肝炎の治療剤もしくは予防剤
【課題】本発明は、肝炎、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に対して有効に作用しうる新規な治療剤もしくは予防剤を提供することを課題とする。
【解決手段】ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤による。ＣＣＬ２０に対する抗体の投与により、動物モデルでの生存率および病理所見において改善が認められ、肝炎に対する予防効果および治療効果が認められた。
【解決手段】ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤による。ＣＣＬ２０に対する抗体の投与により、動物モデルでの生存率および病理所見において改善が認められ、肝炎に対する予防効果および治療効果が認められた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＣＬ２０抗体を有効成分とする肝炎の治療剤もしくは予防剤に関する。特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に有効な治療剤もしくは予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎はウイルス感染、アルコール摂取、薬剤または自己免疫等が原因で肝臓に炎症が起こる病気である。
【０００３】
肝炎の中でも、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎は自然治癒することがなく、感染すると約７０％が慢性肝炎に移行し、その後肝硬変に至る。そして、ウイルスの持続感染によってＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）値の高値が持続すると徐々に肝線維化が進行し、肝がんの発生率が上昇する（非特許文献１）。日本において約９０％の肝がんがＣ型肝炎ウイルスが原因とされている。しかし、血中のウイルス量は肝臓の炎症の程度とは相関せず、Ｃ型肝炎の発症機序には宿主であるヒト免疫機構の関与が大きいと考えられており、強い肝臓の臓器障害の発生にＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献２）。また、薬剤の使用やウイルスの感染などにより誘引され、自己リンパ球が肝細胞と免疫反応を起こす自己免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis：ＡＩＨ）や薬剤の使用によるアレルギー反応で誘引される薬剤性肝炎においても、同様に強い肝臓の臓器障害の発症にＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要であることが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００４】
このような肝炎の治療薬としては、Ｃ型肝炎の場合には現在インターフェロンと抗ウイルス剤が用いられているが、日本において最も多数をしめるGenotype1bの慢性Ｃ型肝炎においては、約５０％の有効性しかなく、炎症が持続する例では肝硬変、さらには肝癌に進展し、生命予後に重大な影響を及ぼす。また、自己免疫性肝炎ではステロイド剤が用いられているが、ステロイドの長期の使用が余儀なくされ、炎症コントロールができずに肝硬変、さらには肝移植が必要とされる状態にいたる例も少なくない。以上の医療背景から、新しい肝炎治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
抗体関連産業は、従来細胞融合によるモノクローナル抗体作製技術を基盤として発展してきた。近年、ファージディスプレイ系を用いた抗体ライブラリー作製技術が開発され、とりわけヒト抗体単離に大きな力を発揮している。基盤技術としてファージディスプレイ系を駆使することで、臨床に役立つ各種感染症に対するヒト抗体の単離が可能となった。例えば、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスに対して非常に強い中和活性を示すヒト抗体をそれぞれ数種類作製することに成功している（第24回日本分子生物学会年会で発表「抗体ライブラリーからのヒト型抗インフルエンザウイルス中和抗体の単離」、第50回日本ウイルス学会で発表「ヒト抗体ライブラリーからの水痘帯状疱疹ウイルス中和抗体の単離」）。近年では、モノクローナル抗体は、短期間で且つ効率的に調製することが可能であり、ヒト型化抗体についても容易に調製することができる。このような抗体は研究用試薬、診断用試薬、各種物質モニター用試薬として多数開発販売されており、更には治療用抗体の開発、生産が進められている。
【０００６】
本発明者らは、先に自己免疫性肝炎を自然発症するモデル動物として、新生仔期胸腺切除（neonatal thymectomy：ＮＴｘ）したＢＡＬＢ／ｃ系統のＰＤ−１遺伝子欠損マウス（ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウス）を作製し、報告した（非特許文献５）。
【０００７】
ＣＣＲ６−ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣ／ ＭＩＰ−３α）系は、獲得免疫に関与する樹状細胞、メモリーＴ細胞、成熟Ｂ細胞を外来抗原に暴露された部位に集結させ、免疫応答を迅速に開始するために重要な役割を担っているケモカインであると考えられている（非特許文献６）。
【０００８】
ＣＣＬ２０(chemokine beta4)に対して特異的に結合する抗体について開示がある（特許文献１）。明細書中に、当該抗体の用途として、癌、炎症性疾患、創傷治癒、自己免疫疾患など数多くの一般的な疾病が羅列されている。そして、炎症性疾患の多数の例示の中の１つとして肝炎が挙げられているが、これら疾患との関連を実証するデータは何ら示されていない。２００３年に報告された「The CC chemokine CCL20 and its receptor CCR6」に関する総説である上記非特許文献６においても、また、２００８年に報告された「Chemokines and Their Receptors: Drug Targets in Immunity and Inflammation」に関する総説（非特許文献７）においても、肝炎との関連を開示する記載はない。また、ＬＡＲＣ（ＣＣＬ２０）を阻害する物質を有効成分とする慢性関節リウマチの治療剤もしくは予防剤について開示がある（特許文献２）。実施例には、ＣＣＬ２０に対するポリクローナル抗体による、リウマチ患者の単核球の遊走阻害作用が示されている。さらに、抗ＣＣＬ２０抗体による自己免疫疾患の治療について開示がある（特許文献３）。ここでは、抗ＣＣＬ２０抗体を関節リウマチの治療に使用することが記載されている。ヒトＣＣＬ２０のアミノ酸配列、核酸配列について開示がある（特許文献４）。ここでは、ＣＣＬ２０のアンタゴニストの用途として感染症や自己免疫疾患が述べられているが、具体的に疾患は特定されていない。また、哺乳動物ＣＣＲ６レセプターおよび関連試薬の新規使用について開示がある（特許文献５）。ここでは、ＭＩＰ−３α抗体が慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患に有用であることが記載されている。しかしながら、ＣＣＬ２０と肝疾患との関係について開示する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開2003/092597号パンフレット
【特許文献２】特開2002-187856号公報
【特許文献３】国際公開2007/083759号パンフレット（特開2009-96716号公報）
【特許文献４】国際公開96/05856号パンフレット
【特許文献５】特表2003-508496号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】新潟医学会雑誌、第119巻、第7号、411頁 (2005)
【非特許文献２】Clinical Science, 112: 141-155 (2007)
【非特許文献３】Autoimmunity Reviews, 3: 207-214 (2004)
【非特許文献４】Nature Reviews, 4: 489-499 (2005)
【非特許文献５】Gastroenterology, 135: 1333-1343 (2008)
【非特許文献６】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14: 409-426 (2003)
【非特許文献７】Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48:171-97 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、肝炎、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に対して有効に作用しうる新規な治療剤もしくは予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために既存の肝炎モデル動物を用いて検討し、当該モデル動物の肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞に多く発現している分子ＣＣＲ６に着目して更に鋭意検討を重ねた結果、そのリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体が肝炎の予防／治療に効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤。
２．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが該ＣＣＬ２０に特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントである前項１記載の肝炎治療剤または予防剤。
３．肝炎が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎である前項１または２記載の肝炎治療剤または予防剤。
４．肝炎が、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎または自己免疫性肝炎である前項１または２記載の治療剤または予防剤。
５．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤。
６．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法。
また、本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントの、肝炎治療剤の調製のための使用、及び、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを肝炎治療が必要な対象に有効量で投与することを含む肝炎治療方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗ＣＣＬ２０抗体は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎モデル動物に予防的もしくは治療的に使用することで、当該肝炎による死亡率を改善することができた。また、生存モデル動物の肝臓を摘出し、ホルマリン固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色し、病理学的検索を行った結果、コンロトールのアイソタイプ抗体投与モデルでは肝臓門脈域を中心に高度に浸潤する単核球細胞と正常肝細胞の壊死が認められるのに対し、本発明の抗ＣＣＬ２０抗体の投与モデルでは、単核球細胞の浸潤や正常肝細胞の壊死などのいずれの所見も著明に改善した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞でのＣＣＲ６を発現した細胞の分布を確認した図である。（参考例１）
【図２】ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを発現した細胞の分布を確認した図である。（参考例１）
【図３】同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウス、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現を確認した図である。（参考例１）
【図４】抗ＣＣＬ２０抗体を予防的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与し、肝炎発症予防効果を生存率により確認した図である。（実施例１）
【図５】抗ＣＣＬ２０抗体を予防的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与したときの生後２８日目のマウス肝臓の病理的検索を行なった結果を示す写真図である。（実施例１）
【図６】抗ＣＣＬ２０抗体を治療的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与し、肝炎治療効果を生存率により確認した図である。（実施例２）
【図７】抗ＣＣＬ２０抗体を治療的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与したときの生後２８日目のマウス肝臓の病理的検索を行なった結果を示す写真図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤に関する。本発明者らは既存の肝炎モデル動物において肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞に多く発現している分子ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが、肝炎の予防／治療に効果があることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１７】
背景技術の欄でも説明したように、本発明者らは先に自己免疫性肝炎を自然発症する新生仔期胸腺切除（neonatal thymectomy:ＮＴｘ）したＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスについて報告した（非特許文献５）。このマウスは、血清中のＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴおよび総ビリルビンが高値を示し、また、胸腺切除によるＴｒｅｇ（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞）の減少と共に、肝浸潤免疫担当細胞のＣＤ８Ｔ陽性細胞が顕著に増加している。
【００１８】
今般、本発明者らは、この肝炎モデルマウスを用いて肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞の発現分子について解析を行った。当該細胞に多く発現している分子のうちＣＣＲ６に着目し、そのＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体を用いて、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおいて、自己免疫性肝炎の発症の抑制及び治療効果を検討したところ、ＣＣＬ２０の抗体が自己免疫肝炎の予防／治療に効果があることを見出した。
【００１９】
本明細書において、ＣＣＬ２０に対する抗体とは、ＣＣＬ２０タンパク質を特異的に認識することができる免疫グロブリン（抗ＣＣＬ２０抗体）をいう。本発明における抗体とは、ポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体の何れであってもよく、特に限定されないが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、本発明の抗体は、例えば、天然型抗原、遺伝子組換抗原または抗原を発現している細胞等からなる抗原を哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体や遺伝子組換技術を用いて製造され得るモノクローナル抗体も包含する。
【００２０】
抗ＣＣＬ２０抗体を製造するための抗原は、ＣＣＬ２０の抗原性を有していれば良く、例えばＣＣＬ２０タンパク質を公知の方法に従って精製した抗原、または遺伝子工学的に調製し、精製した抗原であればよい。当該抗原は、抗原性を有するのであれば、例えばＣＣＬ２０タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、ＣＣＬ２０タンパク質の一部であってもよい。抗ＣＣＬ２０抗体は、上記抗原を用いて自体公知の方法で作製することができ、例えば特許文献１に開示する方法により作製することができる。
【００２１】
上記抗体の活性フラグメントとは、当該抗体の抗原結合部位を含むフラグメントであって、フラグメント自体でＣＣＬ２０タンパク質を特異的に認識することができるものをいう。具体的には、抗ＣＣＬ２０抗体の抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’が挙げられる。活性フラグメントは、自体公知の方法により作製することができる。
【００２２】
本発明における抗体またはその活性フラグメントは、ＣＣＬ２０タンパク質に特異的に結合し、ＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるものであることが好ましい。ＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるとは、例えば、当該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＬ２０タンパク質とＣＣＲ６との結合を阻害したり、または該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＲ６の活性化を介した細胞遊走を阻害すること等が挙げられる。
【００２３】
本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝炎治療剤または予防剤に関する。
肝炎としては、例えば、Ｂ型或いはＣ型などのウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎などが挙げられる。病態としては、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎のいずれにも適用し得る。
特に、本発明においてＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎、例えば、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎に好適に適用できる。動物モデルの肝組織浸潤ＣＤ３陽性Ｔ細胞において、臓器障害を惹起する炎症性サイトカインである、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを高度に発現した細胞の増加が認められる。更に肝組織浸潤ＣＤ３陽性Ｔ細胞のＣＤ８発現について解析したところ、ＣＤ８陰性（ＣＤ４陽性）Ｔ細胞よりもＣＤ８陽性Ｔ細胞の方がその増加は著しかった。よって、ＣＤ８陽性肝細胞は、肝障害を惹起する主因と考えられる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞が末梢免疫組織から肝臓組織に移行してくるにはケモカインとケモカインセプターの相互作用が必要であり、当該動物モデルでは、肝組織に浸潤しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において、ケモカインレセプターであるＣＣＲ６の発現が確認された。また更に、当該動物モデルでは、肝組織にケモカインであるＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現が認められる。そして、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウスに比較して、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝組織でのＣＣＬ２０のｍＲＮＡ発現が相対的に増加していることが確認された。これらの結果から、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎、例えば自己免疫性肝炎に対して効果的に作用しうる。
【００２４】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、上述の肝炎の治療薬または予防薬として使用することができる。また、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制作用を有することから、肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤としても使用することができる。また、本発明はＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法にも及ぶ。これらより、本発明の抗体またはその活性フラグメントを含む組成物は、肝炎の治療剤若しくは予防剤としての医薬組成物として使用することができる。
【００２５】
本発明による治療剤若しくは予防剤の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができるが、非経口投与、特に静脈注射、が好ましい。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００２６】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【００２７】
経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トローチ剤等が挙げられる。
【００２８】
本発明による医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよく、また、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。
【００２９】
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられる。
【００３０】
賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が、それぞれ用いられる。上記の成分は、その塩またはその水和物であってもよい。
【００３１】
例えば経口製剤は、有効成分に、賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。錠剤・顆粒剤の場合には、例えば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤等の場合は、例えばｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤等とを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００３２】
本発明による抗体の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）あたり、経口投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは１０〜１０００ｍｇ／日を、注射投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは５０〜１０００ｍｇ／日を、１回または数回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与範囲から逸脱することがある。
【実施例】
【００３３】
本発明の理解をさらに進めるために、以下に参考例および実施例を示してより具体的に説明する。まず、本発明を完成するに至ったＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスを用いた検討結果を参考例に示し、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体を有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤を用いた結果を各実施例に示す。本発明は、これらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３４】
（参考例）ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの細胞障害性Ｔ細胞におけるＣＣＲ６の発現および肝臓でのＣＣＬ２０の発現
生後３日目のＢＡＬＢ／ｃ系統のＰＤ−１ＫＯマウス（Science 291 319-322 2001）の新生仔胸腺を外科的に摘除した。２週間飼育後、自己免疫性肝炎を引き起こしているＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓を摘出し、当該肝臓から単核球を精製し、フローサイトメトリーにて、ＣＣＲ６を含む細胞表面分子と細胞内でのサイトカイン分子発現について、それぞれの分子に対する特異的抗体を用いて解析した。
【００３５】
先ず、精製した単核球をＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)で標識された抗ＣＤ３抗体を使用してFACSCantoTM IIフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）にてゲートした後、ＰＥ(phycoerythrin)標識抗ＣＣＲ６抗体およびＡＰＣｙ７(allophycocyanin-cy7)標識抗ＣＤ４抗体またはＡＰＣ(allophycocyanin)標識抗ＣＤ８抗体を使用して展開した。その結果、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウス肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれも、脾臓Ｔ細胞に比較して、ＣＣＲ６を発現した細胞の割合が増加していた （図１）。
【００３６】
同様にして、精製した単核球をＣＤ３ゲート後、ＣＤ８とＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのサイトカインにそれぞれ対応する標識抗体を使用して展開した。その結果、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯ３週齢のマウスの肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞においては、ＣＤ３陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれにおいても、臓器障害を伴う炎症惹起性サイトカインである、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを高度に発現した細胞の増加が認められた（図２）。
【００３７】
次に、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウス、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスから肝臓を摘出し、肝組織よりＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ(real-time) ＰＣＲにて、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０プライマー（ATG GCC TGC GGT GGC AAG CGT CTG（配列番号１）とTAG GCT GAG GAG GTT CAC AGC CCT（配列番号２）：Yamazaki T et al. J Immunol. 2008 181:8391-401）を用いて、ＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現を確認した。その結果、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウスに比較して、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝組織でのＣＣＬ２０のｍＲＮＡ発現が相対的に増加していた（図３）。これらの結果から、自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓への肝炎惹起性のＴ細胞の浸潤には、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０の肝臓での発現と、そのリガンド依存性に他の免疫組織から移行してくるＣＣＲ６発現Ｔ細胞の存在が重要であることが分かった。
【００３８】
（実施例１）抗ＣＣＬ２０抗体による肝炎発症抑制効果
ＣＣＬ２０を阻害することで肝への肝炎惹起性Ｔ細胞の浸潤を阻害し、肝炎発症を抑制できるか検討した。自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスは、生後約１０日頃から肝内に炎症細胞浸潤が生じ、約４−５週後には、ほぼ全例で高度の肝炎から死亡する。
【００３９】
そこで、抗ＣＣＬ２０抗体をＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに生後３日目、１０日目、１７日目および２１日目に投与した。抗ＣＣＬ２０抗体としてはマウスＣＣＬ２０ブロッキング抗体(anti-mMIP-3a/CCL20, purified rat monoclonal IgG1, R＆Dシステムズ社製, clone: 114908)を、コントロール抗体としてはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（FG Purified rat IgG1, eBioscience社製, Cat No. 16-4301-85）を各々１００μｇ、５０μｌのリン酸緩衝液に溶解し、抗体溶液を調製した。各抗体溶液を、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに上記投与スケジュールにて、計４回腹腔内注入を行なった。
【００４０】
生後２８日目における生存率を比較した。コントロール抗体投与群では、生存率が４０％であるのに比較して、ＣＣＬ２０抗体投与群では、生存率が８０％と生存率の改善を認めた（図４）。また、コントロール抗体投与群及び抗ＣＣＬ２０抗体投与群の生存マウスの肝臓を摘出し、ホルマリン固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色し、病理学的検索を行った。その結果、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では、肝臓に浸潤する単核球細胞が著明に減少し、正常肝組織構造の破壊も軽度となっていた（図５）。以上の結果から、抗ＣＣＬ２０ブロッキング抗体の投与によって、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝炎発症が抑制できることが明らかとなった。
【００４１】
（実施例２）抗ＣＣＬ２０抗体による肝炎治療効果
ＣＣＬ２０を阻害することで発症した肝炎の治療効果が得られるか検討した。自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスは、生後約４−５週後には、ほぼ全例で高度の肝炎から死亡する。
【００４２】
そこで、抗ＣＣＬ２０抗体をＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの生後１７日目および２１日目に投与した。抗ＣＣＬ２０抗体およびコントロール抗体は、実施例１に準じて使用し、抗体溶液を調製した。各抗体溶液を、上記投与スケジュールにて、計２回腹腔内注入を行った。
【００４３】
生後２８日目における生存率を比較した。この実験において、コントロール抗体投与群では、生存率が３３％であるのに比較して、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では、生存率が１００％と生存率の改善を認めた（図６）。また、生存マウスの肝臓を摘出し、実施例１と同様に病理学的検索を行った。その結果、コンロトールのアイソタイプ抗体投与マウスで認められる肝臓門脈域を中心に高度に浸潤する単核球細胞（図７矢印）と正常肝細胞の壊死（図７円内）のいずれの所見も、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では著明に改善していた（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上詳述したように、 本発明の抗ＣＣＬ２０抗体は、肝炎、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に対して、治療剤または予防剤として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＣＬ２０抗体を有効成分とする肝炎の治療剤もしくは予防剤に関する。特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に有効な治療剤もしくは予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎はウイルス感染、アルコール摂取、薬剤または自己免疫等が原因で肝臓に炎症が起こる病気である。
【０００３】
肝炎の中でも、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝炎は自然治癒することがなく、感染すると約７０％が慢性肝炎に移行し、その後肝硬変に至る。そして、ウイルスの持続感染によってＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）値の高値が持続すると徐々に肝線維化が進行し、肝がんの発生率が上昇する（非特許文献１）。日本において約９０％の肝がんがＣ型肝炎ウイルスが原因とされている。しかし、血中のウイルス量は肝臓の炎症の程度とは相関せず、Ｃ型肝炎の発症機序には宿主であるヒト免疫機構の関与が大きいと考えられており、強い肝臓の臓器障害の発生にＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献２）。また、薬剤の使用やウイルスの感染などにより誘引され、自己リンパ球が肝細胞と免疫反応を起こす自己免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis：ＡＩＨ）や薬剤の使用によるアレルギー反応で誘引される薬剤性肝炎においても、同様に強い肝臓の臓器障害の発症にＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要であることが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００４】
このような肝炎の治療薬としては、Ｃ型肝炎の場合には現在インターフェロンと抗ウイルス剤が用いられているが、日本において最も多数をしめるGenotype1bの慢性Ｃ型肝炎においては、約５０％の有効性しかなく、炎症が持続する例では肝硬変、さらには肝癌に進展し、生命予後に重大な影響を及ぼす。また、自己免疫性肝炎ではステロイド剤が用いられているが、ステロイドの長期の使用が余儀なくされ、炎症コントロールができずに肝硬変、さらには肝移植が必要とされる状態にいたる例も少なくない。以上の医療背景から、新しい肝炎治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
抗体関連産業は、従来細胞融合によるモノクローナル抗体作製技術を基盤として発展してきた。近年、ファージディスプレイ系を用いた抗体ライブラリー作製技術が開発され、とりわけヒト抗体単離に大きな力を発揮している。基盤技術としてファージディスプレイ系を駆使することで、臨床に役立つ各種感染症に対するヒト抗体の単離が可能となった。例えば、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスに対して非常に強い中和活性を示すヒト抗体をそれぞれ数種類作製することに成功している（第24回日本分子生物学会年会で発表「抗体ライブラリーからのヒト型抗インフルエンザウイルス中和抗体の単離」、第50回日本ウイルス学会で発表「ヒト抗体ライブラリーからの水痘帯状疱疹ウイルス中和抗体の単離」）。近年では、モノクローナル抗体は、短期間で且つ効率的に調製することが可能であり、ヒト型化抗体についても容易に調製することができる。このような抗体は研究用試薬、診断用試薬、各種物質モニター用試薬として多数開発販売されており、更には治療用抗体の開発、生産が進められている。
【０００６】
本発明者らは、先に自己免疫性肝炎を自然発症するモデル動物として、新生仔期胸腺切除（neonatal thymectomy：ＮＴｘ）したＢＡＬＢ／ｃ系統のＰＤ−１遺伝子欠損マウス（ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウス）を作製し、報告した（非特許文献５）。
【０００７】
ＣＣＲ６−ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣ／ ＭＩＰ−３α）系は、獲得免疫に関与する樹状細胞、メモリーＴ細胞、成熟Ｂ細胞を外来抗原に暴露された部位に集結させ、免疫応答を迅速に開始するために重要な役割を担っているケモカインであると考えられている（非特許文献６）。
【０００８】
ＣＣＬ２０(chemokine beta4)に対して特異的に結合する抗体について開示がある（特許文献１）。明細書中に、当該抗体の用途として、癌、炎症性疾患、創傷治癒、自己免疫疾患など数多くの一般的な疾病が羅列されている。そして、炎症性疾患の多数の例示の中の１つとして肝炎が挙げられているが、これら疾患との関連を実証するデータは何ら示されていない。２００３年に報告された「The CC chemokine CCL20 and its receptor CCR6」に関する総説である上記非特許文献６においても、また、２００８年に報告された「Chemokines and Their Receptors: Drug Targets in Immunity and Inflammation」に関する総説（非特許文献７）においても、肝炎との関連を開示する記載はない。また、ＬＡＲＣ（ＣＣＬ２０）を阻害する物質を有効成分とする慢性関節リウマチの治療剤もしくは予防剤について開示がある（特許文献２）。実施例には、ＣＣＬ２０に対するポリクローナル抗体による、リウマチ患者の単核球の遊走阻害作用が示されている。さらに、抗ＣＣＬ２０抗体による自己免疫疾患の治療について開示がある（特許文献３）。ここでは、抗ＣＣＬ２０抗体を関節リウマチの治療に使用することが記載されている。ヒトＣＣＬ２０のアミノ酸配列、核酸配列について開示がある（特許文献４）。ここでは、ＣＣＬ２０のアンタゴニストの用途として感染症や自己免疫疾患が述べられているが、具体的に疾患は特定されていない。また、哺乳動物ＣＣＲ６レセプターおよび関連試薬の新規使用について開示がある（特許文献５）。ここでは、ＭＩＰ−３α抗体が慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患に有用であることが記載されている。しかしながら、ＣＣＬ２０と肝疾患との関係について開示する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開2003/092597号パンフレット
【特許文献２】特開2002-187856号公報
【特許文献３】国際公開2007/083759号パンフレット（特開2009-96716号公報）
【特許文献４】国際公開96/05856号パンフレット
【特許文献５】特表2003-508496号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】新潟医学会雑誌、第119巻、第7号、411頁 (2005)
【非特許文献２】Clinical Science, 112: 141-155 (2007)
【非特許文献３】Autoimmunity Reviews, 3: 207-214 (2004)
【非特許文献４】Nature Reviews, 4: 489-499 (2005)
【非特許文献５】Gastroenterology, 135: 1333-1343 (2008)
【非特許文献６】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14: 409-426 (2003)
【非特許文献７】Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48:171-97 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、肝炎、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に対して有効に作用しうる新規な治療剤もしくは予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために既存の肝炎モデル動物を用いて検討し、当該モデル動物の肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞に多く発現している分子ＣＣＲ６に着目して更に鋭意検討を重ねた結果、そのリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体が肝炎の予防／治療に効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤。
２．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが該ＣＣＬ２０に特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントである前項１記載の肝炎治療剤または予防剤。
３．肝炎が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎である前項１または２記載の肝炎治療剤または予防剤。
４．肝炎が、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎または自己免疫性肝炎である前項１または２記載の治療剤または予防剤。
５．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤。
６．ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法。
また、本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントの、肝炎治療剤の調製のための使用、及び、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを肝炎治療が必要な対象に有効量で投与することを含む肝炎治療方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗ＣＣＬ２０抗体は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎モデル動物に予防的もしくは治療的に使用することで、当該肝炎による死亡率を改善することができた。また、生存モデル動物の肝臓を摘出し、ホルマリン固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色し、病理学的検索を行った結果、コンロトールのアイソタイプ抗体投与モデルでは肝臓門脈域を中心に高度に浸潤する単核球細胞と正常肝細胞の壊死が認められるのに対し、本発明の抗ＣＣＬ２０抗体の投与モデルでは、単核球細胞の浸潤や正常肝細胞の壊死などのいずれの所見も著明に改善した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞でのＣＣＲ６を発現した細胞の分布を確認した図である。（参考例１）
【図２】ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを発現した細胞の分布を確認した図である。（参考例１）
【図３】同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウス、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現を確認した図である。（参考例１）
【図４】抗ＣＣＬ２０抗体を予防的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与し、肝炎発症予防効果を生存率により確認した図である。（実施例１）
【図５】抗ＣＣＬ２０抗体を予防的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与したときの生後２８日目のマウス肝臓の病理的検索を行なった結果を示す写真図である。（実施例１）
【図６】抗ＣＣＬ２０抗体を治療的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与し、肝炎治療効果を生存率により確認した図である。（実施例２）
【図７】抗ＣＣＬ２０抗体を治療的にＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに投与したときの生後２８日目のマウス肝臓の病理的検索を行なった結果を示す写真図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤に関する。本発明者らは既存の肝炎モデル動物において肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞に多く発現している分子ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが、肝炎の予防／治療に効果があることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１７】
背景技術の欄でも説明したように、本発明者らは先に自己免疫性肝炎を自然発症する新生仔期胸腺切除（neonatal thymectomy:ＮＴｘ）したＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスについて報告した（非特許文献５）。このマウスは、血清中のＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴおよび総ビリルビンが高値を示し、また、胸腺切除によるＴｒｅｇ（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞）の減少と共に、肝浸潤免疫担当細胞のＣＤ８Ｔ陽性細胞が顕著に増加している。
【００１８】
今般、本発明者らは、この肝炎モデルマウスを用いて肝細胞に浸潤している細胞障害性Ｔ細胞の発現分子について解析を行った。当該細胞に多く発現している分子のうちＣＣＲ６に着目し、そのＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０に対する抗体を用いて、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスにおいて、自己免疫性肝炎の発症の抑制及び治療効果を検討したところ、ＣＣＬ２０の抗体が自己免疫肝炎の予防／治療に効果があることを見出した。
【００１９】
本明細書において、ＣＣＬ２０に対する抗体とは、ＣＣＬ２０タンパク質を特異的に認識することができる免疫グロブリン（抗ＣＣＬ２０抗体）をいう。本発明における抗体とは、ポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体の何れであってもよく、特に限定されないが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、本発明の抗体は、例えば、天然型抗原、遺伝子組換抗原または抗原を発現している細胞等からなる抗原を哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体や遺伝子組換技術を用いて製造され得るモノクローナル抗体も包含する。
【００２０】
抗ＣＣＬ２０抗体を製造するための抗原は、ＣＣＬ２０の抗原性を有していれば良く、例えばＣＣＬ２０タンパク質を公知の方法に従って精製した抗原、または遺伝子工学的に調製し、精製した抗原であればよい。当該抗原は、抗原性を有するのであれば、例えばＣＣＬ２０タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、ＣＣＬ２０タンパク質の一部であってもよい。抗ＣＣＬ２０抗体は、上記抗原を用いて自体公知の方法で作製することができ、例えば特許文献１に開示する方法により作製することができる。
【００２１】
上記抗体の活性フラグメントとは、当該抗体の抗原結合部位を含むフラグメントであって、フラグメント自体でＣＣＬ２０タンパク質を特異的に認識することができるものをいう。具体的には、抗ＣＣＬ２０抗体の抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’が挙げられる。活性フラグメントは、自体公知の方法により作製することができる。
【００２２】
本発明における抗体またはその活性フラグメントは、ＣＣＬ２０タンパク質に特異的に結合し、ＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるものであることが好ましい。ＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるとは、例えば、当該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＬ２０タンパク質とＣＣＲ６との結合を阻害したり、または該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＲ６の活性化を介した細胞遊走を阻害すること等が挙げられる。
【００２３】
本発明は、ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝炎治療剤または予防剤に関する。
肝炎としては、例えば、Ｂ型或いはＣ型などのウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎などが挙げられる。病態としては、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎のいずれにも適用し得る。
特に、本発明においてＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎、例えば、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎に好適に適用できる。動物モデルの肝組織浸潤ＣＤ３陽性Ｔ細胞において、臓器障害を惹起する炎症性サイトカインである、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを高度に発現した細胞の増加が認められる。更に肝組織浸潤ＣＤ３陽性Ｔ細胞のＣＤ８発現について解析したところ、ＣＤ８陰性（ＣＤ４陽性）Ｔ細胞よりもＣＤ８陽性Ｔ細胞の方がその増加は著しかった。よって、ＣＤ８陽性肝細胞は、肝障害を惹起する主因と考えられる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞が末梢免疫組織から肝臓組織に移行してくるにはケモカインとケモカインセプターの相互作用が必要であり、当該動物モデルでは、肝組織に浸潤しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において、ケモカインレセプターであるＣＣＲ６の発現が確認された。また更に、当該動物モデルでは、肝組織にケモカインであるＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現が認められる。そして、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウスに比較して、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝組織でのＣＣＬ２０のｍＲＮＡ発現が相対的に増加していることが確認された。これらの結果から、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎、例えば自己免疫性肝炎に対して効果的に作用しうる。
【００２４】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、上述の肝炎の治療薬または予防薬として使用することができる。また、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントは、肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制作用を有することから、肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤としても使用することができる。また、本発明はＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法にも及ぶ。これらより、本発明の抗体またはその活性フラグメントを含む組成物は、肝炎の治療剤若しくは予防剤としての医薬組成物として使用することができる。
【００２５】
本発明による治療剤若しくは予防剤の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができるが、非経口投与、特に静脈注射、が好ましい。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００２６】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【００２７】
経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トローチ剤等が挙げられる。
【００２８】
本発明による医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよく、また、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。
【００２９】
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられる。
【００３０】
賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が、それぞれ用いられる。上記の成分は、その塩またはその水和物であってもよい。
【００３１】
例えば経口製剤は、有効成分に、賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。錠剤・顆粒剤の場合には、例えば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤等の場合は、例えばｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤等とを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００３２】
本発明による抗体の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）あたり、経口投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは１０〜１０００ｍｇ／日を、注射投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは５０〜１０００ｍｇ／日を、１回または数回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与範囲から逸脱することがある。
【実施例】
【００３３】
本発明の理解をさらに進めるために、以下に参考例および実施例を示してより具体的に説明する。まず、本発明を完成するに至ったＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスを用いた検討結果を参考例に示し、本発明のＣＣＬ２０に対する抗体を有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤を用いた結果を各実施例に示す。本発明は、これらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３４】
（参考例）ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの細胞障害性Ｔ細胞におけるＣＣＲ６の発現および肝臓でのＣＣＬ２０の発現
生後３日目のＢＡＬＢ／ｃ系統のＰＤ−１ＫＯマウス（Science 291 319-322 2001）の新生仔胸腺を外科的に摘除した。２週間飼育後、自己免疫性肝炎を引き起こしているＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓を摘出し、当該肝臓から単核球を精製し、フローサイトメトリーにて、ＣＣＲ６を含む細胞表面分子と細胞内でのサイトカイン分子発現について、それぞれの分子に対する特異的抗体を用いて解析した。
【００３５】
先ず、精製した単核球をＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)で標識された抗ＣＤ３抗体を使用してFACSCantoTM IIフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）にてゲートした後、ＰＥ(phycoerythrin)標識抗ＣＣＲ６抗体およびＡＰＣｙ７(allophycocyanin-cy7)標識抗ＣＤ４抗体またはＡＰＣ(allophycocyanin)標識抗ＣＤ８抗体を使用して展開した。その結果、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウス肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれも、脾臓Ｔ細胞に比較して、ＣＣＲ６を発現した細胞の割合が増加していた （図１）。
【００３６】
同様にして、精製した単核球をＣＤ３ゲート後、ＣＤ８とＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのサイトカインにそれぞれ対応する標識抗体を使用して展開した。その結果、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯ３週齢のマウスの肝臓ＣＤ３陽性Ｔ細胞においては、ＣＤ３陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれにおいても、臓器障害を伴う炎症惹起性サイトカインである、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを高度に発現した細胞の増加が認められた（図２）。
【００３７】
次に、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウス、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスから肝臓を摘出し、肝組織よりＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ(real-time) ＰＣＲにて、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０プライマー（ATG GCC TGC GGT GGC AAG CGT CTG（配列番号１）とTAG GCT GAG GAG GTT CAC AGC CCT（配列番号２）：Yamazaki T et al. J Immunol. 2008 181:8391-401）を用いて、ＣＣＬ２０のｍＲＮＡの発現を確認した。その結果、同系統の非遺伝子改変ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＰＤ−１ＫＯマウスに比較して、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝組織でのＣＣＬ２０のｍＲＮＡ発現が相対的に増加していた（図３）。これらの結果から、自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝臓への肝炎惹起性のＴ細胞の浸潤には、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０の肝臓での発現と、そのリガンド依存性に他の免疫組織から移行してくるＣＣＲ６発現Ｔ細胞の存在が重要であることが分かった。
【００３８】
（実施例１）抗ＣＣＬ２０抗体による肝炎発症抑制効果
ＣＣＬ２０を阻害することで肝への肝炎惹起性Ｔ細胞の浸潤を阻害し、肝炎発症を抑制できるか検討した。自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスは、生後約１０日頃から肝内に炎症細胞浸潤が生じ、約４−５週後には、ほぼ全例で高度の肝炎から死亡する。
【００３９】
そこで、抗ＣＣＬ２０抗体をＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに生後３日目、１０日目、１７日目および２１日目に投与した。抗ＣＣＬ２０抗体としてはマウスＣＣＬ２０ブロッキング抗体(anti-mMIP-3a/CCL20, purified rat monoclonal IgG1, R＆Dシステムズ社製, clone: 114908)を、コントロール抗体としてはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（FG Purified rat IgG1, eBioscience社製, Cat No. 16-4301-85）を各々１００μｇ、５０μｌのリン酸緩衝液に溶解し、抗体溶液を調製した。各抗体溶液を、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスに上記投与スケジュールにて、計４回腹腔内注入を行なった。
【００４０】
生後２８日目における生存率を比較した。コントロール抗体投与群では、生存率が４０％であるのに比較して、ＣＣＬ２０抗体投与群では、生存率が８０％と生存率の改善を認めた（図４）。また、コントロール抗体投与群及び抗ＣＣＬ２０抗体投与群の生存マウスの肝臓を摘出し、ホルマリン固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色し、病理学的検索を行った。その結果、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では、肝臓に浸潤する単核球細胞が著明に減少し、正常肝組織構造の破壊も軽度となっていた（図５）。以上の結果から、抗ＣＣＬ２０ブロッキング抗体の投与によって、ＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの肝炎発症が抑制できることが明らかとなった。
【００４１】
（実施例２）抗ＣＣＬ２０抗体による肝炎治療効果
ＣＣＬ２０を阻害することで発症した肝炎の治療効果が得られるか検討した。自己免疫性肝炎を引き起こすＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスは、生後約４−５週後には、ほぼ全例で高度の肝炎から死亡する。
【００４２】
そこで、抗ＣＣＬ２０抗体をＮＴｘ・ＰＤ−１ＫＯマウスの生後１７日目および２１日目に投与した。抗ＣＣＬ２０抗体およびコントロール抗体は、実施例１に準じて使用し、抗体溶液を調製した。各抗体溶液を、上記投与スケジュールにて、計２回腹腔内注入を行った。
【００４３】
生後２８日目における生存率を比較した。この実験において、コントロール抗体投与群では、生存率が３３％であるのに比較して、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では、生存率が１００％と生存率の改善を認めた（図６）。また、生存マウスの肝臓を摘出し、実施例１と同様に病理学的検索を行った。その結果、コンロトールのアイソタイプ抗体投与マウスで認められる肝臓門脈域を中心に高度に浸潤する単核球細胞（図７矢印）と正常肝細胞の壊死（図７円内）のいずれの所見も、抗ＣＣＬ２０抗体投与群では著明に改善していた（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上詳述したように、 本発明の抗ＣＣＬ２０抗体は、肝炎、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎に対して、治療剤または予防剤として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤。
【請求項２】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが該ＣＣＬ２０に特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントである請求項１記載の肝炎治療剤または予防剤。
【請求項３】
肝炎が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎である請求項１または２記載の肝炎治療剤または予防剤。
【請求項４】
肝炎が、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎または自己免疫性肝炎である請求項１または２記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤。
【請求項６】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法。
【請求項１】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分として含有する肝炎治療剤または予防剤。
【請求項２】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントが該ＣＣＬ２０に特異的に反応するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントである請求項１記載の肝炎治療剤または予防剤。
【請求項３】
肝炎が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による肝細胞障害により惹起される肝炎である請求項１または２記載の肝炎治療剤または予防剤。
【請求項４】
肝炎が、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎または自己免疫性肝炎である請求項１または２記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを有効成分とする肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤抑制剤。
【請求項６】
ＣＣＬ２０に対する抗体またはその活性フラグメントを投与することにより肝組織へのＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤を抑制する方法。
【図３】
【図４】
【図６】
【図１】
【図２】
【図５】
【図７】
【図４】
【図６】
【図１】
【図２】
【図５】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１９７２２８（Ｐ２０１２−１９７２２８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７４７１５（Ｐ２００９−１７４７１５）
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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