腸内細菌科の細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造方法
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された腸内細菌科の細菌を使用して、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸などのＬ−アミノ酸を製造する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関し、さらに詳しくは、この発酵に有用な遺伝子に関する。これらの遺伝子は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産の向上に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然資源から得られる微生物又はそれらの突然変異体の株を利用した発酵方法により工業的に生産されている。通常、微生物はＬ−アミノ酸の生産性を高めるように改変される。
【０００３】
組換えＤＮＡによる微生物の形質転換など、Ｌ−アミノ酸の生産量を高める多くの方法が報告されている（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号を参照）。生産量を高める他の方法は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること及び／又は目的Ｌ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を脱感作させることを含む（例えば、国際公開ＷＯ９５／１６０４２、又は米国特許第４，３４６，１７０号、同第５，６６１，０１２号及び同第６，０４０，１６０号を参照）。
【０００４】
Ｌ−スレオニン生合成に関与する酵素の活性が増大した株（米国特許第５，１７５，１０７号、同第５，６６１，０１２号、同第５，７０５，３７１号、同第５，９３９，３０７号、欧州特許第０２１９０２７号）、Ｌ−スレオニン及びその類似体等の化学物質に対して耐性を示す株（国際特許公開０１／１４５２５Ａ１、欧州特許第３０１５７２号Ａ２、米国特許第５，３７６，５３８号）、生産されるＬ−アミノ酸又はその副生成物によるフィードバック阻害に対して標的酵素が脱感作した株（米国特許第５，１７５，１０７号、同第５，６６１，０１２号）、及びスレオニン分解酵素が不活性化した株（米国特許第５，９３９，３０７号、同第６，２９７，０３１号）を含む、Ｌ−スレオニンの発酵生産に有用な株が知られている。
【０００５】
既知のスレオニン生産株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６（米国特許第５，１７５，１０７号及び同第５，７０５，３７１号）は、現在では最もよく知られたスレオニン生産株のうちの１つである。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株の構築のために、以下に記載される幾つかの変異及びプラスミドが、親株エシェリヒア・コリＫ−１２（ＶＫＰＭ Ｂ−７）に導入された。変異型ｔｈｒＡ遺伝子（ｔｈｒＡ４４２変異）は、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のあるアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。変異型ｉｌｖＡ遺伝子（ｉｌｖＡ４４２変異）は、低活性のスレオニンデアミナーゼをコードし、これはイソロイシン生合成の低下及びイソロイシン部分要求の表現型をもたらす。ｉｌｖＡ４４２変異を含有する細菌では、ｔｈｒＡＢＣオペロンの転写は、イソロイシンにより抑制されず、したがって、スレオニン生産にとって非常に効率的である。スレオニンデヒドロゲナーゼをコードするｔｄｈ遺伝子の不活性化によって、スレオニン分解を防止できる。サッカロース資化の遺伝的決定因子（ｓｃｒＫＹＡＢＲ遺伝子）が上記株に導入された。スレオニン生合成を制御する遺伝子の発現を増大するために、変異型スレオニンオペロンｔｈｒＡ４４２ＢＣを含有するプラスミドｐＶＩＣ４０を、中間体株ＴＤＨ６に導入した。当該株が発酵中に蓄積するＬ−スレオニンの量は、最大８５ｇ／ｌになり得る。
【０００６】
所望の化合物の主な生合成経路を最適化すれば、炭素源であるグルコース等の糖の量を増大させることにより、Ｌ−アミノ酸生産株のさらなる改良を達成することができる。Ｐ
ＴＳによるグルコース輸送は効率が良いにもかかわらず、高い生産性の株における炭素源へのアクセスは、未だに不十分かもしれない。
【０００７】
幾つかの輸送系により糖や他の代謝産物が細菌細胞へ能動輸送されることが知られている。これらの中で、エシェリヒア・コリ由来のＸｙｌＥタンパク質は、Ｄ−キシロースの取り込みに関与するエシェリヒア・コリにおける２つの系のうちの１つであるＤ−キシロースパーミアーゼであり、もう１つはＡＴＰ依存性のＡＢＣトランスポーターＸｙｌＦＧＨである。クローン化されたｘｙｌＥ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏでｘｙｌＥ変異を相補することが示されている(Davis, E. O. 及びHenderson, P. J., J. Biol. Chem., 262(29);13928-32(1987))。細胞全体におけるｘｙｌＥ介在性の輸送は、プロトノフォアで阻害され、アルカリ性へのｐＨ変化を引き起こす(Lam, V.M. 他, J. Bacteriol. 143(1); 396-402(1980))。ｘｙｌＥ及びｘｙｌＦ変異を利用した実験によって、ｘｙｌＥタンパク質はＤ−キシロースに対するＫＭが６３〜１６９μＭであることが立証されている(Sumiya. M.他, Receptors Channels, 3(2); 117-28(1995))。ｘｙｌＥタンパク質は、トランスポーターのメジャーファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のメンバーであり(Griffith, J.K. 他, Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95(1992))、Ｄ−キシロース／プロトン輸送体として機能すると考えられる。ｘｙｌＥ遺伝子は、モノシストロン性のオペロンを構成し、この遺伝子の発現はＤ−キシロースによって誘導されると考えられている。取り込まれたキシロースは、ＸｙｌＡ（キシロースイソメラーゼ）及びＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）酵素の作用によって、キシルロース−５−リン酸に変換される。ｘｙｌＡ遺伝子によってコードされるキシロースイソメラーゼは、適切な条件下でＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換を効果的に触媒する(Wovcha, M. G. 他, Appl Environ Microbiol. 45(4): 1402-4(1983))。
【０００８】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸の生産を増大させるためにＤ−キシロースパーミアーゼの活性が増大した腸内細菌科の細菌を使用することは現在のところ報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、及びこれらの株を使用して非芳香族又は芳香族のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子の発現を増加させることによって、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産が高められるという発見により達成され、本発明が完成した。
【００１１】
本発明の目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによって増加した、前記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現が増加するように該遺伝子の発現制御配列を改変すること、またはＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が高められた、前記細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、さらに、グルコキナーゼ活性が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、さらに、キシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、さらに、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される、前記細菌を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記遺伝子が、
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；及び
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるＤ−キシロースパーミアーゼをコードする、前記細菌を提供することである
【００１９】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列または該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを含む、前記細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣの塩濃度、０．１％ＳＤＳ、６０℃で１５分間洗浄する条件を含む、前記細菌を提供することである
【００２１】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−スレオニン生産菌である、前記細菌を提供することである
【００２２】
本発明のさらなる目的は、
アスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードし、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性を示す変異型ｔｈｒＡ遺伝子、
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、
推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子、及び
それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される遺伝子の発現が増加するようにされに改変された、前記細菌を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−リジン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−ヒスチジン生産菌である、前記細菌を提供することであ
る。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アルギニン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−グルタミン酸生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、培地で前記細菌を培養して培地にＬ−アミノ酸を蓄積させ、培地からＬ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、培地がキシロースを含む、前記方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、前記方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである、前記方法を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、前記方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、培地で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を生産し且つ排出する能力のある細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与されるか又は高められてもよい。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語はまた、培地でエシェリヒア・コリＫ１２等の野生型株又は親株のエシェリヒア・コリよりも大量にＬ−アミノ酸を生産し且つ蓄積することのできる細菌を意味し、好ましくは細菌が培地中に０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸が特に好ましい。
【００３８】
腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、フォトラブズス属（Photorhabdus）、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属、及びエルシニア属（Yersinia）等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００３９】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用される場合のエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００４０】
本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F.C.他(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により記載される細菌が本発明により包含される。
【００４１】
「パントエア属細菌」という用語は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってパントエア属に分類されることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスの数種は最近、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティ等に再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173(1993))。
【００４２】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された腸内細菌科の株を包含する。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を天然には有さず、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするＤＮＡフラグメントで形質転換された腸内細菌科の株も包含する。
【００４３】
「Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性」という語句は、キシロース及びグルコース等の糖類を細胞に輸送する活性を意味する。糖輸送のＰＴＳ系が破壊された細菌の生育の遅延に対する相補性(例えば、本実施例で記載されるΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ変異を参照)、又はｉｎ ｖｉｖｏでのｘｙｌＥ変異に対する相補性（Davis, E.O.及びHenderson, P.J., J. Biol. Chem., 262(29); 13928-32(1987)）により、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を検出することができる。
【００４４】
「細菌がＤ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された」という語句は、改変株の細胞あたりのＤ−キシロースパーミアーゼ活性が、非改変株（例えば、野生型株）の活性よりも高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞あたりのＤ−キシロースパーミアーゼ分子数の増加、Ｄ−キシロースパーミアーゼ分子あたりの比活性の増加等が挙げられる。比較目的に使用することができる野生型株には、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２が挙げられる。本発明においては、細胞内のＤ−キシロースパーミアーゼ活性を高めた結果として、培地中のＬ−アミノ酸（例えば、Ｌ−スレオニン又はＬ−アルギニン）の蓄積量が増加する。
【００４５】
Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子の発現を増大することで、細菌細胞内のＤ−キシロースパーミアーゼ活性を増強することができる。エシェリヒア属細菌由来の任意のｘｙｌＥ遺伝子、並びにコリネ型細菌等の他の細菌由来の任意のｘｙｌＥ
遺伝子を、本発明ではＤ−キシロースパーミアーゼ遺伝子として使用することができる。エシェリヒア属細菌由来のｘｙｌＥ遺伝子が好ましい。
【００４６】
「遺伝子の発現を増大する」という語句は、改変株における遺伝子の発現量が非改変株（例えば、野生型株）の遺伝子の発現量より多いことを意味する。このような改変の例としては、細胞あたりの遺伝子のコピー数の増加、遺伝子の発現レベルの増加等が挙げられる。遺伝子のコピー数の定量は、例えば、染色体ＤＮＡを制限酵素処理し、遺伝子配列に基づくプローブを利用したサザンブロット法やｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの蛍光（ＦＩＳＨ）等によって行われる。ノーザンブロット法、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の様々な方法によって、遺伝子発現のレベルを測定することができる。さらに、対照として使用することができる野生型株としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２又はパントエア・アナナティスＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が挙げられる（米国特許第２００４１８０４０４Ａ１号）。パントエア・アナナティスＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に１９９８年２月１９日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４の寄託番号を受けた。その後、１９９９年１月１１日にブダペスト条約の規定の下、国際寄託に移管され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４を受けた。この株は単離されたときはエンテロバクター・アグロメランスとして同定されたが、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づき、上記のようにパントエア・アナナティスに再分類されている。
【００４７】
Ｄ−キシロースパーミアーゼの細胞内活性を高めた結果として、培地における、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の蓄積が増大する。
【００４８】
エシェリヒア・コリ由来のＤ−キシロースパーミアーゼ、すなわちＤ−キシロース／プロトン輸送体をコードするｘｙｌＥ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列の塩基番号４２４０２７７〜４２３８８０２）。ｘｙｌＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｙｊｂＡ ＯＲＦ遺伝子とｍａｌＧ遺伝子の間に位置している。また、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする他のｘｙｌＥ遺伝子も解明されている（ＡＡＮ４５５９５：キシロース−プロトンｓｙｍ…（ｇｉ：２４０５４６８６）；ＡＡＭ４１０５０：ＭＦＳトランスポーター…（ｇｉ：２１１１２８５３）；キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)：ＸＣＣ１７５９）。本発明において、エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＥ遺伝子は、配列番号１で表される。
【００４９】
細胞への輸送時に、グルコースはｇｌｋ遺伝子がコードするグルコキナーゼでリン酸化される。したがって、細菌をグルコキナーゼ活性が増加するように改変することも望ましい。エシェリヒア・コリのグルコキナーゼをコードするｇｌｋ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１２７９９４の配列における塩基番号２５０６４８１〜２５０７４４６）。ｇｌｋ遺伝子はエシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｂ２３８７ＯＲＦとｂ２３８９ＯＲＦの間に位置している。
【００５０】
ｘｙｌＡ遺伝子がコードするキシロースイソメラーゼはまた、適切な条件下でＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換を効率的に触媒する(Wovcha, M.G. 他, Appl Environ
Microbiol. 45(4): 1402-4(1983))。したがって、細菌をキシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変することも望ましい。エシェリヒア・コリのキシロースイソメラーゼをコードするｘｙｌＡ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列における塩基番号３７２８７８８〜３７２７４６６）。ｘｙｌＡ遺伝子はエシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｘｙｌＢ遺伝子とｘｙｌＦ遺伝子の間に位置している。
【００５１】
さらなる炭素源として、キシロースが培地に含まれるとき、キシロース資化酵素の活性の増大が必要になる。「キシロース資化酵素」としては、キシロース輸送、キシロース異性化、及びキシロースリン酸化に関する酵素、並びに調節タンパク質が挙げられる。このような酵素としては、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシロース輸送体、及びキシロース転写活性化因子が挙げられる。キシロースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの異性化反応を触媒する。キシルロキナーゼは、ＡＴＰを使用したＤ−キシルロースのリン酸化反応を触媒して、Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート及びＡＤＰを生成する。キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ等のキシロース資化酵素の活性の存在は、それぞれ対応するキシロースイソメラーゼ欠損エシェリヒア・コリ変異体、又はキシルロキナーゼ欠損エシェリヒア・コリ変異体への相補性により測定することができる。
【００５２】
上記のキシロース資化酵素をコードする遺伝子はエシェリヒア・コリの染色体上のｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座に位置している。キシルロキナーゼ（ＥＣ番号 ２．７．１．１７）をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＢで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３５の配列における塩基番号３７２５５４６〜３７２７０００）。キシロース結合タンパク質輸送系をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＦで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３７の配列における塩基番号３７２８７６０〜３７２９７５２）。キシロース輸送系の推定ＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＧで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３８の配列における塩基番号３７２９８３０〜３７３１３７１）。ＡＢＣ型のキシロース輸送系のパーミアーゼ成分をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＨで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３９の配列における塩基番号３７３１３４９〜３７３２５３０）。ｘｙｌオペロンの転写調節因子をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＲで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４４０の配列における塩基番号３７３２６０８〜３７３３７８６）。
【００５３】
したがって、遺伝子の既知の塩基配列に基づき調製したプライマーを利用したＰＣＲによって、ｘｙｌＥ、ｇｌｋ、及びｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の遺伝子を得ることができる（ポリメラーゼ鎖反応、White, T.J. 他, Trends Genet., 5, 185(1989)を参照のこと）。他の微生物のＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子も同様の方法で得ることができる。
【００５４】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有する、配列番号２で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質。
【００５５】
本発明で使用される「変異体タンパク質」という語句は、配列の変化を有するタンパク質であって、この配列の変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであっても、有用なレベル、例えば、Ｌ−アミノ酸の生産を増大させるのに有用なレベルで、所望の活性を維持するタンパク質を意味する。変異体タンパク質の変化の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又はタイプによって異なる。これは、タンパク質（Ａ）では、２〜３０、好ましくは２〜１５、及びより好ましくは２〜５であり得る。タンパク質の機能に重要ではないタンパク質の領域でこれらの変異体の変化が起こり得る。これは、幾つかのアミノ酸が互いに高い相同性を有するため、三次元構造又は活性がこの
ような変化による影響を受けないからである。タンパク質の機能に重要ではないタンパク質の領域で、変異体タンパク質のこれらの変化が起こり得る。したがって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を維持している限り、変異体タンパク質（Ｂ）は、配列番号２で示されるＤ−キシロースパーミアーゼの全アミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであり得る。既知の方法、例えば、３つのパラメーター：スコア、同一性、及び類似性を算出する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ２．０を使用して、２つのアミノ酸配列間の相同性を計算することができる。
【００５６】
上記のＤ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、指定部位での１つ又は複数のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加を包含するように、部位特異的変異誘発法を用いて、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を改変することにより得ることができる。上記のような改変ＤＮＡは、従来から知られている変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の試薬による上記ＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００５７】
１つ又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００５８】
Ｄ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞において上記のような変異を有するＤＮＡを発現させ、発現生成物の活性を試験することにより得ることができる。Ｄ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、例えば、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示される塩基配列を有するプローブとハイブリダイズし、Ｄ−キシロースパーミアーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、５０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることができない条件により例示され得る。あるいは、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件に相当する塩濃度、すなわち、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、ＤＮＡがハイブリダイズする条件により、ストリンジェントな条件が例示され得る。洗浄時間は、ブロット法に使用される膜のタイプによって異なり、これは一般的には製造業者によって推奨されるものである。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)の
推奨される洗浄時間は１５分間である。好ましくは、洗浄は２、３回行われる。
【００５９】
配列番号１の塩基配列の部分配列をプローブとして使用することもできる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、洗浄するためのハイブリダイゼーション条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。
【００６０】
上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加は、例えば細菌の種又は属の多様性に起因して自然に存在し、且つＤ−キシロースパーミアーゼを有する変異も包含する（突然変異体又は変異体）。
【００６１】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」は、例えば従来の方法によるＤＮＡの細菌への導入を意味する。このＤＮＡの形質転換は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらし、それにより細菌細胞内のタンパク質の活性を高める。形質転換の方法としては、これまでに報告されている任意の既知の方法が挙げられる。例えば、細胞のＤＮＡに対する透過性を増大するために、塩化カルシウムで受容細胞を処理する方法が、エシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、この方法が使用され得る。
【００６２】
遺伝子発現を高める方法としては、遺伝子のコピー数を増大させることが挙げられる。腸内細菌科の細菌において機能するベクターへの遺伝子導入は、その遺伝子のコピー数を増加させる。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターの例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が挙げられるがこれらに限定されない。「低コピーベクター」という用語は、ベクターに関して使用されるものであり、そのコピー数が、１細胞あたり最大５コピーである。
【００６３】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組換え、Ｍｕ組込み等の方法による細菌染色体への遺伝子の多コピーの導入によっても達成され得る。例えば、１回のＭｕ組込みでは、最大３コピーの遺伝子を細菌染色体へ導入させることが可能である。
【００６４】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ遺伝子のコピー数の増加は、Ｄ−キシルロースパーミアーゼ遺伝子を多コピー細菌の染色体ＤＮＡへ導入することによっても達成することができる。多コピーの遺伝子を細菌の染色体に導入するために、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的として、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、反復性ＤＮＡ、又は転移因子の末端に存在する逆方向反復配列が挙げられるが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号で開示されるように、Ｄ−キシロースパーミアーゼ遺伝子をトランスポゾンに組み込んで遺伝子の多コピーを染色体ＤＮＡに導入することも可能である。
【００６５】
また、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても、遺伝子発現の増強を達成することができる。例えば、強力なプロモーターとして、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、及びλファージのＰＲプロモーター又はＰＬプロモーターが知られている。本発明のＤＮＡの下流に強力なターミネーターを置くことによっても、遺伝子の発現の増強を達成することができる。強力なプロモーター及び／又は強力なターミネーターの使用は、遺伝子のコピーの増加と組み合わせてもよい。別の方法として、例えば、プロモーターの下流に位置する構造遺伝子（遺伝子のコード領域）の転写レベルを増大させるような変異をプロモーターに導入し、プロモーターの効果を高めることもできる。同様に、例えば、ターミネーターの下流に位置する遺伝子の転写のターンオーバーを増加させるような変異をターミネーターに導入してターミネーターの
効果を高めることもできる。
【００６６】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドン、特に開始コドンのすぐ上流の配列との間のスペーサーにおける数塩基の置換は、ｍＲＮＡの翻訳能に顕著に影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つの塩基の性質に依存して、発現レベルにおける２０倍の差が見出された(Gold他, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,
1981; Hui他, EMBO J., 3, 623-629, 1984)。ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに関する位置−１でのＧのＡへの置換であることが報告されている(1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457、ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology)。したがって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子発現を高め、結果として、スレオニン、ホモセリン及び細胞から輸送される他の物質に対する耐性を増大させることが示唆される。
【００６７】
さらに、細菌染色体上のＤキシロースパーミアーゼ遺伝子のプロモーター又はターミネーター領域へ塩基置換を導入することも可能であり、その結果、より強力なプロモーター又はターミネーター機能が達成される。発現制御配列の改変は、例えば、国際特許公開００／１８９３５及び特開平１−２１５２８０号に開示されるように温度感受性プラスミドを使用した遺伝子置換と同じ様式で行うことができる。
【００６８】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの分解及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.,及び Maniatis, T.著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００６９】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本質的に有する細菌へ上述したＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、当該ＤＮＡをすでに保有する細菌へＬ−アミノ酸生産能を付与することによっても得ることができる。
【００７０】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌の親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性を有し、また、ilvA遺伝子にリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010系ベクターに挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００７２】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変される。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００７３】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子が知られている(塩基番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子が知られている(塩基番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子が知られている(塩基番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。
【００７４】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産E. coli VKPM B-3996株に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００７５】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, 塩基番号764〜1651, GenBank
accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual
Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００７６】
E. coliのasd遺伝子は既に知られており(塩基番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いてPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００７７】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に知られており(塩基番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００７８】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を
阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００７９】
WC196株が、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069株と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００８０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌の親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 − B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201
(米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌の親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE.
coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424
B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００８２】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌の親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導体株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン産生株(特開昭57-5693)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌の親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。E. coli VL334 (VKP
M B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性株VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。この株はL-グルタミン酸を生産することができる。
【００８４】
L-グルタミン酸産生細菌の親株は、特に限定はされないが、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼの活性が低下または欠損している株が例示される。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００８５】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００８６】
L-グルタミン酸産生菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株の例としては、パントエア・アナナティス AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。パントエア・アナナティス AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。パントエア・アナナティス AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、エンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、パントエア・アナナティスに再分類されている。AJ13356は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書では、パントエア・アナナティスとして記載する。
【００８７】
Ｌ−アミノ酸の生産
オキサロアセテート（ＯＡＡ）は、Ｔｈｒ及びＬｙｓの合成の基質である。ＯＡＡは、触媒として働くホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）によりＰＥＰから供給される。したがって、細胞におけるＰＥＰＣ濃度の上昇は、これらのアミノ酸の発酵生産に非常に重要であると考えられる。発酵における炭素源としてグルコースを使用するとき、グルコースがグルコース−ホスホトランスフェラーゼ（Ｇｌｃ−ＰＴＳ）系で取り込まれる。この系はＰＥＰを消費し、ＰＴＳにおけるタンパク質はｐｔｓＧ及びｐｔｓＨＩｃｒｒにコードされる。取り込みの際、グルコース１分子からＰＥＰ１分子及びピルビン酸（Ｐｙｒ）１分子が生成される。
【００８８】
グルコースではなく、スクロースで培養したとき、スクロース（Ｓｃｒ−ＰＴＳ）を利用する能力を有するように改変されているＬ−スレオニン生産株及びＬ−リジン生産株は、これらのアミノ酸の生産性がより高くなる（欧州特許第１１４９９１１Ａ２号）。Ｓｃ
ｒ−ＰＴＳによって、スクロース１分子からＰＥＰ３分子及びＰｙｒ１分子が生成され、ＰＥＰ／Ｐｙｒ比が増加し、それによりスクロースからのＴｈｒ及びＬｙｓの合成が容易になると考えられる。さらに、Ｇｌｃ−ＰＴＳはなんらかの発現制御を受けることが報告されており(Postma P. W.他, Microbiol Rev., 57(3), 543-94(1993); Clark B.他 J. Gen. Microbiol., 96(2), 191-201(1976); Plumbridge J., Curr. Opin. Microbiol., 5(2), 187-93(2002); Ryu S.他, J. Biol. Chem., 270(6): 2489-96(1995))、したがって、グルコースの取り込み自体がアミノ酸発酵において律速段階であり得る可能性がある。
【００８９】
ｘｙｌＥ遺伝子の発現を増大させＰＥＰ／Ｐｙｒ比が増加することにより、スレオニン生産株、リジン生産株、ヒスチジン生産株、フェニルアラニン生産株及び／又はグルタミン酸生産株において、さらにアミノ酸の生産が増大するはずである。グルコース２分子からＰＥＰ４分子が生成されるので、ＰＥＰ／Ｐｙｒ比が大きく改善されることが予測される。ｘｙｌＥ遺伝子の発現が増大することによって、ｇｌｃ−ＰＴＳの発現制御が取り除かれることが予測される。
【００９０】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、培地で本発明の細菌を培養する工程、Ｌ−アミノ酸を培地に蓄積させる工程、及び培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含む。さらに、本発明の方法には、培地で本発明の細菌を培養する工程、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸を培地に蓄積させる工程、及び培地からＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸を回収する工程を含む、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸の製造方法が含まれる。
【００９１】
本発明において、培地等からのＬ−アミノ酸の培養、回収、及び精製は、Ｌ−アミノ酸を微生物によって製造する従来の発酵方法に従って行うことができる。
【００９２】
炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて微生物が生育のために必要とする適量の栄養素が含まれていれば、培地は合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース、及びキシロース等の炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択された微生物の資化の態様に応じて、エタノール及びグリセロール等のアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン類等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵性微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。必要であれば、さらなる栄養素を培地に添加してもよい。例えば、微生物が生育のためにＬ−アミノ酸を必要とする場合（Ｌ−アミノ酸要求性）、十分量のＬ−アミノ酸を培地に添加してもよい。
【００９３】
培養は、振盪または通気下での撹拌等の好気条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で、行うことが好ましい。培地のｐＨは通常、５〜９であり、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日間の培養により培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００９４】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、細胞等の固体を液体培地から除去し、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法によって、標的Ｌ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【００９５】
［実施例］
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照し、より具体的に説明される。
【実施例１】
【００９６】
ハイブリットＰＬ−ｔａｃプロモーターによるエシェリヒア・コリｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域の置換
ｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域を置換するために、「Ｒｅｄ媒介性組込み(Red-mediated integration)」及び／又は「Ｒｅｄ駆動性組込み(Red-driven integration)」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)によって記載される方法で、ハイブリットＰＬ−ｔａｃプロモーター及びｃａｔ遺伝子でコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍＲ）を保有するＤＮＡフラグメントをプロモーター領域の代わりにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）の染色体へ組み込んだ。Ｒｅｄ媒介性の組み換え系に関連するλファージ誘導性の遺伝子のドナーとして、熱感受性レプリコンを有する組み換えプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)を使用した。組み換えプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株はエシェリヒア・コリ遺伝ストックセンター(Genetic Stock Center)（Yale university、米国ニューヘーブン）から得ることができ、この寄託番号はＣＧＳＣ７６３０である。
【００９７】
ハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを化学的に合成した。置換プロモーターの塩基配列が配列表（配列番号３）で示される。ハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを含む合成ＤＮＡフラグメントは、５’末端にＢｇｌＩＩ認識部位を含み、これはｃａｔ遺伝子及び細菌染色体に組み込まれるｘｙｌＥ遺伝子５’末端と相同な３６塩基に結合させるために必要である。
【００９８】
鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセス番号Ｘ０６４０３、"Fermentas"、リトアニア）、並びにプライマーＰ１（配列番号４）及びプライマーＰ２（配列番号５）を使用したＰＣＲによって、ｃａｔ遺伝子でコードされるＣｍＲマーカーを含むＤＮＡフラグメントを得た。プライマーＰ１はこの５’末端にＢｇｌＩＩ認識部位を含み、これはハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターと結合させるために必要であり、プライマーＰ２はｘｙｌＥ遺伝子の開始コドンの２１７ｂｐ上流に位置する領域と相同性がある３６塩基を含み、これは細菌染色体への組込みのためにプライマーに導入された。
【００９９】
「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ」増幅装置を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）は、１５ｍＭのＭｇＣｌ2（"Fermentas"、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（"Fermentas"、リトアニア）、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌの組成とした。ＰＣＲ増幅のために、プラスミドＤＮＡ約５ｎｇを反応混合物に添加した。温度プロファイルは以下の通りであった：９５℃で５分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、そして７２℃で７分間の最後の伸長。
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法で精製し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)を使用して抽出し、エタノールで沈澱させた。
【０１００】
２つの上記のＤＮＡフラグメントそれぞれをＢｇｌＩＩ制限酵素で処理し結合させた。プライマーＰ２（配列番号５）及びプライマーＰ３（配列番号６）を使用したＰＣＲによって結合産物を増幅した。プライマーＰ３は、その５’末端に、細菌染色体への更なる組み込みのためのｘｙｌＥ遺伝子５’末端に相同な３６塩基を含む。
【０１０１】
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法によって精製し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)を使用して抽出し、エタノールで沈澱させた。得られたＤＮＡフラグメントを、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのＲｅｄ媒介性組み込みのために使用した。
【０１０２】
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地で３０℃で一晩、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を生育させ、その後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で１：１００に希釈して（アラビノースはＲｅｄ ｓｙｓｔｅｍのプラスミドをコードした遺伝子を誘導するために使用する）、細菌培養液の光学密度がＯＤ６００＝０．４〜０．７に達するように３０℃で生育させた。細菌培養液１０ｍｌ分の生育細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄し、続いて水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡフラグメント１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に加えた。製造業者の指示に従って、"Bio-Rad"エレクトロポレーター（米国）（No.１６５〜２０９８、version ２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。刺激された細胞をＳＯＣ培地(Sambrook他, "Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))１ｍｌに加えて、３７℃で２時間インキュベートして、その後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天上に広げた。プライマーＰ４（配列番号７）及びプライマーＰ５（配列番号８）を使用したＰＣＲにより、ｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域の代わりにＣｍＲマーカーが存在するか否かに関して、２４時間内で生育したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁し、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。以下の温度プロファイルを使用した：９５℃で１０分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、次いで７２℃で７分間の最後の伸長。
幾つかの試験したＣｍＲコロニーには、所望の約２，０００ｂｐのＤＮＡフラグメントが含まれ、ｘｙｌＥ遺伝子の１９２ｂｐのプロモーター領域の代わりに、ＣｍＲマーカーＤＮＡの存在が確認できた（図１を参照）。３７℃で培養することによって、熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６をこれらの株の１つから脱落させ、得られた株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥと称した。
【実施例２】
【０１０３】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大の、ＰＴＳ輸送系が破壊されたエシェリヒア・コリ株の生育に対する効果
ｘｙｌＥ遺伝子の発現増強のエシェリヒア・コリ株の生育に対する効果を示すために、ＰＴＳ輸送系が破壊されたエシェリヒア・コリ株を構築した。
【０１０４】
この目的のために、実施例１にも記載されている、「Ｒｅｄ媒介性組み込み」及び／又は「Ｒｅｄ駆動性組み込み」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)によって記載される方法で、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の染色体上で、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンをカナマイシン耐性マーカー（ＫｍＲ）を保有するＤＮＡフラグメントで置換した。
【０１０５】
ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンは解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列において、ｐｔｓＨ遺伝子、ｐｔｓＩ遺伝子、及びｃｒｒ遺伝子に関して、それぞれ塩基番号２５３１７８６〜２５３２０４３、２５３２０８８〜２５３３８１５、及び２５３３８５６〜２５３４３６５）。ｐｔｓＨＩ
−ｃｒｒオペロンは、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｃｙｓＫ遺伝子とｐｄｘＫ遺伝子の間に位置している。
【０１０６】
鋳型として市販のプラスミドｐＵＣ４ＫＡＮ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセス番号Ｘ０６４０４、"Fermentas"、リトアニア）、並びにプライマーＰ６（配列番号９）およびプライマーＰ７（配列番号１０）を使用したＰＣＲによって、ＫｍＲ遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントを得た。プライマーＰ６はｐｔｓＨ遺伝子の５’末端と相同である３６塩基を含み、プライマーＰ７はｃｒｒ遺伝子の３’末端と相同である３６塩基を含む。これらの配列は細菌染色体へのさらなる組み込みのためにプライマーＰ６及びプライマーＰ７に導入された。
【０１０７】
実施例１に記載されるようにしてＰＣＲを行った。
【０１０８】
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法によって濃縮し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)による遠心分離でゲルから抽出し、エタノールで沈澱させた。エレクトロポレーション後に５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天プレート上に細胞をまいたことを除いては、実施例１に記載されるようにして、得られたＤＮＡフラグメントを使用し、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのＲｅｄ媒介性組み込みを行った。
【０１０９】
プライマーＰ８（配列番号１１）及びプライマーＰ９（配列番号１２）を使用したＰＣＲにより、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの代わりにＫｍＲマーカーが存在するか否かに関して２４時間内で生育したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌで懸濁して、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、実施例１に記載されている条件であった。幾つかの試験したＫｍＲコロニーには、所望の約１，３００ｂｐのＤＮＡフラグメントが含まれ、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの代わりにＫｍＲ遺伝子の存在を確認した。得られた株の１つを３７℃で培養することによって、熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を脱落させ、得られた株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒと称した。
【０１１０】
その後、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒに移し(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)、ＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を得た。
【０１１１】
炭素源としてグルコース（４％）を有する最少Ａｄａｍｓ培地上で生育する能力を４つのエシェリヒア・コリ株、ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ、及びＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥに関して調べた。図２で示されるように、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒはグルコースを含む最少Ａｄａｍｓ培地上であまり生育しなかった（μ〜０．０６）。ｘｙｌＥ遺伝子発現を増大させることによって、グルコースを含む最少Ａｄａｍｓ培地上の受容株の生育特性が有意に高められた。
【実施例３】
【０１１２】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大のスレオニン生産に対する効果
ＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の高められた発現の、スレオニン生産に対する効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントを、Ｐ１形質導入によって、スレオニン生産エシェリヒア・コリ株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６に導入した(Miller, J.H. (1972) E
xperiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株は１９８７年４月７日に寄託番号Ｂ−３９９６で、ロシア工業用微生物コレクション(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)（ＶＫＰＭ）に寄託されている。
【０１１３】
クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天プレート上で３７℃で１８〜２４時間、エシェリヒア・コリＢ−３９９６株及びＢ−３９９６ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を生育させた。種培養を得るために、４％スクロースを有するＬ培地２ｍｌを含む２０×２００ｍｍの試験管で３２℃で１８時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって、この株を生育させた。その後、種培養液０．２１ｍｌ（１０％）を発酵培地に接種した。２０×２００ｍｍの試験管での最少培地２ｍｌにおいて発酵を行った。２５０ｒｐｍで振盪しながら、３２℃で４８時間、細胞を生育させた。
【０１１４】
培養後、移動相（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））を使用したペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−スレオニンの量を測定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り取り、Ｌ−スレオニンをＣｄＣｌ2の０．５％水溶液で溶出し、Ｌ−スレオニンの量を５４０ｎｍでの分光光度法で推定した。結果を表１に示す。ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの導入により、スレオニン生産が向上した。
【０１１５】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は、以下の通りである。
グルコース ８０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２２．０
ＮａＣｌ ０．８
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２
チアミンＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【０１１６】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾熱滅菌した。ｐＨを７．０に調整した。滅菌後、抗生剤を培地に導入した。
【０１１７】
【表１】
【実施例４】
【０１１８】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大のＬ−リジン生産に対する効果
エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡの全塩基配列は既知である(Science, 277, 1453-1474(1997))。報告された塩基配列に基づきプライマーを合成し、以下のようなＰＣＲ法でｘｙｌＥ遺伝子を増幅した。
【０１１９】
従来の方法で、染色体ＤＮＡを調製した(Sambrook, J., Fritsch E.F.及びManiatis T.(1989): Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)。ＥｃｏＲＩ認識部位をアクセス番号ＡＥ０００４７６の配列７４７９〜７５０８の５’末端に付加してプライマー１０（配列番号１３）を設計して、ＳａｌＩ認識部位をアクセス番号ＡＥ０００４７６の配列８９６３〜８９９２の相補配列の５’末端に付加してプライマー１１（配列番号１４）を設計した。これらのプライマーを使用することによって、"PCR protocols. Current methods and applications"(White, B.A., ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993)に記載されている標準条件に従って、ｘｙｌＥ遺伝子を増幅した。
【０１２０】
従来の方法でＰＣＲ産物を精製した。制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩでこの産物を消化し、ライゲーションキットを使用して、同じ制限酵素で処理したベクターｐＳＴＶ２９へ結合させた。エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセルを結合産物で形質転換して(Sambrook, J., Fritsch E.F.及びManiatis T.(1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、細胞を１０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）、及び５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬプレート（１０ｇ／ｌのバクト−トリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７．０）上に蒔いて、一晩培養した。白色のコロニーが出現し、これをピックアップし単離することによって形質転換細胞を得た。アルカリ抽出法によって、形質転換細胞からプラスミドを調製し、順方向でｘｙｌＥ遺伝子がｌａｃプロモーターと結合したプラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥを得た。
【０１２１】
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産株として、エシェリヒア・コリＷＣ１９６を使用した。
【０１２２】
ＷＣ１９６をプラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥおよびベクターｐＳＴＶ２９のそれぞれで形質転換し、ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９を得た。６００ｎｍでの最終ＯＤが約０．６に達するまで、３７℃で５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地で、これらの株をそれぞれ培養した。その後、等量の４０％グルセロール溶液を培地に加え、混合物を適量で分注して、−８０℃で保存した。以下、これを「グリセロールストック」と称する。
【０１２３】
Ｌ−リジン生産条件下で、キシロースパーミアーゼ活性を高めた効果を確認するために、上述の手順に従って、プラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びプラスミドｐＣＡＢＤ２でＷＣ１９６を形質転換した。ｐＣＡＢＤ２は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子をコードするｄａｐＢ遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子を含むプラスミド（米国特許第６，０４０，１６０号）である。対照として、ＷＣ１９６をプラスミドｐＳＴＶ２９及びプラスミドｐＣＡＢＤ２で形質転換した。６００ｎｍでの最終ＯＤが約０．６に達するまで、３７℃で５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール及び２０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含むＬ培地で、得られた形質転換細胞をそれぞれ培養し
た。その後、等量の４０％グルセロール溶液を培地に加え、混合物を適量で分注して、−８０℃で保存した。
【０１２４】
ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９のグリセロールストックを溶解して、それぞれ１００μｌを５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬプレート上に均一に蒔いて、３７℃で２４時間培養した。さらに、ＷＣ１９６／（ｐＣＡＢＤ２，ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ）及びＷＣ１９６／（ｐＣＡＢＤ２，ｐＳＴＶ２９）のそれぞれを５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール及び２０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含むＬプレート上に均一に蒔いて、３７℃で２４時間培養した。プレート上の細胞量の約１／８を５００ｍｌ容のフラスコで必要な薬剤を含む発酵培地２０ｍｌに接種した。１１５ｒｐｍの撹拌速度で往復式振盪培養機を使用することによって、３７℃で１６時間培養を行った。培養後、培地のＬ−リジン及び残存グルコースの量を既知の方法(Ｂｉｏｔｅｃｈ−ａｎａｌｙｚｅｒ ＡＳ２１０、サクラ精機株式会社製)で測定した。その後、消費したグルコースに対するＬ−リジンの収量を各株について算出した。
【０１２５】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２４
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母エキス ２．０
【０１２６】
ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、１１５℃で１０分間培地をオートクレーブした。グルコース及びＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏは別々に滅菌した。１８０℃で２時間乾熱滅菌した３０ｇ／ｌのＣａＣＯ3を加えた。
【０１２７】
結果を表２に示す。ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥは、キシロースパーミアーゼの発現量が増加していないＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９に比べて、より多くの量のＬ−リジンを蓄積した。さらに、キシロースパーミアーゼ活性を高めることによって、多くの量のＬ−リジンを生産するＷＣ１９６／ｐＣＡＢＤ２でもまた、Ｌ−リジンの蓄積及び収量が向上することが観察された。
【０１２８】
【表２】
【実施例５】
【０１２９】
Ｌ−アルギニン生産におけるｘｙｌＥ遺伝子発現増大の効果
アルギニン生産におけるＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、アルギニン生産エシェリヒア・コリ３８２株に導入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。３８２株は２０００年４月１０日に寄託番号ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６で、ロシア工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ）(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に寄託されている。
【０１３０】
得られた株３８２ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ及び親株３８２を、ＬＢ培地２ｍｌで、３２℃で１８時間、それぞれ培養し、得られた培養液０．３ｍｌを２０×２００ｍｍの試験管の中の発酵培地２ｍｌに接種して、回転式振盪培養機によって３２℃で４８時間培養した。
【０１３１】
培養後、移動相（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））を使用したペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−アルギニンの量を測定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−アルギニンを含むスポットを切り取り、Ｌ−アルギニンをＣｄＣｌ2の０．５％水溶液で溶出し、Ｌ−アルギニンの量を５４０ｎｍでの分光光度法で測定した。
【０１３２】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４８．０
（ＮＨ４）2ＳＯ4 ３５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミンＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．１
ＣａＣＯ3 ５．０
【０１３３】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾熱滅菌した。ｐＨを７．０に調整した。
【０１３４】
１０個の独立した実験の結果を表３に示す。３８２ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株は、Ｄ−キシロースパーミアーゼの発現量が増加していない３８２株に比べて、より多くの量のＬ−アルギニンを蓄積したことが表３からわかる。
【０１３５】
【表３】
【実施例６】
【０１３６】
グルコース及びキシロースの混合物の発酵からのＬ−ヒスチジン生産菌によるＬ−ヒスチジンの生産
グルコース及びキシロースの混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産に、Ｌ−ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株を使用した。エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０）は、ロシア特許番号ＲＵ２１１９５３６において詳細に記載されている。８０株は１９９９年１０月１５日に寄託番号Ｂ−７２７０で、ロシア工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ；Dorozhny proezd. 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された。その後、２００４年６月１２日にブダペスト条約の規定の下、国際寄託に移管された。
【０１３７】
ＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の発現増強のヒスチジン生産における効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株に導入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Gene
tics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。通常の方法により、ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒプラスミドで８０株及び得られた８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を形質転換して、８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株及び８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株を得た。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体からのｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座のクローニングは、ロシア特許出願番号ＲＵ２００５１０６７２０に記載されている。
【０１３８】
種培養を得るために、１ｇ／ｌのストレプトマイシン及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬ培養液２ｍｌを含む４０ｍｌ容の試験管（φ１８ｍｍ）で２７℃で６時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって、８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株及び８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株を生育させた。その後、種培養液２ｍｌ（５％）を発酵培地に接種した。発酵培地２ｍｌを含む４０ｍｌ容の試験管で２７℃で５０時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって発酵を行った。
【０１３９】
培養後、ペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−ヒスチジンの量を測定した。移動相の組成は、ブタノール：アセテート：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）である。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．５％）を可視化試薬として使用した。結果を表４に示す。
【０１４０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
炭水化物（全量） １００．０
マメノウ 全窒素として０．２
（ダイズ加水分解物）
Ｌ−プロリン ０．８
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
チアミンＨＣｌ ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ3 ６．０
ストレプトマイシン １．０
【０１４１】
炭水化物（グルコース、キシロース）、Ｌ−プロリン、ベタイン、及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3は１１０℃で３０分間、乾熱滅菌した。滅菌前にＫＯＨでｐＨを６．０に調整した。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株は、Ｄ−キシロースパーミアーゼの発現が増加していない８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株に比べて、グルコース及びキシロースの混合物を含む培地において、より多くの量のＬ−ヒスチジンを蓄積させたことが表４からわかる。
【０１４４】
本発明を好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また均等物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明は、発酵によりＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等の非芳香族又は芳香族のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供する。本発明によれば、腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌の生産性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】エシェリヒア・コリの染色体におけるｘｙｌＥ遺伝子の上流の領域の構造並びにｃａｔ遺伝子及びハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを含む融合したＤＮＡフラグメントの構造を示す図である。
【図２】グルコースを有する培地で生育させたエシェリヒア・コリ株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ及びＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの増殖曲線を示す図である。ＭＧ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５、ＭＧΔｐｔｓ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ、ＭＧΔｐｔｓＰｘｙｌＥ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関し、さらに詳しくは、この発酵に有用な遺伝子に関する。これらの遺伝子は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産の向上に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然資源から得られる微生物又はそれらの突然変異体の株を利用した発酵方法により工業的に生産されている。通常、微生物はＬ−アミノ酸の生産性を高めるように改変される。
【０００３】
組換えＤＮＡによる微生物の形質転換など、Ｌ−アミノ酸の生産量を高める多くの方法が報告されている（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号を参照）。生産量を高める他の方法は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること及び／又は目的Ｌ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を脱感作させることを含む（例えば、国際公開ＷＯ９５／１６０４２、又は米国特許第４，３４６，１７０号、同第５，６６１，０１２号及び同第６，０４０，１６０号を参照）。
【０００４】
Ｌ−スレオニン生合成に関与する酵素の活性が増大した株（米国特許第５，１７５，１０７号、同第５，６６１，０１２号、同第５，７０５，３７１号、同第５，９３９，３０７号、欧州特許第０２１９０２７号）、Ｌ−スレオニン及びその類似体等の化学物質に対して耐性を示す株（国際特許公開０１／１４５２５Ａ１、欧州特許第３０１５７２号Ａ２、米国特許第５，３７６，５３８号）、生産されるＬ−アミノ酸又はその副生成物によるフィードバック阻害に対して標的酵素が脱感作した株（米国特許第５，１７５，１０７号、同第５，６６１，０１２号）、及びスレオニン分解酵素が不活性化した株（米国特許第５，９３９，３０７号、同第６，２９７，０３１号）を含む、Ｌ−スレオニンの発酵生産に有用な株が知られている。
【０００５】
既知のスレオニン生産株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６（米国特許第５，１７５，１０７号及び同第５，７０５，３７１号）は、現在では最もよく知られたスレオニン生産株のうちの１つである。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株の構築のために、以下に記載される幾つかの変異及びプラスミドが、親株エシェリヒア・コリＫ−１２（ＶＫＰＭ Ｂ−７）に導入された。変異型ｔｈｒＡ遺伝子（ｔｈｒＡ４４２変異）は、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のあるアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。変異型ｉｌｖＡ遺伝子（ｉｌｖＡ４４２変異）は、低活性のスレオニンデアミナーゼをコードし、これはイソロイシン生合成の低下及びイソロイシン部分要求の表現型をもたらす。ｉｌｖＡ４４２変異を含有する細菌では、ｔｈｒＡＢＣオペロンの転写は、イソロイシンにより抑制されず、したがって、スレオニン生産にとって非常に効率的である。スレオニンデヒドロゲナーゼをコードするｔｄｈ遺伝子の不活性化によって、スレオニン分解を防止できる。サッカロース資化の遺伝的決定因子（ｓｃｒＫＹＡＢＲ遺伝子）が上記株に導入された。スレオニン生合成を制御する遺伝子の発現を増大するために、変異型スレオニンオペロンｔｈｒＡ４４２ＢＣを含有するプラスミドｐＶＩＣ４０を、中間体株ＴＤＨ６に導入した。当該株が発酵中に蓄積するＬ−スレオニンの量は、最大８５ｇ／ｌになり得る。
【０００６】
所望の化合物の主な生合成経路を最適化すれば、炭素源であるグルコース等の糖の量を増大させることにより、Ｌ−アミノ酸生産株のさらなる改良を達成することができる。Ｐ
ＴＳによるグルコース輸送は効率が良いにもかかわらず、高い生産性の株における炭素源へのアクセスは、未だに不十分かもしれない。
【０００７】
幾つかの輸送系により糖や他の代謝産物が細菌細胞へ能動輸送されることが知られている。これらの中で、エシェリヒア・コリ由来のＸｙｌＥタンパク質は、Ｄ−キシロースの取り込みに関与するエシェリヒア・コリにおける２つの系のうちの１つであるＤ−キシロースパーミアーゼであり、もう１つはＡＴＰ依存性のＡＢＣトランスポーターＸｙｌＦＧＨである。クローン化されたｘｙｌＥ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏでｘｙｌＥ変異を相補することが示されている(Davis, E. O. 及びHenderson, P. J., J. Biol. Chem., 262(29);13928-32(1987))。細胞全体におけるｘｙｌＥ介在性の輸送は、プロトノフォアで阻害され、アルカリ性へのｐＨ変化を引き起こす(Lam, V.M. 他, J. Bacteriol. 143(1); 396-402(1980))。ｘｙｌＥ及びｘｙｌＦ変異を利用した実験によって、ｘｙｌＥタンパク質はＤ−キシロースに対するＫＭが６３〜１６９μＭであることが立証されている(Sumiya. M.他, Receptors Channels, 3(2); 117-28(1995))。ｘｙｌＥタンパク質は、トランスポーターのメジャーファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のメンバーであり(Griffith, J.K. 他, Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95(1992))、Ｄ−キシロース／プロトン輸送体として機能すると考えられる。ｘｙｌＥ遺伝子は、モノシストロン性のオペロンを構成し、この遺伝子の発現はＤ−キシロースによって誘導されると考えられている。取り込まれたキシロースは、ＸｙｌＡ（キシロースイソメラーゼ）及びＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）酵素の作用によって、キシルロース−５−リン酸に変換される。ｘｙｌＡ遺伝子によってコードされるキシロースイソメラーゼは、適切な条件下でＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換を効果的に触媒する(Wovcha, M. G. 他, Appl Environ Microbiol. 45(4): 1402-4(1983))。
【０００８】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸の生産を増大させるためにＤ−キシロースパーミアーゼの活性が増大した腸内細菌科の細菌を使用することは現在のところ報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、及びこれらの株を使用して非芳香族又は芳香族のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子の発現を増加させることによって、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産が高められるという発見により達成され、本発明が完成した。
【００１１】
本発明の目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによって増加した、前記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現が増加するように該遺伝子の発現制御配列を改変すること、またはＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が高められた、前記細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、さらに、グルコキナーゼ活性が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、さらに、キシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、さらに、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される、前記細菌を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記遺伝子が、
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；及び
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるＤ−キシロースパーミアーゼをコードする、前記細菌を提供することである
【００１９】
本発明のさらなる目的は、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列または該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを含む、前記細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣの塩濃度、０．１％ＳＤＳ、６０℃で１５分間洗浄する条件を含む、前記細菌を提供することである
【００２１】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−スレオニン生産菌である、前記細菌を提供することである
【００２２】
本発明のさらなる目的は、
アスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードし、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性を示す変異型ｔｈｒＡ遺伝子、
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、
推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子、及び
それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される遺伝子の発現が増加するようにされに改変された、前記細菌を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現が増加するように改変された、前記細菌を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−リジン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−ヒスチジン生産菌である、前記細菌を提供することであ
る。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アルギニン生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−グルタミン酸生産菌である、前記細菌を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、培地で前記細菌を培養して培地にＬ−アミノ酸を蓄積させ、培地からＬ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、培地がキシロースを含む、前記方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、前記方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである、前記方法を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、前記方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、培地で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を生産し且つ排出する能力のある細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与されるか又は高められてもよい。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語はまた、培地でエシェリヒア・コリＫ１２等の野生型株又は親株のエシェリヒア・コリよりも大量にＬ−アミノ酸を生産し且つ蓄積することのできる細菌を意味し、好ましくは細菌が培地中に０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸が特に好ましい。
【００３８】
腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、フォトラブズス属（Photorhabdus）、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属、及びエルシニア属（Yersinia）等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００３９】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用される場合のエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００４０】
本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F.C.他(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により記載される細菌が本発明により包含される。
【００４１】
「パントエア属細菌」という用語は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってパントエア属に分類されることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスの数種は最近、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティ等に再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173(1993))。
【００４２】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された腸内細菌科の株を包含する。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を天然には有さず、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするＤＮＡフラグメントで形質転換された腸内細菌科の株も包含する。
【００４３】
「Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性」という語句は、キシロース及びグルコース等の糖類を細胞に輸送する活性を意味する。糖輸送のＰＴＳ系が破壊された細菌の生育の遅延に対する相補性(例えば、本実施例で記載されるΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ変異を参照)、又はｉｎ ｖｉｖｏでのｘｙｌＥ変異に対する相補性（Davis, E.O.及びHenderson, P.J., J. Biol. Chem., 262(29); 13928-32(1987)）により、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を検出することができる。
【００４４】
「細菌がＤ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された」という語句は、改変株の細胞あたりのＤ−キシロースパーミアーゼ活性が、非改変株（例えば、野生型株）の活性よりも高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞あたりのＤ−キシロースパーミアーゼ分子数の増加、Ｄ−キシロースパーミアーゼ分子あたりの比活性の増加等が挙げられる。比較目的に使用することができる野生型株には、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２が挙げられる。本発明においては、細胞内のＤ−キシロースパーミアーゼ活性を高めた結果として、培地中のＬ−アミノ酸（例えば、Ｌ−スレオニン又はＬ−アルギニン）の蓄積量が増加する。
【００４５】
Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子の発現を増大することで、細菌細胞内のＤ−キシロースパーミアーゼ活性を増強することができる。エシェリヒア属細菌由来の任意のｘｙｌＥ遺伝子、並びにコリネ型細菌等の他の細菌由来の任意のｘｙｌＥ
遺伝子を、本発明ではＤ−キシロースパーミアーゼ遺伝子として使用することができる。エシェリヒア属細菌由来のｘｙｌＥ遺伝子が好ましい。
【００４６】
「遺伝子の発現を増大する」という語句は、改変株における遺伝子の発現量が非改変株（例えば、野生型株）の遺伝子の発現量より多いことを意味する。このような改変の例としては、細胞あたりの遺伝子のコピー数の増加、遺伝子の発現レベルの増加等が挙げられる。遺伝子のコピー数の定量は、例えば、染色体ＤＮＡを制限酵素処理し、遺伝子配列に基づくプローブを利用したサザンブロット法やｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの蛍光（ＦＩＳＨ）等によって行われる。ノーザンブロット法、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の様々な方法によって、遺伝子発現のレベルを測定することができる。さらに、対照として使用することができる野生型株としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２又はパントエア・アナナティスＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が挙げられる（米国特許第２００４１８０４０４Ａ１号）。パントエア・アナナティスＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に１９９８年２月１９日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４の寄託番号を受けた。その後、１９９９年１月１１日にブダペスト条約の規定の下、国際寄託に移管され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４を受けた。この株は単離されたときはエンテロバクター・アグロメランスとして同定されたが、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づき、上記のようにパントエア・アナナティスに再分類されている。
【００４７】
Ｄ−キシロースパーミアーゼの細胞内活性を高めた結果として、培地における、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の蓄積が増大する。
【００４８】
エシェリヒア・コリ由来のＤ−キシロースパーミアーゼ、すなわちＤ−キシロース／プロトン輸送体をコードするｘｙｌＥ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列の塩基番号４２４０２７７〜４２３８８０２）。ｘｙｌＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｙｊｂＡ ＯＲＦ遺伝子とｍａｌＧ遺伝子の間に位置している。また、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする他のｘｙｌＥ遺伝子も解明されている（ＡＡＮ４５５９５：キシロース−プロトンｓｙｍ…（ｇｉ：２４０５４６８６）；ＡＡＭ４１０５０：ＭＦＳトランスポーター…（ｇｉ：２１１１２８５３）；キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)：ＸＣＣ１７５９）。本発明において、エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＥ遺伝子は、配列番号１で表される。
【００４９】
細胞への輸送時に、グルコースはｇｌｋ遺伝子がコードするグルコキナーゼでリン酸化される。したがって、細菌をグルコキナーゼ活性が増加するように改変することも望ましい。エシェリヒア・コリのグルコキナーゼをコードするｇｌｋ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１２７９９４の配列における塩基番号２５０６４８１〜２５０７４４６）。ｇｌｋ遺伝子はエシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｂ２３８７ＯＲＦとｂ２３８９ＯＲＦの間に位置している。
【００５０】
ｘｙｌＡ遺伝子がコードするキシロースイソメラーゼはまた、適切な条件下でＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換を効率的に触媒する(Wovcha, M.G. 他, Appl Environ
Microbiol. 45(4): 1402-4(1983))。したがって、細菌をキシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変することも望ましい。エシェリヒア・コリのキシロースイソメラーゼをコードするｘｙｌＡ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列における塩基番号３７２８７８８〜３７２７４６６）。ｘｙｌＡ遺伝子はエシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｘｙｌＢ遺伝子とｘｙｌＦ遺伝子の間に位置している。
【００５１】
さらなる炭素源として、キシロースが培地に含まれるとき、キシロース資化酵素の活性の増大が必要になる。「キシロース資化酵素」としては、キシロース輸送、キシロース異性化、及びキシロースリン酸化に関する酵素、並びに調節タンパク質が挙げられる。このような酵素としては、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシロース輸送体、及びキシロース転写活性化因子が挙げられる。キシロースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの異性化反応を触媒する。キシルロキナーゼは、ＡＴＰを使用したＤ−キシルロースのリン酸化反応を触媒して、Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート及びＡＤＰを生成する。キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ等のキシロース資化酵素の活性の存在は、それぞれ対応するキシロースイソメラーゼ欠損エシェリヒア・コリ変異体、又はキシルロキナーゼ欠損エシェリヒア・コリ変異体への相補性により測定することができる。
【００５２】
上記のキシロース資化酵素をコードする遺伝子はエシェリヒア・コリの染色体上のｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座に位置している。キシルロキナーゼ（ＥＣ番号 ２．７．１．１７）をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＢで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３５の配列における塩基番号３７２５５４６〜３７２７０００）。キシロース結合タンパク質輸送系をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＦで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３７の配列における塩基番号３７２８７６０〜３７２９７５２）。キシロース輸送系の推定ＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＧで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３８の配列における塩基番号３７２９８３０〜３７３１３７１）。ＡＢＣ型のキシロース輸送系のパーミアーゼ成分をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＨで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４３９の配列における塩基番号３７３１３４９〜３７３２５３０）。ｘｙｌオペロンの転写調節因子をコードする遺伝子が知られており、ｘｙｌＲで示される（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１３１４４０の配列における塩基番号３７３２６０８〜３７３３７８６）。
【００５３】
したがって、遺伝子の既知の塩基配列に基づき調製したプライマーを利用したＰＣＲによって、ｘｙｌＥ、ｇｌｋ、及びｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の遺伝子を得ることができる（ポリメラーゼ鎖反応、White, T.J. 他, Trends Genet., 5, 185(1989)を参照のこと）。他の微生物のＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子も同様の方法で得ることができる。
【００５４】
エシェリヒア・コリ由来のｘｙｌＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有する、配列番号２で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質。
【００５５】
本発明で使用される「変異体タンパク質」という語句は、配列の変化を有するタンパク質であって、この配列の変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであっても、有用なレベル、例えば、Ｌ−アミノ酸の生産を増大させるのに有用なレベルで、所望の活性を維持するタンパク質を意味する。変異体タンパク質の変化の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又はタイプによって異なる。これは、タンパク質（Ａ）では、２〜３０、好ましくは２〜１５、及びより好ましくは２〜５であり得る。タンパク質の機能に重要ではないタンパク質の領域でこれらの変異体の変化が起こり得る。これは、幾つかのアミノ酸が互いに高い相同性を有するため、三次元構造又は活性がこの
ような変化による影響を受けないからである。タンパク質の機能に重要ではないタンパク質の領域で、変異体タンパク質のこれらの変化が起こり得る。したがって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を維持している限り、変異体タンパク質（Ｂ）は、配列番号２で示されるＤ−キシロースパーミアーゼの全アミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであり得る。既知の方法、例えば、３つのパラメーター：スコア、同一性、及び類似性を算出する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ２．０を使用して、２つのアミノ酸配列間の相同性を計算することができる。
【００５６】
上記のＤ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、指定部位での１つ又は複数のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加を包含するように、部位特異的変異誘発法を用いて、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を改変することにより得ることができる。上記のような改変ＤＮＡは、従来から知られている変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の試薬による上記ＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００５７】
１つ又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００５８】
Ｄ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞において上記のような変異を有するＤＮＡを発現させ、発現生成物の活性を試験することにより得ることができる。Ｄ−キシロースパーミアーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、例えば、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示される塩基配列を有するプローブとハイブリダイズし、Ｄ−キシロースパーミアーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、５０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることができない条件により例示され得る。あるいは、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件に相当する塩濃度、すなわち、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、ＤＮＡがハイブリダイズする条件により、ストリンジェントな条件が例示され得る。洗浄時間は、ブロット法に使用される膜のタイプによって異なり、これは一般的には製造業者によって推奨されるものである。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)の
推奨される洗浄時間は１５分間である。好ましくは、洗浄は２、３回行われる。
【００５９】
配列番号１の塩基配列の部分配列をプローブとして使用することもできる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、洗浄するためのハイブリダイゼーション条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。
【００６０】
上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加は、例えば細菌の種又は属の多様性に起因して自然に存在し、且つＤ−キシロースパーミアーゼを有する変異も包含する（突然変異体又は変異体）。
【００６１】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」は、例えば従来の方法によるＤＮＡの細菌への導入を意味する。このＤＮＡの形質転換は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらし、それにより細菌細胞内のタンパク質の活性を高める。形質転換の方法としては、これまでに報告されている任意の既知の方法が挙げられる。例えば、細胞のＤＮＡに対する透過性を増大するために、塩化カルシウムで受容細胞を処理する方法が、エシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、この方法が使用され得る。
【００６２】
遺伝子発現を高める方法としては、遺伝子のコピー数を増大させることが挙げられる。腸内細菌科の細菌において機能するベクターへの遺伝子導入は、その遺伝子のコピー数を増加させる。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターの例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が挙げられるがこれらに限定されない。「低コピーベクター」という用語は、ベクターに関して使用されるものであり、そのコピー数が、１細胞あたり最大５コピーである。
【００６３】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組換え、Ｍｕ組込み等の方法による細菌染色体への遺伝子の多コピーの導入によっても達成され得る。例えば、１回のＭｕ組込みでは、最大３コピーの遺伝子を細菌染色体へ導入させることが可能である。
【００６４】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ遺伝子のコピー数の増加は、Ｄ−キシルロースパーミアーゼ遺伝子を多コピー細菌の染色体ＤＮＡへ導入することによっても達成することができる。多コピーの遺伝子を細菌の染色体に導入するために、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的として、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、反復性ＤＮＡ、又は転移因子の末端に存在する逆方向反復配列が挙げられるが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号で開示されるように、Ｄ−キシロースパーミアーゼ遺伝子をトランスポゾンに組み込んで遺伝子の多コピーを染色体ＤＮＡに導入することも可能である。
【００６５】
また、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても、遺伝子発現の増強を達成することができる。例えば、強力なプロモーターとして、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、及びλファージのＰＲプロモーター又はＰＬプロモーターが知られている。本発明のＤＮＡの下流に強力なターミネーターを置くことによっても、遺伝子の発現の増強を達成することができる。強力なプロモーター及び／又は強力なターミネーターの使用は、遺伝子のコピーの増加と組み合わせてもよい。別の方法として、例えば、プロモーターの下流に位置する構造遺伝子（遺伝子のコード領域）の転写レベルを増大させるような変異をプロモーターに導入し、プロモーターの効果を高めることもできる。同様に、例えば、ターミネーターの下流に位置する遺伝子の転写のターンオーバーを増加させるような変異をターミネーターに導入してターミネーターの
効果を高めることもできる。
【００６６】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドン、特に開始コドンのすぐ上流の配列との間のスペーサーにおける数塩基の置換は、ｍＲＮＡの翻訳能に顕著に影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つの塩基の性質に依存して、発現レベルにおける２０倍の差が見出された(Gold他, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,
1981; Hui他, EMBO J., 3, 623-629, 1984)。ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに関する位置−１でのＧのＡへの置換であることが報告されている(1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457、ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology)。したがって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子発現を高め、結果として、スレオニン、ホモセリン及び細胞から輸送される他の物質に対する耐性を増大させることが示唆される。
【００６７】
さらに、細菌染色体上のＤキシロースパーミアーゼ遺伝子のプロモーター又はターミネーター領域へ塩基置換を導入することも可能であり、その結果、より強力なプロモーター又はターミネーター機能が達成される。発現制御配列の改変は、例えば、国際特許公開００／１８９３５及び特開平１−２１５２８０号に開示されるように温度感受性プラスミドを使用した遺伝子置換と同じ様式で行うことができる。
【００６８】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの分解及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.,及び Maniatis, T.著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００６９】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本質的に有する細菌へ上述したＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、当該ＤＮＡをすでに保有する細菌へＬ−アミノ酸生産能を付与することによっても得ることができる。
【００７０】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌の親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性を有し、また、ilvA遺伝子にリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010系ベクターに挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００７２】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変される。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００７３】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子が知られている(塩基番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子が知られている(塩基番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子が知られている(塩基番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。
【００７４】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産E. coli VKPM B-3996株に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００７５】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, 塩基番号764〜1651, GenBank
accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual
Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００７６】
E. coliのasd遺伝子は既に知られており(塩基番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いてPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００７７】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に知られており(塩基番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００７８】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を
阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００７９】
WC196株が、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069株と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００８０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌の親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 − B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201
(米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌の親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE.
coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424
B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００８２】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌の親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導体株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン産生株(特開昭57-5693)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌の親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。E. coli VL334 (VKP
M B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性株VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。この株はL-グルタミン酸を生産することができる。
【００８４】
L-グルタミン酸産生細菌の親株は、特に限定はされないが、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼの活性が低下または欠損している株が例示される。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００８５】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００８６】
L-グルタミン酸産生菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株の例としては、パントエア・アナナティス AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。パントエア・アナナティス AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。パントエア・アナナティス AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、エンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、パントエア・アナナティスに再分類されている。AJ13356は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書では、パントエア・アナナティスとして記載する。
【００８７】
Ｌ−アミノ酸の生産
オキサロアセテート（ＯＡＡ）は、Ｔｈｒ及びＬｙｓの合成の基質である。ＯＡＡは、触媒として働くホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）によりＰＥＰから供給される。したがって、細胞におけるＰＥＰＣ濃度の上昇は、これらのアミノ酸の発酵生産に非常に重要であると考えられる。発酵における炭素源としてグルコースを使用するとき、グルコースがグルコース−ホスホトランスフェラーゼ（Ｇｌｃ−ＰＴＳ）系で取り込まれる。この系はＰＥＰを消費し、ＰＴＳにおけるタンパク質はｐｔｓＧ及びｐｔｓＨＩｃｒｒにコードされる。取り込みの際、グルコース１分子からＰＥＰ１分子及びピルビン酸（Ｐｙｒ）１分子が生成される。
【００８８】
グルコースではなく、スクロースで培養したとき、スクロース（Ｓｃｒ−ＰＴＳ）を利用する能力を有するように改変されているＬ−スレオニン生産株及びＬ−リジン生産株は、これらのアミノ酸の生産性がより高くなる（欧州特許第１１４９９１１Ａ２号）。Ｓｃ
ｒ−ＰＴＳによって、スクロース１分子からＰＥＰ３分子及びＰｙｒ１分子が生成され、ＰＥＰ／Ｐｙｒ比が増加し、それによりスクロースからのＴｈｒ及びＬｙｓの合成が容易になると考えられる。さらに、Ｇｌｃ−ＰＴＳはなんらかの発現制御を受けることが報告されており(Postma P. W.他, Microbiol Rev., 57(3), 543-94(1993); Clark B.他 J. Gen. Microbiol., 96(2), 191-201(1976); Plumbridge J., Curr. Opin. Microbiol., 5(2), 187-93(2002); Ryu S.他, J. Biol. Chem., 270(6): 2489-96(1995))、したがって、グルコースの取り込み自体がアミノ酸発酵において律速段階であり得る可能性がある。
【００８９】
ｘｙｌＥ遺伝子の発現を増大させＰＥＰ／Ｐｙｒ比が増加することにより、スレオニン生産株、リジン生産株、ヒスチジン生産株、フェニルアラニン生産株及び／又はグルタミン酸生産株において、さらにアミノ酸の生産が増大するはずである。グルコース２分子からＰＥＰ４分子が生成されるので、ＰＥＰ／Ｐｙｒ比が大きく改善されることが予測される。ｘｙｌＥ遺伝子の発現が増大することによって、ｇｌｃ−ＰＴＳの発現制御が取り除かれることが予測される。
【００９０】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、培地で本発明の細菌を培養する工程、Ｌ−アミノ酸を培地に蓄積させる工程、及び培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含む。さらに、本発明の方法には、培地で本発明の細菌を培養する工程、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸を培地に蓄積させる工程、及び培地からＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸を回収する工程を含む、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、又はＬ−グルタミン酸の製造方法が含まれる。
【００９１】
本発明において、培地等からのＬ−アミノ酸の培養、回収、及び精製は、Ｌ−アミノ酸を微生物によって製造する従来の発酵方法に従って行うことができる。
【００９２】
炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて微生物が生育のために必要とする適量の栄養素が含まれていれば、培地は合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース、及びキシロース等の炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択された微生物の資化の態様に応じて、エタノール及びグリセロール等のアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン類等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵性微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。必要であれば、さらなる栄養素を培地に添加してもよい。例えば、微生物が生育のためにＬ−アミノ酸を必要とする場合（Ｌ−アミノ酸要求性）、十分量のＬ−アミノ酸を培地に添加してもよい。
【００９３】
培養は、振盪または通気下での撹拌等の好気条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で、行うことが好ましい。培地のｐＨは通常、５〜９であり、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日間の培養により培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００９４】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、細胞等の固体を液体培地から除去し、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法によって、標的Ｌ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【００９５】
［実施例］
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照し、より具体的に説明される。
【実施例１】
【００９６】
ハイブリットＰＬ−ｔａｃプロモーターによるエシェリヒア・コリｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域の置換
ｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域を置換するために、「Ｒｅｄ媒介性組込み(Red-mediated integration)」及び／又は「Ｒｅｄ駆動性組込み(Red-driven integration)」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)によって記載される方法で、ハイブリットＰＬ−ｔａｃプロモーター及びｃａｔ遺伝子でコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍＲ）を保有するＤＮＡフラグメントをプロモーター領域の代わりにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）の染色体へ組み込んだ。Ｒｅｄ媒介性の組み換え系に関連するλファージ誘導性の遺伝子のドナーとして、熱感受性レプリコンを有する組み換えプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)を使用した。組み換えプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株はエシェリヒア・コリ遺伝ストックセンター(Genetic Stock Center)（Yale university、米国ニューヘーブン）から得ることができ、この寄託番号はＣＧＳＣ７６３０である。
【００９７】
ハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを化学的に合成した。置換プロモーターの塩基配列が配列表（配列番号３）で示される。ハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを含む合成ＤＮＡフラグメントは、５’末端にＢｇｌＩＩ認識部位を含み、これはｃａｔ遺伝子及び細菌染色体に組み込まれるｘｙｌＥ遺伝子５’末端と相同な３６塩基に結合させるために必要である。
【００９８】
鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセス番号Ｘ０６４０３、"Fermentas"、リトアニア）、並びにプライマーＰ１（配列番号４）及びプライマーＰ２（配列番号５）を使用したＰＣＲによって、ｃａｔ遺伝子でコードされるＣｍＲマーカーを含むＤＮＡフラグメントを得た。プライマーＰ１はこの５’末端にＢｇｌＩＩ認識部位を含み、これはハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターと結合させるために必要であり、プライマーＰ２はｘｙｌＥ遺伝子の開始コドンの２１７ｂｐ上流に位置する領域と相同性がある３６塩基を含み、これは細菌染色体への組込みのためにプライマーに導入された。
【００９９】
「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ」増幅装置を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）は、１５ｍＭのＭｇＣｌ2（"Fermentas"、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（"Fermentas"、リトアニア）、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌの組成とした。ＰＣＲ増幅のために、プラスミドＤＮＡ約５ｎｇを反応混合物に添加した。温度プロファイルは以下の通りであった：９５℃で５分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、そして７２℃で７分間の最後の伸長。
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法で精製し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)を使用して抽出し、エタノールで沈澱させた。
【０１００】
２つの上記のＤＮＡフラグメントそれぞれをＢｇｌＩＩ制限酵素で処理し結合させた。プライマーＰ２（配列番号５）及びプライマーＰ３（配列番号６）を使用したＰＣＲによって結合産物を増幅した。プライマーＰ３は、その５’末端に、細菌染色体への更なる組み込みのためのｘｙｌＥ遺伝子５’末端に相同な３６塩基を含む。
【０１０１】
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法によって精製し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)を使用して抽出し、エタノールで沈澱させた。得られたＤＮＡフラグメントを、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのＲｅｄ媒介性組み込みのために使用した。
【０１０２】
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地で３０℃で一晩、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を生育させ、その後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で１：１００に希釈して（アラビノースはＲｅｄ ｓｙｓｔｅｍのプラスミドをコードした遺伝子を誘導するために使用する）、細菌培養液の光学密度がＯＤ６００＝０．４〜０．７に達するように３０℃で生育させた。細菌培養液１０ｍｌ分の生育細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄し、続いて水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡフラグメント１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に加えた。製造業者の指示に従って、"Bio-Rad"エレクトロポレーター（米国）（No.１６５〜２０９８、version ２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。刺激された細胞をＳＯＣ培地(Sambrook他, "Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))１ｍｌに加えて、３７℃で２時間インキュベートして、その後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天上に広げた。プライマーＰ４（配列番号７）及びプライマーＰ５（配列番号８）を使用したＰＣＲにより、ｘｙｌＥ遺伝子のプロモーター領域の代わりにＣｍＲマーカーが存在するか否かに関して、２４時間内で生育したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁し、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。以下の温度プロファイルを使用した：９５℃で１０分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、次いで７２℃で７分間の最後の伸長。
幾つかの試験したＣｍＲコロニーには、所望の約２，０００ｂｐのＤＮＡフラグメントが含まれ、ｘｙｌＥ遺伝子の１９２ｂｐのプロモーター領域の代わりに、ＣｍＲマーカーＤＮＡの存在が確認できた（図１を参照）。３７℃で培養することによって、熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６をこれらの株の１つから脱落させ、得られた株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥと称した。
【実施例２】
【０１０３】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大の、ＰＴＳ輸送系が破壊されたエシェリヒア・コリ株の生育に対する効果
ｘｙｌＥ遺伝子の発現増強のエシェリヒア・コリ株の生育に対する効果を示すために、ＰＴＳ輸送系が破壊されたエシェリヒア・コリ株を構築した。
【０１０４】
この目的のために、実施例１にも記載されている、「Ｒｅｄ媒介性組み込み」及び／又は「Ｒｅｄ駆動性組み込み」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)によって記載される方法で、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の染色体上で、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンをカナマイシン耐性マーカー（ＫｍＲ）を保有するＤＮＡフラグメントで置換した。
【０１０５】
ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンは解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０の配列において、ｐｔｓＨ遺伝子、ｐｔｓＩ遺伝子、及びｃｒｒ遺伝子に関して、それぞれ塩基番号２５３１７８６〜２５３２０４３、２５３２０８８〜２５３３８１５、及び２５３３８５６〜２５３４３６５）。ｐｔｓＨＩ
−ｃｒｒオペロンは、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｃｙｓＫ遺伝子とｐｄｘＫ遺伝子の間に位置している。
【０１０６】
鋳型として市販のプラスミドｐＵＣ４ＫＡＮ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセス番号Ｘ０６４０４、"Fermentas"、リトアニア）、並びにプライマーＰ６（配列番号９）およびプライマーＰ７（配列番号１０）を使用したＰＣＲによって、ＫｍＲ遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントを得た。プライマーＰ６はｐｔｓＨ遺伝子の５’末端と相同である３６塩基を含み、プライマーＰ７はｃｒｒ遺伝子の３’末端と相同である３６塩基を含む。これらの配列は細菌染色体へのさらなる組み込みのためにプライマーＰ６及びプライマーＰ７に導入された。
【０１０７】
実施例１に記載されるようにしてＰＣＲを行った。
【０１０８】
増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル−電気泳動法によって濃縮し、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」("Sigma"、米国)による遠心分離でゲルから抽出し、エタノールで沈澱させた。エレクトロポレーション後に５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天プレート上に細胞をまいたことを除いては、実施例１に記載されるようにして、得られたＤＮＡフラグメントを使用し、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのＲｅｄ媒介性組み込みを行った。
【０１０９】
プライマーＰ８（配列番号１１）及びプライマーＰ９（配列番号１２）を使用したＰＣＲにより、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの代わりにＫｍＲマーカーが存在するか否かに関して２４時間内で生育したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌで懸濁して、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、実施例１に記載されている条件であった。幾つかの試験したＫｍＲコロニーには、所望の約１，３００ｂｐのＤＮＡフラグメントが含まれ、ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの代わりにＫｍＲ遺伝子の存在を確認した。得られた株の１つを３７℃で培養することによって、熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を脱落させ、得られた株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒと称した。
【０１１０】
その後、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒに移し(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)、ＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を得た。
【０１１１】
炭素源としてグルコース（４％）を有する最少Ａｄａｍｓ培地上で生育する能力を４つのエシェリヒア・コリ株、ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ、及びＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥに関して調べた。図２で示されるように、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒはグルコースを含む最少Ａｄａｍｓ培地上であまり生育しなかった（μ〜０．０６）。ｘｙｌＥ遺伝子発現を増大させることによって、グルコースを含む最少Ａｄａｍｓ培地上の受容株の生育特性が有意に高められた。
【実施例３】
【０１１２】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大のスレオニン生産に対する効果
ＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の高められた発現の、スレオニン生産に対する効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントを、Ｐ１形質導入によって、スレオニン生産エシェリヒア・コリ株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６に導入した(Miller, J.H. (1972) E
xperiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株は１９８７年４月７日に寄託番号Ｂ−３９９６で、ロシア工業用微生物コレクション(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)（ＶＫＰＭ）に寄託されている。
【０１１３】
クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天プレート上で３７℃で１８〜２４時間、エシェリヒア・コリＢ−３９９６株及びＢ−３９９６ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を生育させた。種培養を得るために、４％スクロースを有するＬ培地２ｍｌを含む２０×２００ｍｍの試験管で３２℃で１８時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって、この株を生育させた。その後、種培養液０．２１ｍｌ（１０％）を発酵培地に接種した。２０×２００ｍｍの試験管での最少培地２ｍｌにおいて発酵を行った。２５０ｒｐｍで振盪しながら、３２℃で４８時間、細胞を生育させた。
【０１１４】
培養後、移動相（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））を使用したペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−スレオニンの量を測定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り取り、Ｌ−スレオニンをＣｄＣｌ2の０．５％水溶液で溶出し、Ｌ−スレオニンの量を５４０ｎｍでの分光光度法で推定した。結果を表１に示す。ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの導入により、スレオニン生産が向上した。
【０１１５】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は、以下の通りである。
グルコース ８０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２２．０
ＮａＣｌ ０．８
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２
チアミンＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【０１１６】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾熱滅菌した。ｐＨを７．０に調整した。滅菌後、抗生剤を培地に導入した。
【０１１７】
【表１】
【実施例４】
【０１１８】
ｘｙｌＥ遺伝子発現増大のＬ−リジン生産に対する効果
エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡの全塩基配列は既知である(Science, 277, 1453-1474(1997))。報告された塩基配列に基づきプライマーを合成し、以下のようなＰＣＲ法でｘｙｌＥ遺伝子を増幅した。
【０１１９】
従来の方法で、染色体ＤＮＡを調製した(Sambrook, J., Fritsch E.F.及びManiatis T.(1989): Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)。ＥｃｏＲＩ認識部位をアクセス番号ＡＥ０００４７６の配列７４７９〜７５０８の５’末端に付加してプライマー１０（配列番号１３）を設計して、ＳａｌＩ認識部位をアクセス番号ＡＥ０００４７６の配列８９６３〜８９９２の相補配列の５’末端に付加してプライマー１１（配列番号１４）を設計した。これらのプライマーを使用することによって、"PCR protocols. Current methods and applications"(White, B.A., ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993)に記載されている標準条件に従って、ｘｙｌＥ遺伝子を増幅した。
【０１２０】
従来の方法でＰＣＲ産物を精製した。制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩでこの産物を消化し、ライゲーションキットを使用して、同じ制限酵素で処理したベクターｐＳＴＶ２９へ結合させた。エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセルを結合産物で形質転換して(Sambrook, J., Fritsch E.F.及びManiatis T.(1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、細胞を１０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）、及び５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬプレート（１０ｇ／ｌのバクト−トリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７．０）上に蒔いて、一晩培養した。白色のコロニーが出現し、これをピックアップし単離することによって形質転換細胞を得た。アルカリ抽出法によって、形質転換細胞からプラスミドを調製し、順方向でｘｙｌＥ遺伝子がｌａｃプロモーターと結合したプラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥを得た。
【０１２１】
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産株として、エシェリヒア・コリＷＣ１９６を使用した。
【０１２２】
ＷＣ１９６をプラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥおよびベクターｐＳＴＶ２９のそれぞれで形質転換し、ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９を得た。６００ｎｍでの最終ＯＤが約０．６に達するまで、３７℃で５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地で、これらの株をそれぞれ培養した。その後、等量の４０％グルセロール溶液を培地に加え、混合物を適量で分注して、−８０℃で保存した。以下、これを「グリセロールストック」と称する。
【０１２３】
Ｌ−リジン生産条件下で、キシロースパーミアーゼ活性を高めた効果を確認するために、上述の手順に従って、プラスミドｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びプラスミドｐＣＡＢＤ２でＷＣ１９６を形質転換した。ｐＣＡＢＤ２は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子をコードするｄａｐＢ遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子を含むプラスミド（米国特許第６，０４０，１６０号）である。対照として、ＷＣ１９６をプラスミドｐＳＴＶ２９及びプラスミドｐＣＡＢＤ２で形質転換した。６００ｎｍでの最終ＯＤが約０．６に達するまで、３７℃で５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール及び２０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含むＬ培地で、得られた形質転換細胞をそれぞれ培養し
た。その後、等量の４０％グルセロール溶液を培地に加え、混合物を適量で分注して、−８０℃で保存した。
【０１２４】
ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ及びＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９のグリセロールストックを溶解して、それぞれ１００μｌを５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬプレート上に均一に蒔いて、３７℃で２４時間培養した。さらに、ＷＣ１９６／（ｐＣＡＢＤ２，ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥ）及びＷＣ１９６／（ｐＣＡＢＤ２，ｐＳＴＶ２９）のそれぞれを５０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール及び２０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含むＬプレート上に均一に蒔いて、３７℃で２４時間培養した。プレート上の細胞量の約１／８を５００ｍｌ容のフラスコで必要な薬剤を含む発酵培地２０ｍｌに接種した。１１５ｒｐｍの撹拌速度で往復式振盪培養機を使用することによって、３７℃で１６時間培養を行った。培養後、培地のＬ−リジン及び残存グルコースの量を既知の方法(Ｂｉｏｔｅｃｈ−ａｎａｌｙｚｅｒ ＡＳ２１０、サクラ精機株式会社製)で測定した。その後、消費したグルコースに対するＬ−リジンの収量を各株について算出した。
【０１２５】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２４
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母エキス ２．０
【０１２６】
ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、１１５℃で１０分間培地をオートクレーブした。グルコース及びＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏは別々に滅菌した。１８０℃で２時間乾熱滅菌した３０ｇ／ｌのＣａＣＯ3を加えた。
【０１２７】
結果を表２に示す。ＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９−ｘｙｌＥは、キシロースパーミアーゼの発現量が増加していないＷＣ１９６／ｐＳＴＶ２９に比べて、より多くの量のＬ−リジンを蓄積した。さらに、キシロースパーミアーゼ活性を高めることによって、多くの量のＬ−リジンを生産するＷＣ１９６／ｐＣＡＢＤ２でもまた、Ｌ−リジンの蓄積及び収量が向上することが観察された。
【０１２８】
【表２】
【実施例５】
【０１２９】
Ｌ−アルギニン生産におけるｘｙｌＥ遺伝子発現増大の効果
アルギニン生産におけるＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、アルギニン生産エシェリヒア・コリ３８２株に導入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。３８２株は２０００年４月１０日に寄託番号ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６で、ロシア工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ）(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に寄託されている。
【０１３０】
得られた株３８２ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ及び親株３８２を、ＬＢ培地２ｍｌで、３２℃で１８時間、それぞれ培養し、得られた培養液０．３ｍｌを２０×２００ｍｍの試験管の中の発酵培地２ｍｌに接種して、回転式振盪培養機によって３２℃で４８時間培養した。
【０１３１】
培養後、移動相（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））を使用したペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−アルギニンの量を測定した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。Ｌ−アルギニンを含むスポットを切り取り、Ｌ−アルギニンをＣｄＣｌ2の０．５％水溶液で溶出し、Ｌ−アルギニンの量を５４０ｎｍでの分光光度法で測定した。
【０１３２】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４８．０
（ＮＨ４）2ＳＯ4 ３５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミンＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．１
ＣａＣＯ3 ５．０
【０１３３】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾熱滅菌した。ｐＨを７．０に調整した。
【０１３４】
１０個の独立した実験の結果を表３に示す。３８２ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株は、Ｄ−キシロースパーミアーゼの発現量が増加していない３８２株に比べて、より多くの量のＬ−アルギニンを蓄積したことが表３からわかる。
【０１３５】
【表３】
【実施例６】
【０１３６】
グルコース及びキシロースの混合物の発酵からのＬ−ヒスチジン生産菌によるＬ−ヒスチジンの生産
グルコース及びキシロースの混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産に、Ｌ−ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株を使用した。エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０）は、ロシア特許番号ＲＵ２１１９５３６において詳細に記載されている。８０株は１９９９年１０月１５日に寄託番号Ｂ−７２７０で、ロシア工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ；Dorozhny proezd. 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された。その後、２００４年６月１２日にブダペスト条約の規定の下、国際寄託に移管された。
【０１３７】
ＰＬ−ｔａｃプロモーターの制御下にあるｘｙｌＥ遺伝子の発現増強のヒスチジン生産における効果を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの染色体由来のＤＮＡフラグメントをＰ１形質導入によって、ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株に導入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Gene
tics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。通常の方法により、ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒプラスミドで８０株及び得られた８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ株を形質転換して、８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株及び８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株を得た。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体からのｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座のクローニングは、ロシア特許出願番号ＲＵ２００５１０６７２０に記載されている。
【０１３８】
種培養を得るために、１ｇ／ｌのストレプトマイシン及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬ培養液２ｍｌを含む４０ｍｌ容の試験管（φ１８ｍｍ）で２７℃で６時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって、８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株及び８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株を生育させた。その後、種培養液２ｍｌ（５％）を発酵培地に接種した。発酵培地２ｍｌを含む４０ｍｌ容の試験管で２７℃で５０時間、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）によって発酵を行った。
【０１３９】
培養後、ペーパークロマトグラフィによって、培地に蓄積したＬ−ヒスチジンの量を測定した。移動相の組成は、ブタノール：アセテート：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）である。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．５％）を可視化試薬として使用した。結果を表４に示す。
【０１４０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は以下の通りである。
炭水化物（全量） １００．０
マメノウ 全窒素として０．２
（ダイズ加水分解物）
Ｌ−プロリン ０．８
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
チアミンＨＣｌ ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ3 ６．０
ストレプトマイシン １．０
【０１４１】
炭水化物（グルコース、キシロース）、Ｌ−プロリン、ベタイン、及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。ＣａＣＯ3は１１０℃で３０分間、乾熱滅菌した。滅菌前にＫＯＨでｐＨを６．０に調整した。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
８０ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株は、Ｄ−キシロースパーミアーゼの発現が増加していない８０／ｐＭＷ１１９ｍｏｄ−ｘｙｌＡ−Ｒ株に比べて、グルコース及びキシロースの混合物を含む培地において、より多くの量のＬ−ヒスチジンを蓄積させたことが表４からわかる。
【０１４４】
本発明を好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また均等物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明は、発酵によりＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−グルタミン酸等の非芳香族又は芳香族のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供する。本発明によれば、腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌の生産性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】エシェリヒア・コリの染色体におけるｘｙｌＥ遺伝子の上流の領域の構造並びにｃａｔ遺伝子及びハイブリッドＰＬ−ｔａｃプロモーターを含む融合したＤＮＡフラグメントの構造を示す図である。
【図２】グルコースを有する培地で生育させたエシェリヒア・コリ株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ及びＭＧ１６５５ＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥの増殖曲線を示す図である。ＭＧ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５、ＭＧΔｐｔｓ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒ、ＭＧΔｐｔｓＰｘｙｌＥ＝エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｔｓＨＩ−ｃｒｒＰＬ−ｔａｃｘｙｌＥ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項２】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現を増加させることによって増加した、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現制御配列を改変すること、又はＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増加した、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
さらに、グルコキナーゼ活性が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
さらに、キシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
さらに、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項７】
エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
前記遺伝子が、
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；及び
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるＤ−キシロースパーミアーゼをコードする、請求項２に記載の細菌。
【請求項９】
Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列または該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項１０】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣの塩濃度、０．１％ＳＤＳ、６０℃で１５分間洗浄する条件を含む、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
Ｌ−スレオニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
アスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードし、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性を示す変異型ｔｈｒＡ遺伝子、
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、
推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子、及び
それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される遺伝子の発現が増加するようにさらに改変された、請求項１１
に記載の細菌。
【請求項１３】
変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現が増加するように改変された、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１４】
Ｌ−リジン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１６】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１７】
Ｌ−アルギニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１９】
培地で請求項１に記載の細菌を培養して該培地にＬ−アミノ酸を蓄積させ、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２０】
前記培地がキシロースを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が増加するように改変された、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項２】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現を増加させることによって増加した、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性が、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子の発現制御配列を改変すること、又はＤ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増加した、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
さらに、グルコキナーゼ活性が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
さらに、キシロースイソメラーゼ活性が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
さらに、ｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子座の発現が増加するように改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項７】
エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
前記遺伝子が、
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；及び
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるＤ−キシロースパーミアーゼをコードする、請求項２に記載の細菌。
【請求項９】
Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の１〜１４７６番目の塩基配列または該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、Ｄ−キシロースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項１０】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣの塩濃度、０．１％ＳＤＳ、６０℃で１５分間洗浄する条件を含む、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
Ｌ−スレオニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
アスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードし、スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性を示す変異型ｔｈｒＡ遺伝子、
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子、
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、
推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子、及び
それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される遺伝子の発現が増加するようにさらに改変された、請求項１１
に記載の細菌。
【請求項１３】
変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現が増加するように改変された、請求項１２に記載の細菌。
【請求項１４】
Ｌ−リジン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１６】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１７】
Ｌ−アルギニン生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１９】
培地で請求項１に記載の細菌を培養して該培地にＬ−アミノ酸を蓄積させ、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２０】
前記培地がキシロースを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５１７５８３（Ｐ２００８−５１７５８３Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８９８７（Ｐ２００７−５１８９８７）
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１９８４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４３７３０
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１９８４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４３７３０
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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