【課題】骨疾患（例えば、骨粗鬆症、関節炎からの骨の損失、ページェット病、および骨減少）を処置する手段の提供など。
【解決手段】オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、もしくは配列番号２６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、抗体。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年４月５日に出願された、米国仮出願番号６０／３７０，４０７に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）を結合する抗体に関する。骨疾患（例えば、骨粗鬆症、関節炎からの骨の損失、ページェット病、および骨減少）を処置するための組成物および方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生存骨組織は、骨の形成（堆積として公知）と骨の破壊（再吸収として公知）の間の動的平衡を示す。これらのプロセスは、少なくとも２つの細胞型によって媒介され得る：骨芽細胞（これは、骨の有機マトリックスを含む分子を分泌する（堆積））；ならびに破骨細胞（これは、骨マトリックスの溶解および骨塩の可溶化（再吸収）を促進する）。特定の個体（例えば、閉経後の女性）において、再吸収の速度が堆積の速度を超え得、このことは、骨の質量および強度を減少させ得、骨折の危険性を増加させ、そして破壊された骨の修復を遅くするか、または不完全にする。
【０００４】
オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）は、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであり、そしてＮＦ−κＢのレセプターアクチベーター（ＲＡＮＫ、破骨細胞の分化および活性化レセプター、すなわちＯＤＡＲとも称される）への結合を介して、破骨細胞の形成を促進する。オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、他方で、ＯＰＧＬを分泌し、そしてＯＤＡＲとのＯＰＧＬの会合を防止することによって、破骨細胞の形成を阻害する。従って、ＯＤＡＲと会合するＯＰＧＬの量は、骨の堆積と再吸収との間の平行に相関する。骨減少疾患（例えば、骨粗鬆症）を患う個体は、骨の堆積より大きい再吸収速度を示し、このことは、ＯＰＧＬの増加したレベルまたは活性から生じ得る。従って、破骨細胞発生におけるＯＰＧＬの活性を調節し得る分子を有することが有用である。生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）におけるＯＰＧＬの量を検出し、ＯＰＧＬの増加したレベルに関連する骨減少障害を診断し得ることもまた、有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）に結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、この抗体は、破骨細胞の分化および活性化レセプター（ＯＤＡＲ）へのＯＰＧＬの結合を阻害する。本発明によってまた、本発明のモノクローナル抗体を産生し、そして最も好ましくは、細胞培養培地中に分泌する、ハイブリドーマ細胞株が提供される。本発明の抗体は、低い骨密度に関連する種々の障害を処置するために有用である。
【０００６】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、最も好ましくは、ヒト抗体を提供し、ここで、この重鎖は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、またはＩｇＧ_４重鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号２に記載されるＩｇＧ_１重鎖定常領域のアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【０００７】
本発明はまた、重鎖および軽鎖を含む抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、最も好ましくは、ヒト抗体を提供し、ここで、この軽鎖は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【０００８】
本発明は、特に、ＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域を特異的に結合する、ヒト抗体、最も好ましくは、モノクローナル抗体に関する。本発明はまた、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の、Ｄ−Ｅループ領域の外側である領域に結合するヒト抗体、好ましくは、モノクローナル抗体に関する。さらに、本発明は、ＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域の外側の領域と、Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部との両方に結合する、ヒト抗体、好ましくは、モノクローナル抗体に関する。１つの局面において、本発明の抗体は、ＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域の外側の第一の領域に結合し、次いで、第一の領域への結合を維持したままで、Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部である第二の領域に結合する。このような結合は、本明細書中で、連続的であると称される。別の局面において、本発明の抗体は、ＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域の外側の第一の領域、およびＤ−Ｅループ領域の全てまたは一部である第二の領域に、同時に結合し得る。このような結合は、本明細書中で、同時であると称される。
【０００９】
特定の局面において、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖の可変領域は、配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、または配列番号２６のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の局面において、軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、または配列番号２８のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。さらなる局面において、重鎖は、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、または配列番号５０のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。なおさらなる局面において、軽鎖は、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、または配列番号５２のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００１０】
本発明はまた、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号６に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００１１】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し、（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）ここで、この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）ここで、この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００１２】
他の局面において、第一の可変領域は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００１３】
なお他の局面において、第一の可変領域は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１４】
本発明は、さらに、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号１４に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００１５】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し、（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）ここで、この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）ここで、この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００１６】
他の局面において、第一の可変領域は、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００１７】
さらなる局面において、第一の可変領域は、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１８】
本発明は、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号２２に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００１９】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し、（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）ここで、この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）ここで、この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００２０】
特定の局面において、第一の可変領域は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００２１】
さらなる局面において、第一の可変領域は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２２】
さらに、本発明は、ＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号２６に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００２３】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し、（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）ここで、この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）ここで、この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００２４】
他の局面において、第一の可変領域は、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００２５】
さらなる局面において、第一の可変領域は、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２６】
本発明は、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００２７】
本発明は、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号３８に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００２８】
本発明は、さらに、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００２９】
本発明は、さらに、ＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、その重鎖は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてその軽鎖は、配列番号５２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００３０】
特定の局面において、本発明は、ＯＰＧＬを特異的に結合し、そして重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し、ここで、この重鎖可変領域は、配列番号１０または配列番号１８に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の局面において、この軽鎖可変領域は、配列番号１２または配列番号２０に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００３１】
本発明はまた、ＯＰＧＬを特異的に結合する抗体を提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号３４または配列番号４２に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の局面において、軽鎖可変領域は、配列番号３６または配列番号４４に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００３２】
本発明は、さらに、ＯＰＧＬを特異的に結合する抗体を提供し、ここで、重鎖は、配列番号１０に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして軽鎖可変領域は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００３３】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００３４】
さらなる局面において、第一の可変領域は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００３５】
他の局面において、第一の可変領域は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００３６】
本発明はまた、特異的に結合する抗体を提供し、ここで、重鎖は、配列番号１８に記載される重鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして軽鎖は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００３７】
特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体を提供し（ａ）ここで、この重鎖は、第一の可変領域を含み、そしてこの第一の可変領域は、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｂ）この軽鎖は、第二の可変領域を含み、この第二の可変領域は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、そして（ｃ）この抗体は、ＯＰＧＬと相互作用する。
【００３８】
他の局面において、第一の可変領域は、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００３９】
さらに他の局面において、第一の可変領域は、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、そして第二の可変領域は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、ＯＰＧＬを特異的に結合する抗体を提供し、ここで、重鎖は、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして軽鎖は、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００４１】
本発明は、ＯＰＧＬを特異的に結合する抗体を提供し、ここで、重鎖は、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして軽鎖は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００４２】
本発明はまた、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、および（Ｆａｂ’）_２を提供する。
【００４３】
特定の局面において、本発明は、可変領域および定常領域を含む重鎖を提供し、この可変領域は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、または配列番号２６のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００４４】
さらに、本発明はまた、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、または配列番号５０のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖を提供する。
【００４５】
特定の局面において、本発明は、可変領域および定常領域を含む軽鎖を提供し、この可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、または配列番号２８のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００４６】
他の局面において、本発明はまた、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、または配列番号５２のいずれかに記載されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖を提供する。
【００４７】
本発明はまた、ＯＰＧＬを特異的に結合する単離されたヒト抗体に関し、ここで、この抗体は、以下を含む：（ａ）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域。特定の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域は、図１５に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ１領域であり得、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ１領域は、図１６に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ１領域であり得る。他の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域は、図１５に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ２領域であり得、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ２領域は、図１６に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ２領域であり得る。なお他の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、図１５に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ３領域であり、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、図１６に示されるような、１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ３領域である。
【００４８】
本発明はまた、ＯＰＧＬを特異的に結合する単離されたヒト抗体に関し、ここで、この抗体は、以下を含む：（ａ）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域。特定の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域は、図１５に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ１領域であり得、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ１領域は、図１６に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ１領域であり得る。他の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域は、図１５に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ２領域であり得、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ２領域は、図１６に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ２領域であり得る。なお他の局面において、ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、図１５に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ３領域であり、そしてヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、図１６に示されるような、２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ３領域である。
【００４９】
さらに、本発明は、骨減少障害を処置するための方法を提供し、この方法は、薬学的に有効な量の本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、その必要がある個体に投与する工程を包含する。
【００５０】
本発明は、さらに、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の、Ｄ−Ｅループ領域の外側、またはＯＰＧＬのＤ−Ｅループ領域の外側とＤ−Ｅループ領域の全てまたは一部との両方に結合し得る、融合タンパク質または他の分子に関し、ここで、結合は、連続的または同時（上記抗体と一緒であり、包括的に、本明細書中で「特異的結合パートナー」と称される）である。これらの分子は例えば、ＷＯ ００／２４７８２（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される方法を使用して調製され得るようなものである。このような分子は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）において発現され得る。
【００５１】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＯＰＧＬのレベルを検出するための方法を提供する。この方法は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントにサンプルを接触させる工程を包含する。本発明の抗ＯＰＧＬ抗体は、ＯＰＧＬの検出および定量のための任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイならびに酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｓｏｌａ、１９８７、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７−１５８ページ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）において使用され得る。この抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＯＰＧＬと結合し得る。
【００５２】
本発明における１つの局面において、抗体はオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、もしくは配列番号２６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む。
【００５３】
１つの実施形態において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域に特異的に結合する。
【００５４】
本発明における1つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧ
Ｌ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号１０もしくは配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む。
【００５５】
１つの実施形態において、この抗体は、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；または
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方と特異的に結合する。
【００５６】
好ましい実施形態において、この抗体は、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方と特異的に結合し、この結合が、連続的または同時である。
【００５７】
本発明における１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、もしくは配列番号２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む。
【００５８】
１つの実施形態において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域に特異的に結合する。
【００５９】
本発明の１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号１２もしくは配列番号２０に示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む。
【００６０】
１つの実施形態において、この抗体は、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；または
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方と特異的に結合する。
【００６１】
１つの好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【００６２】
１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、もしくは配列番号５０のいずれかに示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００６３】
１つの実施形態において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域に特異的に結合する。
【００６４】
１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号３４もしくは配列番号４２に示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む。
【００６５】
１つの実施形態において、この抗体は、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；または
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方
と特異的に結合する。
【００６６】
１つの好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【００６７】
１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、この抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、もしくは配列番号５２のいずれかに示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００６８】
１つの好ましい実施形態において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域に特異的に結合する。
【００６９】
１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号３６もしくは配列番号４４に示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む。
【００７０】
１つの実施形態において、この抗体は、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；または
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方と特異的に結合する。
【００７１】
１つの好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【００７２】
１つの局面において、抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、以下：
ａ．配列番号６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ．配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖；
ｃ．配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｄ．配列番号２６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｅ．配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖、および配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；
ｆ．配列番号３８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖、および配列番号４０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；
ｇ．配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖、および配列番号４８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；または
ｈ．配列番号５０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖、および配列番号５２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；
を含む。
【００７３】
１つの実施形態において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域と特異的に結合する。
【００７４】
別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００７５】
この好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００７６】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００７７】
この好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００７８】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００７９】
この好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００８０】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号２６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００８１】
この好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、配列番号２６に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００８２】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００８３】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号３８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号４０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００８４】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号４８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００８５】
なお別の実施形態において、前記重鎖が、配列番号５０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号５２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００８６】
１つの局面において、この抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体が、以下：
ａ．配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ．配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖および配列番号２０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｃ．配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖、および配列番号３６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；あるいは
ｄ．配列番号４２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖および配列番号４４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖；
を含む。
【００８７】
１つの実施形態において、この抗体が、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；または
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方
と特異的に結合する。
【００８８】
１つの好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【００８９】
１つの実施形態において、前記重鎖が、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００９０】
１つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、前記配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、前記配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００９１】
１つの実施形態において、前記重鎖が、配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号２０に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む。
【００９２】
１つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域が、前記配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記軽鎖可変領域が、前記配列番号２０に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【００９３】
１つの実施形態において、前記重鎖が、配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号３６に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００９４】
１つの実施形態において、前記重鎖が、配列番号４２に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントまたはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含み、そして前記軽鎖が、配列番号４４に示されるようなアミノ酸配列、その抗原結合フラグメント、またはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００９５】
１つの実施形態において、前記重鎖および軽鎖が、融通性のリンカーにより結合されて単鎖抗体を形成する。
【００９６】
１つの好ましい実施形態において、この抗体は、単鎖Ｆｖ抗体である。
【００９７】
１つの実施形態において、抗体は、Ｆａｂ抗体である。
【００９８】
１つの実施形態において、抗体は、Ｆａｂ’抗体である。
【００９９】
１つの実施形態において、抗体は、（Ｆａｂ’）_２抗体である。
【０１００】
１つの実施形態において、抗体は、完全にヒトである。
【０１０１】
１つの実施形態において、抗体は、ＯＰＧＬの破骨細胞の分化および活性化レセプター（ＯＤＡＲ）への結合を阻害する。
【０１０２】
本発明は、１つの局面において、患者における骨減少障害を処置するための方法であって、該方法が、患者にこの抗体の薬学的有効量を投与する工程を包含する。
【０１０３】
本発明は、１つの好ましい実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアおよびこの抗体の治療的有効量を含む、薬学的組成物である。
【０１０４】
本発明は、１つの局面において、患者における骨減少障害を処置するための方法であって、該方法が、患者にこの薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０１０５】
本発明は、１つの局面において、生物学的サンプル中のＯＰＧＬを検出するための方法であって、該方法が、以下：
ａ．該サンプルを抗体と、該抗体のＯＰＧＬへの結合を可能にする条件下で、接触させる工程；および
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程
を包含する。
【０１０６】
本発明は、１つの局面において、可変領域および定常領域を含む重鎖であって、該可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２もしくは配列番号２６のいずれかにおいて示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【０１０７】
本発明は、１つの局面において、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６もしくは配列番号５０のいずれかにおいて示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む、重鎖である。
【０１０８】
本発明は、１つの局面において、可変領域および定常領域を含む軽鎖であって、該可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４もしくは配列番号２８のいずれかにおいて示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む。
【０１０９】
本発明は、１つの局面において、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８もしくは配列番号５２のいずれかにおいて示されるようなアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくはその免疫学的機能的免疫グロブリンフラグメントを含む、軽鎖である。
【０１１０】
本発明は、１つの局面において、単離されたヒト抗体であって、以下：
ａ．ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域であって、該ヒト重鎖ＣＤＲ３領域が、図１５に示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３または９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ３領域である、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに
ｂ．ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域であって、該ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域が、図１６に示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ３領域である、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域；を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【０１１１】
１つの実施形態において、この抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域と特異的に結合する。
【０１１２】
１つの実施形態において、この単離されたヒト抗体であって、前記ヒト重鎖ＣＤＲ２領域が、図１５で示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の該重鎖ＣＤＲ２領域であり、そして前記ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域が、図１６で示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ２領域である。
【０１１３】
１つの好ましい実施形態において、この抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域と特異的に結合する。
【０１１４】
１つの実施形態において、この単離されたヒト抗体であって、前記ヒト重鎖ＣＤＲ１領域が、図１５で示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の該重鎖ＣＤＲ１領域であり、そして前記ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域が、図１６で示されるような１６Ｅ１、２Ｄ８、２２Ｂ３、または９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ１領域である。
【０１１５】
１つの好ましい実施形態において、この抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）のＤ−Ｅループ領域と特異的に結合する、抗体。
【０１１６】
本発明の１つの局面において、単離されたヒト抗体であって、以下：
ａ．ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域であって、該ヒト重鎖ＣＤＲ３領域が、図１５に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ３領域である、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに
ｂ．ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域であって、該ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域が、図１６に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ３領域である、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域；
を含み、該抗体が、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と特異的に結合する。
【０１１７】
１つの実施形態において、この抗体は、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；あるいは
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方
と特異的に結合し、結合が、連続的または同時である。
【０１１８】
１つの好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【０１１９】
１つの実施形態において、この単離されたヒト抗体であって、前記ヒト重鎖ＣＤＲ２領域が、図１５に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ２領域であり、そして前記ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域が、図１６に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ２領域である。
【０１２０】
１つの好ましい実施形態において、この抗体が、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；あるいは
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方
と特異的に結合し、結合が連続的または同時である。
【０１２１】
１つのより好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【０１２２】
１つの実施形態において、前記ヒト重鎖ＣＤＲ１領域が、図１５に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の重鎖ＣＤＲ１領域であり、そして前記ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域が、図１６に示されるような２Ｅ１１または１８Ｂ２の軽鎖ＣＤＲ１領域である。
【０１２３】
１つの好ましい実施形態において、この抗体が、以下：
ａ．Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）の領域；あるいは
ｂ．該Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方
と特異的に結合し、結合が連続的または同時である。
【０１２４】
１つのより好ましい実施形態において、前記Ｄ−Ｅループ領域の外側にあるＯＰＧＬの領域および該Ｄ−Ｅループ領域の全てまたは一部の両方との結合が、連続的または同時である。
【０１２５】
本発明の特定の好ましい実施形態が、以下の特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）（図１Ａ）および抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号２）（図１Ｂ）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）（図１Ａ）および抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号２）（図１Ｂ）を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖定常領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３）（図２Ａ）および抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４）（図２Ｂ）を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、２２Ｂ３抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号５）（図３Ａ）および２２Ｂ３抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）（図３Ｂ）を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、２２Ｂ３抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号７）（図４Ａ）および２２Ｂ３抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）（図４Ｂ）を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、２Ｅ１１抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号９）（図５Ａ）および２Ｅ１１抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、２Ｅ１１抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１１）（図６Ａ）および２Ｅ１１抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）（図６Ｂ）を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、２Ｄ８抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１３）（図７Ａ）および２Ｄ８抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）（図７Ｂ）を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、２Ｄ８抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１５）（図８Ａ）および２Ｄ８抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）（図８Ｂ）を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、１８Ｂ２抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１７）（図９Ａ）および１８Ｂ２抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８）（図９Ｂ）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、１８Ｂ２抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１９）（図１０Ａ）および１８Ｂ２抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０）（図１０Ｂ）を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、１６Ｅ１抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２１）（図１１Ａ）および１６Ｅ１抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２２）（図１１Ｂ）を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、１６Ｅ１抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２３）（図１２Ａ）および１６Ｅ１抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２４）（図１２Ｂ）を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、９Ｈ７抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２５）（図１３Ａ）および９Ｈ７抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２６）（図１３Ｂ）を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、９Ｈ７抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２７）（図１４Ａ）および９Ｈ７抗ＯＰＧＬ抗体のκ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２８）（図１４Ｂ）を示す。
【図１５】図１５は、１６Ｅ１、２Ｅ１１、１８Ｂ２、２Ｄ８、２２Ｂ３、および９Ｈ７と名付けた抗ＯＰＧＬ抗体についての重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは下線が引かれており、非コンセンサスアミノ酸は影をつけてボールド体にしてある。
【図１６】図１６は、１６Ｅ１、２Ｅ１１、１８Ｂ２、２Ｄ８、２２Ｂ３、および９Ｈ７と名付けた抗ＯＰＧＬ抗体についての軽鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは下線が引かれており、非コンセンサスアミノ酸は影をつけてボールド体にしてある。
【図１７】図１７は、ｐＤＳＲα１９：９Ｈ７κ鎖発現ベクターの環状プラスミドの図を示す。
【図１８】図１８は、ｐＤＳＲα１９：９Ｈ７重鎖発現ベクターの環状プラスミドの図を示す。
【図１９】図１９は、抗ＯＰＧＬ抗体を産生するための例示的細胞培養プロセスを示す。
【図２０】図２０は、光学密度対抗ＯＰＧＬ抗体濃度を示すグラフであり、ＯＰＧＬ抗体媒介性の破骨細胞の阻害を実証する。
【図２１】図２１は、カニクイザルにおける、１．０ｍｇ／ｋｇでの皮下投与の後の抗ＯＰＧＬ抗体の血清濃度のグラフを示す。
【図２２】図２２は、カニクイザルにおける、抗ＯＰＧＬ抗体の１．０ｍｇ／ｋｇでの皮下投与の後の血清ＮＴｘの基線からの％変化を表すグラフを示す。
【図２３】図２３は、Ｄ領域とＥ領域との間のＯＰＧＬ領域における、マウス（配列番号７０）、ヒト（配列番号７１）、およびマウスＤＥ改変体（配列番号７２）のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２４】図２４は、酵素免疫アッセイの結果を示し、本発明の６つの抗ＯＰＧＬ抗体がマウスＯＰＧＬ（１４３〜３１７）に結合することを示す。
【図２５】図２５は、酵素免疫アッセイの結果を示し、本発明の４つの抗ＯＰＧＬ抗体がＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ／ＤＥ（１５８〜３１６）に結合することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に使用される節の題字は、組織化するための目的のみであり、記載する主題の限定として解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての参考文献は、任意の目的のために、本明細書に参考として明示的に援用される。
【０１２８】
（定義）
標準的な技術を組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用した。酵素反応および精製技術は、製造者の記載に従って、あるいは、当該分野で一般的になされているように、または本明細書に記載するように実行した。上述の技術および手順は、一般的に、当該分野で周知の従来の方法に従って、ならびに、本明細書にわたって引用され、考察される種々の一般的な参考文献およびより詳細な参考文献に記載されるように行った。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｒｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（任意の目的のために、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。特定の定義を提供しない限り、本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、および医化学および薬化学に関連して利用される命名法、およびそれらの実験室手順および技術は、当該分野で周知かつ一般的であるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、および送達、ならびに患者の処置のために使用され得る。
【０１２９】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有すると理解される：
用語「単離したポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、または合成的起源、あるいはそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源によって、単離したポリヌクレオチドは、（１）天然に見出された単離したポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しない、（２）天然では結合しないポリヌクレオチドに結合している、あるいは（３）より大きな配列の部分としては天然では存在しない。
【０１３０】
本明細書でいう、用語「単離したタンパク質」とは、主題のタンパク質が以下の特徴を有することを言う。（１）普通は一緒に見出される少なくともいくつかの他のタンパク質を有さない、（２）同じ供給源（例えば、同じ種）に由来する他のタンパク質を実質的に有さない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、（４）天然では結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の材料の少なくとも約５０％から分離されている、（５）天然では「単離したタンパク質」と結合しているタンパク質の一部と（共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって）結合していない、（６）天然では結合していないポリペプチドと（共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって）作動可能に結合している、あるいは（７）天然には存在しない。このような単離したタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、合成的な起源を有するもの、あるいはそれらの任意の組合せによってコードされ得る。好ましくは、単離したタンパク質は、天然環境において見出される、その使用（治療、診断、予防、研究など）を妨害する、タンパク質またはポリペプチド、あるいは他の夾雑物を実質的に含まない。
【０１３１】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ネイティブのタンパク質、つまり天然に存在する細胞および特定の非組換え細胞、あるいは遺伝学的に操作した細胞または組換え細胞によって生産されるタンパク質の配列を有する分子、ならびにネイティブのタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列の1つ以上のアミノ酸の欠失
、付加、および／または置換を有する分子を意味する。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、詳細には、抗ＯＰＧＬ抗体、あるいは抗ＯＰＧＬ抗体の1つ以上のアミノ
酸の欠失、付加、および／または置換を有する配列を含む。
【０１３２】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドをいう。特定の実施形態において、フラグメントは、少なくとも５〜約５００アミノ酸の長さである。特定の実施形態において、フラグメントは、少なくとも５，６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸の長さであるっことが理解される。特に有用なポリペプチドフラグメントとしては、機能的ドメイン（結合ドメインを含む）が挙げられる。抗ＯＰＧＬ抗体の場合、有用なフラグメントとしては、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖または２つのＣＤＲを含む可変領域の一部などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
用語「免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント」とは、本明細書で使用する場合、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の少なくともＣＤＲを含むポリペプチドフラグメントをいう。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、抗原に結合し得る。好ましい実施形態において、抗原は、レセプターに特異的に結合するリガンドである。これらの実施形態において、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントの結合は、リガンドのレセプターへの結合を防止し、レセプターに結合したリガンドによって生じる生物学的応答を妨害する。好ましくは、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、ＯＰＧＬに特異的に結合する。最も好ましくは、このフラグメントは、ヒトＯＰＧＬに特異的に結合する。
【０１３４】
用語「天然に存在する」とは、本明細書で使用し、対象に適用する場合、対象が天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）に存在し、かつヒトによって意図的に改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列が、天然に存在する。
【０１３５】
用語「作動可能に結合した」とは、用語が適用される成分が、適切な条件下でそれらが本来の機能を実行することを可能とする関係にあることを意味する。例えば、制御配列は、それに結合するコード配列に「作動可能に結合し」、それによって、制御配列の転写活性に適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成される。
【０１３６】
用語「制御配列」とは、本明細書で使用する場合、それらがライゲーションされたコード配列の発現、プロセッシングまたは細胞内局在をもたらし得るポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なり得る。特定の実施形態において、原核生物のための制御配列としては、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられ得る。別の特定の実施形態において、真核生物のための制御配列としては、転写因子のための１つ以上の認識部位を有するプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列およびポリアデニル化配列が挙げられ得る。特定の実施形態において、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列が挙げられ得る。
【０１３７】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書でいう場合、少なくとも１０塩基の長さの一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。前記改変体としては、塩基改変体（例えば、ブロモウリジン）、リボース改変体（例えば、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボース）およびヌクレオチド間結合改変体（例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ））が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、詳細には、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含む。
【０１３８】
用語「オリゴヌクレオチド」としては、本明細書で使用する場合、天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および／または天然には存在しないオリゴヌクレオチド結合によって、一つに結合した天然に存在するヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドが挙げら得る。オリゴヌクレオチドは、一般的に、一本鎖であり、２００塩基以下の長さを有するメンバーを含む、ポリヌクレオチドのサブセットである。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝異変体の構築における使用のために、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列を基準として、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１３９】
用語「天然に存在するヌクレオチド」としては、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが挙げられる。用語「改変ヌクレオチド」としては、改変されているか、または置換されている糖基などを有するヌクレオチドが挙げられる。用語「オリゴヌクレオチド結合」としては、オリゴヌクレオチド結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなど）が挙げられる。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１；Ｓｔｅｃら，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９；Ｚｏｎら，１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９；Ｚｏｎら，１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ，８７−１０８ページ；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（これらのそれぞれの開示は、任意の目的のために本明細書に参考として援用される）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能とするために検出可能な標識を含み得る。
【０１４０】
用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【０１４１】
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞の形質転換のために適切であり、挿入した異種の核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を有するベクターをいう。発現としては、例えば、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）といったプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
用語「宿主細胞」は、形質転換されているか、または核酸配列で形質転換され、次いで、選択した目的の遺伝子を発現させ得る細胞をいうために使用される。選択した遺伝子が存在している限り、その子孫が、起源である親細胞に対して、形態学または遺伝子組成において同一であるか否かを問わず、この用語は親細胞の子孫を含む。
【０１４３】
用語「形質導入」は、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移転をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物の細胞内配列の獲得および転移もいう。
【０１４４】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性のＤＮＡの取り込みをいうために使用され、外因性ＤＮＡをその細胞膜の内側に導入した場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、当該分野において周知であり、本明細書において開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，前出；Ｄａｖｉｓら，１９８６，ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞に1つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入するために使用され
得る。
【０１４５】
用語「形質転換」とは、本明細書で使用する場合、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、細胞は形質転換されて、ネイティブの状態から遺伝学的に改変される。トランスフェクションまたは形質導入の後で、形質転換されているＤＮＡは、物理的に細胞の染色体に統合することで細胞中のＤＮＡと再結合し得るし、複製されることなくエピソーム要素として一過的に維持され得るし、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、細胞は安定的に形質転換されていると考えられる。
【０１４６】
用語「天然に存在する」または「ネイティブ」とは、生物学的材料（例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など）に関連して使用する場合、天然に見出され、ヒトによって操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「非ネイティブ」とは、本明細書で使用する場合、天然には見出されないか、あるいはヒトによって構造的に改変されているか、または合成されている材料をいう。
【０１４７】
用語「抗原」とは、選択的な結合因子（例えば、抗体）によって結合され得る分子またはその一部、および抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために動物においてさらに使用され得る分子またはその一部をいう。抗原は、1つ以上のエピトープを有し得る
。
【０１４８】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係性をいい、これらはその配列を比較することで決定される。当該分野において、「同一性」はまた、核酸分子またはポリペプチドの間の配列関連性の程度も意味し、場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列の間の適合によって決定される。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって得られるギャップアラインメント（ある場合）を有する２つ以上の配列のより小さいほうの間の同一的適合の％の単位である。
【０１４９】
用語「類似性」は、当該分野において関連する概念について使用されるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」とは、同一的適合および保存的な置換の適合の両方を含む関連性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０が同一のアミノ酸であり、残りが全て非保存的置換である場合、その％同一性および％類似性は両方とも５０％である。同じ例において、保存的な置換が存在する５以上の位置が存在する場合、％同一性は５０％のままであるが、％類似性は７５（１５／２０）である。そのために、保存的置換が存在する場合において、２つのポリペプチドの間の％類似性は、この２つのポリペプチドの間の％同一性よりも高い。
【０１５０】
関連するポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編），１９９４、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏら，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３；およびＤｕｒｂｉｎら，１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列の間の最大の適合を与えるように設計されている。同一性を決定するための方法は、公共的に利用可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）が挙げられるが、これに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，前出）から公共的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【０１５２】
２つのアミノ酸配列をアラインメントするための特定のアラインメントのスキームは、個の２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、この小さなアラインメント領域は、たとえこの２つの全長配列の間に十分な関係がない場合であっても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、特定の実施形態において、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続的アミノ酸を含むアラインメントを生じ得る。
【０１５３】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用する場合、％配列同一性が決定されるべき２つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適にな適合（「適合スパン」、アルゴリズムによって決定される）についてアラインメントされる。特定の実施形態において、ギャップ開始ペナルティ（３回の平均ディアゴナルとして計算される。ここで、「平均ディアゴナル」は、使用されている比較マトリクスのディアゴナルの平均値であり、「ディアゴナル」は、特定の比較マトリクスによる各完全なアミノ酸の適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常は、ギャップ開始ペナルティの１／１０である）、ならびに比較マトリクス（例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２）が、アルゴリズムと組合わせて使用される。特定の実施形態において、標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０の比較マトリクスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２の比較マトリクスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）もまた、アルゴリズムによって使用される。
【０１５４】
特定の実施形態において、ポリペプチド配列比較のためのパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリクス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，前出からのＢＬＯＳＵＭ ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターとともに有用であり得る。特定の実施形態において、前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップのペナルティーはない）。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、２０の従来形アミノ酸およびその略語は、従来の使用法に従う。ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編），１９９１，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，（これらは、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然のアミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型アミノ酸はまた、本発明のポリペプチドの適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプチド表記法において、標準的な使用法および慣習に従って、左側がアミノ末端方向であり、右側がカルボキシ末端方向である。
【０１５６】
同様に、別段記載されなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は、５’方向といわれる。伸長中のＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向といわれる；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」といわれる；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」といわれる。
【０１５７】
天然に存在する残基は、一般的な側鎖の特性に基づいたクラスに分類され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５８】
保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得、このアミノ酸残基は、代表的には、生物学的系における合成よりむしろ、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆形態または反転形態が挙げられる。
【０１５９】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを包含し得る。このような置換された残基は、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域に、または分子の非相同な領域に導入され得る。
【０１６０】
このような変更を行う際に、特定の実施形態に従って、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。ヒドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１６１】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を起こす際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【０１６２】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。特定の実施形態において、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、免疫原性および抗原結合または免疫原性と（すなわち、タンパク質の生物学的特性と）相関する。
【０１６３】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープをまた、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【０１６４】
例示的なアミノ酸置換は、表１に示される。
【０１６５】
（表１）
【０１６６】
【表１】

当業者は、周知の技術を用いて、本明細書中に記載されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。特定の実施形態において、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得ることによって、活性を破壊することなく変化され得るその分子の適切な領域を同定し得る。他の実施形態において、当業者は、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。さらなる実施形態において、生物学的活性または構造に重要な領域さえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【０１６７】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、当業者は、類似のタンパク質における活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質における、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【０１６８】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。特定の実施形態において、当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換をそれぞれの所望されるアミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。次いで、これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が破壊を生じるか、所望でなく減少するか、または所望でない活性であることを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避され得る。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【０１６９】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． ｉｎＢｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１１３：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６（１９７８）；およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４（１９７９）を参照のこと。さらに、二次構造を推定するのを補助するために、コンピュータープログラムが現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された推定性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、重要な数の構造が解析されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１７０】
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３５５−４３５８）、および「ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ」（Ｈｏｌｍら、１９９９、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、１９９７、前出を参照のこと）を包含する。
【０１７１】
特定の実施形態において、抗体改変体は、グリコシル化改変体を含み、ここでグリコシル化部位の数および／またはタイプは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されている。特定の実施形態において、タンパク質改変体は、ネイティブタンパク質より多いまたは少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴づけられ、ここでＸと示されるアミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作り出すためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型の炭水化物鎖の付加のために可能な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除または変化させる置換は、ネイティブポリペプチドに存在するＮ結合型炭水化物鎖の付加を防止する。また、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配置が提供される。ここで１以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的には、天然に存在するもの）が排除され、１以上の新しいＮ結合型部位が作り出される。さらに好ましい抗体改変体は、システイン改変体を含み、ここで親またはネイティブのアミノ酸配列中の１以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸で置換される（例えば、セリン）。システイン改変体は、特に、抗体が生物学的に活性なコンホメーションに再折りたたみされなければならない場合、例えば、不溶性封入体の単離の後に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、代表的には、不対システインから生じる相互作用を最小限にするために偶数である。
【０１７２】
さらなる実施形態において、抗体改変体は、改変Ｆｃフラグメントまたは改変重鎖定常領域を含む抗体を含み得る。Ｆｃフラグメント（これは、「結晶化するフラグメント」を表す）または重鎖定常領域は、変異によって改変されて、変化した結合特性を抗体に与え得る（例えば、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１：１−８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４，ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２４５−２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２−２１００；これらの全ては、本明細書中に参考として援用される、を参照のこと）。このような変異は、置換、付加、欠失、またはこれらの任意の組み合わせを含み得、代表的には、本明細書中に記載の方法に従って、そして当該分野で公知の方法に従って（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，第３版，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，本明細書中に参考として援用される、を参照のこと）、１以上の変異原性オリゴヌクレオチドを使用して、部位指向性変異誘発によって生成される。
【０１７３】
特定の実施形態に従って、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解性に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体の形成に対する結合親和性を変化させ、（４）リガンドまたは抗原の結合親和性を変化させ、そして／または（５）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的特性または機能的特性を付与するか、またはこれらの特性を改変するものである。特定の実施形態に従って、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において（特定の実施形態においては、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）行われ得る。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、代表的には、親配列の構造的特性を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを壊すか、または親配列を特徴づける二次構造の他の型を破壊する傾向がないはずである）。当該分野で認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ
ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ （ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ，編），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（その各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１７４】
ペプチドアナログは、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬物として製薬産業において一般的に使用される。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（これらは、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）。このような化合物は、しばしば、コンピューター化分子モデリングの補助により開発されている。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療的効果または予防的効果を生成するために使用され得る。一般的に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体のようなパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当該分野で周知の方法によって、以下から選択される連結によって必要に応じて置換される１以上のペプチド結合を有する：−−ＣＨ_２ＮＨ−−、−−ＣＨ_２Ｓ−−、−−ＣＨ_２−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ_２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−−、および−−ＣＨ_２ＳＯ−−。同じ型のＤ−アミノ酸を有するコンセンサス配列の１以上のアミノ酸の体系的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、特定の実施形態において、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列バリエーションを含む拘束されたペプチドは、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって、当該分野で公知の方法によって生成され得る（全ての目的のために本明細書中に参考として援用されるＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）。
【０１７５】
「抗体」または「抗体ペプチド」とは、特異的結合について、インタクトな抗体と競合する、インタクトな抗体またはその結合フラグメントをいう。特定の実施形態において、結合フラグメントは組換えＤＮＡ技術によって生成される。特定の実施形態において、結合フラグメントは、インタクトな抗体の酵素的切断または化学的切断によって生成される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、および単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
用語「重鎖」は、重鎖定常領域およびＯＰＧＬに対する特異性を付与するために十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。用語「軽鎖」は、軽鎖定常領域およびＯＰＧＬに対する特異性を付与するために十分な可変領域配列を有する免疫グロブリンポリペプチドを含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｈ、および３つの定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。このＶ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈ３ドメインは、カルボキシル末端にある。用語「重鎖」は、本明細書中で使用される場合、全長重鎖およびそのフラグメントを含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｌ、および定常領域ドメインＣ_Ｌを含む。重鎖のように、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。用語「軽鎖」は、本明細書中で使用される場合、全長軽鎖およびそのフラグメントを含む。Ｆ（ａｂ）フラグメントは、１つの軽鎖およびＣ_Ｈ１ならびに１つの重鎖の可変領域から構成される。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、１つの軽鎖およびＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間に多くの定常領域を含む１つの重鎖を含む。その結果、鎖間ジスルフィド結合は、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成するために２つの重鎖の間で形成され得る。Ｆｖ領域は、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。単鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変領域が可撓性のリンカーによって接合されて、抗原結合領域を形成する単一ポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。単鎖抗体は、ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号（参考として援用される）に詳細に議論されている。
【０１７７】
「多特異的」または「多機能的」抗体以外の二価抗体は、特定の実施形態において、同一の抗原性特異性を有する結合部位を含むことが理解される。
【０１７８】
本発明に従う抗体結合性および特異性を評価するにあたって、抗体は、過剰な抗体が、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、またはそれ以上（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定される）、レセプターに結合したリガンドの量を減少させる場合、リガンドがレセプターに結合することを実質的に阻害する。
【０１７９】
用語「エピトープ」は、任意のポリペプチド決定基、好ましくは、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得るポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面の基を含み、特定の実施形態においては、特定の三次元構造特性、および／または特異的な電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。特定の実施形態において、抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体は、解離定数が１０^−８Ｍ以下である場合、特定の実施形態において、解離定数が１０^−９Ｍ以下である場合、特定の実施形態において、解離定数が１０^−１０Ｍ以下である場合、抗原を特異的に結合するという。
【０１８０】
用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を示すために、本明細書中で使用される。
【０１８１】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」または「標識される」とは、検出可能なマーカーの、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込みまたはポリペプチドへの、標識されたアビジン（例えば、好ましくは、光学的方法もしくは比色法により検出され得る蛍光マーカー、化学発光マーカー、または酵素活性のような検出可能なマーカーを含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン部分の結合による組み込みをいう。特定の実施形態において、標識はまた、治療剤であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、本明細書中に開示される方法において有利に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネートまたはＦＩＴＣ、ローダミン、またはランタニド蛍光体（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ））、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン基）および二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメインまたはエピトープタグ）。特定の実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ_２）_ｎ、約２０未満のｎ）によって結合されて、潜在的な立体障害が減少される。
【０１８２】
用語「生物学的サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、生きているものまたは以前に生きていたものに由来する任意の量の物質を含むが、これらに限定されない。このような、生きているものとしては、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が挙げられるが、これらに限定されない。このような物質としては、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節、および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
用語「骨減少障害」は、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、溶解性骨転移、歯周炎、慢性関節リウマチ、および固定に起因する骨の喪失を含むが、これらに限定されない。これらの骨障害に加えて、乳癌および前立腺癌ならびに多発性骨髄腫のような特定のガンは、破骨細胞活性を増大させ、骨の再吸収を誘導することが公知である。これらの癌は、現在、骨中のＯＰＧＬの過剰発現を生じる因子を生成し、増大した破骨細胞数および活性をもたらすことが公知である。
【０１８４】
用語「薬学的因子または薬物」とは、本明細書中で使用される場合、適切に患者に投与された場合、所望の治療的効果を誘導し得る化合物または組成物をいう。
【０１８５】
本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋」または「実質的に精製される」とは、存在する主な種である（すなわち、モルベースで組成物中に任意の他の個々の種より量が多い）化合物または種を意味する。特定の実施形態において、実質的に精製された画分は、目的の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物である。特定の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％より多くを含む。特定の実施形態において、この種は、本質的に均一になるまで精製される（夾雑種は、従来の検出法によって組成物中で検出できない）。ここでこの組成物は、単一の高分子種から本質的になる。
【０１８６】
用語「患者」は、ヒトおよび動物の被験体を含む。
【０１８７】
文脈が別段必要としなければ、単数形は、複数形を含むこととし、複数形もまた単数形を含むこととする。
【０１８８】
本発明は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）（破骨細胞の形成に関与するサイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバー）に免疫学的に特異的な、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、最も好ましくは、ヒト抗体を提供する。増大した破骨細胞活性は、多くの骨減少障害（閉経後の骨粗鬆症、パジェット病、溶解性骨転位および慢性関節リウマチを含む）と相関する。従って、ＯＰＧＬ活性の減少は、破骨細胞活性の減少を生じ得、骨減少障害の重篤度を低下させ得る。本発明の特定の実施形態に従って、ＯＰＧＬに対する抗体は、骨減少障害（上記の障害が挙げられるが、これらに限定されない）を検出し、診断し、予防し、そして処置するために使用され得る。
【０１８９】
本発明の特定の実施形態において、ヒトＯＰＧＬに対する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。特定の実施形態において、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子（特に、可変領域に対応する配列）をコードするヌクレオチド配列およびこれらを含むアミノ酸が提供される。特定の実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）（特に、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に対応する配列が提供される。特定の実施形態に従って、例えば、免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株がまた提供される。特定の実施形態において、本発明は、ヒトＯＰＧＬに対する精製されたヒトモノクローナル抗体を提供する。
【０１９０】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）におけるメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローン化および再構築する能力ならびにそれらをマウス生殖細胞系内に導入する能力は、非常に大きなまたはおおまかにマッピングされた遺伝子座の機能的成分の解明およびヒト疾患の有用なモデルの作製に対するアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するためのこのような技術の利用は、発生の間のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とそれらの連絡、ならびに疾患の誘導および進行のそれらの関連に対する独特の観察を提供する。
【０１９１】
このような戦略の重要な実用的な適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウス内へのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の導入は、抗体の機構の元にあるプログラム化された発現および構築ならびにＢ細胞発生におけるそれらの役割を研究するための機会を提供する。さらに、このような戦略は、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生のための供給源を提供する。完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来のＭＡｂに特有の免疫原応答およびアレルギー応答を最小化し、そしてそれによって、投与された抗体の効力および安全性を増加することを予期される。完全ヒト抗体は、骨粗鬆症、炎症、自己免疫、および癌のような慢性ヒト疾患および繰り返すヒト疾患（その処置が、繰り返された抗体投与を必要とする）の処置に使用され得る。従って、本発明の抗ＯＰＧＬ抗体の１つの特定の利点は、抗体が完全ヒトであり、そしてヒト抗マウス抗体または非ヒト種由来の他の以前に記載された非完全ヒト抗体と通常関連する有害な反応を最小にしながら、非急性の様式で患者に投与され得る。
【０１９２】
当業者は、マウス抗体産生において欠損したマウス株をヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントで操作し得、その結果、マウスは、ヒト抗体を産生するが、マウス抗体を産生しない。マウス生殖系の大きなヒトＩｇフラグメントは、可変遺伝子の多様性ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存する。抗体の多様性のためのマウスの機構ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の選択および欠如を利用することによって、これらのマウス株における再生されたヒト抗体レパートリーは、目的の任意の抗原（ヒト抗原を含む）に対する高い親和性抗体を生じる。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂは、産生および選択され得る。
【０１９３】
特定の実施形態において、当業者は、ヒト可変領域とともにヒト以外の種由来の領域を構築して、キメラ抗体を産生し得る。
【０１９４】
（天然に存在する抗体構造）
天然に存在する抗体の構造的単位は、代表的に、テトラマーを含む。各々のこのようなテトラマーは、代表的に、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各々の対は、１つの完全長「軽」鎖（特定の実施形態において、約２５ｋＤａ）および１つの完全長「重」鎖（特定の実施形態において、約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、代表的に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、代表的に、エフェクター機能を担い得る定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、代表的に、κ鎖およびλ鎖として分類される。重鎖は、代表的に、μ、δ、、γ、またはεとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧは、いくつかのサブクラス（ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４を含むがこれらに限定されない）を有する。ＩｇＭは、サブクラス（ＩｇＭ_１およびＩｇＭ_２を含むがこれらに限定されない）を有する。ＩｇＡは、同様に、サブクラス（ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２を含むがこれらに限定されない）に分割される。全長軽鎖および重鎖内において、代表的に、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＮＯＬＯＧＹ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕ１，Ｗ．，ｅｄ，）１９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、代表的に、抗原結合部位を形成する。
【０１９５】
可変領域は、代表的に、相補性決定領域またはＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域によって結合される比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、代表的に特定のエピトープへの結合を可能にし得るフレームワーク領域によって整列される。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方が、代表的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、代表的に、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （１９８７および１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ．１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３の定義に従った。
【０１９６】
（二重特異的抗体または二機能性抗体）
二重特異性抗体または二機能性抗体は、代表的に、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｋｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照のこと。
【０１９７】
（抗体の調製）
本発明は、ヒトＯＰＧＬに特異的に結合する抗体を提供する。特定の実施形態において、抗体は、全長ＯＰＧＬまたはそのフラグメントでの免疫化によって産生され得る。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、および／または組換え抗体であり得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物の免疫化によって調製されるヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願番号、ＷＯ９３／１２２２７を参照のこと）。
【０１９８】
抗ＯＰＧＬ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、同じかまたは別の種からの抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植され得る。特定の実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植され得る。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、特定の実施形態において、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列由来のＦＲは、コンセンサスアミノ酸配列を同定するために整列される。特定の実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置換される。特定の実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲのまれなアミノ酸は、置換されないが、一方、ＦＲアミノ酸の残りは、置換される。まれなアミノ酸は、それらが通常ＦＲにおいて見出されない位置にある特定のアミノ酸である。特定の実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体由来の移植された可変領域は、抗ＯＰＧＬ抗体の定常領域とは異なる定常領域とともに使用され得る。特定の実施形態において、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号に記載される（これらは、本明細書によって、任意の目的で、参考として援用される）。
【０１９９】
本発明の抗体は、マウスの抗体産生細胞に挿入されるヒト抗体産生遺伝子座の実質的な部分を有し、そして内因性マウス抗体を産生する際に欠損するようにさらに操作されるトランスジェニックマウスを使用して調製される。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、そしてマウス免疫グロブリン分子および抗体を産生しないかまたは実質的に減少した量を産生する。この結果を達成するために使用される技術は、本明細書中に開示される特許、出願、および参考文献に開示される特許、出願、ならびに参考文献に開示される。特定の実施形態において、当業者は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２４８９３（これは、任意の目的で参考として本明細書中で援用される）に開示される方法を使用し得る。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（これは、任意の目的で本明細書によって参考として援用される）を参照のこと。
【０２００】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術）を含む種々の技術によって産生され得る。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいものの、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の技術（例えば、Ｂリンパ細胞のウイルスまたは腫瘍形成性形質転換）が使用され得る。
【０２０１】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウスである。マウスのハイブリドーマ産生は、十分に確立されており、そして融合のための免疫化脾細胞の単離技術は、当該分野において周知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
【０２０２】
好ましい実施形態において、ＯＰＧＬに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウスを使用して作製され得る。これらのトランスジェニックマウス（本明細書中において、「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれる）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的化された変異とともに、非再配列ヒト重鎖免疫グロブリン配列（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ｅｄ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６−８５９）。従って、このマウスは、ＩｇＭまたはκの減少した発現を示し、そして免疫化に応答して、導入されるヒト重鎖および軽鎖トランスジェニックは、抗親和性ヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を作製するためにクラススイッチおよび体細胞変異を受ける（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ，Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１（これらの全ての内容が、その全体で参考として本明細書によって援用される）に詳細に記載される。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１．０１６号；同第５，８１４．３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；（全て、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する）、ならびに米国特許第５，５４５，８０７（Ｓｕｒａｎｉらに対する）；国際公開番号ＷＯ ９３／１２２７，１９９３年６月２４日に公開；ＷＯ ９２／２２６４６，１９９２年１２月２３日に公開；ＷＯ ９２／０３９１８、１９９２年３月１９日に公開（これらの全ての開示が、その全体で本明細書によって援用される）をさらに参照のこと。あるいは、以下の実施例に記載されるＨＣｏ７トランスジェニックマウス株およびＨＣｏ７トランスジェニックマウス株を、ヒト抗ＯＰＧＬ抗体を作製するために使用され得る。
【０２０３】
特定の実施形態に従って、ＯＰＧＬに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体は、以下のように産生される。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスは、目的の抗原で免疫化される。抗体を発現するマウス由来のリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）が得られる。このように回復される細胞を骨髄腫型細胞株と融合されて、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し、そしてこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、そして目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために選択される。特定の実施形態において、ＯＰＧＬに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の産生が提供される。
【０２０４】
本発明の特定の実施形態において、この抗体は、１０^−８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）でＯＰＧＬに結合する。特定の実施形態において、本発明の抗体は、約１０^−８Ｍと１０^−１０Ｍとの間のＫ_ｄで、ＯＰＧＬに結合する。
【０２０５】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ_１アイソタイプである。本発明の特定の実施形態において、抗体は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ_１重鎖を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体を含む重鎖および軽鎖をコードする核酸は、哺乳動物細胞での発現のためにクローニングされた。特定の実施形態において、抗体の可変領域は、ＩｇＧ_１アイソタイプについての定常領域以外の定常領域に連結される。
【０２０６】
特定の実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖および軽鎖に対する保存的改変（およびコードする核酸に対する対応する改変）は、抗ＯＰＧＬ抗体と類似の機能および生化学特徴を有する抗ＯＰＧＬ抗体を産生する。対照的に、抗ＯＰＧＬ抗体の機能的および／または生化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたは螺旋コンフォメーションのような置換の領域の分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対するそれらの効果において有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中の置換を作製することによって達成され得る。
【０２０７】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、非ネイティブ残基によるネイティブアミノ酸残基の置換をいう。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。

所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、抗ＯＰＧＬ抗体の重要な残基を同定するために、または本明細書中に記載される抗ＯＰＧＬ抗体の親和性を増加または減少するために使用され得る。
【０２０８】
代替の実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。これらの実施形態において、特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用され得る。これらの実施形態において、形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入する（例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに（またはウイルスベクター内に）パッケージし、そして宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入することを含む）ための任意の公知の方法によって、または当該分野で公知のトランスフェクション手順によってであり得る（米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、任意の目的で本明細書中で参考として適用される）によって例示される）。一般的に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該分野で周知であり、これには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内のポリヌクレオチドのカプセル化、核酸と正電荷脂質の混合、および核酸内へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
本発明のＯＰＧＬ抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または軽鎖領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的連結技術を使用して適切な発現ベクター内に挿入される。好ましい実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体重鎖または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に付加され、そして発現ベクター内に連結される。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が存在し得るように、宿主細胞機構と適合する）。発現ベクターの概説について、ＭＥＴＨ．ＥＮＺ．１８５（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。代表的に、宿主細胞のいずれかに使用される発現ベクターは、プラスミド維持のため、および外部ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０２１０】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＯＰＧＬポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス））または市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＯＰＧＬポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対して抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＯＰＧＬポリペプチドから除去される。
【０２１１】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）、合成またはネイティブであり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０２１２】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０２１３】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である否かに関わらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子を含み得る大きな片のＤＮＡから単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明かである。
【０２１４】
複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０２１５】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化され得るか、またはベクターの一部として市販で購入され、これは、本明細書中上記のような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０２１６】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。細菌ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方における選択のために使用され得る。
【０２１７】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、特定の条件下で細胞の生存および増殖を可能にするのに十分な高いレベルで、単一のコピー数で発現され得ない遺伝子が組み換え細胞の連続的生成の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびプロモーターレスチミジンキナーゼが挙げられる。これらのプロモーターを使用すると、哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＯＰＧＬポリペプチドに結合する抗体のような別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量の抗ＯＰＧＬ抗体のようなポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。
【０２１８】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましい、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最後のタンパク質産物は、１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断される場合、所望のポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０２１９】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、抗ＯＰＧＬ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出すかまたはポリメラーゼ連鎖反応によってプロモーターを増幅し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、抗ＯＰＧＬ抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０２２０】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定されないが、以下のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０２２１】
関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定されないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ ２２ ：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリンベースのタンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）；ならびに最も特にリンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）。
【０２２２】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明の抗ＯＰＧＬ抗体をコードする核酸の転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に独立する。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化について例示的に増強するエレメントである。エンハンサーは、核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０２２３】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような簡便な開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がすでにベクター内に存在しない場合、これらは、個々に得られ得、そしてベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０２２４】
ベクターが構築され、そして抗ＯＰＧＬ抗体をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。抗ＯＰＧＬ抗体に対する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、例えば、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部で、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示される。
【０２２５】
適切な条件下で培養される場合、宿主は、（宿主細胞が抗ＯＰＧＬ抗体を培養液中に分泌する場合に）培養培地から引き続いて回収され得るか、または（抗ＯＰＧＬ抗体が分泌される場合に）抗ＯＰＧＬ抗体を産生する宿主細胞から直接回収され得る、抗ＯＰＧＬ抗体を合成する。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子（例えば、所望の発現レベル、グリコシル化またはリン酸化のような所望の活性または必要な活性であるポリペプチドの改変、ならびに生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さ）に依存する。
【０２２６】
発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限定されないが、以下が挙げられる：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な多くの不死化細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多数の他の細胞株）。特定の実施形態において、細胞株が高い発現レベルを有し、そして構成的なＯＰＧＬ結合特性を有する抗体を産生することを測定することによって、細胞株は、選択され得る。別の実施形態において、それ自体の抗体を作製しないが、異種抗体を産生し、そして分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株が、選択され得る。
【０２２７】
本発明の抗体は、生物学的サンプル中のＯＰＧＬの検出、およびタンパク質を生成する細胞または組織の識別に関して、有用である。特定の実施形態において、ＯＰＧＬに結合し、他のＯＰＧＬと結合する化合物との相互作用をブロックする抗体は、破骨細胞分化および骨吸収の調節における、治療上の用途を有し得る。特定の実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、ＯＰＧＬのＯＤＡＲ（ＲＡＮＫ）への結合をブロックし得、その結果として、シグナル伝達カスケードの閉塞、およびＮＦ−ｋＢ媒介性転写活性の損失となり得る。ＮＦ−ｋＢ媒介性転写活性の測定（例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる）に関するアッセイは、当業者に公知である。
【０２２８】
特定の実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、骨の疾患（例えば、骨粗鬆症およびパジェット病）の処置において有用であり得る。特定の実施形態において、抗体は、ＯＰＧの存在下または非存在下における、ＯＰＧＬへの結合に関して試験され得、ＯＰＧＬ媒介性破骨細胞生成の阻害能力および／または骨吸収の阻害能力を検査され得る。
【０２２９】
本発明の抗ＯＰＧＬ抗体は、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて（特に、他の癌治療薬と組み合わせて）投与され得る。このような薬剤は、一般に、放射線療法または化学療法を含む。例えば、化学療法は、以下：アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、および当業者に公知の他の薬物のうち、１種以上の処置を含み得る。
【０２３０】
さらに、抗ＯＰＧＬ抗体は、腫瘍細胞に結合し、腫瘍の増殖への細胞傷害性効果および／または細胞増殖抑制性効果を誘導する抗体と組み合わせて、患者に投与され得る。このような抗体の例として、細胞表面のタンパク質 Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質および腫瘍細胞上に存在する上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）に結合し、これらのタンパク質を提示する腫瘍細胞への細胞傷害性効果および／または細胞増殖抑制性効果を誘導する抗体が、挙げられる。このような抗体の例として、乳癌の処置のためのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ、および非ホジキンリンパ腫の処置のためのＲＩＴＵＸＡＮが挙げられる。また、組み合わせ治療には、癌治療薬剤として、腫瘍細胞中で選択的にアポトーシスを誘導するポリペプチド（例えば、ＴＮＦ関連ポリペプチド ＴＲＡＩＬ）が挙げられる。本発明の抗ＯＰＧＬまたは抗原結合フラグメントは、癌治療薬剤での処置の前に、癌治療薬剤での処置と共に、または癌治療薬剤での処置の後に投与され得る。抗ＯＰＧＬ抗体は、転移性の癌による骨重量の損失の発症を防ぐために、または和らげるために、予防的に投与され得、あるいは、転移に起因する骨重量の損失の現状の処置のために与えられ得る。
【０２３１】
本発明の抗ＯＰＧＬ抗体は、骨中の腫瘍細胞の増殖を防ぐためにおよび／または処置するために、使用され得る。骨に転移する癌は、内骨基質を再吸収するように腫瘍細胞が破骨細胞を刺激すると、直ちに広がり得る。抗ＯＰＧＬ抗体での処置は、再吸収を阻害し、腫瘍細胞が骨格全体に広がる可能性を減少させることにより、骨密度を維持する。骨に転移する任意の癌は、抗ＯＰＧＬ抗体で防がれ得るおよび／または処置され得る。
【０２３２】
１つの実施形態において、多発性骨髄腫は、抗ＯＰＧＬ抗体または抗ＯＰＧＬ抗体の抗原結合フラグメントで、防がれ得るおよび／または処置され得る。多発性骨髄腫は、骨に局在化する。罹患患者は、典型的に、局在化領域における破骨細胞の活性化の増大に起因する骨重量の損失を示す。骨髄腫細胞は、直接的かまたは間接的かのどちらかでＯＰＧＬを生成し、次いで、このことが破骨細胞を活性化し、結果として骨髄空間に埋め込まれた骨髄腫細胞を取り囲む、局所的な骨の溶解となる。骨髄腫細胞に隣接する標準的な破骨細胞は、次いで、骨髄腫細胞の増殖および拡散を導くＩＬ−６を生成する。骨髄腫細胞は、クローン様式で拡張し、不適当な骨の再吸収により形成される骨の空間を占有する。抗ＯＰＧＬ抗体での動物の処置は、破骨細胞の活性化をブロックし、次いで、このことが破骨細胞によるＩＬ−６生成の減少、ならびに骨髄腫すべての増殖および／または拡散の抑制を導く。
【０２３３】
抗ＯＰＧＬ抗体は、上記で引用した骨重量の損失の結果となる状態の処置に関して、単独で使用され得、あるいは、治療的に効果的な量の骨増殖促進性（同化促進性）薬剤または骨抗吸収性薬剤（例えば、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２の指定された骨形態形成因子、トランスホーミング増殖因子−βおよびＴＧＦ−βファミリーの構成要素、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１０、インターロイキン−１ インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、副甲状腺ホルモン、Ｅシリーズプロスタグランジン、ビスホスホネートおよび骨促進性ミネラル（例えば、フッ化物およびカルシウム）が挙げられるが、これに限らない）と組み合わせて使用され得る。同化作用性薬剤としては、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）が挙げられ、ここで、後者の薬剤は、好ましくはＩＧＦ結合性タンパク質と複合化される。好ましい実施形態としてはまた、抗ＯＰＧＬ抗体とインターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターアンタゴニストとの組み合わせ、あるいは抗ＯＰＧＬ抗体と可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター−１または可溶性ＴＮＦレセプター−２）との組み合わせが挙げられる。例示的なＩＬ−１レセプターアンタゴニストは、ＷＯ８９／１１５４０に、ならびに例示的な可溶性ＴＮＦレセプター−１はＷＯ９８／０１５５５に記載される。
【０２３４】
好ましい実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、保存料および／またはアジュバントと共に、治療有効量の本発明の抗体を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、治療有効量の抗ＯＰＧＬ抗体を含む薬学的組成物が、提供される。
【０２３５】
受容可能な処方物質は、好ましくは、使用される容量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。この薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸収または浸透を改変、維持または保存するための処方物質を含み得る。適切な処方物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；ならびに他の糖類（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香料および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニクス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；等張性増強剤（例えば、アルカリ金属ハライド（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバント。（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【０２３６】
特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば、投与の意図される経路、送達様式および所望の投薬に依存して、当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前出）を参照のこと。このような組成物は、物理的状態、安定性、本発明の抗体のインビボ放出の速度および本発明の抗体のインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２３７】
薬学的組成物中の主なビヒクルまたはキャリアは、その性質が水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口投与のための組成物中に一般的な他の材料が補充されていてもよい。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み得る。これは、ソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。抗ＯＰＧＬ抗体組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態で、任意の処方剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出）で所望の程度の純度を有する選択された組成物と混合することによって、保存用に調製され得る。さらに、抗ＯＰＧＬ抗体産物は、スクロースのような適切な賦型剤を用いた凍結乾燥物として処方され得る。
【０２３８】
処方成分は、投与の部位にアクセス可能な濃度で存在する。緩衝液は、生理的なｐＨまたはわずかに低いｐＨ（代表的に、約５〜約８の範囲のｐＨ）で組成物を維持するために有利に使用される。
【０２３９】
本発明の薬学的組成物は、非経口的に送達され得る。非経口投与が企図される場合、本発明に使用するための治療的組成物は、発熱物質を含まない形態（非経口的に受容可能な水溶液（薬学的に受容可能なビヒクル中の所望の抗ＯＰＧＬ抗体含む））であり得る。非経口的注射に特に適切なビヒクルは、抗ＯＰＧＬ抗体が、適切に保管された滅菌等張液として処方される滅菌蒸留水である。調製は、因子（例えば、注入可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）を用いる所望の分子の処方を含み得、この因子は、産物の制御放出または徐放を提供し得、デポ注入（ｄｅｐｏｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を介して送達され得る。ヒアルロン酸との処方は、循環において持続時間を促進する効果を有する。移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を導入し得る。
【０２４０】
この組成物は、吸入のために選択され得る。これらの実施形態において、抗ＯＰＧＬ抗体は、吸入のための乾燥粉末として処方され得るか、または抗ＯＰＧＬ抗体の吸入溶液はまた、エアゾール送達のためのプロペラント（例えば、ネブライザ）を用いて処方され得る。肺投与は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２４１】
本発明の薬学的組成物は、消化管を通じて（例えば、経口）送達され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の範囲内である。この様式で投与される抗ＯＰＧＬ抗体は、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の調合において慣例的に使用されるそれらのキャリアとともにまたはそれを含まずに処方され得る。カプセルは、胃腸管において、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解が最小化される時点で処方物の活性部分が放出されるように設計され得る。さらなる薬剤が、抗ＯＰＬ抗体の吸収を容易にするように含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合因子もまた使用され得る。
【０２４２】
薬学的組成物は、抗ＯＰＧＬ抗体の有効量を、錠剤の製造のために適切な非毒性賦型剤と混合して含み得る。滅菌水または別の適切なビヒクル中にその錠剤を溶解することによって、溶液が単位用量形態で調製され得る。適切な賦型剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合因子（例えば、デンプン、ゼラチン、アラビアゴム）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２４３】
さらなる薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これには、徐放処方物または制御送達処方物中の抗ＯＰＧＬ抗体を含む処方物が挙げられる。種々の他の徐放送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。徐放調製物としては、以下が挙げられる：成型された物品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクス、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）。徐放組成物はまた、リポソームを含み得る。このリポソームは、当該分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９。
【０２４４】
インビボ投与のために使用される薬学的組成物は、代表的に、無菌である。特定の実施形態において、これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成され得る。特定の実施形態において、その組成物が凍結乾燥されている場合、これらの方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構築の前またはその後のいずれかで行われ得る。特定の実施形態において、非経口的投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存され得る。特定の実施形態において、非経口的組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）または皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルに配置される。
【０２４５】
一旦、本発明の薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、直ぐ使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
【０２４６】
本発明はまた、単回用量投与単位を産生するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得、このキットは、単回および複数のチャンバつきの予備充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシジンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットである。
【０２４７】
治療に使用される、有効量の抗ＯＰＧＬ抗体薬学的組成物は、例えば、治療環境および治療観察に依存する。従って、特定の実施形態に従う処置の適切な投薬レベルが、部分的に、送達される分子、抗ＯＰＧＬ抗体は使用される適応症、投与経路および／または患者の状態（年齢および一般的な健康状態）に依存して変更されることが当業者に理解される。特定の実施形態において、臨床医は、投薬量を力価測定し、そして投与経路を変更して、最適な治療効果を得ることができる。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲でる。特定の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得るか；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るか；あるいは１μｇ／ｋｇから約３０μｇ／ｋｇの範囲であり得るか；あるいは５μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２４８】
投与の頻度は、使用される処方物における、抗ＯＰＧＬ抗体の薬物動態的パラメータに依存する。例えば、臨床医は、投薬量が所望の効果を達成するに達するまで、その組成物を投与する。従って、その組成物は、単回用量として、または２回を超える用量（これは、所望の分子の同じ量を含んでいても含んでいなくてもよい）として、あるいは移植可能なデバイスまたはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投薬の精製は、当業者によって日常的になされ、そして当業者によって日常的に行われる職務の範囲内である。適切な投薬は、適切な用量応答データの使用によって確認され得る。
【０２４９】
本発明の薬学的組成物の投薬経路としては、以下が挙げられる：経口、吸入、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または創傷内経路への注射または注入；あるいは徐放系または移植デバイスによる投与。薬学的組成物は、注入により、ボーラス注射または注射あるいは移植デバイスにより連続的に投与され得る。薬学的組成物はまた、所望の分子が吸収またはカプセル化される膜、スポンジまたは別の適切な物質の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、適切な組織または器官へに移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続投与により得る。
【０２５０】
本発明のエキソビボに従う抗ＯＰＧＬ抗体薬学的組成物を使用することもまた所望され得る。そういった場合において、患者から取り出された細胞、組織または器官は、抗ＯＰＧＬ抗体薬学的組成物に暴露され、その後、その細胞、組織および／または器官は、続いてその患者に移植して戻される。
【０２５１】
特に、抗ＯＰＧＬ抗体は、本明細書において記載される方法のような方法を用いて遺伝子操作された特定の細胞を移植してそのポリペプチドを発現および分泌させることによって送達され得る。特定の実施形態において、このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得、そして不死化され得る。他の実施形態において、これらの細胞は、不死化され得る。他の実施形態において、免疫学的応答の機会を減少するために、それらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。さらなる実施形態において、カプセル化された材料は、代表的に、生体適合性で、半透過性のポリマー封入物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防することを可能にする。
【実施例】
【０２５２】
以下の実施例は、実施された実験および達成された結果を含み、これは例示のみの目的のために提供され、そして本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【０２５３】
（実施例１）
（ＯＰＧＬに対するヒトモノクローナル抗体の生成）
（トランスジェニックＨｕＭａｂマウス）
ＯＰＧＬに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、トランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、およびＨＣｏ７＋ＣＨｏ１２株（これらの各々は、ヒト抗体遺伝子を発現する）を使用して調製した。これらのマウス株の各々において、内在性マウスκ軽鎖遺伝子が、ホモ接合性破壊され（Ｃｈｅｎら．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０に記載されるように）、そして外在性マウス重鎖遺伝子は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例１に記載されるように、ホモ接合性破壊されている。これらのマウス株の各々は、ヒトκ軽鎖導入遺伝子であるＫＣｏ５を有する（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に記載されるように）。ＨＣｏ７株は、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，６２５，８２５号；および同第５，５４５，８０７号（参考として援用される）に記載されるように、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１２株は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例２に記載されるように、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ７＋ＣＨｏ１２株は、ＣＨｏ７重鎖導入遺伝子およびＨＣｏ１２重鎖導入遺伝子の両方を有し、かつ各導入遺伝子に対してヘミ接合性である。これらの株のすべては、本明細書中で、ＨｕＭａｂマウスと称される。
【０２５４】
（ＨｕＭａｂ免疫）
ＯＰＧＬに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ＨｕＭａｂマウスを、抗原としてのＥ．ｃｏｌｉまたはＣＨＯ細胞由来の精製組換えＯＰＧＬで免疫した。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇら、９１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９，Ｆｉｓｈｗｉｌｄら．，同書およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８８４（これら各々の教示は参考として援用される）に記載される。マウスは、最初の抗原注射時に、６〜１６週齢であった。ＯＰＧＬ抗原（例えば、ＯＰＧＬを発現するトランスフェクトされたＥ.ｃｏｌｉまたはＣＨＯ細胞から精製）の精製組換え調製物（５
０〜１００μｇ）を使用して、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内（ＩＰ）免疫または皮下免疫（Ｓｃ）した。
【０２５５】
ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスの免疫を、完全フロイントアジュバント中の抗原を使用して２回実施し、２〜４週間後に、不完全フロイントアジュバント中の抗原を用いるＩＰ免疫を実施（合計９回までの免疫）した。数ダースのマウスを、各抗原について免疫した。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２株のうち合計１３６匹のＨｕＭａｂマウスを、ＯＰＧＬで免疫した。免疫応答を、後眼窩採血によってモニタリングした。
【０２５６】
ＯＰＧＬに結合する抗体を産生するＨｕＭａｂマウスを選択するために、免疫したマウス由来の血清を、Ｆｉｃｈｗｉｌｄら（前出）により記載されるようにして、ＥＬＩＳＡによって試験した。簡単に述べると、マイクロタイタープレートを、ＣＨＯ細胞またはＥ.ｃｏｌｉ由来の精製組換えＯＰＧＬで、ＰＢＳ中１〜２μＬ／ｍＬでコーティングし、
そして５０μＬ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中５％のニワトリ血清で、２００μＬ／ウェルでブロックした。ＯＰＧＬ免疫マウス由来の血漿の希釈物を、各ウェルに加え、そして周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、これらのプレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ，Ａ−１８８８，０．２２ｍｇ／ｍＬ）で発色させて、４１５〜４９５のＯＤで分析した。十分な力価の抗ＯＰＧＬヒト免疫グロブリンを有するマウスを使用して、以下に記載されるようなモノクローナル抗体を生成した。
【０２５７】
（ＯＰＧＬに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製）
抗原で静脈内にブーストし、その２日後に屠殺することによって、モノクローナル抗体産生のためのマウスを準備し、その後脾臓を取り出した。マウス脾細胞を、ＨｕＭａｂマウスから単離し、そして標準的なプロトコールに基づいて、ＰＥＧと融合させて、マウス骨髄腫細胞株にした。代表的には、各抗原について１０〜２０の融合を実施した。
【０２５８】
簡単に述べると、免疫したマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を、５０％ ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌型マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）の数の４分の１に融合した。細胞を、平底マイクロタイタープレート中に約１×１０^５細胞／ウェルでプレーティングし、続いて、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，ＣＲＬ １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）＋５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ Ｐ−７１８５）中の、選択培地（１０％ ウシ胎仔血清、１０％ Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）馴化培地、および３〜５％ オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）を含む）中で約２週間インキュベートした。１〜２週間後、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で、細胞を培養した。
【０２５９】
得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。個々のウェルを、ヒト抗ＯＰＧＬモノクローナルＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡ（上記）によってスクリーニングした。一旦、広範なハイブリドーマ増殖が生じると、通常は、培地を１０〜１４日後にモニタリングした。抗体分泌ハイブリドーマを置換し、そしてＥＬＩＳＡによりまだ陽性である場合、再びヒトＩｇＧについてスクリーニングし、抗ＯＰＧＬモノクローナル抗体を、限界希釈によって少なくとも２回サブクリーニングした。安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために、組織培養培地中で少量の抗体を作製した。
【０２６０】
（ＯＰＧＬに結合するヒトモノクローナル抗体の選択）
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＯＰＧＬ免疫原とのポジティブな反応性を示したハイブリドーマについてスクリーニングした。高いアビディティでＯＰＧＬに結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをサブクローニングし、そしてさらに特徴付けた。各ハイブリドーマ由来の１つのクローン（これは親細胞の反応性を維持した（ＥＬＩＳＡにより決定））を、液体窒素中で貯蔵された５〜１０バイアル細胞バンクを作製するために選択した。
【０２６１】
アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡを実施して、本明細書中で開示されるように産生したモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。これらの実験において、マイクロタイタープレートウェルをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトκ軽鎖の溶液（５０μＬ／ウェル）でコーティングし、そして４℃でインキュベートした。５％ニワトリ血清でブロックした後、プレートを、各試験したモノクローナル抗体由来の上清および精製アイソタイプコントロールと反応させた。プレートを周囲温度で１〜２時間インキュベートした。次いで、これらのウェルを、ヒトＩｇＧ_１またはＩｇＧ_３特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトポリクローナル抗血清と反応させ、そしてプレートを発色させ、そして上記のようにして分析した。
【０２６２】
ＥＬＩＳＡによって検出したところ、ＯＰＧＬへの有意な結合を示した６種のハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体を、インビトロレセプター結合アッセイおよびヒトＯＰＧＬ依存性インビトロ破骨細胞形成アッセイ（以下の実施例６に記載）を使用して、生物学的活性についてさらに試験した。選択された抗体を、１６Ｅ１、２Ｗ１１、１８Ｂ２、２Ｄ８、２２Ｂ３および９Ｈ７と命名した。これらの抗ＯＰＧＬ抗体の重鎖アライメントを、図１５に示す。抗ＯＰＧＬ抗体の軽鎖アライメントを図１６に示す。非コンセンサス配列を、太字で影つきで示し、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線付きで示す。
【０２６３】
（実施例２）
（９Ｈ７抗ＯＰＧＬ重鎖および軽鎖のクローニング）
（９Ｈ７抗ＯＰＧＬ ＭＡｂ軽鎖のクローニング）
３種の抗ＯＰＧＬハイブリドーマ軽鎖ｃＤＮＡ（９Ｈ７、１６Ｅ１および１８Ｅ２）を、ｐＤＳＲ１９哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。９Ｈ７κ軽鎖をコードするプラスミドの構築物を明確に記載する；他の軽鎖種のクローニングを類似の手順を使用して実施した。抗ＯＰＧＬ−９Ｈ７κ軽鎖可変領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法を使用して、ハイブリドーマ９Ｈ７総ＲＮＡから調製した第１鎖ｃＤＮＡから得た。第１鎖ｃＤＮＡを、伸長５’−アダプター（５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＣＮＮＮＮＮＮＴ−３’、配列番号５３）を有するランダムプライマー、ならびに第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（カタログＮｏ．１８０８９−０１１）用のＧｉｂｃｏ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにより提供される材料および方法を使用して、９Ｈ７総ＲＮＡから調製した。以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのために使用した：
５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プライマー（配列番号５４)：
５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’；
３’κＲＡＣＥプライマー，２３１０−０３（配列番号５５）
５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’。
【０２６４】
増幅したＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして得られたプラスミドを配列決定した。κ鎖コンセンサス配列を使用して、９Ｈ７κ鎖の可変領域のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計した。シグナル配列を作製するために、３工程ＰＣＲを実施した。第１に、プライマー３６６９−７３および２７０８−５３（以下に記載）を、９Ｋ７ ｃＤＮＡ軽鎖クローンテンプレートと共に使用した。この反応に使用した条件は以下のとおりである：９４℃で１分間；９４℃で２０秒間、４２℃で３０秒間、７４℃で１５０秒間を２サイクル；９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、７４℃で１５０秒間を２５サイクル；および７４℃で７分間、Ｐｆｕポリメラーゼならびに適切な緩衝液およびヌクレオチドを使用する。次いで、ＰＣＲ産物を、プライマー２６６３−０７および２７０８−５３を使用して増幅し、その後、プライマー２６６３−０８および２７０８−５３を使用して増幅した。これらのプライマーを以下に示す：
【０２６５】
【化１】

ＰＣＲ反応は、２３８アミノ酸残基（２２アミノ酸シグナル配列を含む）をコードする７４１ｂｐのフラグメントを生成し、このフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱｉａｇｅｎカタログＮｏ．２８１０４）を使用して精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断し、そして再びＱｉａｇｅｎで精製した。このフラグメントは、５’Ｋｏｚａｋ（転写開始）部位を有する完全軽鎖、および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号６０）
を含むが、このフラグメントを、ｐＤＳＲα１９に連結して、プラスミドｐＤＳＲα１９：９Ｈ７κを作製した（図１７）。ｐＤＳＲα１９は、以前に記載されている（国際出願公開番号ＷＯ９０／１４３６３を参照のこと。これは任意の目的のために、本明細書中に参考として援用される）。簡単に述べると、ｐＤＳＲα２９を作製するために、ｐＤＳＲα２を以下の様式で改変した：ウシ下垂体糖タンパク質ホルモンα−ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）のαサブユニット由来の転写終結／ポリアデニル化シグナルを含む配列を、約１４００塩基対短縮して、改変後に、８８５塩基対、およびＮｄｅＩ部位における末端にした；ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーターは、２０９塩基対を含み、この塩基対は、５’末端から約１キロベース短縮された；ＤＨＦＲポリＡ配列由来の約５５０塩基対のＢｇｌＩＩフラグメントが欠失した。
【０２６６】
９Ｈ７κ軽鎖発現クローンを配列決定して、これが９Ｈ７ハイブリドーマにおいて同定された同じペプチドをコードしたかを確認した。最終的な発現ベクターであるｐＤＳＲα１９：９Ｈ７κは、５４７９ｂｐであり、かつ表２で記載される７個の機能的領域を含む。
【０２６７】
【表２−１】

【０２６８】
【表２−２】

（ｐＤＳＲ１９：ｈＩｇＧ１ Ｃ_Ｈの構築）
ｐＤＳＲ１９：ラット可変領域／ヒト定常領域ＩｇＧ_１プラスミドを、ラット可変領域配列、ヒト定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）およびｐＤＳＲ１９の三成分リガンドを使用して構築した。直線状ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１ Ｃ_Ｈプラスミドを、ｐＤＳＲ１９：ラット可変領域／ヒト定常領域ＩｇＧ_１プラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｍＢＩで消化して、ラット可変領域のコード部分を除去することによって調製した。得られた直線状プラスミド（１．０ｋｂｐのヒトＩｇＧ_１定常領域ドメイン（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン）を含む）をゲル単離し、そしてハイブリドーマ由来αＯＰＧＬ可変領域を許容するために使用した。
【０２６９】
（９Ｈ７抗ＯＰＧＬＭＡｂ重鎖のクローニング）
３種の抗ＯＰＧＬハイブリドーマＩｇＧ_１重鎖ｃＤＮＡ;９Ｈ７、１６Ｅ１および１８
Ｂ２を、ｐＤＳＲ１９哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。９Ｈ７ ＩｇＧ_１重鎖をコードするプラスミドの構築を明示的に本明細書中に記載する；他のハイブリドーマ重鎖を、類似の手順を使用してクローニングした。抗ＯＰＧＬ−９Ｈ７重鎖可変領域を、ＰＣＲ増幅法を使用して、ハイブリドーマ９Ｈ７総ＲＮＡから調製した第１鎖ｃＤＮＡから得た。第１鎖ｃＤＮＡを、伸長５’−アダプター（５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＣＮＮＮＮＮＮＴ−３’、配列番号５３）を有するランダムプライマー、ならびに第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（カタログＮｏ．１８０８９−０１１）用のＧｉｂｃｏ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにより提供される材料および方法を使用して、９Ｈ７総ＲＮＡから調製した。以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのために選択した：
５’重鎖ＲＡＣＥプライマー、２５０８−０２（配列番号６１）
５’−（ＣＧ）ＡＧＧＴ（ＣＧ）ＣＡＧ（ＣＴ）Ｔ（ＧＴ）ＧＴＧ（ＣＧ）ＡＧＴＣ−３’；
３’重鎖ＲＡＣＥプライマー、２４２０−５４（配列番号６２）：
５’−ＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣ−３’。
【０２７０】
増幅したＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、得られたプラスミドを配列決定した。重鎖コンセンサス配列を使用して、９Ｈ７重鎖の可変領域のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計した。シグナル配列を作製するために、三工程ＰＣＲを実施した。はじめに、プライマー２５１２−９８および２６７３−１４を、９Ｈ７重鎖ｃＤＮＡクローンテンプレートと共に使用した。この反応に使用した条件は以下のとおりであった：９４℃で１分間；９４℃で２０秒間、４２℃で３０秒間、７４℃で１５０秒間を２サイクル；９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、７４℃で１５０秒間を２５サイクル；および７４℃で７分間、Ｐｆｕポリメラーゼならびに適切な緩衝液およびヌクレオチドを使用する。次いで、ＰＣＲ産物を、プライマー２６６３−０７および２６７３−１４を使用して増幅し、その後、プライマー２６６３−０８および２６７３−１４を使用して増幅した。これらのプライマーを以下に示す：
【０２７１】
【化２】

ＰＣＲ反応は、１３８アミノ酸残基（２２アミノ酸シグナル配列を含む）をコードする４４３ｂｐのフラグメントを生成し、このフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱｉａｇｅｎカタログＮｏ．２８１０４）を使用して精製し、ＸｂａＩおよびＢｓｍＢＩで切断し、そして再びＱｉａｇｅｎで精製した。このフラグメントは、５’Ｋｏｚａｋ（転写開始）部位を有する重鎖、および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号６０）
を含むが、このフラグメントを、ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１Ｃ_Ｈに連結して、プラスミドｐＤＳＲα１９：９Ｈ７ ＩｇＧ１を作製した（図１８）。
【０２７２】
９Ｈ７ ＩｇＧ_１重鎖発現クローンを配列決定し、９Ｈ７ハイブリドーマにおいて同定された同じペプチドをコードすることを確認した。最終発現ベクターである、ｐＤＳＲα１９：ラット可変領域／ヒト定常領域ＩｇＧ_１は、６１５８ｂｐであり、表３に記載される７つの機能的領域を含む。
【０２７３】
【表３−１】

【０２７４】
【表３−２】

（実施例３）
（ＣＨＯ細胞における９Ｈ７ 抗ＯＰＧＬ ＭＡｂ発現）
組換え抗ＯＰＧＬ抗体をチャイニーズハムスター卵巣細胞、特に、ＣＨＯ ＡＭ−１／Ｄ（米国特許第６，２１０，９２４号（参考として援用される）に開示される）により産生する。本発明の各抗ＯＰＧＬ抗体の完全重鎖または完全軽鎖をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター（例えば、上記のベクター）へクローニングする。完全重鎖を発現し得る発現ベクターおよび適切な抗ＯＰＧＬ抗体の完全軽鎖を発現する発現ベクターにより、ＣＨＯ ＡＭ−１／Ｄ細胞を同時トランスフェクションする。例えば、２２Ｂ３抗体を産生するために、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。２Ｅ１１抗体を産生するために、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。２Ｄ８抗体を産生するために、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。１８Ｂ２抗体を産生するために、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。１６Ｅ１抗体を産生するために、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。９Ｈ７抗体を産生するために、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現し得るベクターおよび配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現し得るベクターにより、細胞を同時トランスフェクションする。表４は、種々のＯＰＧＬ抗体についての完全重鎖および完全軽鎖を要約する。
【０２７５】
【表４】

当該分野で認識されているリン酸カルシウム法を使用して、ｐＤＳＲα１９：９Ｈ７ ＩｇＧ_１およびｐＤＳＲα１９：９Ｈ７ κプラスミドをジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ⁻）無血清適合化チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＡＭ−１／Ｄ、米国特許第６，２１０，９２４号）へ同時トランスフェクションすることにより、９Ｈ７抗ＯＰＧＬ ＭＡｂの安定な発現を達成した。トランスフェクトした細胞を、透析した血清を含むがヒポキサンチン−チミジンを含まない倍地中の９６ウェルプレートにおいて選択し、ＤＨＦＲ酵素を発現する細胞の増殖を確認した。５０００を超えるトランスフェクトしたクローンをアッセイ（例えば、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）およびＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングし、馴化倍地中での９Ｈ７抗ＯＰＧＬ ＭＡｂの発現を検出した。最も高く発現しているクローンを単一細胞クローニングおよび細胞バンクの作製のために選択した。
【０２７６】
（実施例４）
（抗ＯＰＧＬ抗体の産生）
抗ＯＰＧＬ抗体をＣＨＯ細胞のクローン株における発現によって産生する。各産生を実行するために、単一のバイアルからの細胞を無血清細胞培養培地へと融解させる。これらの細胞をまずＴフラスコ中で増殖させ、続いて、播種するために十分な種菌を２０Ｌバイオリアクター中で生成されるまで、一連のスピナーフラスコを介して連続して増殖させる。５〜１０日増殖させた後、次いで、培養物を使用して、３００Ｌバイオリアクターに植え付ける。さらに５〜１０日増殖させた後、培養物を使用して、２０００Ｌバイオリアクターに植え付ける。供給バッチ培養を使用して、産生を２０００Ｌバイオリアクター中で実行し、ここで、濃縮培地成分を含む栄養供給を加えて、細胞増殖および培養物のバイオアベイラビリティを維持する。産生を約２週間続け、この間、抗ＯＰＧＬ抗体を細胞によって構成的に産生し、そして細胞培養培地に分泌させる。
【０２７７】
産生リアクターを一定のｐＨ、温度、および溶存酸素レベルに制御する：ｐＨは二酸化炭素ガスおよび炭酸ナトリウムの添加によって制御する；溶存酸素は、空気、窒素、および酸素ガスの流入によって制御する。
【０２７８】
産生の終わりに、細胞ブロスをディスク立て管遠心分離に送り、培養上清を細胞から分離する。濃縮物をデプスフィルター、続いて０．２μｍフィルターによりさらに清澄化する。次いで、清澄化した馴化培地を接線流濾過によって濃縮する。馴化培地を１５倍〜３０倍に濃縮する。次いで、得られる濃縮した馴化培地を精製により処理するか、または後日の精製のために凍結させる。図１９は、抗ＯＰＧＬ抗体を産生するための例示的な細胞培養プロセスを示す。
【０２７９】
（実施例５）
（ＢＬＡｃｏｒｅによるＯＰＧＬに結合する抗体のスクリーニング）
全ての実験を製造者の指示書に従い、以下の改変を行ってＢＩＡｃｏｒｅ ２０００上で実施した。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む実行緩衝液を使用して、実験を室温で実施した。ｐＨ４．５の１０ｍＭ 酢酸塩中、５０μｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを、１，６００応答単位（ＲＵ）のレベルまで、ＣＭ５ Ｒｅｓｅａｒｃｈ等級センサチップ（ＢＩＯｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）上に固定化した。抗体（８〜２０μｇ／ｍＬ）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇチップ上に３００〜４００ＲＵのレベルで捕捉した。ＣＨＯヒトＯＰＧＬ（ｈｏＰＧＬ）１４０またはＥ．ｃｏｌｉマウスＯＰＧＬ（ｍＯＰＧＬ）１５８を、０．２５〜６２ｎＭの濃度で固定化された抗体上を通過させた。Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用して、結合速度論を決定した。１６００ＲＵまで固定化されたＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを、ブランク表面として使用した。マウスモノクローナル抗体をポジティブコントロールとして使用して、ｈＯＰＧＬ １４０への結合を示し、そして表面安定性をモニタリングした。
【０２８０】
全ての抗ＯＰＧＬ抗体は、ＣＨＯ ｈＯＰＧＬ １４０への強い結合を示した。２２Ｂ３は、試験した他の抗体より遅い解離速度を有するようである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｍＯＰＧＬ １５８の結合は検出されなかった。これらの結果を表５に要約する。
【０２８１】
【表５】

（実施例６）
（抗ＯＰＧＬ抗体中和活性）
（破骨細胞形成の阻害）
ＲＡＷ ２６４．７（受託番号ＴＩＢ−７１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、マウスマクロファージ細胞株であり、これは、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血球ウイルス誘導性腫瘍由来であった。ＲＡＷ ２６４．７細胞は、ＯＰＧＬの存在下で、破骨細胞様細胞に分化する。ＯＰＧＬの存在下でのＲＡＷ細胞からの培養物における破骨細胞の生成についてのアッセイは、Ｈｓｕら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５４０−３５４５（本明細書中で参考として援用される）によって詳細に記載されている。
【０２８２】
ＲＡＷ細胞をＯＰＧＬリガンドにより刺激して、破骨細胞様細胞へと分化させ得、この分化を、破骨細胞の特性である、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性によって測定し得る。この活性は、破骨細胞形成に対する抗体の効果をアッセイすることによって、本発明に従って産生される抗ＯＰＧＬ抗体を特徴付けるための基礎を提供する。
【０２８３】
ＲＡＷ細胞を、一定量のＯＰＧＬ（４０ｎｇ／ｍＬ）および可変量の抗ＯＰＧＬ抗体（６．３ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、細胞培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬ ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ 硫酸ストレプトマイシン）中で４日間インキュベートした。４日後、この細胞を、透過化処理および酸性化によって、次いで、５分間ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）で処理し、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）活性について染色した。手短に言えば、この培地を、細胞から吸引し、そして１００μＬのクエン酸緩衝液（４１０ｍＬ ０．１Ｍクエン酸、５９０ｍＬ ０．１Ｍ クエン酸塩、三ナトリウム塩、および１ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の処方を有する）を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを室温にて３〜５分間インキュベートした。次いで、１００μＬのＰＮＰＰ溶液（１５７．８ｍｇ 酸性ホスファターゼ試薬（Ｓｉｇｍａ １０４−１００）、７．２ｍＬ 酒石酸塩溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３８７−３）および２２．８ｍＬ クエン酸緩衝液の処方を有する）を添加し、そしてプレートを、室温にて３〜５分間インキュベートした。この反応を、５０μＬ０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加によって終了した。
【０２８４】
ＴＲＡＰは、ｐ−ニトロフェニルホスフェートからｐ−ニトロフェノールに変換し、これを、４０５ｎｍでの光学密度測定によって定量し得る。従って、ＴＲＡＰ活性（これは、破骨細胞発達の代理のマーカーである）は、４０５ｎｍでの光学密度に相関する。光学密度対抗ＯＰＧＬ抗体濃度のプロットを、図２０に示し、そして抗ＯＰＧＬ抗体が、用量依存様式において、このアッセイで破骨細胞形成を阻害したことを証明する。ＩＣ_５０値を、予測機能を使用して計算し、そして表６に示す。ＯＰＧＬ中和活性を有するアルカリ性ホスファターゼ連結ラットポリクローナル抗ヒトＯＰＧＬ抗体（ＡＰ Ｒａ−抗ＨｕＯＰＧＬ Ａｂ）を、抗ｈｕＯＰＧＬ抗体中和活性アッセイのポジティブコントロールとして使用した。
【０２８５】
（表６）
【０２８６】
【表６】

（実施例７：カニクイザルの薬物速度論）
本発明の抗ＯＰＧＬ抗体のインビボ活性および薬物速度論を、カニクイザルを使用してアッセイした。各々５年齢を超えず、かつ２〜５ｋｇの体重を有する３匹の雌のカニクイザルは、１ｍｇ／ｋｇ抗ＯＰＧＬ抗体の単一皮下（ＳＣ）用量を受けた。
【０２８７】
動物に、トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から発現した抗ＯＰＧＬ抗体を服用させ、そして血清サンプルを、抗ＯＰＧＬ抗体レベル、抗治療抗体分析ならびに骨代謝回転マーカー（ｂｏｎｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｍａｒｋｅｒ）の血清Ｎ−テロペプチド（血清Ｎ−Ｔｘ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）および血清カルシウム（血清Ｃａ）の分析の決定のために回収した。
【０２８８】
ＳＣ投与に続く血清濃度−時間プロフィールを、図２１に示す。ＳＣ投与に従う血清Ｎ−Ｔｘ濃度−時間プロフィールを、図２２に示す。
【０２８９】
（実施例８：ＯＰＧＬに対する抗体のエピトープの同定）
（改変体マウスＯＰＧＬの生成）
ヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］を、ＷＯ ０１／６２９３２（２００１年８月３０日に公開され、これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）の実施例１に記載されるように生成した。導入されたＮ末端メチオニン残基によって先行されたマウスＯＧＰＬ（国際出願公開番号Ｗ０９８／４６７５１（参考として援用される）の図１に示されるように）のアミノ酸残基１５８〜３１６を含むマウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成した。マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］を、以前に記載したように細菌の可溶性画分から精製した（Ｌａｃｅｙら、１９９８，Ｃｅｌｌ ９３：１６５−１７６）。ＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］を、国際出願公開番号Ｗ０９８／４６７５１の図１に示されるように、簡便な遺伝子操作技術を使用して、残基１５８〜３１６のＮ末端に融合されたＦＬＡＧ−タグ配列が続くＮ末端メチオニンをコードする核酸を導入することによって生成される。ＦＬＡＧ−タグ化ＯＰＧＬ［１５８−３１６］分子を、細菌発現ベクターｐＡＭＧ２１（ｐＡＭＧ２１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号９８１１３を有する）にクローン化した。
【０２９０】
ＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］ポリペプチド改変体が構築され、この改変体において、２２９〜２３３位でアミノ酸残基ＳＶＰＴＤ（配列番号６８）（国際出願公開番号ＷＯ９８／４６７５１の図１に示されるような）は、２３０〜２３４位で対応するアミノ酸残基ＤＬＡＴＥ（配列番号６９）（国際出願公開番号ＷＯ９８／４６７５１の図４で示されるように）で置換された。「ＦＬＡＧ−マウス」ＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥ」といわれる得られた構築物は、図２３（変異が位置される場合のみを示す）に示されるような核酸配列およびタンパク質配列（配列番号７２）を有する。アミノ酸配列変化は、Ｄ領域とＥ領域との間のＯＰＧＬの領域に位置される。図２３は、この領域におけるアミノ酸配列のマウス（配列番号７０）、ヒト（配列番号７１）およびマウスＤＥ改変体（配列番号７２）の比較を示す。マウス改変体の配列変化は、未変化の２３４位でＴを有するＳ２３１Ｄ、Ｖ２３２Ｌ、Ｐ２３３ＡおよびＤ２３５Ｅである。この領域における隣接配列は、マウスＯＰＧＬとヒトＯＰＧＬとの間で実質的に同一である。
【０２９１】
この分子を、２工程ＰＣＲ反応を使用して構築し、第１の工程は、２分離ＰＣＲ反応（設計された反応Ａおよび反応Ｂ）を含んだ。反応Ａおよび反応Ｂの両方について、ｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］ＤＮＡを、ＰＣＲの鋳型として使用した。反応Ａは、ＰＣＲにオリゴヌクレオチド番号２６４０−９０および番号２６４０−９１を使用し、一方反応Ｂは、オリゴヌクレオチド番号２６４０−９２および番号２６４０−９３を使用した。
【０２９２】
【化３】

反応Ａおよび反応Ｂについての条件は以下であった：１分間９５℃；２０秒間９５℃、３０秒間４４℃、４５秒間７２℃を５サイクル；２０秒間９５℃、３０秒間６０℃、４５秒間７２℃を２５サイクル；およびＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および適切な緩衝液およびヌクレオチドと共に１０分間７２℃。熱サイクルを行った後、反応ＡおよびＢからのＰＣＲ産物を、簡便な方法を使用して、アガロースゲルから精製した。第２の工程ＰＣＲ反応（設計された反応Ｃ）は、鋳型として精製された反応Ａ産物および反応Ｂ産物ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチド番号２６４０−９０および番号２６４０−９３を使用した。反応Ｃについての条件は以下であった：１分間９５℃；２０秒間９５℃、３０秒間３７℃、１分間７２℃を２５サイクル；およびＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼおよび適切な緩衝液およびヌクレオチドと共に１０分間７２℃。熱サイクルに続いて、反応Ｃからの産物を、製造者によって提供される方法を使用して、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そしてＤＨ１０ｂ（Ｇｉｂｃｏ）細胞にエレクトロポレーションした。クローンを選択し、そして配列決定し、ＤＬＡＴＥ（配列番号６９）に変更されたマウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］中のアミノ酸配列ＳＶＰＴＤ（配列番号６８）を確認した。次いで、配列確認ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、精製し、そして細菌発現ベクターｐＡＭＧ２１にサブクローン化し、プラスミドｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥを得た。
【０２９３】
プラスミドｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥを含むＥ．ｃｏｌｉ宿主ＧＭ９４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ下受託番号２０２１７３で寄託された）を、２ＸＹＴ培地中で指数関数増殖相まで増殖させ、そして１００ｎｇ／ｍＬまでのＶ ｆｉｓｃｈｅｒｉ合成自己誘導因子の添加によってＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質を発現するように導入した。導入の約３〜６時間後、この細胞をペレット化し、そして組換えＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質を、Ｌａｃｅｙら、ｉｂｉｄに記載される方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの可溶性画分から精製した。
【０２９４】
（ヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］およびＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥへの抗ヒトＯＰＧＬ抗体の結合）
Ｃｏｓｔａｒ Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．Ｐｌａｔｅｓ（Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｃａｔ番号；３５９０）を、１００μＬ／ウェルで３μｇ／ｍＬのヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］タンパク質、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］タンパク質、またはＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質のいずれかで、撹拌しながら４℃にて一晩、コートした。一晩のインキュベーションの後、タンパク質溶液を、プレートから取りだし、そしてＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中の２００μＬの５％ニワトリ血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号；１６１１０−０８２）を、プレートの各ウェルに添加し、そしてプレートを、室温（ＲＴ）にて３時間、撹拌しながらインキュベートした。インキュベーションおよびブロッキングの後、プレートを、ｄＨ_２Ｏ中の１×Ｋ−Ｐ洗浄溶液（カタログ番号；５０−６３−００，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で４回洗浄し、そして乾燥した。精製した抗ＯＰＧＬ抗体またはヒトＯＰＧＬ［２２−１９４］−Ｆｃタンパク質を、２μｇ／ｍＬ〜１．９５３ｎｇ／ｍＬのＰＢＳＴ中の５％ニワトリ血清から１：１で連続希釈し、そして１００μＬ／ウェルを、ヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］またはＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質のいずれかでコートしたマイクロタイタープレートの適切なウェルに添加した。プレートを、撹拌しながら室温にて２．２５時間インキュベートし、１×Ｋ−Ｐ洗浄溶液で４回洗浄し、そして乾燥した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ番号；１０９−０３６−０９８）を、ＰＢＳＴ中５％ニワトリ血清中に１：３０００に希釈し、そして１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、１.２５時間、室温にて撹拌しながらインキュベートし、１×
Ｋ−Ｐ洗浄溶液で６回洗浄し、そして乾燥した。１００μＬの未希釈ＡＢＴＳ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ；Ｃａｔ番号；５０−６６−００）を、各ウェルに添加し、そしてこの皿を室温にて、十分に青緑色に着色するまでインキュベートした。着色を、１００μＬ １％ ＳＤＳの添加によって停止した。着色の定量を、４０５ｎｍでの検出を用いてマイクロタイタープレートを使用して行った。
【０２９５】
酵素免疫アッセイの結果を、図２４および２５に示す。本発明の６つ全ての抗ＯＰＧＬ抗体は、ヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］ひ結合する。しかし、２２Ｂ３抗体のみが、試験された濃度範囲にわたってマウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］に検出可能に結合することを示す。マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］に対する２２Ｂ３抗体の結合が、ヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］に対して非常に低い親和性で生じるが、２Ｄ８抗体、９Ｈ７抗体、１６Ｅ１抗体および２２Ｂ３抗体は、ＦＬＡＧ−タグ化マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥ（図２５）に結合し、ならびにおそらく上記のアッセイ条件下でヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］にも結合する。従って、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］と比較して、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥのアミノ酸変化は、抗体２Ｄ８、抗体９Ｈ７、抗体１６Ｅ１および抗体２２Ｂ３の結合活性に対して重要である。抗体２Ｅ１１および抗体１８Ｂ２は、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］またはマウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥのいずれかへの検出可能な結合を示さない。
【０２９６】
ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥは、実施例６に記載されるようなＲＡＷ細胞アッセイにおける活性についてのアッセイされ、そして破骨細胞の形成についてヒトＯＰＧＬ［１４３−３１７］の場合と同じＥＤ５０を有することが観察され、ＤＥ改変体が、インビトロで破骨細胞活性の促進において活性である。従って、マウスＯＰＧＬ［１５８−３１６］／ＤＥに対する抗ＯＰＧＬ抗体の結合は、破骨細胞形成を阻害するようである。
【０２９７】
２Ｄ８、９Ｈ７、１６Ｅ１および２２Ｂ３抗ヒトＯＰＧＬ抗体のエピトープは、少なくともアミノ酸残基ＤＬＡＴＥ（国際出願公開番号Ｗ０９８／４６７５１の図４に示されるようなヒトＯＰＧＬの残基２３０〜２３４）（Ｄ−Ｅループと呼ばれる）を含むヒトＯＰＧＬの領域に局在する。２Ｅ１１および１８Ｂ２抗ヒトＯＰＧＬ抗体は、それ自体でＤ−Ｅループ領域に対応するペプチドフラグメントに結合しない。しかし、ネイティブな分子において、これらの抗体は、Ｄ−Ｅループ領域の外側のエピトープに結合し得るか、またはこれらの抗体は、分子の他の部分と共にＤ−Ｅループ領域の全てまたは一部に結合し得ることが理解される。
【０２９８】
上記の開示は、本発明の特定の実施形態を強調し、そしてそれらに対する全ての改変または代替等価物は、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【公開番号】特開２０１２−１８８４５１（Ｐ２０１２−１８８４５１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３４８８０（Ｐ２０１２−１３４８８０）
【出願日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【分割の表示】特願２００９−１２２５９３（Ｐ２００９−１２２５９３）の分割
【原出願日】平成１５年４月７日（２００３．４．７）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン　インコーポレイテッド (76)
【出願人】（５０６１９９８７９）メダレックス　インコーポレーティッド (30)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＡＲＥＸ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】