライド、は水溶性の、効率的な脳取込みを示す選択的シグマ−１受容体アゴニストである。運動機能の回復に対するこの化合物の効果が実験的脳卒中の二つのモデルにおいて調べられた。第一のモデルにおいて、高血圧自然発症ラットは大きな皮質梗塞と重度の運動障害をもたらすｐＭＣＡＯを処置された（図１Ａ）。
【０１０６】
ＡＧＹ−９４８０６で処置したラットにおける神経再生の徴候
３５匹の高血圧自然発症ラットに永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を施し、３つの処置群に分けた。ＡＧＹ−９４８０６を０．３ｍｇ／ｋｇ（１２匹のラット）又は１．０ｍｇ／ｋｇ（１２匹のラット）の用量で、閉塞後２日に開始し、閉塞後２８日まで毎日継続して皮下投与した。対照群には（１１匹のラット）ビヒクルのみを投与した。処置開始時、及び試験中のいくつかの時点で、回転棒モデルにおけるラットのパフォーマンスを評価した。このモデルは実施例１に記載されている。これは、水平につるされた長さ１ｍの回転棒を横断することをラットに要求する。この課題は動物の感覚運動のパフォーマンスを測定する。動物の行動をビデオカメラで記録し、後に訓練技術者によって解析され、スコアを記録した。スコア範囲は０〜６であり、０は非常にパフォーマンスが悪く、６は健常動物（ＭＣＡＯなし）のパフォーマンスを示す。結果を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
０．３ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した群は、第３０日の合計平均スコアが５．２を示し、これは健常動物で予想される値に近い。
【０１０９】
したがって、この試験は、シグマ−１の選択的アゴニスト、ＡＧＹ−９４８０６を、虚血性脳卒中モデルのラットに脳卒中後２日から脳卒中後２８日までの２８日間、毎日投与する場合、機能回復、特に運動技量の回復を容易にすることを示している。梗塞サイズは影響を受けず、ビヒクル、０．３及び１．０ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した群は、それぞれ、無傷の同側性大脳半球の２４、２３及び２５．５％の測定値であった（図１Ａ）。
【０１１０】
再かん流傷害を模倣する他の実験的脳卒中モデルにおいて、ｔＭＣＡＯを９０分適用し、ラットはｔＭＣＡＯ後２日〜２８日の間ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔテストを用いて運動機能を試験された（図１Ｂ、１Ｃ）。動物はｔＭＣＡＯ後２日にＡＧＹ−９４８０６で処置された。擬手術を受けた動物は試験の間少数の間違いをし、グリッドを素早く、２〜３秒以内に、横切った。ｔＭＣＡＯ後、ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ数とグリッドを横切るに要する時間は増加し、重度の運動障害を示した。ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ数はＡＧＹ−９４８０６（１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物では検討された全ての回復時間において、ビヒクルで処置されたラットに比べて有意に少なかった、（ｐ＜０．０１；２ウエイＡＮＯＶＡ後にボンフェローニテスト）（図１Ｄ）。同様に、ＡＧＹ−９４８０６（１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は検討された全ての時間ポイントにおいて、ビヒクルで処置されたラットに比べてグリッドを約２倍早く横切った（図１Ｃ）。横切るに要する時間はビヒクルで処置された動物では２０±４でありＡＧＹ−９４８０６で処置されたラットは１０±３（ｐ＜０．０５；２ウエイＡＮＯＶＡ後にボンフェローニテスト）であった。
【０１１１】
皮質及び皮質下の組織損傷と運動機能障害をもたらすｆｌｕｉｄ ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎにより誘導された実験的外傷性脳損傷（ＴＢＩ）におけるＡＧＹ−９４８０６の使用が試験された。ＴＢＩに処せられたＷｉｓｔａｒラット衝撃後２日において１ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６を皮下投与し、その後３週間にわたって毎日処置し、１４日目と２１日目に感覚運動機能を試験した。ＡＧＹ−９４８０６で処置した動物は平均機能スコアが４．５であり、正常範囲内であり、一方ビヒクルで処置された群は有意に低いスコアで、回復１４日目及び２１日目でそれぞれ３及び２であった（ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）、（図１Ｄ）。コンポジットスコアもビヒクル処置動物での平均１８から最高スコア２４の平均２１．５に有意に改善された（図１Ｅ）。
【０１１２】
これらを併せると、これらのデータはシグマ−１受容体リガンドＡＧＹ−９４８０６での処置は、処置が損傷の２日後に始まり２乃至４週間続けるときに、実験的脳損傷の３つの異なるモデルにおいて感覚運動機能を有意に改善することを示す。
【０１１３】
実施例３
ＡＧＹ−９４８０６で処置したラットにおける神経再生のさらなる徴候
円筒試験
【０１１４】
４３匹の高血圧自然発症ラットに永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を施し、３つの処置群に分けた。ＡＧＹ−９４８０６を０．１ｍｇ／ｋｇ（１４匹のラット）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（１４匹のラット）の用量で、閉塞後２日に開始し、１４日間毎日継続して経口投与した。対照群には（１５匹のラット）ビヒクルのみを投与した。処置開始時及び試験中のいくつかの時点に、円筒試験におけるラットのパフォーマンスを評価した。この試験は実施例１に記載されている。動物の感覚運動パフォーマンスを測定する。試験中のラットのパフォーマンスを、永久ＭＣＡＯ前１日、そして永久ＭＣＡＯ後１４日、２８日及び５９日に評価した。ラットが幅２０ｃｍの透明なガラス円筒内を自由に動くさまを、モニターした。後肢で立ちながら、それぞれの前肢によってなされる円筒壁への接触を、ブラインドの観察者が記録した。各動物について合計２０回の接触を記録し、左肢に障害がある、両肢に障害がある、及び障害のない前肢接触数を、合計接触に対する割合として計算した。結果を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
前肢の使用の左右不同性（左／右の％差）は永久ＭＣＡＯの結果である。ＭＣＡＯ前の動物は、左右不同性の行動を示さなかった。ビヒクルで処置した動物は、観察期間中左右不同のままであった。０．３ｍｇ／ｋｇのＡＧＹ−９４８０６で処置した動物は、前肢の使用の左右不同性が、測定した全ての時点でＭＣＡＯ前レベルまで減少した。
【０１１７】
したがって、この試験は、シグマ−１の選択的アゴニスト、ＡＧＹ−９４８０６を、虚血性脳卒中モデルのラットに脳卒中後２日から毎日、１４日間投与すると、機能回復、特に運動技量の回復を容易にすることを示している。
【０１１８】
実施例４
シグマ−１受容体活性化は神経突起生長を高めスパイン形態を変化させる
脳卒中後の感覚運動機能の改善は生き残っている組織の可塑性を高めることに依存する。皮質ニューロン及び海馬ニューロンにおけるそれぞれインビトロでのＡＧＹ−９４８０６による処置における神経突起生長及び樹状形態が決定された。
【０１１９】
神経突起生長。初代ニューロンカルチャーを調製し、０．８×１０４細胞／ウエルの密度で９６孔プレートのＢ２７含有神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｒｕｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、３時間にわたって３７℃で５％ＣＯ２中で付着させた。神経突起生長は、所望のインキュベーション時間、異なるＡＧＹ−９４８０６濃度でニューロンをインキュベートして、誘導した。実験の終了時にニューロンカルチャーを固定し染色し、神経突起形成を光学画像システム（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量した。集団中の全ての細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて同定し、ニューロンはチュービリンの神経形に対する一次抗体及び、緑色蛍光を発する細胞体及び神経突起をもたらすフルオロフォアＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５８８を結合した二次抗体を用いた間接免疫蛍光法で標識する。神経突起生長はつぎに画像解析アルゴリズム（Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量した。
【０１２０】
初代海馬カルチャー調製。海馬初代カルチャーを調製し、２０細胞／ｍｍ２でポリリジンコートカバーグラス上にプレートし、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ（Ｂ２７、０．５ｍＭ Ｌグルタミン及び１００Ｕペニシリン／ストレプトアビジン／ｍｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ及び１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２及び５μＭシトシンアラビノシド添加、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生長させた。カルチャーは実験前にインビトロで７〜１０日間生長させた。Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ（Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）ＩＶＩの温度制御かん流システムに載置し、初代細胞カルチャーにおいてＧｉｓｓｅｌｓｓｏｎら、２００５に基づいて実施した。生長メディウムをかん流ポンプＭＳ−Ｒｅｇｌｏ（Ｉｓｍａｔｅｃ ＳＡ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて２６０μｌ／分のかん流速度により無酸素ｉＣＳＦかん流メディウムに変更した。クラーク電極（Ｃｏｎｓｏｒｔ ｚ９２１、Ｔｕｍｈｏｕｔ、ベルギー）を用いてかん流メディウムの酸素含量をモニターした。細胞死の評価はｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（１０μｇ／ｍｌ）で判定した。
【０１２１】
コマ取り顕微鏡検査法及びスパイン分類。樹状突起の形態変化はコマ取り画像法で検査した。取得及び分析はＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ−８１蛍光顕微鏡にマウントした冷却デジタルカメラ（Ｆ−ｖｉｅｗ）を制御するソフトウエアＳｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＩＳ（ＡｎａｌｙＳＩＳ Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｏｒｐ、ドイツ）を用いて実施した。専用ＧＦＰフィルター及び自然濃度フィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ． Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）を用いて光毒性及びブリーチングを最小化した。
【０１２２】
シグマ−１受容体発現はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを初代皮質ニューロンにエレクトロポレーション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｍａｘａ）により導入してノックダウンした。新鮮な分離された初代皮質ニューロン（４．８×１０６ウエル）をｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎバッファーに再懸濁した。シグマ−１受容体特異的（ＧＧＣＵＵＧＡＧＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＡ）又はスクランブル化（ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＵＣＡＡＵＵ）ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを添加し、再懸濁ニューロンをＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍ Ｇ−１３を用いてエレクトロポレートした。シグマ−１受容体ノックダウン下におけるＡＧＹ−９４８０６誘導神経突起生長を測定するために、化合物を最終濃度３μＭとなるように添加し、細胞を３日間、化合物存在下にインキュベートした。受容体ノックダウンの程度を評価するために、細胞を１００μｌリシスバッファー中で超音波処理で破砕し、４−２０％トリスグリシンゲルに流した。シグマ−１受容体タンパクレベルはラットのシグマ−１受容体配列中のアミノ酸１４４−１６２に該当するヘプチド「ＥＶＹＹＰＧＥＴＶＶＨＧＰＧＥＡＴＤＶ」を認識する選択的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで検出した。
【０１２３】
３μＭＡＧＹ−９４８０６は有意に平均神経突起長さ（図２Ａ）を、３μＭＡＧＹ−９４８０６による皮質ニューロン処置後２日及び３日において、２倍以上に増加させた（ｐ＜０．０１；Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔ）（図２Ｂ）。カルチャー中において海馬ニューロンの神経突起の生長及び分岐もまた１μＭＡＧＹ−９４８０６により高められた（データを示さない）。シグマ−１受容体（ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ））処置は有意にシグマ−１受容体タンパクレベルを、スクランブルｓｉ−ＲＮＡ配列（ｓｉ（ｓｃｒ））に比べて減少させた、（図２Ｃ、挿入）。ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ）による初代皮質ニューロンにおけるシグマ−１受容体ｍＲＮＡのノックダウンは有意に神経突起生長を、ｓｉ（ｓｃｒ）に比べて、ビヒクル処置カルチャー及びＡＧＹ−９４８０６（３μＭ）処置カルチャーの両方において、インビトロ２日後において、減少させた（図２Ｃ）。さらに、ｓｉ（Ｓｉｇ１Ｒ）は神経突起生長に対するＡＧＹ−９４８０６の刺激効果を完全に破壊した（図２Ｄ）。
【０１２４】
従って、ＡＧＹ−９４８０６は、シグマ−１受容体の刺激を通して、神経突起生長及び分岐を高め、カルチャー中において皮質及び海馬ニューロンのスパイン形態における可塑性を誘発する。
【０１２５】
実施例５
遺伝子発現研究
ルンド大学の動物実験に関する倫理委員会は実験プロトコールを承認した。Ｍｏｌｌｅｇａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｅｊｂｙ、デンマークから入手した月齢６カ月の雄性ＳＨＲ（高血圧自然発症ラット）を、２カ月前及び術前に標準ケージ（５５０×３５０×２００ｍｍ、各ケージにラット３〜４匹）に収容し、メトヘキシタール ナトリウム（Ｂｒｉｅｔａｌ、３７℃）５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内麻酔した。小さな開頭術によって右ＭＣＡにアクセスし、線条体動脈末端で動脈を連結し、新皮質梗塞を引き起こした。平均手術時間は約２０分であり、体温は３７℃付近に維持された。術後に、ラットを個々のケージに２４時間維持した。ＭＣＡ閉塞（ＭＣＡＯ）を受けたラットは、標準環境（ＳＥ）に戻すか、又は水平及び垂直のボード、鎖、ブランコ、木製ブロック、並びに大きさ及び材質の異なる物体を備えた大きな縦型エンリッチ環境（ＥＥ）ケージ（８１５×６１０×１，２８０ｍｍ）においた。ボードと可動性物体とのあいだの距離を１週間に２回変化させた。擬似群には、ＭＣＡＯを起こさずに擬似手術を施し、標準環境においた。全ての実験群において、遺伝子発現の終点解析として回復の１２日及び６０日目を選択した。研究は６つの実験群を用いて行われ、各群は６〜８匹の動物で構成された。
【０１２６】
１２日及び６０日後に各実験群の動物を屠殺し、ＲＮＡ精製及び標的調製のために、脳の内側、吻側及び前頭葉、並びに海馬及び線条体領域の組織を単離した。ラット皮質ｃＤＮＡライブラリー由来の５０，０００クローンから成るｃＤＮＡアレイを、対象動物、標準ＭＣＡＯ動物及びエンリッチ環境動物から得た標識標的核酸とハイブリダイズさせた。得られた遺伝子発見アレイデータのバイオインフォマティクス解析後、上方制御された約３４００遺伝子を選択した。各それぞれのアレイフィルターに関する平均空ウェル値によって生クローンデータを正規化した。次にこれらの値を近似の正規性まで変換した（ｌｏｇ２＋１）。その後の統計解析のために全ての複製をプールした。各脳領域（前頭、内側、吻側、海馬及び線条体）に関し、３つの実験条件（エンリッチ環境、脳卒中及び対照）の時点を主成分分析（ＰＣＡ）で解析した。範囲外のデータポイントをデータセットから取り除いた。次に、所定の脳領域及び時点内の実験条件間のクローンの挙動に関してＡＮＯＶＡを実施した。ＡＮＯＶＡの結果は、ｐ値＜０．０５のクローンに関してフィルターをかけた。次に、このフィルターをかけたＡＮＯＶＡリストをＴｕｋｅｙ ＨＳＤ試験で解析し、クローンの発現パターンを決定した。
【０１２７】
１．８倍以上に上方制御された発現、及び変動係数（ｃｖ）＞０．２に基づいて選択した。選択したクローンをとり、ＰＣＲで増幅し、プロファイリングアレイのためにナイロンメンブレン上に再びプリントした。プロファイリングアレイは、回復期間が１２日及び６０日のさまざまな皮質及び皮質下領域由来のプローブで調査した。更なる解析のため、上方制御されたクローンを選択した。
【０１２８】
発見及びプロファイリングアレイからのデータの解析により、虚血性脳卒中の病態生理学における潜在的メカニズム経路、及びエンリッチ環境後の機能回復の細胞内メカニズムの同定が可能になった。この解析には、調節されたクローンの主成分分析、及び同様の発現プロファイルを有する調節された遺伝子のクラスター化が含まれた。主成分分析は、遺伝子クラスターのセット間で因果関係をもらたす。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に対する潜在的介入標的としての調節された遺伝子の選択には、限定されるものではないが、配列アノテーション、発現プロファイル、ＣＮＳ疾患の病理における生物学的関連性のメカニズム経路内への遺伝子の配置、特定遺伝子の調節を対象とする薬物を開発するための技術的実行可能性（即ち薬物化能力）、ＣＮＳ又は他の臓器の病理における遺伝子の公知の生物学的役割を含めた一連の基準が含まれた。
【０１２９】
ＥＥアレイデータの解析は、動物をエンリッチ環境においた場合、標準環境と比較して、線条体及び前頭葉では１型シグマ受容体ｍＲＮＡは上方制御されるが、内側皮質では１型シグマ受容体ｍＲＮＡは下方制御されることを示している。したがって、エンリッチ環境を適用して脳を刺激すると、感覚運動機能の制御に重要な脳領域において１型シグマ受容体の発現を誘導する。
【０１３０】
実施例６
シグマ−１受容体はニューロンにおいてＪＮＫ及びｐ３２シグナル伝達を活性化する
初代神経細胞カルチャーを密度が０．８×１０４細胞において９６孔ウエルプレートのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養した。細胞は１０μＭの選択的キナーゼ阻害剤（ＪＮＫ用にＳＰ６００１２５、ｐ３８用にＳＢ２０３５８０、ＥＲＫ用にＵ０１２６及びＰＩ３キナーゼ用にＬＹ２９４００２、すべてＴｏｃｒｉｓから）で１時間、プレインキュベートした後、３μＭＡＧＹ−９４８０６又はビヒクル（０．０３％ＤＭＳＯ）を添加した。カルチャー中で２日後神経突起生長を、記載のとおりに決定した。ｃ−ｊｕｎリン酸化研究のために、初代皮質ニューロンをプレートし、３μＭＡＧＹ−９４８０６で３時間後にカルチャー中で処置した。ｃ−ｊｕｎリン酸化に対する効果はＡＧＹ−９４８０６投与の５、１５及び３０分後に測定された。細胞を集め、氷上で破砕し、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＮａＦ、２０ｍｍＮａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭＮａ３ＶＯ４、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコレート、１ｍＭＰＭＳＦ、及び１：２００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ２７１４）からなるホモジェナイズバッファー中で４℃にてスピンダウンした。ｃ−ｊｕｎ及びリン酸化ｃ−ｊｕｎの両方を条件あたり２０μｇの全タンパクを含有する試料中で、抗ｃ−ｊｕｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃９１６２）又は抗リン酸化ｃ−ｊｕｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃９２６１）を、それぞれ製造者の推奨に従って１：１０００に希釈して用いて、検出した。細胞破砕物はつぎにホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を１：２０００に希釈したものとインキュベートした。免疫反応性をＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＃ＲＰＮ２１３２）を用いた強化化学ルミネッセンスにより視覚化した。
【０１３１】
対照カルチャー中で、３μＭＡＧＹ−９４８０６は無処置カルチャーと比べて２倍以上（ｐ＜０．０１；ボンフェローニ／ダンテスト）神経突起長を増加させた（図３Ａ）。ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（１０μＭ）及びｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）は、それぞれ神経突起長を６２±１μｍ及び６３±９μｍに、ＡＧＹ−９４８０６処置対照群と比べて約８０％、減少させた。これら２群における神経突起生長の程度は対応する対照群から統計的に異ならなかった。ＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０μＭ）及びＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０μＭ）は効果がなかった。さらに、ＡＧＹ−９４８０６は初代皮質ニューロン中におけるｃ−ｊｕｎリン酸化レベルを約２倍（Ｐ＜０．０５；ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ；図３Ｂ）増加させた。従って、ＡＧＹ−９４８０６媒介神経突起生長におけるシグマ−１受容体活性化はＪＮＫ／ｐ３８活性化の上流である。
【０１３２】
実施例７
錠剤の調製
式ＩＶの化合物（１０．０ｇ）を乳糖（８５．５ｇ）、ヒドロキシプロピルセルロースＨＰＣ−ＳＬ（２．０ｇ）、ヒドロキシプロピルセルロースＬ−ＨＰＣ、ＬＨ−２２（２．０ｇ）及び純水（９．０ｇ）と混合し、得られる混合物を顆粒化、乾燥及びグレーディングに供し、得られる顆粒をステアリン酸マグネシウム（０．５ｇ）と混合して錠剤製造に供し、錠剤あたり１０ｍｇの式ＩＶの化合物を含有する錠剤を得る。
【０１３３】
実施例８
被験者への投与
実施例７で調製した錠剤を時間０に被験者に与える。２４時間ごとに錠剤１錠を１週間与える。３錠目を投与した後、被験者を神経変性イベントに曝す。処置被験者は、未処置被験者に比べて重篤でない神経障害の症状を示す。
【０１３４】
本願において参照した全ての公開特許及び出版物は本明細書中にその全体が援用される。
【０１３５】
本発明の好ましい態様について説明し、記載したが、本発明の精神及び範囲を逸脱することなくさまざまな改変をすることが可能であることは認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
図面の簡単な説明
【図１】図１はＡＧＹ−９４８０６が永久及び一時的ＭＣＡ閉塞及び脳外傷による脳障害後の機能回復を高めることを説明する。永久に閉塞されたＭＣＡを有するＳＨＲラットは毎日生理食塩水（Ｖｈ）（ｎ＝７）、０．３（ｎ＝９）又は１ｍｇ／ｋｇ皮下投与（ｎ＝１０）で２８日間、閉塞から２日後に開始して、処置された。（図１Ａ）：皮質部位に位置する梗塞（左パネル、星）は、群において有意に異ならなかった（右パネル）。（図１Ｂ及び１Ｃ）：ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ ｔｅｓｔにより評価した９０分間のＭＣＡの一時的閉塞後の回復。パフォーマンスはなされたｆｏｏｔ ｆａｕｌｔの数で表示され（図１Ｂ）及び水平に吊り下げた梯子を横切るに要する時間で表示される（図１Ｃ）。生理食塩水（ｎ＝１３）、０．３（ｎ＝１５）又は１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１１）ＡＧＹ９４８０６皮下投与による処置がＭＣＡＯ後の回復の２日後から開始され毎日２８日間継続された。数値は平均±ＳＥＭである。統計的差（＊＊及び＊はｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５、２要因分散分析（２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びその後のボンフェローニテスト）。ＡＧＹ９４８０６（１．０ｍｇ／ｋｇ）による処置はこの試験における測定された全てのタイムポイントでパフォーマンスを改善した。（図１Ｄ及びＥ）：ＡＧＹ９４８０６はそれぞれ、機能回復（回転棒ｒｏｔａｔｉｎｇ ｐｏｌｅ）及び外傷による脳損傷後のコンポジットニューロスコアを高める。動物は、それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ経皮投与のＡＧＹ９４８０６（ｎ＝１０）又は生理食塩水（ｎ＝９）で処置された。メジアンは（ドット）で、第２５及び第７５パーセンタイルは（ボックス）で、最高値及び最低値は（バー）で示す。（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー）。
【０１３７】
【図２】図２はＡＧＹ−９４８０６が神経突起生長及び分岐、並びにスパインヘッドモーフィングを高めることを説明する。分離された皮質ニューロンをプレーティング時にＡＧＹ９４８０６の存在している（ＡＧＹ９４８０６）又は存在していない（コントロール）媒質で処置した。（図２Ａ）：３μＭ ＡＧＹ９４８０６を含まない及び含む媒質で処置した抗神経チューブリン抗体で染色された皮質細胞の顕微鏡写真。（図２Ｂ）：３μＭ ＡＧＹ９４８０６は、コントロールカルチャーと比較した場合、カルチャー中において処置後２日及び３日後神経突起生長を有意に高める。データは異なる日に実施された４−８ウエルを含む３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。（＊＊はｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ ｔｅｓｔ）。（図２Ｃ）：初代皮質ニューロンにおいてｓｉＲＮＡでＳｉｇ１Ｒタンパクをノックダウンすると２日目に神経突起生長が、スクランブルシークエンス（ｓｃｒ）で処置した場合と比べて、コントロールカルチャーと３μＭ ＡＧＹ９４８０６で処置したカルチャーの両方において、減少する。データは平均±ＳＤ（＊＊＊はｐ＜０．００１、スチューデント、ｔ−検定）。ＡＧＹ９４８０６はスパインヘッド形態を変える。挿入写真：Ｓｉｇ１Ｒのノックダウンはウエスタンブロット上の受容体タンパクレベルを減少する（３つのうちの１ブロットを示した）。（図２Ｄ）：初代皮質ニューロンにおいてｓｉＲＮＡでＳｉｇ１Ｒタンパクをノックダウンすると２日目に神経突起生長が、スクランブルシークエンス（ｓｃｒ）での処置に比べて、コントロールカルチャーと３μＭ ＡＧＹ９４８０６で処置したカルチャーの両方において、減少する。データは平均±ＳＤ（＊＊＊はｐ＜０．００１、スチューデント、ｔ−検定）。
【０１３８】
【図３Ａ】図３は異なるプロテインキナーゼ阻害剤の神経突起生長及びｃＪｕｎリン酸化に対する効果を説明する。（Ａ）：皮質ニューロンカルチャーを３μＭ ＡＧＹ９４８０６に対して１０μＭのＪｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤ＳＰ６００１２５、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０、１０μＭのＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２８及び１０μＭのＰＩ−３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２の添加並びに無添加で、プレーティング時に処置した。神経突起長さを処置後２日で評価した。データは４−８ウエルの３−６の独立実験からの平均±ＳＤである。ＮＳは非有意を示し＊＊はＡＧＹ９４８０６処置対照群からの有意差（ｐ＜０．０１、１要因分散分析及びその後のボンフェローニ／ダン検定）を示す。
【図３Ｂ】（Ｂ）：皮質ニューロンカルチャーを１５分間３μＭ ＡＧＹ−９４８０６並びにｃＪｕｎ及びリン酸化ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃＪｕｎ）に対する抗体でプローブされた細胞溶解物で処置した。典型的ウエスタンブロットを示した。ＡＧＹ−９４８０６は初代皮質ニューロンにおいてｃ−ｊｕｎリン酸化レベルを約２倍増加させた（ｐ＜０．０５；ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＹ−９４８０６をＪＮＫ／ｐ３８経路が活性化される細胞に接触させることを含む、ＪＮＫ／ｐ３８経路の活性化方法。
【請求項２】
ＡＧＹ−９４８０６が、約０．０１μＭから約１００μＭの濃度である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＧＹ−９４８０６が、約０．１μＭから約１０μＭの濃度である請求項２記載の方法。
【請求項４】
活性化が神経突起の生長を高める請求項１記載の方法。
【請求項５】
神経変性疾患発症後の神経発生を容易にするための哺乳動物被験者の治療方法であって、医薬的有効量のＡＧＹ−９４８０６又はその塩若しくは溶媒和物を被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
神経再生の徴候について被験者を評価することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
神経再生の徴候が被験者の機能回復である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
機能回復が運動技量、認知技量、言語、知覚又は感覚機能の回復である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
機能回復が運動技量の回復である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
機能回復が認知技量の回復である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
神経再生の徴候が被験者の脳又は脊髄における構造変化である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
神経再生の徴候が見られるまでＡＧＹ−９４８０６を被験者に反復投与する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
ＡＧＹ−９４８０６を毎日投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
神経変性疾患が虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項１５】
虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷後少なくとも２４時間に治療が開始される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷後少なくとも４８時間に治療が開始される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
被験者を刺激環境に曝すことを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物被験者がヒトである、請求項５記載の方法。
【請求項１】
ＡＧＹ−９４８０６をＪＮＫ／ｐ３８経路が活性化される細胞に接触させることを含む、ＪＮＫ／ｐ３８経路の活性化方法。
【請求項２】
ＡＧＹ−９４８０６が、約０．０１μＭから約１００μＭの濃度である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＧＹ−９４８０６が、約０．１μＭから約１０μＭの濃度である請求項２記載の方法。
【請求項４】
活性化が神経突起の生長を高める請求項１記載の方法。
【請求項５】
神経変性疾患発症後の神経発生を容易にするための哺乳動物被験者の治療方法であって、医薬的有効量のＡＧＹ−９４８０６又はその塩若しくは溶媒和物を被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
神経再生の徴候について被験者を評価することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
神経再生の徴候が被験者の機能回復である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
機能回復が運動技量、認知技量、言語、知覚又は感覚機能の回復である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
機能回復が運動技量の回復である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
機能回復が認知技量の回復である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
神経再生の徴候が被験者の脳又は脊髄における構造変化である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
神経再生の徴候が見られるまでＡＧＹ−９４８０６を被験者に反復投与する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
ＡＧＹ−９４８０６を毎日投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
神経変性疾患が虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項１５】
虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷後少なくとも２４時間に治療が開始される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
虚血性脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷後少なくとも４８時間に治療が開始される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
被験者を刺激環境に曝すことを更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物被験者がヒトである、請求項５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５１６６５０（Ｐ２００９−５１６６５０Ａ）
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８９５９（Ｐ２００８−５３８９５９）
【出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３５８０
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（３０１００４７４３）株式会社エムズサイエンス (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３５８０
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（３０１００４７４３）株式会社エムズサイエンス (8)
【Ｆターム（参考）】
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