脂質代謝異常症の予測方法
【課題】被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法を提供する。
【解決手段】被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測又は診断する方法であって、下記の工程：(1)被験物質を哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質非投与の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及びフェノキシプロピルアミン化合物のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【解決手段】被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測又は診断する方法であって、下記の工程：(1)被験物質を哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質非投与の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及びフェノキシプロピルアミン化合物のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを予測又は診断する方法に関する。より具体的には、特定の生体内物質の変動を測定することにより、被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物投与により生体組織中にリン脂質蓄積が引き起こされる場合があり、この病態は薬物誘発性リン脂質症（drug-induced phospholipidosis）と呼ばれている。薬剤誘発性リン脂質症は、親水性と疎水性の両者の性質を有する種々の陽性イオン化合物の投与により発現し、そのメカニズムとしては、（1）薬物とリン脂質との結合物のphospholipaseによる消化不良、（2）薬物による直接的なphospholipase活性阻害、（3）ライソゾームへの薬物の取り込みの結果生じるライソゾーム内pH上昇によるphospholipase活性の低下，（4）薬物によるリン脂質の合成亢進が考えられている。また、蓄積する物質が中性脂肪及びスフィンゴミエリンの場合には、それぞれ脂肪症（steatosis）及びスフィンゴミエリン蓄積症（sphingolipidosis）と呼ばれ、リン脂質症を含め、これらの病態は脂質代謝異常症（lipidosis）に分類される。脂質代謝異常症のヒトでの発現リスクが低い医薬候補化合物を創製するためには、新薬の探索研究の段階で医薬候補化合物の脂質代謝異常症の誘発ポテンシャルを簡便かつ確実に予測することが極めて重要である。しかしながら、新薬開発の際の非臨床安全性評価における一般的な脂質代謝異常症の診断方法は病理組織学的検査であるが、脂質代謝異常症がある程度進行しないと病理組織学的変化として観察することは困難である。また、臨床推定使用量よりも極めて高い投与用量で医薬候補化合物を実験動物に投与した場合に脂質代謝異常症が認められるケース、あるいは観察された脂質代謝異常症の程度が軽微なケースなどでは、該医薬候補化合物がヒトに投薬された場合のリスクとベネフィットを考慮した上で、臨床試験段階に進む場合もあり，その際には外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料により、脂質代謝異常症を診断しながら、注意深く臨床試験を取り進める必要がある。このような理由から、脂質代謝異常症を簡便かつ確実に予測する、または外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料を用いて脂質代謝異常症を確実に診断する方法の開発が求められている。
【０００３】
そのような手段として、生体内物質をマーカーとして利用して脂質代謝異常症を誘発する可能性のある物質を予測又は診断する手段が提案されている。例えば、フェナセルツ酸(フェニルアセチルグリシン、PAG; Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2001; Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000)、リゾビスホスファチジン酸(Biochim. Biophys. Acta, 1631, pp.136-146, 2003)、白血球中脂肪滴(J. Appl. Toxicol., 26, pp.167-177, 2005)、白血球における遺伝子発現(米国毒性学会要旨集, pp.35, 2006)などはリン脂質症のバイオマーカーとして利用できることが知られており、被験物質のリン脂質代謝異常症誘発可能性を評価するためのバイオマーカーとして利用できることが期待できる。また、フェニルアラニン代謝経路のバランス変化を指標として、医薬の開発段階において候補化合物の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法も提案されている(国際公開WO2005/64344)。
【特許文献１】国際公開WO2005/64344
【非特許文献１】Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2001
【非特許文献２】Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000
【非特許文献３】Biochim. Biophys. Acta, 1631, pp.136-146, 2003
【非特許文献４】J. Appl. Toxicol., 26, pp.167-177, 2005
【非特許文献５】米国毒性学会要旨集, pp.35, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測する方法を提供することにある。より具体的には、特定の生体内物質の変動を検出することにより、被験物質について脂質代謝異常症の誘発可能性を簡便かつ確実に予測する方法を提供することが本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、特定の生体内物質の変動を検出することにより、薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症の発症の有無を簡便かつ確実に診断する方法及びそのための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、脂質代謝異常症の一つであるリン脂質症を誘発することが知られている物質を動物に投与すると23種の特定の生体内物質の変動が生じることを見出した。この知見を基にして、被験物質を投与した後に該生体物質の変動を検出することによって、その被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性を有するか否かを簡便かつ確実に予測することができること、及びこの特定の生体内物質をバイオマーカーとして利用することによりヒトを含む哺乳類動物において薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症の発症可能性を外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料を用いて簡便かつ確実に診断することができることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成された。
【０００６】
すなわち、本発明により、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測又は診断する方法であって、下記の工程：
(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び下記の式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)：
【化１】
のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法が提供される。
【０００７】
上記の発明の好ましい態様によれば，特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチンである上記の方法；生体試料が尿、血漿、血清、または組織ホモジネートである上記の方法；組織ホモジネートが肺ホモジネートまたは肝ホモジネートである上記の方法；及び被験物質が医薬候補化合物である上記の方法が提供される。
【０００８】
また、本発明により、医薬候補化合物のスクリーニング方法であって、上記の予測方法により脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定された被験物質を被験物質群から除外して脂質代謝異常症の誘発可能性のない医薬候補化合物を選抜する工程を含む方法、及び該スクリーニング方法により選抜された医薬候補化合物を含むライブラリーが提供される。
さらに、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーとしての上記の特定生体内物質の使用、及び被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーであって、上記の特定生体内物質を含むバイオマーカーが本発明により提供される。
【０００９】
別の観点からは、脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：
(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法が提供される。
【００１０】
上記の発明の好ましい態様によれば、特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチンである上記の方法；生体試料が尿、血漿、血清、又は組織ホモジネートである上記の方法；組織ホモジネートが、肺ホモジネート又は肝臓ホモジネートである上記の方法；及び脂質代謝異常症が遺伝性リピドーシス、薬物起因性リピドーシス、又は脂肪酸代謝ホメオスタシス異常である上記の方法が提供される。
【００１１】
また、脂質代謝異常症の診断用マーカーとしての上記の特定生体内物質の使用、及び脂質代謝異常症の診断用マーカーであって、上記の特定生体内物質を含む診断用マーカーが本発明により提供される。
さらに、上記のバイオマーカー又は上記の診断用マーカーを化学的又は生物学的に検出可能な測定用試薬；上記の特定生体内物質の変動を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む脂質代謝異常症の予防及び／又は治療のための医薬；及び上記の特定生体内物質の発現を抑制する作用又は上記の特定生体内物質の発現を亢進する作用を有する物質を有効成分として含む脂質代謝異常症の予防及び／又は治療のための医薬も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の予測方法によれば、実験動物を用いた長期にわたる毒性試験を行うことなく、簡便かつ確実に被験物質が脂質代謝異常症誘発可能性を有するか否かを判定することができ、安全な医薬候補化合物を迅速にスクリーニングすることができる。また、本発明の診断方法は上記の診断用マーカーを用いることにより患者に苦痛を与えずに簡便かつ精度の高い診断を行うことができるという特徴がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法であって、下記の工程：(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法ことを特徴としている。
【００１４】
バイオセンサーを用いて医薬候補化合物に起因する脂質代謝異常症を予測する方法及び脂質代謝異常症及びその関連疾患を診断する方法については国際公開WO 2005/64344に記載があり、その予測方法に使用される生体試料の種類（細胞又は組織など）、生体試料の採取方法、実験動物の種類、及び被験物質に実験動物を曝露させる手段、並びにその診断方法の適用対象となる脂質代謝異常症及びその関連疾患などが詳細かつ具体的に説明されている。これらの説明は本発明の予測方法及び診断方法を理解するために有用であり、当業者は上記刊行物を参照しつつ本発明を容易に理解することができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示として含める。
【００１５】
本発明の予測方法において適用される被験物質の種類は特に限定されず、有機低分子化合物のほか、高分子化合物、無機化合物、核酸類（RNAiなどに用いる小分子RNAや非天然型塩基を含む核酸などを含む）、糖類、脂質類、又はペプチド類（オリゴペプチド又はポリペプチド類を含む）などの任意の物質が包含される。一般的には、本発明の予測方法を医薬候補化合物のスクリーニング手段として使用することが好ましく、被験物質は医薬候補化合物であることが好ましい。
【００１６】
本発明の予測方法において使用されるヒト以外の哺乳類動物の種類は特に限定されず、例えば、サル、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギなどの通常の実験動物を使用することができる。被験物質を上記哺乳類動物に投与する方法は特に限定されず、被験物質の物理化学的性状や動物の種類などに応じて適宜の投与経路を選択することができる。例えば、経口投与、静脈内投与、又は腹腔内投与など適宜の投与経路を選択できる。
【００１７】
生体試料の種類も特に限定されず、例えば、尿、血液、唾液、リンパ液、組織、又は細胞など任意の生体試料を使用することができ、それらの種類の応じて、適宜の分離手段を採用することができる。例えば、採血により採取した血液を生体試料として用いることができ、採取した血液から分離した血清を生体試料として用いてもよい。また、手術などの手段で摘出した臓器などから採取した組織のホモジネートを生体試料として用いることもでき、ホモジネート上清を生体試料として用いてもよい。例えば、肺や肝臓などの臓器から採取した組織のホモジネート又はホモジネート上清を好ましく用いることができる。
【００１８】
生体試料中に含まれる特定生体内物質の種類は特に限定されないが、該特定生体内物質は、脂質代謝異常症を誘発することが知られている2種の物質：アミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により変動する生体内物質を用いる必要がある。アミオダロンについてはToxicol. Appl. Pharmacol., 97, pp.124-133, 1987及びHepatology, 8, pp.1063-1068, 1988に脂質代謝異常症を発症することが記載されている。フェノキシプロピルアミン化合物(I)はWO 00/71517に開示された化合物である。また、アミオダロン投与により観察される白血球中脂肪滴は、フェノキシプロピルアミン化合物(I)の投与では観察されない。
【００１９】
本発明の予測方法で測定の対象となる特定生体内物質は、生体内に本来的に存在する物質、好ましくは本来的に一定の濃度範囲内で存在する物質であってもよく、あるいは脂質代謝異常症において出現又は消失する物質であってもよい。特定生体内物質は任意の生体内物質又は被験物質の代謝物であってもよい。2種以上の特定生体内物質を測定することによって、より精度の高い予測が可能になる場合がある。特定生体内物質としては、例えば、L-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N-オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を挙げることができ、好ましくはL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を挙げることができる。これらのうち、L―カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネートが更に好ましく、L-カルニチンが最も好ましい。もっとも、特定生体内物質はこれらに限定されることはない。
【００２０】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定性及び定量又はそれらのどちらかを目的として特定生体内物質を検出することを意味しており、濃度測定のほか、同定などの概念を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においてもこの用語を限定的に解釈してはならない。「測定結果」という用語は濃度の測定値などのほか検出の有無などの指標も含めて最も広義に解釈する必要があり、必ずしも得られた数値自体を意味するものではない。例えば、ある特定生体内物質の濃度が検出限界以下の濃度に変動した場合、この結果も「測定結果」の概念に含まれる。
【００２１】
特定生体内物質の測定手段は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の測定手段を1種又は2種以上組み合わせて用いることができるが、例えば、キャピラリー電気泳動と質量分析法とを組み合わせて測定を行うことが好ましい。例えば、Anal. Chem., 77, pp.78-84, 2005; Electrophoresis, 25, pp.1964-1972, 2004; Journal of Proteome Research., 2, pp488-494, 2003などを参照することにより当業者はこの測定を容易に行うことができる。この方法によれば、分子量及び電気泳動時間から特定生体内物質を高感度かつ精度よく同定し、かつ定量することができるという特徴がある。もっとも、特定生体内物質の種類に応じて適宜の測定手段を採用できることは当業者に自明である。
【００２２】
メタボローム解析とは、生体内の代謝物質の総体（メタボローム）の網羅的な測定を意味する。メタボローム測定法としては、キャピラリー電気泳動・質量分析法、ガスクロマトグラフィー・質量分析法、高速液体クロマトグラフィー・質量分析法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法、核磁気共鳴分析法（NMR）などが知られている（メタボローム研究の最前線、2003、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社（富田勝、西岡孝明編））。
【００２３】
また、特定生体内物質は、未処理あるいは適切な誘導体化処理の後、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどによる分離手法と、紫外線、蛍光、電気化学的検出方法、Free Induction Decay（FID：自動誘導減衰）、質量分析などの機器分析手法を適切に組み合わせた測定方法、酵素免疫測定（ELISA）、放射性同位体による免疫測定（RIA）、化学発光酵素免疫測定（CLEIA）などの免疫反応を利用した測定方法、酵素反応と吸光度、蛍光あるいは発光検出などを組み合わせた生化学的手法でも測定可能である。
【００２４】
生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定することができる。本明細書において「有意差」とは一般的には周知かつ慣用の統計分析手法により2つの測定結果に有意な差が得られることを意味するが、必ずしも厳密な統計学的手法によらずにみかけ上の差を認めた場合にも有意差ありと判定してもよい。
【００２５】
被験物質が脂質代謝異常症の誘発性を示す場合には、特定生体内物質の濃度や組織分布などに変動が生じる。本明細書において「変動」という用語は、例えば、特定生体内物質の濃度上昇又は濃度減少、消失、出現、組織内若しくは細胞内又は生体中の分布変化、あるいは発現亢進などの1種又は2種以上を含む概念であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。この変動は、被験物質を投与した動物から採取した生体試料中に含まれる特定生体内物質の測定結果と被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果とを比較することにより、容易に確認することができる。一般的には、被験物質の非投与群をコントロール群とすることにより容易に変動を確認することができるが、健常な哺乳類動物からあらかじめ得た測定結果を標準結果とし用意しておき、その標準結果と比較して有意差の有無を判定してもよい。このような態様も本発明の方法に包含されることは言うまでもない。
【００２６】
上記の予測方法を用いて、脂質代謝異常症を誘発することのない安全な医薬候補化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、スクリーニングの対象となる被験物質群のなかから上記の予測方法を用いて脂質代謝異常症を誘発する可能性のある被験物質を選択し、被験物質群からその被験物質を除外して、残りの被験物質群をスクリーニング結果物として得る工程を含んでいる。このようにして得られたスクリーニング結果物に含まれる物質は、脂質代謝異常症を誘発する可能性がないか、あるいはその可能性が極めて低い安全な物質であり、医薬として好適に使用可能な物質である。また、このようにして得た安全な物質群からなるライブラリーは、新規な医薬の開発のための物質ソース群として有用である。
【００２７】
別の観点から提供される本発明の方法は、脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質であることを特徴としている。哺乳類動物としては、ヒトのほか、イヌ又はネコなどのペット類、あるいはウシやブタなどの家畜類が挙げられるが、これらに限定されることはない。好ましくはヒトを対象として診断を行うことができる。
【００２８】
上記の診断方法において、脂質代謝異常症としては、例えば、遺伝性リピドーシス（例えばゴーシェ病、ニーマンピック病（A〜C型）、ファーブリ病、ウォルマン病、コレステロールエステル蓄積症、脳腱黄色腫病、フィトステロール血症、レフサム病、テイ-サックス病、全身性(GM1)ガングリオシドーシス、サルファチドリピドーシス(黒染性白質萎縮症）、ガラクトシルセラミドリピドーシスなど）、薬物起因性リピドーシス(例えばPLsis、脂肪症、スフィンゴミエリン蓄積症など）、脂肪酸代謝ホメオスタシス異常(例えば、脂肪酸β酸化異常など）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。本明細書において「脂質代謝異常症」という用語には、脂質代謝異常を伴う疾患、又は脂質代謝異常に起因する疾患なども包含される。このような疾患は脂質代謝異常症の関連疾患として知られており、例えば、高血圧症、粥状硬化症、動脈硬化、心筋梗塞、脂肪肝、肝炎、肝硬変、糖尿病、痴呆症、アルツハイマー症、心臓病、及び慢性疲労症候群などのほか、薬物起因性リピドーシス関連疾患として肺線維症、失明、及び脳症などが挙げられる。もっとも、本発明の診断方法の対象となる脂質代謝異常症はこれらに限定されることはない。
【００２９】
上記の診断方法は基本的に上記の予測方法と同様にして行うことができ、好ましくは個体から分離された生体試料として尿又は血液などを用いることができる。健常者から得た測定結果として、あらかじめ健常者から得た測定結果を標準結果として用意しておき、その結果を利用することもできる。被験個体から得た測定値と健常者から得た測定結果との間に有意差が認められた場合には、その被験個体は脂質代謝異常症をすでに発症しているか、あるいは脂質代謝異常症を発症する危険性がある。本明細書において「脂質代謝異常症の発症可能性を有する」という用語は、その個体が脂質代謝異常症をすでに発症していることを病理組織学的手段などにより明確に確認できる場合のほか、その個体が脂質代謝異常症に罹患していることを病理学的には証明できないものの他の臨床データーから脂質代謝異常症を発症していることが強く疑われる場合、あるいは脂質代謝異常症を将来発症する危険性を有している場合などを含めて、最も広義に解釈する必要がある。
【００３０】
上記の特定生体内物質は脂質代謝異常症の診断用マーカーとして有用である。診断用マーカーとしては、1種の特定生体内物質を用いてもよいが、2種以上の特定生体内物質を組み合わせて用いてもよい。上記の診断方法の便宜のために、該診断用マーカーを化学的又は生物学的手段により特異的に検出できる測定用試薬を提供することも望ましく、2種以上の該診断用マーカーをそれぞれ特異的に検出できる測定用試薬を組み合わせてキットとして提供することも望ましい。特定生体内物質を特異的に検出可能な試薬としては、例えば、特定生体内物質に特異的に反応する標識化抗体などを挙げることができるが、この特定の試薬に限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
アミオダロン及びフェノキシプロピルアミン化合物（I）を試験物質として、リン脂質症の発現の有無を病理組織学検査及び肺組織中のホスファチジルコリン定量により調べた。また、尿及び血清中の中間・最終代謝産物をCE-TOFMSを用いて網羅的に分析した。
【００３２】
アミオダロンはSIGMA社より購入し、フェノキシプロピルアミン化合物（I）は三菱ウェルファーマ株式会社で合成し、実験に使用した。6週齢のCrl:CD(SD)ラットを日本チャールスリバーから購入し、5日間馴化飼育した後に実験に用いた。動物は1群4匹からなる3群に無作為に群分けし、溶媒対照群には0.5％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液（HPMC）、アミオダロン投与群とフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群はそれぞれHPMCによる懸濁液を150mg/kgと100mg/kgの投与用量で14日間反復経口投与した。最終投与の直後にすべての動物を代謝ケージに移し、24時間にわたり尿を採取した。最終投与24時間後に動物をジエチルエーテルで麻酔した上で採血し、さらに放血後、肺を採取した。血液は定法にて血清を分離した後、メタノール・クロロホルムによる抽出液をCE-TOFMSに添加した。尿は遠心分離により夾雑物を取り除いた後、CE-TOFMSに添加した。CE-TOFMSによる解析は特願2005-258684号明細書に記載された方法に準じて実施した。肺は二分割し、一部の組織片については定法に従い病理組織標本を作製して病理組織変化を観察した。他方の組織片は採取後速やかに液体窒素にて凍結した上で、定法に従いホスファチジルコリンを定量した。
【００３３】
病理組織学検査では、アミオダロン投与群の全例でリン脂質症の特徴である泡沫肺胞マクロファージの集簇が認められた。一方、フェノキシプロピルアミン化合物(I)投与群及び溶媒対照群ではいずれの個体においてもリン脂質症の発現を疑わせる所見は観察されなかった。肺のリン脂質定量の結果を図１に示す。アミオダロン投与群及びフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群のホスファチジルコリン量は、いずれも溶媒対照群に比べて有意な増加が認められた。フェノキシプロピルアミン化合物(I)投与群の増加率は約1.5倍に対し、アミオダロン投与群は約3.5倍の増加率を示し、本実験条件においては、アミオダロン投与群の方がフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群よりリン脂質症の程度は重度であると考えられた。
【００３４】
CE-TOFMSにより生体内物質の一斉分析を実施した後、メタボローム・ディファレンシャルディスプレイ法による各生体内物質量の群間比較をWilliamsの多重比較検定で行うとともに各個体毎に肺組織中のホスファチジルコリン量との間でピアソンとスピアマンの相関係数を求め、相関係数0.5以上又は-0.5以下のピークを抽出した。個々のピークについては精密質量及び電気移動度から候補物質の絞込み、質量分析装置（MS/MS）による物質の構造推定を行い、標準物質が入手可能な物質については比較し物質を同定した。その結果、表１に示すように、アミオダロン投与群とフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群においてともに変動する代謝物として、尿からはトリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、L-カルニチン、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、フルクトシルリジン、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、フェニルアセチルグリシン、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、及び5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネートが見出され、血清からはトリメチルアミン N−オキシド、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン及びL-ヒスチジンが見出された。同定もしくは推定された物質は、ヒスチジンやトリプトファンなどのアミノ酸代謝経路、脂肪酸のβ酸化経路及び尿素回路などに由来する生体内代謝物質であった。この中のフェニルアセチルグリシンは薬物誘発性リン脂質症のバイオマーカーとしての有用性が報告されており（Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000；Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2000）、本発明の予測・診断方法が高い精度を有していることを示唆している。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】肺組織中のホスファチジルコリン量を示した図である。図中、化合物(I)はフェノキシプロピルアミン化合物（I）の結果を示す。データは平均値＋標準偏差を示し、**、p<0.01（Dunnettの多重比較検定）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを予測又は診断する方法に関する。より具体的には、特定の生体内物質の変動を測定することにより、被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物投与により生体組織中にリン脂質蓄積が引き起こされる場合があり、この病態は薬物誘発性リン脂質症（drug-induced phospholipidosis）と呼ばれている。薬剤誘発性リン脂質症は、親水性と疎水性の両者の性質を有する種々の陽性イオン化合物の投与により発現し、そのメカニズムとしては、（1）薬物とリン脂質との結合物のphospholipaseによる消化不良、（2）薬物による直接的なphospholipase活性阻害、（3）ライソゾームへの薬物の取り込みの結果生じるライソゾーム内pH上昇によるphospholipase活性の低下，（4）薬物によるリン脂質の合成亢進が考えられている。また、蓄積する物質が中性脂肪及びスフィンゴミエリンの場合には、それぞれ脂肪症（steatosis）及びスフィンゴミエリン蓄積症（sphingolipidosis）と呼ばれ、リン脂質症を含め、これらの病態は脂質代謝異常症（lipidosis）に分類される。脂質代謝異常症のヒトでの発現リスクが低い医薬候補化合物を創製するためには、新薬の探索研究の段階で医薬候補化合物の脂質代謝異常症の誘発ポテンシャルを簡便かつ確実に予測することが極めて重要である。しかしながら、新薬開発の際の非臨床安全性評価における一般的な脂質代謝異常症の診断方法は病理組織学的検査であるが、脂質代謝異常症がある程度進行しないと病理組織学的変化として観察することは困難である。また、臨床推定使用量よりも極めて高い投与用量で医薬候補化合物を実験動物に投与した場合に脂質代謝異常症が認められるケース、あるいは観察された脂質代謝異常症の程度が軽微なケースなどでは、該医薬候補化合物がヒトに投薬された場合のリスクとベネフィットを考慮した上で、臨床試験段階に進む場合もあり，その際には外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料により、脂質代謝異常症を診断しながら、注意深く臨床試験を取り進める必要がある。このような理由から、脂質代謝異常症を簡便かつ確実に予測する、または外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料を用いて脂質代謝異常症を確実に診断する方法の開発が求められている。
【０００３】
そのような手段として、生体内物質をマーカーとして利用して脂質代謝異常症を誘発する可能性のある物質を予測又は診断する手段が提案されている。例えば、フェナセルツ酸(フェニルアセチルグリシン、PAG; Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2001; Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000)、リゾビスホスファチジン酸(Biochim. Biophys. Acta, 1631, pp.136-146, 2003)、白血球中脂肪滴(J. Appl. Toxicol., 26, pp.167-177, 2005)、白血球における遺伝子発現(米国毒性学会要旨集, pp.35, 2006)などはリン脂質症のバイオマーカーとして利用できることが知られており、被験物質のリン脂質代謝異常症誘発可能性を評価するためのバイオマーカーとして利用できることが期待できる。また、フェニルアラニン代謝経路のバランス変化を指標として、医薬の開発段階において候補化合物の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法も提案されている(国際公開WO2005/64344)。
【特許文献１】国際公開WO2005/64344
【非特許文献１】Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2001
【非特許文献２】Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000
【非特許文献３】Biochim. Biophys. Acta, 1631, pp.136-146, 2003
【非特許文献４】J. Appl. Toxicol., 26, pp.167-177, 2005
【非特許文献５】米国毒性学会要旨集, pp.35, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測する方法を提供することにある。より具体的には、特定の生体内物質の変動を検出することにより、被験物質について脂質代謝異常症の誘発可能性を簡便かつ確実に予測する方法を提供することが本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、特定の生体内物質の変動を検出することにより、薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症の発症の有無を簡便かつ確実に診断する方法及びそのための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、脂質代謝異常症の一つであるリン脂質症を誘発することが知られている物質を動物に投与すると23種の特定の生体内物質の変動が生じることを見出した。この知見を基にして、被験物質を投与した後に該生体物質の変動を検出することによって、その被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性を有するか否かを簡便かつ確実に予測することができること、及びこの特定の生体内物質をバイオマーカーとして利用することによりヒトを含む哺乳類動物において薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症の発症可能性を外科的侵襲の少ない方法で採取された生体試料を用いて簡便かつ確実に診断することができることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成された。
【０００６】
すなわち、本発明により、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測又は診断する方法であって、下記の工程：
(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び下記の式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)：
【化１】
のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法が提供される。
【０００７】
上記の発明の好ましい態様によれば，特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチンである上記の方法；生体試料が尿、血漿、血清、または組織ホモジネートである上記の方法；組織ホモジネートが肺ホモジネートまたは肝ホモジネートである上記の方法；及び被験物質が医薬候補化合物である上記の方法が提供される。
【０００８】
また、本発明により、医薬候補化合物のスクリーニング方法であって、上記の予測方法により脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定された被験物質を被験物質群から除外して脂質代謝異常症の誘発可能性のない医薬候補化合物を選抜する工程を含む方法、及び該スクリーニング方法により選抜された医薬候補化合物を含むライブラリーが提供される。
さらに、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーとしての上記の特定生体内物質の使用、及び被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーであって、上記の特定生体内物質を含むバイオマーカーが本発明により提供される。
【０００９】
別の観点からは、脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：
(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法が提供される。
【００１０】
上記の発明の好ましい態様によれば、特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である上記の方法；特定生体内物質がL-カルニチンである上記の方法；生体試料が尿、血漿、血清、又は組織ホモジネートである上記の方法；組織ホモジネートが、肺ホモジネート又は肝臓ホモジネートである上記の方法；及び脂質代謝異常症が遺伝性リピドーシス、薬物起因性リピドーシス、又は脂肪酸代謝ホメオスタシス異常である上記の方法が提供される。
【００１１】
また、脂質代謝異常症の診断用マーカーとしての上記の特定生体内物質の使用、及び脂質代謝異常症の診断用マーカーであって、上記の特定生体内物質を含む診断用マーカーが本発明により提供される。
さらに、上記のバイオマーカー又は上記の診断用マーカーを化学的又は生物学的に検出可能な測定用試薬；上記の特定生体内物質の変動を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む脂質代謝異常症の予防及び／又は治療のための医薬；及び上記の特定生体内物質の発現を抑制する作用又は上記の特定生体内物質の発現を亢進する作用を有する物質を有効成分として含む脂質代謝異常症の予防及び／又は治療のための医薬も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の予測方法によれば、実験動物を用いた長期にわたる毒性試験を行うことなく、簡便かつ確実に被験物質が脂質代謝異常症誘発可能性を有するか否かを判定することができ、安全な医薬候補化合物を迅速にスクリーニングすることができる。また、本発明の診断方法は上記の診断用マーカーを用いることにより患者に苦痛を与えずに簡便かつ精度の高い診断を行うことができるという特徴がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法であって、下記の工程：(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法ことを特徴としている。
【００１４】
バイオセンサーを用いて医薬候補化合物に起因する脂質代謝異常症を予測する方法及び脂質代謝異常症及びその関連疾患を診断する方法については国際公開WO 2005/64344に記載があり、その予測方法に使用される生体試料の種類（細胞又は組織など）、生体試料の採取方法、実験動物の種類、及び被験物質に実験動物を曝露させる手段、並びにその診断方法の適用対象となる脂質代謝異常症及びその関連疾患などが詳細かつ具体的に説明されている。これらの説明は本発明の予測方法及び診断方法を理解するために有用であり、当業者は上記刊行物を参照しつつ本発明を容易に理解することができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示として含める。
【００１５】
本発明の予測方法において適用される被験物質の種類は特に限定されず、有機低分子化合物のほか、高分子化合物、無機化合物、核酸類（RNAiなどに用いる小分子RNAや非天然型塩基を含む核酸などを含む）、糖類、脂質類、又はペプチド類（オリゴペプチド又はポリペプチド類を含む）などの任意の物質が包含される。一般的には、本発明の予測方法を医薬候補化合物のスクリーニング手段として使用することが好ましく、被験物質は医薬候補化合物であることが好ましい。
【００１６】
本発明の予測方法において使用されるヒト以外の哺乳類動物の種類は特に限定されず、例えば、サル、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギなどの通常の実験動物を使用することができる。被験物質を上記哺乳類動物に投与する方法は特に限定されず、被験物質の物理化学的性状や動物の種類などに応じて適宜の投与経路を選択することができる。例えば、経口投与、静脈内投与、又は腹腔内投与など適宜の投与経路を選択できる。
【００１７】
生体試料の種類も特に限定されず、例えば、尿、血液、唾液、リンパ液、組織、又は細胞など任意の生体試料を使用することができ、それらの種類の応じて、適宜の分離手段を採用することができる。例えば、採血により採取した血液を生体試料として用いることができ、採取した血液から分離した血清を生体試料として用いてもよい。また、手術などの手段で摘出した臓器などから採取した組織のホモジネートを生体試料として用いることもでき、ホモジネート上清を生体試料として用いてもよい。例えば、肺や肝臓などの臓器から採取した組織のホモジネート又はホモジネート上清を好ましく用いることができる。
【００１８】
生体試料中に含まれる特定生体内物質の種類は特に限定されないが、該特定生体内物質は、脂質代謝異常症を誘発することが知られている2種の物質：アミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により変動する生体内物質を用いる必要がある。アミオダロンについてはToxicol. Appl. Pharmacol., 97, pp.124-133, 1987及びHepatology, 8, pp.1063-1068, 1988に脂質代謝異常症を発症することが記載されている。フェノキシプロピルアミン化合物(I)はWO 00/71517に開示された化合物である。また、アミオダロン投与により観察される白血球中脂肪滴は、フェノキシプロピルアミン化合物(I)の投与では観察されない。
【００１９】
本発明の予測方法で測定の対象となる特定生体内物質は、生体内に本来的に存在する物質、好ましくは本来的に一定の濃度範囲内で存在する物質であってもよく、あるいは脂質代謝異常症において出現又は消失する物質であってもよい。特定生体内物質は任意の生体内物質又は被験物質の代謝物であってもよい。2種以上の特定生体内物質を測定することによって、より精度の高い予測が可能になる場合がある。特定生体内物質としては、例えば、L-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N-オキシド、ヒポタウリン、フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を挙げることができ、好ましくはL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を挙げることができる。これらのうち、L―カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネートが更に好ましく、L-カルニチンが最も好ましい。もっとも、特定生体内物質はこれらに限定されることはない。
【００２０】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定性及び定量又はそれらのどちらかを目的として特定生体内物質を検出することを意味しており、濃度測定のほか、同定などの概念を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においてもこの用語を限定的に解釈してはならない。「測定結果」という用語は濃度の測定値などのほか検出の有無などの指標も含めて最も広義に解釈する必要があり、必ずしも得られた数値自体を意味するものではない。例えば、ある特定生体内物質の濃度が検出限界以下の濃度に変動した場合、この結果も「測定結果」の概念に含まれる。
【００２１】
特定生体内物質の測定手段は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の測定手段を1種又は2種以上組み合わせて用いることができるが、例えば、キャピラリー電気泳動と質量分析法とを組み合わせて測定を行うことが好ましい。例えば、Anal. Chem., 77, pp.78-84, 2005; Electrophoresis, 25, pp.1964-1972, 2004; Journal of Proteome Research., 2, pp488-494, 2003などを参照することにより当業者はこの測定を容易に行うことができる。この方法によれば、分子量及び電気泳動時間から特定生体内物質を高感度かつ精度よく同定し、かつ定量することができるという特徴がある。もっとも、特定生体内物質の種類に応じて適宜の測定手段を採用できることは当業者に自明である。
【００２２】
メタボローム解析とは、生体内の代謝物質の総体（メタボローム）の網羅的な測定を意味する。メタボローム測定法としては、キャピラリー電気泳動・質量分析法、ガスクロマトグラフィー・質量分析法、高速液体クロマトグラフィー・質量分析法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法、核磁気共鳴分析法（NMR）などが知られている（メタボローム研究の最前線、2003、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社（富田勝、西岡孝明編））。
【００２３】
また、特定生体内物質は、未処理あるいは適切な誘導体化処理の後、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどによる分離手法と、紫外線、蛍光、電気化学的検出方法、Free Induction Decay（FID：自動誘導減衰）、質量分析などの機器分析手法を適切に組み合わせた測定方法、酵素免疫測定（ELISA）、放射性同位体による免疫測定（RIA）、化学発光酵素免疫測定（CLEIA）などの免疫反応を利用した測定方法、酵素反応と吸光度、蛍光あるいは発光検出などを組み合わせた生化学的手法でも測定可能である。
【００２４】
生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定することができる。本明細書において「有意差」とは一般的には周知かつ慣用の統計分析手法により2つの測定結果に有意な差が得られることを意味するが、必ずしも厳密な統計学的手法によらずにみかけ上の差を認めた場合にも有意差ありと判定してもよい。
【００２５】
被験物質が脂質代謝異常症の誘発性を示す場合には、特定生体内物質の濃度や組織分布などに変動が生じる。本明細書において「変動」という用語は、例えば、特定生体内物質の濃度上昇又は濃度減少、消失、出現、組織内若しくは細胞内又は生体中の分布変化、あるいは発現亢進などの1種又は2種以上を含む概念であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。この変動は、被験物質を投与した動物から採取した生体試料中に含まれる特定生体内物質の測定結果と被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果とを比較することにより、容易に確認することができる。一般的には、被験物質の非投与群をコントロール群とすることにより容易に変動を確認することができるが、健常な哺乳類動物からあらかじめ得た測定結果を標準結果とし用意しておき、その標準結果と比較して有意差の有無を判定してもよい。このような態様も本発明の方法に包含されることは言うまでもない。
【００２６】
上記の予測方法を用いて、脂質代謝異常症を誘発することのない安全な医薬候補化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、スクリーニングの対象となる被験物質群のなかから上記の予測方法を用いて脂質代謝異常症を誘発する可能性のある被験物質を選択し、被験物質群からその被験物質を除外して、残りの被験物質群をスクリーニング結果物として得る工程を含んでいる。このようにして得られたスクリーニング結果物に含まれる物質は、脂質代謝異常症を誘発する可能性がないか、あるいはその可能性が極めて低い安全な物質であり、医薬として好適に使用可能な物質である。また、このようにして得た安全な物質群からなるライブラリーは、新規な医薬の開発のための物質ソース群として有用である。
【００２７】
別の観点から提供される本発明の方法は、脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び上記の構造式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質であることを特徴としている。哺乳類動物としては、ヒトのほか、イヌ又はネコなどのペット類、あるいはウシやブタなどの家畜類が挙げられるが、これらに限定されることはない。好ましくはヒトを対象として診断を行うことができる。
【００２８】
上記の診断方法において、脂質代謝異常症としては、例えば、遺伝性リピドーシス（例えばゴーシェ病、ニーマンピック病（A〜C型）、ファーブリ病、ウォルマン病、コレステロールエステル蓄積症、脳腱黄色腫病、フィトステロール血症、レフサム病、テイ-サックス病、全身性(GM1)ガングリオシドーシス、サルファチドリピドーシス(黒染性白質萎縮症）、ガラクトシルセラミドリピドーシスなど）、薬物起因性リピドーシス(例えばPLsis、脂肪症、スフィンゴミエリン蓄積症など）、脂肪酸代謝ホメオスタシス異常(例えば、脂肪酸β酸化異常など）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。本明細書において「脂質代謝異常症」という用語には、脂質代謝異常を伴う疾患、又は脂質代謝異常に起因する疾患なども包含される。このような疾患は脂質代謝異常症の関連疾患として知られており、例えば、高血圧症、粥状硬化症、動脈硬化、心筋梗塞、脂肪肝、肝炎、肝硬変、糖尿病、痴呆症、アルツハイマー症、心臓病、及び慢性疲労症候群などのほか、薬物起因性リピドーシス関連疾患として肺線維症、失明、及び脳症などが挙げられる。もっとも、本発明の診断方法の対象となる脂質代謝異常症はこれらに限定されることはない。
【００２９】
上記の診断方法は基本的に上記の予測方法と同様にして行うことができ、好ましくは個体から分離された生体試料として尿又は血液などを用いることができる。健常者から得た測定結果として、あらかじめ健常者から得た測定結果を標準結果として用意しておき、その結果を利用することもできる。被験個体から得た測定値と健常者から得た測定結果との間に有意差が認められた場合には、その被験個体は脂質代謝異常症をすでに発症しているか、あるいは脂質代謝異常症を発症する危険性がある。本明細書において「脂質代謝異常症の発症可能性を有する」という用語は、その個体が脂質代謝異常症をすでに発症していることを病理組織学的手段などにより明確に確認できる場合のほか、その個体が脂質代謝異常症に罹患していることを病理学的には証明できないものの他の臨床データーから脂質代謝異常症を発症していることが強く疑われる場合、あるいは脂質代謝異常症を将来発症する危険性を有している場合などを含めて、最も広義に解釈する必要がある。
【００３０】
上記の特定生体内物質は脂質代謝異常症の診断用マーカーとして有用である。診断用マーカーとしては、1種の特定生体内物質を用いてもよいが、2種以上の特定生体内物質を組み合わせて用いてもよい。上記の診断方法の便宜のために、該診断用マーカーを化学的又は生物学的手段により特異的に検出できる測定用試薬を提供することも望ましく、2種以上の該診断用マーカーをそれぞれ特異的に検出できる測定用試薬を組み合わせてキットとして提供することも望ましい。特定生体内物質を特異的に検出可能な試薬としては、例えば、特定生体内物質に特異的に反応する標識化抗体などを挙げることができるが、この特定の試薬に限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
アミオダロン及びフェノキシプロピルアミン化合物（I）を試験物質として、リン脂質症の発現の有無を病理組織学検査及び肺組織中のホスファチジルコリン定量により調べた。また、尿及び血清中の中間・最終代謝産物をCE-TOFMSを用いて網羅的に分析した。
【００３２】
アミオダロンはSIGMA社より購入し、フェノキシプロピルアミン化合物（I）は三菱ウェルファーマ株式会社で合成し、実験に使用した。6週齢のCrl:CD(SD)ラットを日本チャールスリバーから購入し、5日間馴化飼育した後に実験に用いた。動物は1群4匹からなる3群に無作為に群分けし、溶媒対照群には0.5％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液（HPMC）、アミオダロン投与群とフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群はそれぞれHPMCによる懸濁液を150mg/kgと100mg/kgの投与用量で14日間反復経口投与した。最終投与の直後にすべての動物を代謝ケージに移し、24時間にわたり尿を採取した。最終投与24時間後に動物をジエチルエーテルで麻酔した上で採血し、さらに放血後、肺を採取した。血液は定法にて血清を分離した後、メタノール・クロロホルムによる抽出液をCE-TOFMSに添加した。尿は遠心分離により夾雑物を取り除いた後、CE-TOFMSに添加した。CE-TOFMSによる解析は特願2005-258684号明細書に記載された方法に準じて実施した。肺は二分割し、一部の組織片については定法に従い病理組織標本を作製して病理組織変化を観察した。他方の組織片は採取後速やかに液体窒素にて凍結した上で、定法に従いホスファチジルコリンを定量した。
【００３３】
病理組織学検査では、アミオダロン投与群の全例でリン脂質症の特徴である泡沫肺胞マクロファージの集簇が認められた。一方、フェノキシプロピルアミン化合物(I)投与群及び溶媒対照群ではいずれの個体においてもリン脂質症の発現を疑わせる所見は観察されなかった。肺のリン脂質定量の結果を図１に示す。アミオダロン投与群及びフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群のホスファチジルコリン量は、いずれも溶媒対照群に比べて有意な増加が認められた。フェノキシプロピルアミン化合物(I)投与群の増加率は約1.5倍に対し、アミオダロン投与群は約3.5倍の増加率を示し、本実験条件においては、アミオダロン投与群の方がフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群よりリン脂質症の程度は重度であると考えられた。
【００３４】
CE-TOFMSにより生体内物質の一斉分析を実施した後、メタボローム・ディファレンシャルディスプレイ法による各生体内物質量の群間比較をWilliamsの多重比較検定で行うとともに各個体毎に肺組織中のホスファチジルコリン量との間でピアソンとスピアマンの相関係数を求め、相関係数0.5以上又は-0.5以下のピークを抽出した。個々のピークについては精密質量及び電気移動度から候補物質の絞込み、質量分析装置（MS/MS）による物質の構造推定を行い、標準物質が入手可能な物質については比較し物質を同定した。その結果、表１に示すように、アミオダロン投与群とフェノキシプロピルアミン化合物（I）投与群においてともに変動する代謝物として、尿からはトリメチルアミン N−オキシド、ヒポタウリン、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、L-カルニチン、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、フルクトシルリジン、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、フェニルアセチルグリシン、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、及び5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネートが見出され、血清からはトリメチルアミン N−オキシド、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン及びL-ヒスチジンが見出された。同定もしくは推定された物質は、ヒスチジンやトリプトファンなどのアミノ酸代謝経路、脂肪酸のβ酸化経路及び尿素回路などに由来する生体内代謝物質であった。この中のフェニルアセチルグリシンは薬物誘発性リン脂質症のバイオマーカーとしての有用性が報告されており（Biomarkers, 5, pp.410-423, 2000；Magn. Reson. Chem., 39, pp.559-565, 2000）、本発明の予測・診断方法が高い精度を有していることを示唆している。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】肺組織中のホスファチジルコリン量を示した図である。図中、化合物(I)はフェノキシプロピルアミン化合物（I）の結果を示す。データは平均値＋標準偏差を示し、**、p<0.01（Dunnettの多重比較検定）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法であって、下記の工程：
(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び下記の式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)：
【化１】
のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【請求項２】
特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N-オキシド、ヒポタウリン，フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
特定生体内物質がL-カルニチンである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が尿、血漿、血清、又は組織ホモジネートである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織ホモジネートが肺ホモジネート又は肝臓ホモジネートである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
医薬候補化合物のスクリーニング方法であって、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の予測方法により脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定された被験物質を被験物質群から除外して脂質代謝異常症の誘発可能性のない医薬候補化合物を選抜する工程を含む方法。
【請求項９】
被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーであって、請求項１に記載の特定生体内物質を含むバイオマーカー。
【請求項１０】
脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：
(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び請求項１に記載のフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【請求項１１】
脂質代謝異常症が遺伝性リピドーシス、薬物起因性リピドーシス、又は脂肪酸代謝ホメオスタシス異常である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脂質代謝異常症の診断用マーカーであって、請求項１０に記載の特定生体内物質を含む診断用マーカー。
【請求項１】
被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測する方法であって、下記の工程：
(1)被験物質をヒト以外の哺乳類動物に投与した後、該哺乳類動物から生体試料を採取する工程；及び
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を被験物質を投与していない哺乳類動物から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該被験物質が脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び下記の式で表されるフェノキシプロピルアミン化合物(I)：
【化１】
のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【請求項２】
特定生体内物質の測定をメタボローム解析により行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4,6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸、トリメチルアミン N-オキシド、ヒポタウリン，フルクトシルリジン、ベタイン、L-アスパラギン、L-オルニチン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-ヒスチジンからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
特定生体内物質がL-カルニチン、4-ベータ-アセチルアミノエチルイミダゾール、N-アセチル-L-ヒスチジン、1-リボシルイミダゾール-4-アセテート、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ-2-キノリンカルボン酸、4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン、3-インドキシルスルフェート、5-2'-カルボキシエチル-4_6-ジヒドロキシピコリネート、グアニジドアセテート、4-グアニジノブタノエート、N-アミジノ-L-アスパラギン酸からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質である請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
特定生体内物質がL-カルニチンである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が尿、血漿、血清、又は組織ホモジネートである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織ホモジネートが肺ホモジネート又は肝臓ホモジネートである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
医薬候補化合物のスクリーニング方法であって、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の予測方法により脂質代謝異常症を誘発する可能性があると判定された被験物質を被験物質群から除外して脂質代謝異常症の誘発可能性のない医薬候補化合物を選抜する工程を含む方法。
【請求項９】
被験物質の脂質代謝異常症誘発可能性を予測するためのバイオマーカーであって、請求項１に記載の特定生体内物質を含むバイオマーカー。
【請求項１０】
脂質代謝異常症の診断方法であって、下記の工程：
(1)ヒトを含む哺乳類動物個体から生体試料を採取する工程；
(2)該生体試料中に含まれる特定生体内物質を測定し、得られた測定結果を健常者から採取した生体試料中に含まれる該特定生体内物質の測定結果と比較し、これらの測定結果に有意差が認められた場合には該個体は脂質代謝異常症の発症可能性を有すると判定する工程
を含み、かつ該特定生体内物質がアミオダロン及び請求項１に記載のフェノキシプロピルアミン化合物(I)のそれぞれの投与により有意に変動する1種又は2種以上の物質である方法。
【請求項１１】
脂質代謝異常症が遺伝性リピドーシス、薬物起因性リピドーシス、又は脂肪酸代謝ホメオスタシス異常である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脂質代謝異常症の診断用マーカーであって、請求項１０に記載の特定生体内物質を含む診断用マーカー。
【図１】
【公開番号】特開２００７−３１５８５２（Ｐ２００７−３１５８５２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４４０３４（Ｐ２００６−１４４０３４）
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【出願人】（５０４０５９４２９）ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【出願人】（５０４０５９４２９）ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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