金属抽出ペプチド（ＭＡＰ）タグおよび関連する方法
【課題】画像化、研究、化学療法、およびキレーション療法（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）等における種々の用途に有用な、選択的に金属に結合する能力を有する、短いペプチドモチーフおよびこのようなモチーフを使用するための方法を提供する。
【解決手段】特定の実施形態において、本発明は、新規なペプチドベースのタグもしくは金属の結合剤（ＭＡＰタグ）を提供する。上記ＭＡＰタグは、ポリペプチドもしくはタンパク質中に高親和性金属結合部位を直接コードするために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、平面四角形および／もしくは四角錐の幾何的配置において金属に結合し得るそれらの能力によって特徴付けられる。
【解決手段】特定の実施形態において、本発明は、新規なペプチドベースのタグもしくは金属の結合剤（ＭＡＰタグ）を提供する。上記ＭＡＰタグは、ポリペプチドもしくはタンパク質中に高親和性金属結合部位を直接コードするために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、平面四角形および／もしくは四角錐の幾何的配置において金属に結合し得るそれらの能力によって特徴付けられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願との相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６１／０５２，９１８号（２００８年５月１３日出願）に対する優先権を主張する。この仮特許出願は、参照により本願に援用される。
【０００２】
（政府の利益の陳述）
本発明は合衆国国立衛生研究所の助成金（Ｇｒａｎｔ Ｎｏ．Ｐ２０ ＲＲ−１７７０８）の下、開発された。合衆国政府は本発明に対し一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
以前に、金属を利用して、ポリペプチド（例えば、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント）を組成物から抽出することは、一般的な技術であった。このような抽出物は、上記組成物内の他の物質に優先して、金属が特定のポリペプチドと錯体形成する能力に基づいた。２つの異なるペプチドベースの金属結合タグが、組成物からペプチドを分離するために使用され得ることは、公知である。しかし、これら結合タグは、アミノ酸の特定のタイプ、および本発明に関連して記載されるものとは実質的に異なる結合を達成するために利用されるアミノ酸の特定の数もしくは特定の配列を有する。例えば、例えば、これら２種の結合タグは、同じタイプの金属に結合しなくてもよいし、本発明と同じ幾何的配置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を使用して結合しなくてもよい。第１の結合タグに関するさらなる情報は、特許文献１（Ｈａｒｏｏｎら）において得られ得、配列ＮＸＥＱＶＳＰを含むペプチドに関する。第２の結合タグに関する情報は、特許文献２（Ａｒｂｏｇａｓｔら）において得られ得、そこで記載されるタンパク質全体であるようであるタグの配列に関する。
【０００４】
タンパク質の組換え発現のために生物の遺伝物質においてコードされ得るタグは、タンパク質生成物の精製および同定のために広く利用されてきた。この最も顕著な例は、Ｈｉｓ−タグ技術であった。この技術は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、全細胞からタグ化したタンパク質を効率的に単離する容易な手段を提供する。多くの他のペプチドベースのタグは、ペプチドタグを認識する抗体を使用して、細胞培養アッセイもしくは細胞溶解物において上記タグ化タンパク質を検出するために開発されてきた。これら技術は、インサイチュアッセイもしくはインビトロアッセイにおいて有用であるが、一般に、それらはインビボ分析には適用可能でない。ペプチドタグの利点は、上記タグが、目的のタンパク質を標識するためのさらなる化学工程の必要なくして、上記タンパク質に共有結合することである。
【０００５】
ＭＲＩ画像化は、生きている動物およびヒトにおいて構造的特徴を調べるための一般的な方法である。上記技術は安全でありかつ非侵襲性である。造影剤は、上記方法の感度を改善するために開発されてきており、それらは、上記ＭＲＩ画像において認められる特徴を増強するために使用される。上記改善は、造影剤が、隣り合う分子（代表的には、水）からのシグナルを変化させる金属を含むことから、達成されてきた。最も一般に使用される薬剤は、Ｇｄ（ＩＩＩ）をキレート化するが、他の金属は、対比を増強するために使用され得る。Ｇｄ含有造影剤は、腎性全身性線維症もしくは腎性線維化性皮膚症として公知の重篤な合併症が生じ得るので、腎機能が損傷した患者において使用できなかった。このような患者の必要性に対処するために、代替の画像化剤が必要とされる。金属をキレート化する化合物はまた、分子レベルでの詳細を検討するために、ＰＥＴ画像化およびＳＰＥＣＴ画像化において使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，２０８，１３８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００１８９７４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本開示は、一般に、トリペプチドモチーフおよびこのようなモチーフを使用するための方法に関する。これらペプチドは、金属に結合する能力を有し、このことは、これらペプチドを種々の適用に有用にする。特に、本開示のトリペプチドは、画像化、研究、化学療法、およびキレーション療法（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）における適用を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む組成物であって、ここでＸは、ＸＣ１Ｃ２が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方において金属を結合し得るような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、組成物。
（項目２）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目５）
配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドおよび金属を含む組成物であって、ここで該金属は、該トリペプチドと錯体化しており；そしてここでＸは、トリペプチドおよび金属が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有する錯体を形成するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、組成物。
（項目６）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目３に記載の組成物。
（項目７）
前記金属は、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅからなる群より選択される、項目３に記載の組成物。
（項目８）
前記金属は、放射性同位体である、項目３に記載の組成物。
（項目９）
前記金属は、６２Ｃｕである、項目３に記載の組成物。
（項目１０）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の組成物。
（項目１１）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目３に記載の組成物。
（項目１２）
金属と、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドとを錯体化して、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を形成する工程を包含する方法であって；ここでＸは、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有するような任意のアミノ酸であり；そして
ここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、方法。
（項目１３）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記金属は、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅからなる群より選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
前記金属は、放射性同位体である、項目１２に記載の組成物。
（項目１６）
前記金属は、６２Ｃｕである、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１８）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１９）
前記金属は、生物学的サンプル中に存在する、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記金属は、被験体において見いだされる、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を検出する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
前記金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を画像化する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
【０００８】
特定の実施形態によれば、本開示は、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む組成物を提供し；ここでＸは、ＸＣ１Ｃ２が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方において金属を結合し得るような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【０００９】
他の実施形態によれば、本開示は、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドおよび金属を含む組成物を提供し；ここで上記金属は、上記トリペプチドと錯体化し；そしてここでＸは、トリペプチドおよび金属が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有する錯体を形成するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【００１０】
他の実施形態によれば、本開示は、金属と、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドとを錯体化して、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を形成する工程を包含する方法を提供し；ここでＸは、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【００１１】
本発明の特徴および利点は、以下の実施形態の説明を読めば、当業者に容易に明らかである。
【００１２】
（図面）
本開示のより完全な理解は、添付の図面とともに、以下の詳細な説明を参照することによって得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、構造１ ４Ｎ配位を有するＧＧＨ様金属錯体ＮＧＨを示す。構造２および構造３ いくつかの脱プロトン化骨格Ｎ原子によって上記金属の配位に影響を及ぼすＧＧＨ様配置を示す。
【図２】図２は、ヒトＰＲＬ酵素（ＰＲｌ−１、ＰＲＬ−２、およびＰＲＬ−３を含む）のＣ末端部分の配列アラインメントを示す。ＰＲＬ−１のＨ１６６は、青で示されるＮＧＨモチーフの一部である。ＰＲＬ−１の残基Ｃ１７０およびＣ１７１は、赤で示されるＣａａＸモチーフ（ボックスで囲った）の一部である。上記ＮＣＣモチーフは、太字が付されている。
【図３】図３は、Ａ． ｐＨ１０において獲得したニッケル結合トリペプチドのＥＳＩ−ＭＳ（ここで質量は、ニッケルが上記ペプチドに結合されていることを示す）、Ｂ．上記サンプルのｐＨを５に低下させた後のＥＳＩ−ＭＳスペクトル（ニッケルが、上記ペプチドから放出されたことを示す）を示す。
【図４】図４は、Ｃｕ−ＮＣＣ磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を示す。
【図５】図５は、Ｈｉｓ−タグの切断および除去後に、Ｎｉ（ＩＩ）（ｐＨ７．４）の存在下で精製した、精製ＷＴ ＰＲＬ−１の写真を示す。写真は、その特徴的なさび色を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｎｉ２＋イオンの存在下で精製したＰＲＬ−１改変体の電子吸収スペクトルを示す。各タンパク質改変体について３つの（２つの）スペクトルを８００〜２００ｎｍまで記録し、平均した。全ての改変体についてのタンパク質濃縮物は、Ａ２８０比較に基づいて、５ｍｇ／ｍＬから１０％以内までである。７００〜３００ｎｍまでのスペクトルを示す。目に見える特徴は、３１８ｎｍおよび４２１ｎｍでの吸収極大である。挿入図。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおいて吸収極大の可視化のために、より小さなスケールで、６００〜４００ｎｍまでのスペクトルが示される。曲線は、以下のとおりである：ＰＲＬ−１−ＷＴ、黒（一番上）；ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａ、赤（一番上から２番目）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ、橙色（一番下）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ、緑（一番下から２番目）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓ、青（真ん中）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＲＬ−１ ＷＴの分解スペクトル（Ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）。３００〜７００ｎｍの間のＮｉ精製ＰＲＬ−１ ＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分解は、５つの曲線を使用するデータと適合する。その３１８ｎｍのショルダーは、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおけるピークに分解される。上記分解された吸収ピーク（灰色破線）の和および生データ（黒実線）が、ともに示される。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおけるピークもまた、存在する。
【００１４】
特許および特許出願ファイルは、少なくとも１部のカラーで仕上げられた図面を含む。カラー図面付きのこの特許もしくは特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金を支払えば、特許庁によって提供される。
【００１５】
本開示は、種々の改変および代替の形態に影響されやすいが、特定の例示的実施形態は、図面に既に示されており、本明細書により詳細に記載される。しかし、特定の例示的実施形態の説明が、本発明を開示される特定の形態に限定すると意図されないが、一方で、この開示は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような全ての改変および等価物を網羅することが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（説明）
本発明は、一般に、短いペプチドモチーフおよびこのようなモチーフを使用するための方法に関する。これらペプチドは、選択的に金属に結合する能力を有し、このことは、これらペプチドを、種々の適用に有用にする。特に、本発明のペプチドは、画像化、研究、化学療法、およびキレーション療法における適用を有する。
【００１７】
一般に、本開示は、選択された金属と強く結合する短い新規なペプチドモチーフ（ＭＡＰタグといわれる）に関する。よって、これらＭＡＰタグは、とりわけ、上記選択された金属を、組成物から抽出するために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、３アミノ酸長であり、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくはその間の任意の位置において、より長いポリペプチドおよびタンパク質の中に含まれ得る。特定の実施形態において、しかし、上記ＭＡＰタグが、金属と結合するための上記ＭＡＰタグを表す、ポリペプチドもしくはタンパク質の配置に存在する（例えば、外部ループに存在する）ことは、有利であり得る。上記ＭＡＰタグはまた、非ペプチド実体に結合され得る。さらに、１種より多いＭＡＰタグは、特定の分子上に存在し得る。
【００１８】
多くのタンパク質が金属に結合することは公知である。しかし、このような結合は、代表的には、密な結合を達成し、次いで、開いた際に、容易に上記金属を放出するために、折りたたまれたタンパク質構造内で不連続なアミノ酸配列を利用する。他方で、ＭＡＰタグによる金属結合は、非常に密接して近くにある原子を使用して達成され、よって、極端な条件が、上記金属を放出するために必要とされる。上記タンパク質の熱変性および化学的変性は、上記金属のゆっくりとした放出を可能にする。例えば、極端な条件の使用（例えば、沸点温度、強酸）は、一定期間にわたって（例えば、数時間から長時間）上記金属をゆっくりと放出することをもたらし得る。
【００１９】
（Ａ．化学的構造）
特定の実施形態において、本開示は、新規なペプチドベースのタグもしくは金属の結合剤（ＭＡＰタグ）を提供する。上記ＭＡＰタグは、ポリペプチドもしくはタンパク質中に高親和性金属結合部位を直接コードするために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、平面四角形および／もしくは四角錐の幾何的配置において金属に結合し得るそれらの能力によって特徴付けられる。
【００２０】
（１．ペプチド配列）
本開示のＭＡＰタグは、一般に、金属に結合し得る、少なくとも３個連続するアミノ酸残基を含む。本開示のＭＡＰタグは、一般に、ＸＣ１Ｃ２によって表される配列を有し、ここでＣ１およびＣ２は、同じであってもよいし、異なっていてもよく、システイン、もしくはシステイン様非天然アミノ酸（例えば、硫黄含有α−アミノ酸もしくはβ−アミノ酸）であり得、そしてここでＸは、上記形成されるペプチドタグが、平面四角形／四角錐の幾何的配置において金属に結合し得る限りにおいて、別の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、またはアミノ酸アナログであり得る。本明細書において使用される場合、Ｌ鏡像異性アミノ酸の略語は、従来どおりであり、以下のとおりである：
【００２１】
【表１】
いくつかの実施形態において、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、もしくはアルギニン（Ｒ）であり得る。
【００２２】
アミノ酸配列が、一連の三文字アミノ酸略語もしくは一文字アミノ酸略語として表される場合、標準的な使用および慣例に従って、左側がアミノ末端方向であり、右側がカルボキシ末端方向であることが理解される。
【００２３】
本開示のＭＡＰタグは、任意の組換え技術システムを使用して、発現のための遺伝子もしくはヌクレオチド配列と一続きで（ｉｎ ｌｉｎｅ）コードされ得る。さらに、上記タグは、ペプチドもしくはタンパク質の生成のための任意の合成法もしくは生合成法を使用して、ペプチドもしくはタンパク質へと組み込まれ得る。適用において、上記ＭＡＰタグは、金属と自発的に反応して、ペプチド−金属錯体を形成する。このようなペプチド−金属錯体は、溶液中で、または金属交換反応（ｔｒａｎｓｍｅｔａｌｌａｔｉｏｎ）もしくは任意の他のプロセスを介して、形成し得る。
【００２４】
上記ＭＡＰタグは、単独で使用され得るか、あるいはＮ末端側、Ｃ末端側に結合され得るか、またはポリペプチド鎖内の可撓性リンカーもしくはループへと挿入され得るタグとして、使用され得る。上記ＭＡＰタグは、金属配位に関与する側鎖以外の任意の位置で改変され得る。よって、上記ＭＡＰタグは、Ｚ−ＸＣ１Ｃ２−Ｚ１のような配列を含み得、Ｚは、任意のアミノ酸もしくは任意のアミノ酸配列であり得、Ｚ１は、Ｚに等しいもしくは等しくない、任意のアミノ酸またはアミノ酸配列であり得る。上記アミノ酸は、上記表１と同様に示される。非天然のおよびアミノ酸のアナログは、上記表中には列挙されていないが、それらは、Ｚ、Ｚ１、および／もしくはＸに組み込まれ得る。
【００２５】
特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグは、別の分子に結合され得る。例えば、上記ＭＡＰタグは、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸）のような非ペプチド実体に結合され得る。上記結合は、共有結合であってもよいし、リンカーを介して行われていてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記ＭＡＰタグは、以下のような配列を含み得る：ＮＣ１Ｃ２；Ｚ−ＮＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＮＣ１Ｃ２；ＮＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＱＣ１Ｃ２；Ｚ−ＱＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＱＣ１Ｃ２；ＱＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＨＣ１Ｃ２；Ｚ−ＨＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＨＣ１Ｃ２；ＨＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＫＣ１Ｃ２；Ｚ−ＫＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＫＣ１Ｃ２；ＫＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＲＣ１Ｃ２；Ｚ−ＲＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＲＣ１Ｃ２；もしくはＲＣ１Ｃ２−Ｚ１。上記のように、Ｚは、任意のアミノ酸もしくは任意のアミノ酸配列であり得、Ｚ１は、またはＺに等しいかもしくは等しくない、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸配列であり得る。上記アミノ酸は、表１と同じように表される。非天然のおよびアミノ酸のアナログは、上記表中には列挙されていないが、それらは、化合物ＺおよびＺ１に組み込まれ得る。
【００２７】
一実施形態において、上記ＭＡＰタグは、以下の構造式を有するＮＣＣを含む：
【００２８】
【化１】
特定の実施形態において、本開示のＭＡＰタグは、金属とのＭＡＰタグ錯体化前、もしくは金属との錯体化後のいずれかに、上記ＭＡＰタグの標的化送達を提供する遺伝子もしくはヌクレオチド配列と一続きでコードされ得る。このことは、遺伝子、ペプチド、もしくは標的化に有用であることが公知の他のモチーフを使用して、達成され得る。例えば、ＭＡＰタグは、抗体、増殖因子、ペプチドなどと一緒に組み込まれ得る。
【００２９】
（２．金属結合）
特定の実施形態において、本開示のＭＡＰタグは、単独で、またはポリペプチドもしくはタンパク質に組み込まれる場合、金属と錯体化して、平面四角形／四角錐の幾何的配置を有するＭＡＰタグ−金属錯体を形成し得る。上記金属は、上記ＭＡＰタグと、２Ｎ：２Ｓ配位を介して錯体化し得る。上記ＭＡＰタグはまた、当業者によって認識される適切な条件下で、平面四角形の幾何的配置において多くの金属に結合し得る。一般に、本開示のＭＡＰタグは、ＩＵＰＡＣ Ｇｒｏｕｐを参照すると：３族金属（例えば、Ｙ）；５族金属（例えば、ＶおよびＵ）；６族金属（例えば、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ）；７族金属（例えば、Ｍｎ、Ｔｃ、Ｒｅ）；８族金属（例えば、ＦｅおよびＲｕ）；９族金属（例えば、Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ）；１０族金属（例えば、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ）；１１族金属（例えば、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）；１２族金属（例えば、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）；１３族金属（例えば、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）；１４族金属（例えば、ＳｎおよびＰｂ）；ならびに１５族金属（例えば、Ｂｉ）を結合し得る。特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグは、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅと結合しかつＭＡＰタグ−金属錯体を形成し得る。
【００３０】
上記のように、上記金属を結合すると、上記ＭＡＰタグは、平面四角形の幾何的配置を有する。本開示はまた、種々の平面四角形配置にある、ＭＡＰタグ金属配位を企図する。例えば、上記ＭＡＰタグがＮＣＣでありかつ上記金属が上記のようにＭとして表される任意の金属である場合、上記ＭＡＰタグは、式１によって表される構造式を有し得る：
【００３１】
【化２】
他の構造的配置がまた、企図される。例えば、上記ＭＡＰタグがＮＣ１Ｃ２でありかつＣ１が非天然アミノ酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノ−２−メルカプト酢酸）でありかつＣ２がシステインである場合、上記ＭＡＰタグの構造式は、式２として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３２】
【化３】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＮＣ１Ｃ２であり、Ｃ２は、非天然アミノ酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノ−４−メルカプト酪酸であり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式３として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３３】
【化４】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＮＣ１Ｃ２であり、Ｃ２は、βアミノ酸（例えば、３−アミノ−２−メルカプトプロピオン酸であり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式４として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３４】
【化５】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＲＣＣであり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式５として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３５】
【化６】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＱＣＣであり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式６として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３６】
【化７】
（Ｂ．上記ＭＡＰタグの適用）
（１．金属抽出のためのＭＡＰタグ）
上記のように、ＭＡＰタグは、高親和性で金属を結合し得る。ＭＡＰタグはまた、液体から固体までの範囲に及ぶ種々の組成物から金属を抽出し得る。結論として、ＭＡＰタグが、配位を共有するのではなく上記金属を抽出する能力は、以下で依り詳細に記載されるように、上記タグを、特定の金属を別の組成物から分離することにおける使用に影響を受けやすくする。上記ＭＡＰタグは、上記金属と錯体化し、次いで、上記金属を組成物中の成分（例えば、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、または例えば、ＩＤＡもしくはＮＴＡと結合体化した固体支持体）から上記金属を抽出もしくは除去することによって、上記組成物から金属イオンを封鎖する。よって、上記ＭＡＰタグは、金属抽出ペプチド（ＭＡＰ）タグである。
【００３７】
さらに、少なくとも一部は、ＭＡＰタグが金属に選択的に結合する能力に起因して、本開示の実施形態は、キレーション療法に有用であり得る。従って、ＭＡＰタグは、生物学的に毒性の金属（例えば、鉛）を封鎖するために使用され得る。
【００３８】
同様に、ＭＡＰタグはまた、金属を水、他の水溶液、もしくは身体の外の任意の組成物から封鎖することにおいて有用であり得る。上記ＭＡＰタグ自体は、一般に、多くの溶媒中で可溶性である。しかし、特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグ−金属錯体は、多くの有機溶媒中では溶解性が乏しく、いったん金属結合が起こると、沈殿し得る。このことは、有機溶媒からの抽出の間の効率的な分離を可能にする。
【００３９】
（２．画像化適用）
特定の実施形態において、本開示は、ＭＡＰタグを使用する、画像化のための方法を提供する。このような方法は、治療的画像化および医療的画像化、または他の画像化適用のために使用され得る。上記ＭＡＰタグと錯体化するように選択される金属は、上記特定の適用および画像化技術に依存する。例えば、常磁性金属は、画像化技術（例えば、ＭＲＩ、ＮＭＲおよびＥＰＲ）との使用に選択され得る一方で、金は、電子顕微鏡のような技術のために選択され得る。その一方で亜鉛は、蛍光のような適用のために選択され得る。どの金属が所定の適用および画像化技術に適しているかは、当業者によく知られている。
【００４０】
一実施形態において、ＭＡＰタグは、画像化技術において使用するための試薬を調製するために利用される。すなわち、ＭＡＰタグは、金属に結合し、続いて、画像化のために使用され得る（例えば、上記金属が画像化のために使用され得るように、被験体の身体において使用され得る）錯体を提供する。適切な画像化技術の例としては、単独でもしくは組み合わせにおいて、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放出型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）、電子顕微鏡、蛍光画像法などが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態において、ＭＡＰタグは、被験体の一部に局在するポリペプチドもしくはタンパク質、または非タンパク質実体へと組み込まれ得る。ここでＭＡＰタグ−金属錯体の金属部分は、局在部位（例えば、組織もしくは腫瘍）を画像化する能力を提供する。例えば、上記ＭＡＰタグ−金属錯体は、上記ＭＡＰタグ化分子の標的化部分に対するレセプターおよび／もしくは結合パートナーを発現する組織もしくは他の構造を同定するために使用され得る。上記金属を可視化し得る画像化技術は、このような特徴の同定のために使用され得る。
【００４２】
例えば、ＭＲＩ造影剤は、隣り合う原子の緩和を変化させて、上記造影剤が存在する領域と、存在しない領域との間で検出されるシグナルの差異を発生させる、代表的には、金属中心を含む常磁性種である。ＭＡＰタグは、Ｃｕと錯体化される場合には、常磁性であり得る。従って、ＭＡＰタグ−金属錯体は、ＭＲＩ造影剤として使用するための能力を有する。大部分の造影剤は、顕微鏡レベルで標的化されないが、身体もしくは組織中の肉眼的構造および欠損を明らかにするために使用される。適用のこのタイプにおいて、上記造影剤の濃度は、非常に高い。造影剤を、選択された組織もしくは顕微鏡的構造に標的化することは、細胞レベルでの異常の同定を可能にする点で有益である。例えば、上記ＭＡＰタグは、特定のレセプターを発現する癌細胞を認識する抗体上のタグとして発現され得る。標的化された送達は、より低い濃度の造影剤が投与されることを可能にする。このことは、とりわけ、毒性および他の副作用を最小にする助けになり得る。
【００４３】
６２Ｃｕが、身体内の分子的な詳細を画像化し得る、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ画像化において使用される放射活性同位体であることは公知である。よって、ＭＡＰタグは、Ｃｕ（もしくは別の金属）の適切な放射性同位体を添加され得、これら画像化技術でのトレーサーとして使用され得る。同様に、上記タグを、任意のタンパク質もしくはペプチド、または細胞の部分セットを結合する他の分子に融合することによって、標的化された画像化が、達成され得る。
【００４４】
上記ＭＡＰタグは、特定の金属に対して高い親和性を有する短い配列であるので、とりわけ有利である。従って、発現されたタンパク質もしくは他の分子においてＭＡＰタグをコードすることによって、生物内の特定の細胞タイプへの標的化された送達は、可能である。さらに、細胞の部分セットを標的化することは、画像化に必要とされる造影剤の量の減少を可能にする。
【００４５】
（３．化学療法）
本発明はまた、化学療法を補助するために使用され得る。例えば、ＭＡＰタグは、白金および／もしくは放射性核種との錯体を形成し得、特定の細胞もしくは細胞タイプへの標的化された送達を提供するために使用され得る。
【００４６】
本発明のよりよい理解を促進するために、以下の特定の実施形態の実施例が提供される。以下の実施例が、本発明の範囲全体を限定するようにも、規定するようにも、決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
変異誘発技術を、選択された金属と強い結合親和性を有する上記ペプチドモチーフを同定するために使用した。簡潔には、ヒトＰＲＬ−１遺伝子を、ｐＥＴ−３０ Ｘａ ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ＰＣＲベースのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して変異させた。Ｃ１７０Ｓ、Ｃ１７１Ｓ、およびＨ１６６Ａ変異体を生成するプライマー（５’から３’）は、それぞれ、
【００４８】
【数１】
および
【００４９】
【数２】
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）であった。大文字は、変異した塩基を示す。ＰＣＲ反応物をＤｐｎＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、１．５時間にわたって３７℃において処理し、ＮｏｖａＢｌｕｅ ＧｉｇａＳｉｎｇｌｅｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に直接形質転換し、３０ｍｇ／ｍＬ カナマイシン選択でＬＢ上にまいた。個々のコロニーを、選択的ＬＢ中で３７℃において一晩増殖させた。得られたＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。全ての変異を、ＤＮＡ色素−ターミネーター配列決定によって確認した（Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄｓ ＤＮＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｍｉｄｊｉ，ＭＮ）。上記二重変異体Ｃ１７０Ｓ／Ｃ１７１Ｓを、第２回の変異誘発によって生成し、同様に確認した。
【００５０】
ＰＲＬ−１および関連する変異遺伝子を有するベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換し、選択的ＬＢ上で３７℃において一晩増殖させた。選択されたコロニーを、選択的Ｍ９ＺＢブロス中で、一晩３７℃において増殖させた。次いで、一晩の培養物を、５００ｍＬの非標識最小培地に移し、０．６〜０．８の間のＯＤ５５０において、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ＮＭＲ実験のために発現させたタンパク質は、１５Ｎ−塩化アンモニウムを含む最小培地中で増殖させた。上記組換えタンパク質の過剰発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細胞を、４４００×ｇでの遠心分離によってペレット化し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５１】
一連のＰＲＬ−１変異体を、金属配位に関与する残基を同定するために試験した。ＧＧＨ様モチーフを含むモデルペプチドは、極めて高い親和性でＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を配位することを示した。このモチーフにおいて、２つのＧｌｙ位置のうちのいずれかにおける置換が、ごくわずかに結合を低下させるのに対して、Ｈｉｓの変異は、結合を破壊する。ＰＲＬ−１は、ＮＧＨ、ＧＧＨ様コンセンサスモチーフを、そのＣ末端付近においてコードする（図２）。従って、ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを、ＰＲＬ−１に含まれる上記ＮＧＨ配列が、金属結合を担うという仮説を試験するために作製した。ＰＲＬ−１およびＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを、それぞれ、約１２０μＭおよび６０μＭのＮｉを結合したＩＣＰ−ＭＳによって、並行して分析した。吸収分光法によって測定した場合に、わずか２０％のシグナルの低下が、Ｈ１６６Ａについて認められた。タンパク質シグナルが、等しい程度にまで減少され、可視領域のシグナルの損失が、タンパク質不安定性に起因することはまた、吸収スペクトルから明らかである。タンパク質不安定性は、上記２つの検出法における不均衡が原因のようである。なぜなら、ＩＣＰ−ＭＳは、分析する前に、実質的により多くのサンプル操作を要するからである。上記ヒスチジン変異体は、堅い結合を保持したままであったので、Ｃ１７０および／もしくはＣ１７１における変異を、チオールがＮｉ配位にしばしば関与することから、作製した。個々のシステイン変異体、ならびに二重変異体におけるＮｉレベルは、野生型タンパク質と比較して、大いに低下した。このことは、両方のＣｙｓ残基が、金属配位に影響を及ぼすことを示す。Ｃ１７０Ｓ変異体においても、上記Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ二重変異体においてもＮｉが検出されなかったが、約１７μＭの小さなシグナルが、ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓについて認められた。
【００５２】
（実施例２）
タンパク質精製技術を使用して、上記タンパク質−金属錯体を精製した。簡潔には、細胞ペレットを、３０ｍＬ 緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４、Ａｒ散布した）中に再懸濁し、１５，０００ｐｓｉにおいて、フレンチプレッシャーセル（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して溶解した。緩衝液のアルゴン散布を行って、酸素を置換した。次いで、サンプルを、２１，０００×ｇにおいて遠心分離し、その上清を、０．２μｍ ナイロンフィルタを通して濾過した。（Ｈｉｓ）６−タグ化ＰＲＬ−１の精製を、流速１ｍＬ／分において、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムを使用して行った。サンプルを、金属添加した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せ、載せた後に、５×カラム容積ですすいだ。溶出を、１３×カラム容積かけて６０％ 緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４、アルゴン散布ありもしくはなし）へ、３×カラム容積かけて１００％ Ｂへの直線勾配を使用して達成し、および４×カラム容積かけて１００％ Ｂにおいて維持した。溶出を、２８０ｎｍでの吸収によってモニターし、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して純度について試験した。適切な画分をプールし、Ａｒ散布したもしくはＡｒ散布していない１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析した。上記（Ｈｉｓ）６−タグを、第Ｘａ因子プロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、室温において一晩使用して、上記標的タンパク質から切断した。ＸａｒｒｅｓｔＴＭアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、プロテアーゼを除去し、上記カラムに再度載せて上記タグおよび任意の非切断タンパク質を除去する前に０．２μｍ ナイロンフィルタで濾過した。上記タンパク質を、透析緩衝液中の上記カラムに載せ、最初のフロースルーを集めて、上記タンパク質サンプルを作製した。サンプルを濃縮し、（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離フィルタを使用して、Ａｒ散布１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．４中で、少なくとも１０６倍交換した。上記サンプルの純度および変異体確認を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＳＩ−ＭＳによって確認した。カラムを、１Ｍ ＮａＯＨで処理し、２×カラム容積の１００ｍＭ ＥＤＴＡでストリッピングし、Ａｒ散布した１００ｍＭ ＮｉＳＯ４、１００ｍＭ ＣｕＳＯ４、１００ｍＭ ＣｕＣｌ２もしくは１００ｍＭ ＺｎＣｌ２を、各使用の直前に再度充填した。
【００５３】
図５は、上記Ｈｉｓ−タグの切断および除去後の精製ＰＲＬ−１を示す。上記ｈｉｓ−タグに結合した金属は、八面体の幾何的配置を有し、これは、青緑色であり、このような配位事象に対応する吸収は、スペクトルのうちの７００〜８００ｎｍ領域において現れる。Ｎｉ（ＩＩ），ｐＨ７．４の存在下で精製したＷＴ ＰＲＬ−１の写真は、その特徴的なさび色を示す。上記精製した野生型ＰＲＬ−１タンパク質は、予測外のさび色を有する（図５）。このことは、芳香族残基（すなわち、ＴｒｐもしくはＴｙｒ）の金属錯体化もしくは酸化から生じ得る。
【００５４】
芳香族残基の酸化は、上記タンパク質のインタクトなおよびトリプシン消化研究からの質量分析データに基づいて容易に排除された。さらに、本発明者らは、上記さび色のタンパク質が、高速遠心分離の間にチューブの底で濃縮されるので、上記タンパク質の密度が、予測されるより高いことを観察した。金属配位が上記タンパク質錯体の密度を増加させるので、本発明者らは、上記発色団が、上記タンパク質との金属錯体の形成によって生成される可能性をさらに調べた。金属キレート化クロマトグラフィーを使用して、ＰＲＬ−１を精製したので、金属イオンのもっとも可能性のある供給源は、上記ＩＭＡＣ樹脂に由来するＮｉであった。
【００５５】
組換えＷＴ ＰＲＬ−１を含む細胞溶解物が、等しく分けて、Ｎｉ２＋充填した、Ｃｕ２＋充填したもしくはＺｎ２＋充填したＩＭＡＣ樹脂を使用して並行して（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）精製した場合、上記タンパク質は、上記キレート化樹脂に結合した金属を抽出する。金属交換反応の速度は、ニッケルで最も速く、続いて、銅であった。亜鉛は、全てのサンプルにおいてある程度存在し、このことは、上記タンパク質が亜鉛をインビボで拾い上げることを示す。亜鉛が上記カラムに結合される場合、亜鉛のみが、上記タンパク質中で認められる。Ａｐｏ ＰＲＬ−１は、可溶性が乏しく、金属の損失が沈殿をもたらす。誘導結合型プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって試験した場合に各精製からの可溶性物質は、結合した金属の等しい割合を有する。
【００５６】
（実施例３）
ＩＣＰ−ＭＳを使用して、上記結合した金属を特徴付けした。簡潔には、精製タンパク質サンプルを、ＰＦＡ微小遠心分離管（Ｓａｖｉｌｌｅｘ，＃ｓ ７２４０、７２４１）において濃硝酸中、６８±１℃で１６．５±０．７時間にわたって消化した。消化前のタンパク質定量に基づいて、次いで、上記サンプルを、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中で１．５μＭへと希釈し、０．２μｍ ナイロンフィルタを通して濾過し、微小同軸ネブライザ（ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）を装備したＶＧ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ＶＧＩＩ＋ＸＳ Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒへと注入した。最小で、２つの別個に調製したサンプルを、各タンパク質改変体について分析した。各サンプルを２回スキャンし、標準物質を、各サンプルスキャンの前、その間、およびその後に走らせた。ドリフトを、サンプルの注入と標準物質の注入との両方のスキャンの間の洗浄している間にモニターした。
【００５７】
上記発色団が、荷電したＩＭＡＣマトリクスからの金属のタンパク質抽出から生じるという本発明者らの仮説を調査するために、サンプルを、半定量的分析のためにＩＣＰ−ＭＳに供した。バックグラウンド金属を除去するために激しい洗浄を使用したので、この方法から得られた値は、結合した金属量より本質的に小さく見積もられるが、上記タンパク質に対して異なる金属の相対的親和性を評価するために使用され得る。さらに、上記細胞における発現の間にＰＲＬ−１に結合してしまった可能性のある内因性の金属リガンドを同定するために、ＩＣＰ−ＭＳを使用して、周期表中の最初の２列の遷移金属、および他の一般的に生物学的に関連する金属の存在を探した。顕著なことには、上記データは、Ｚｎおよび特定の金属（例えば、Ｎｉ）にのみ結合したＰＲＬ−１が、精製の間に上記ＩＭＡＣカラムで使用されたことを示した。１６時間にわたって７０℃において硝酸中で消化した、平均して５００μＭ Ｎｉ精製タンパク質サンプルは、約１８０μＭ Ｎｉを含むと決定され、これは、１：２．７＋／−０．７のＮｉ 対 タンパク質化学量論を生じた。Ｚｎはまた、約６０μＭにおいて上記Ｎｉ精製サンプル中で検出された。別個に、Ｚｎ−ＩＭＡＣを使用するＰＲＬ−１の精製は、Ｚｎが、２７０μＭにおいて多い量で存在する唯一の金属であり［１ Ｚｎ：１．８ タンパク質］、これらタンパク質サンプルが、Ｎｉのわずかなバックグラウンドレベルを含むことを示した。Ｎｉ精製ＰＲＬ−１およびＺｎ精製ＰＲＬ−１の両方のＩＣＰ−ＭＳは、顕著な量で他の金属を示さず、このことは、亜鉛が、インビボで配位され、上記ニッケルのクロマトグラフィー精製の間に、Ｎｉ２＋によって部分的に置換されたことを示唆する。ＩＣＰ−ＭＳ分析は、Ａｒ流中で行われ、Ａｒの最も量の多い同位体がＣａと同じ質量を有するので、Ｃａ結合は、一次質量シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｓｓ ｓｉｇｎａｌ）からは決定できない。にも関わらず、遙かに多い量のＣａが、Ｚｎと比較すると細胞培養培地中に存在し、それでもなお上記ＩＣＰ−ＭＳシグナルが、主に亜鉛に対応するので、上記タンパク質は、カルシウムに結合しないようである。上記ＩＣＰ−ＭＳデータは、ＰＲＬ−１がＮｉ−ＩＭＡＣを使用して精製される場合、Ｚｎが評価できる程度の量で存在することを示す。このことは、Ｚｎ結合が細胞において存在することを示唆する。
【００５８】
（実施例４）
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、上記ＰＲＬ−１タンパク質の濃度を測定するために使用した。簡潔には、精製ＰＲＬ−１アナログの濃度を、２８０ｎｍにおいて測定し、１９４２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して計算した。高い２００ｎｍ領域での考えられる金属−タンパク質吸収干渉が原因で、上記ＵＶ−Ｖｉｓ定量法の有効性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって確認した。１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、および１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＲＬ−１アナログのスペクトルを、８００〜２００ｎｍまで、Ｃａｒｙ １００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で集めた。上記分析における散乱効果を較正するために、ＰＲＬ−１−ＷＴスペクトルを、上記ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓスペクトルを差し引くことによって調整した。なぜなら、上記ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓスペクトルは、金属を結合しないからである。得られたスペクトルを分解し、ピーク位置を、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ ７．００ソフトウェアを使用して評価した。３つの方法は、金属置換を目的とした。第１において、ＰＲＬ−１−ＷＴ（例えば、野生型）サンプルを、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を使用して還元し、イミダゾールを、１０ｍＭの濃度になるように添加した。０．５ｍＭ タンパク質サンプルに対して、これは、ＢＭＥの４００倍溶液過剰に対応して、上記２つのＣ末端システインチオールと競合し、イミダゾールの２００倍溶液過剰に対応して、単一のＣ末端ヒスチジンイミダゾール側鎖と競合する。新たなベースラインをとり、スペクトルを再計算した。第２の方法において、ベースラインを、１００μＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液について再計算し、１００μＭ ＥＤＴＡ中で１０００万倍交換した上記ＰＲＬ−１−ＷＴサンプルに対するスペクトルを、記録した。最後に、１０ｍｇ／ｍＬ タンパク質サンプルを、５．６Ｍ グアニジウム塩酸塩中で変性させ、９０℃へと加熱し、新たなベースラインをとり、そのスペクトルを、０時間、２時間、４時間、および６時間で集めた。
【００５９】
よって、ＰＲＬ−１による金属配位の特徴を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法で決定した。ＰＲＬ−１およびその変異体が使用した上記金属配位幾何的配置を、８００〜２００ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法を使用して分析した。ＰＲＬ−１の吸収スペクトルは、２８０ｎｍおよび２２０ｎｍにおいてピークを生成した。このことは、上記タンパク質内の芳香族およびペプチド結合から生じ、上記Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定される濃度とよく一致する。金属含有化合物は、可視範囲においていくつかの波長でしばしば吸収し、上記Ｎｉ精製およびＣｕ精製のＰＲＬ−１タンパク質はまた、可視範囲においてピークを表し、これは、上記サンプルのさび色に対応する。ＰＲＬ−１ ＷＴは、３１８ｎｍにおいて最大（非常に大きな２８０バンドのショルダーとして明らか）、４２１ｎｍにおいてより広いシグナル、および５２６ｎｍにおいて非常に広いピークを示す（図６Ａ）。Ｃｕ精製ＰＲＬ−１は、Ｎｉ精製ＰＲｌ−１と同様のスペクトルプロフィールを生じる（データは示さず）；しかし、小さい青色のシフトは、上記個々のスペクトルピークに対して観察され、このことは、ＣｕをＮｉの代わりに使用した場合に予測される。予測されるように、Ｚｎを充填した樹脂を使用して上記タンパク質を精製した場合には、吸収も目に見える色も認められなかった。このことは、Ｚｎ（ＩＩ）が完結したｄ殻を有し、よって、可視スペクトルにおいて電子移動を示すはずがないという事実に起因する。
【００６０】
上記ＷＴタンパク質と比較して、上記Ｈ１６６Ａ改変体は、同じ吸収プロフィールを示したが、上記ピークは、上記ＩＣＰ−ＭＳ結果と一致して、ある程度強度が低下した。ＰＲＬ−１−ＷＴおよびＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａのスペクトルは、可視領域において上記システイン変異体のものとは異なる。等しい濃度において、システイン１７０および／もしくはシステイン１７１におけるセリンでの個々の置換は、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍでのシグナルの完全な損失を示す。これら変異タンパク質を、１０ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍＭ）と同程度の濃度において試験したところ、特異的吸収バンドは検出されなかった。上記ＷＴからのシグナルは、０．１ｍｇ／ｍＬにおいて明らかであり、このことは、Ｎｉの結合が、各変異によって、少なくとも１００倍低下することを示す。
【００６１】
較正したＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのデコンボルーションを、３００ｎｍ〜７００ｎｍの間で行った。すると、３１８ｎｍピークが、それぞれ、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおいて、全ての複合ピーク吸収に対して５４％、３８％および７％寄与する３つの別個の吸収バンドから構成されることが明らかになる（図６Ｂ）。上記ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａの吸収プロフィールは、上記野生型タンパク質スペクトルと非常に似ている。残基１６６における上記イミダゾール基の非存在は、吸収極大をシフトもせず、３１８ｎｍ吸収の成分バンドに顕著に寄与もしない。このことは、上記ＮＧＨモチーフ内のヒスチジンに由来するイミダゾールが、Ｎｉを直接配位しないことをさらに示す。
【００６２】
ＰＲＬ−１におけるＮｉ結合は、ＰＲＬ−１の活性部位におけるジスルフィド結合の還元によって影響を受けない。２０ｍＭ ＢＭＥの添加は、上記スペクトル吸収プロフィールのＵＶもしくは可視領域を変化させず、このことは、金属結合が、上記タンパク質の還元および上記還元剤の存在によって大きく影響を受けないことを示す。上記還元型スペクトルを、上記酸化型から差し引くと、上記還元型ＷＴサンプルと、上記酸化型ＷＴサンプルとの間には、金属配位に有意差がないことが確認される。Ｈｉｓからの小さな貢献がなされるか否かを調べるために、さらなるイミダゾールを、上記溶液に添加して、一時的な会合のシグナル強度を増大させた。１０ｍＭ イミダゾールの添加は、上記吸収プロフィールに対して影響がなかった。このことは、上記Ｎｉへの接近が制限されていることを示唆する。さらに、上記Ｎｉ精製サンプルが、イミダゾールの存在下で還元された場合に、スペクトル変化は認められなかった。Ｎｉ精製ＷＴサンプルの、１００μＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液への１０００万倍の交換は、上記スペクトルに対してほとんど影響がなく、このサンプルに対する吸光度値は、上記ＷＴ吸光度の誤差範囲内であった。７．４から８．５へとｐＨを上げると、モル吸収係数（ε）を約６倍増大させるはずであるが、興味深いことには、ｐＨが上昇した場合に、εの変化は認められなかった。このことは、上記結合したＮｉが、ＰＲＬ−１に接近できない溶媒であることを示唆し得る。しかし、６．５へと上記ｐＨを下げると、目に見えるピークの強度は低下する（データは示さず）。
【００６３】
Ｎｉ結合は、ｐＨ７．４において不可逆性になるようである。なぜなら、Ｎｉ精製ＰＲＬ−１に由来するＮｉの移動が、攻撃的な手段を要するからである。Ｎｉ精製ＰＲＬ−１を、５．６Ｍ グアニジウム塩酸塩で９０℃において処理した場合に、３１８ｎｍ、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおける上記ピークは、６時間かけて徐々に消失するに過ぎない（データは示さず）。７５０ｎｍにおけるシグナルの付随した出現は、６時間かけて観察された。このことは、Ｎｉが、上記タンパク質から放出され、八面体の幾何的配置において水によって配意されたことを示す。図６Ａは、Ｎｉ２＋イオンの存在下で精製したＰＲＬ−１改変体の電子吸収スペクトルを示す。各タンパク質改変体に対する３つのスペクトルを、８００〜２００ｎｍで記録し、平均した。全ての改変体についてのタンパク質濃度は、Ａ２８０比較に基づいて、５ｍｇ／ｍＬから１０％以内までである。７００〜３００ｎｍのスペクトルが示される。目に見える特徴は、３１８ｎｍおよび４２１ｎｍにおける吸収極大である。図６Ａにおいて、曲線は、以下のとおりである：ＰＲＬ−１−ＷＴ、黒色；ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａ、赤色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ、橙色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ、緑色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓ、青色。
【００６４】
図６Ｂは、ＰＲＬ−１ ＷＴの分解したスペクトルを示す。３００〜７００ｎｍの間でのＮｉ精製ＰＲＬ−１ ＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分解は、５つの曲線を使用した上記データと適合する。上記３１８ｎｍのショルダーは、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおけるピークに分解される。上記分解された吸収ピークの和（灰色破線）および生データ（黒色実線）が、両方示される。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおけるピークも、存在する。
【００６５】
図６Ｂの挿入図は、６００〜４００ｎｍのスペクトルを示し、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおける吸収極大の可視化のために拡大スケールで示される。
【００６６】
（実施例５）
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して、上記サンプルを分析した。簡潔には、ＥＳＩスペクトルを、ＭＳモードで操作したＱ−Ｔｏｆ−２（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ ＵＫ） Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで獲得し、感度について８０００分解（ＦＷＨＨ）に離調した（ｄｅ−ｔｕｎｅｄ）フライトアナライザーの時間とともにデータを獲得した。全タンパク質ＥＳＩスペクトルについては、精製タンパク質サンプルを、未処理（「酸化」）２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中で１μｇ／μＬに希釈し、室温でインキュベートした。精製後１日目、４日目、および７日目の時点で採取し、使用する準備が出来るまで−８０℃で凍結した。サンプルを、短い（３ｃｍ×１ｍｍ内径）逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣカラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ１，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）で脱塩した。サンプルを、タンパク質（５μｇ）を含む１％ ギ酸溶液から上記カラムに載せ、同じ溶液中で洗浄し、９０％ ＭｅＯＨ／０．５％ ギ酸で、上記ＥＳＩ源へと直接溶出した。コーン電圧（ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）は、６０ｅＶであり、衝突セル上の電圧は、２０Ｖであった。８００〜３０００ｕの質量範囲にわたってスペクトルを獲得し、１サイクルあたり５秒にわたってデータを蓄積した。
【００６７】
トリプシン消化のために、ＰＲＬ−１−ＷＴ、ＰＲＬ−１−Ｈ１６６ＡおよびＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓを、２０ｍＭ β−メルカプトエタノールありまたはなしの炭酸水素アンモニウム中（ｐＨ８．２）で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１：５０比のプロテアーゼ：タンパク質（ｗ／ｗ）で添加し、３７℃において１６時間にわたってインキュベートした。完全な消化を確認するために、種々の時点でのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、銀染色で可視化した。ＭＳ分析と組み合わせて、キャピラリーＨＰＬＣ分離を、１０μＬ／分での勾配を発生させるクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ ｃａｐＬＣ ＸＬ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）とともに、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって充填されたＺｏｒｂａｘ ＳＢＣ１８ ＲＰカラム（５ｃｍ×０．３２ｍｍ内径，３．５μｍ ビーズサイズ、３００Å ポアサイズ）を使用して行った。２０％から８０％ Ｂへの直線勾配を、１２０分かけて適用した。溶媒は、以下であった：Ａ ９９％ Ｈ２Ｏ、１％ ＭｅＯＨ、Ｂ ９９％ ＭｅＯＨ、１％ Ｈ２Ｏ（ともに０．０８％ ギ酸）。アルゴンを、上記ビームを約２０％まで減衰させる圧力で、上記衝突セルに入れた。このことは、供給調節器での１６ｐｓｉに、または衝突セル付近にあるペニングゲージでの５．３×１０−５ｍＢａｒに対応する。上記衝突セルを、最大移動のために８Ｖで操作し、スペクトルを、２５０〜２０００ｕの範囲にわたって獲得し、１サイクルあたり８秒間のデータを蓄積した。
【００６８】
ＮＭＲ実験を行って、上記サンプルを分析した。簡潔には、２Ｄ １Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを、パルスフィールド勾配を備えた低温の三重共鳴（ｔｒｉｐｌｅ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）プローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ８００ ＭＨｚ ＮＭＲ分光器で獲得した。水抑制を、フリップ−バック（ｆｌｉｐ−ｂａｃｋ）パルスを使用して達成した。全てのスペクトルを、３７℃において得、１Ｈにおいて２０４８ポイントでの１６回のスキャンで獲得した。２５６増分もしくは１２８増分を、それぞれ、ＷＴおよびＣ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓの１５Ｎにおいて集めた。サンプルを、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中に調製し、５％ Ｄ２Ｏを含めた。ＷＴ ＰＲＬ−１およびＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓの濃度は、それぞれ、１．０ｍＭおよび０．８ｍＭであった。サンプル還元を、スペクトル獲得の前に、１０ｍＭ ＤＴＴを少なくとも２４時間添加することによって達成した。１Ｈ化学シフトを、Ｄ２Ｏ中の外部ＤＳＳ標準に関して参照した（２９）。１Ｈに対する間接的な参照は、１３Ｃおよび１５Ｎに対して決定し、このことから、比１３Ｃ／１Ｈ＝０．２５１４４９５３０および１５Ｎ／１Ｈ＝０．１０１３２９１１８を想定した。コンピュータープログラムｎｍｒＰｉｐｅおよびＳｐａｒｋｙを、データ処理およびスペクトル分析のために使用した。
【００６９】
（実施例６）
上記ＭＡＰタグモチーフが金属結合を完全に担うことを確認するために、本発明者らは、ＮＣＣを合成した。上記ＮＣＣペプチドを合成し、精製し、上記ペプチドを、金属充填ＩＭＡＣ樹脂とともにインキュベートした。錯体形成を、陰イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して確認した（図３）。
【００７０】
上記ＮＣＣペプチドにおいて、吸収シグナルは、ＰＲＬ−１中に埋まった上記ペプチド−金属錯体について観察したことを模倣するが、上記錯体は、上記トリペプチドの中により露出している。上記可視範囲における吸収は、そのｐＨが６から７．４へと上昇する場合に強くなる。酸性化は、そのシグナル強度を減少させ、より塩基性のｐＨに戻った場合に、完全なシグナルが戻ることはない。このことは、上記平面四角形の幾何的配置からいくつかの金属の不可逆的な損失が起こり得ることを示す。上記ｐＨを１０へと上昇させると、第５の配位子である、おそらく水もしくはヒドロキシドが、配位し、四角錐配置を生じることが示唆される。ｐＨ７．４において、この配位子は、おそらく高度に交換可能であり、吸収分光法によって検出するにはあまりに一過性過ぎる。上記交換可能な配位子は、上記バルク溶媒の常磁性緩和への達成方法を提供し、ＭＲＩによって検出され得る（図４）。さらに、上記金属塩を、上記ペプチドを含む水溶液へと混合することによって、上記金属を添加した。条件に依存して、上記ペプチドの吸収スペクトルは、金属移動を介して形成された上記錯体に類似であったか、または全長タンパク質について得られたものとは全く異なっていたかのいずれかであった。上記異なるスペクトルは、上記金属が、この場合、硫黄によってのみ配位されている可能性があることを明らかにする。上記ＮＣＣペプチドは、金属結合を付与するに十分であるが、生成される錯体のタイプは、上記金属が上記ペプチドに導入される方法に依存する。金属交換反応は、上記金属を、上記ＮＣＣトリペプチドに組み込んで、極めて高親和性の平面四角形の錯体を生成するための効率的な方法を提供する。
【００７１】
ＮＧＨのＧＧＨ様金属錯体は、図１の構造１に示される。本発明者らは、上記金属結合ＮＣＣ錯体について２つの考えられる化学的構造を想定した。これらを、図１の構造２および構造３に示す。構造２は、いくつかの脱プロトン化骨格Ｎ原子によって上記金属の配位を伴うＧＧＨ様配置に対応する。この場合、Ｈｉｓに由来するイミダゾリウム窒素は、ＮＣＣにおいて、配位した錯体における３位でＣｙｓ由来の硫黄と交換される。この錯体は、３Ｎ：１Ｓ配位を有し、このことは、本発明者らの吸収スペクトルとは一致しない。上記ＮＣＣによる独特の特異的配位を確認するために、ＮＧＣも合成し、金属結合における中心的Ｃｙｓ側鎖の重要性を確認した。上記ＩＭＡＣ樹脂とともにインキュベートした上記ＮＧＣペプチドは、上記金属結合したＮＣＣもしくはＰＲＬ−１スペクトルと似た吸収スペクトルを生じない。よって、本発明者らは、ＧＧＨ様配位が利用されず、上記特定の幾何的配置において金属を結合するために遙かに低い親和性を有するはずであると結論づけた。
【００７２】
構造３は、上記ペプチド単独、およびより大きなタンパク質の状況にある上記ペプチドの両方について得られたデータと完全に一致している。両方についての上記吸収スペクトルは、２つに硫黄原子が、２つの窒素原子とともに上記錯体に関与していることを示し、上記窒素原子のうちの一方は脱プロトン化され、他方は、１つのプロトンが結合されている。構造３は、Ｎ末端アミン基を伴わなくてもよく、このアミン基は、上記ペプチドおよびタンパク質のスペクトルに差異を引き起こすようである。なぜならこの原子は、上記タンパク質中のペプチド結合に埋め込まれているからである。一部はこの構造に基づいて、Ｑ、Ｈ、Ｋ、もしくはＲに由来する窒素は、上記モチーフの１位におけるＮの代わりに使用され得る。
【００７３】
上記金属結合部位および配位の幾何的配置を研究した。ＰＲＬ−１が二価金属カチオンに結合するという知見は、興味深い。なぜなら、他のＰＴＰａｓｅによる特異的金属配位は報告されていなかったからである。ＰＲＬ−１のＣ末端配列は、この酵素ファミリーの中でも独特であり、ＧＧＨ様モチーフ（特定の場合においては、金属に結合し得るが、この場合では、結合しない）および上記新規なＭＡＰタグモチーフの両方をコードする。上記ＧＧＨ様モチーフの幾何的配置は、平面四角形である。濃縮したＰＲＬ−１サンプルで認められた徴的なさび色は、上記ＧＧＨペプチドの色と類似する。このことは、Ｎｉ配位が、平面四角形の幾何的配置において起こることを示唆する。本発明者らの研究から、ＮｉがＰＲＬ−１のＣ末端において結合されることがさらに明らかになっている。金属配位は、ＰＲＬ−１中の上記ＧＧＨ様モチーフによって達成されない。なぜなら、上記おそらく必須のＨｉｓの変異は、結合に対してほとんど影響を有さないからである。両方のトリペプチドが平面四角形の配位を使用して結合するという事実にも拘わらず、各々についての化学現象は異なる。
【００７４】
Ｎｉ精製ＷＴ ＰＲＬ−１から得られたＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、３１８ｎｍ、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍ付近にバンドを示す。平面四角形の幾何的配置において窒素配位子を介してＮｉを結合したペプチドおよび有機分子については、４２０ｎｍ付近の特徴的なｄ−ｄバンドが、文献中で頻繁に報告されている。Ｍａｒｏｎｅｙらは、最初から計算を行い、平面四角形の幾何的配置を使用して、Ｎｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を配位する合成ペプチド模倣物のスペクトル割り当てを行った。１つのバンドを除いて、彼らの観察および計算は、ＰＲＬ−１から観察されたスペクトルと非常に近く一致している。別個に、ＮｉＳＯＤの還元した平面四角形形態を、密度汎関数理論を使用して分析した。その結果は、類似の関連する特徴を示す。これらシステムにおける上記バンドの位置およびそれらの相対強度の傾向は、上記ＰＲＬ−１タンパク質スペクトルにおいて十分に保存されている。これらおよび他の研究に基づいて、５２６ｎｍバンドは、Ｎｉｘｙ−−＞Ｎｉｘ２−ｙ２転移から生じるようである。同様に、上記４２１ｎｍバンドは、Ｎｉｚ２−−＞Ｎｉｘ２−ｙ２転移からくる可能性がある。強い上記３１８ｎｍバンドは、上記配位子−金属電荷転移バンド（ＬＭＣＴ）を反映する。上記スペクトルの分解から、この吸収が、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおける３つのバンドが複合しているようであることが明らかにされている。他のガイドとしての構造を使用して、３０６ｎｍにおける最も鋭く最も強いバンドが、硫黄原子からの転移に対応し、他の２つのバンドは、窒素供与またはおそらくより弱い硫黄供与から生じる可能性がある。
【００７５】
一連のＣ末端変異体の中で、Ｃ１７０およびＣ１７１を含む変異のみが、これら波長でのシグナルを破壊した。最も顕著なことには、上記ＬＭＣＴに対応する３１８ｎｍエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）は、上記システイン変異スペクトル中に不足している。全体の吸収プロフィールに関して、上記システイン変異体の低い３００ｎｍ領域における上記小さな非常に広い吸収は、より低い波長における高強度のバンド、または散乱効果からの人工産物であるようである。なぜなら、それは、上記３１８ｎｍの成分バンドのうちの１つであると不正確に位置づけられているからである。Ｎｉ ｄ軌道（４２１ｎｍ、５２６ｎｍ）内の転移に特徴があり得るバンドはまた、硫黄が酸素によって置換される場合には存在しない。元のバンドは存在せず、さらなるバンドは、Ｃ１７０もしくはＣ１７１のいずれかの変異の際に吸収スペクトル中に現れる。また、これら残基に関わるジスルフィド結合は、上記ＭＳデータにおいて観察されない。よって、両方のシステインが、金属配位に直接関与するようである。本発明者らのＩＣＰ−ＭＳデータは、Ｃ１７０およびＣ１７１に由来する両方の硫黄原子が、堅いＮｉ結合に必要とされることをさらに示す。なぜなら、いずれの硫黄原子も、単独では十分ではないようであるからである。
【００７６】
ＰＲＬ−１によって生成されるスペクトル特徴はまた、Ｎｉが、残っている２つの位置における窒素原子によって配位されることを示唆する。頻繁には、Ｈｉｓに由来するイミダゾリウムのＮもしくは骨格アミドのＮは、金属（例えば、Ｚｎ、ＣｕおよびＮｉ）を配位することが観察される。平面四角形の幾何的配置を使用して、Ｎｉを結合するモデルペプチドおよびタンパク質において、上記繋がる窒素基のうちのいくつかは、脱プロトン化され、負に荷電した種が、上記金属を結合する。上記５２６ｎｍにおける吸収バンドは、ＰＲＬ−１が、脱プロトン化窒素を介してＮｉを配位することを示すのに対して、上記ＰＲＬ−１スペクトルにおいて生じた４２１ｎｍ吸収は、単独でプロトン化された窒素による配位を反映する。ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを作製するための上記ＧＧＨ様モチーフにおけるＨｉｓの変異は、このヒスチジンの側鎖が、Ｎｉ結合に実質的に影響を及ぼさないことを明らかにした。ＰＲＬ−１は、Ｈ１６６に加えて、３つの他のＨｉｓをコードする。Ｈ２３、Ｈ６４およびＨ１０３は、上記配列の異なる領域に位置し、変性条件下で堅く結合したままである可能性は低い。上記金属を放出するために上記タンパク質を解こうとする試みは、高温で数時間にわたる高濃度の変性剤での激しい処理を必要とした。化学的変性および熱変性は、Ｎｉのゆっくりとした放出のみを可能にし、ＣＤデータは、Ｎｉが放出される十分前にＰＲＬ−１が完全に解かれることを示すので、上記金属は、上記タンパク質の短いセグメントにおいてクラスター形成した原子によって配位されるようである。
【００７７】
上記ＧＧＨタイプペプチドは、極めて堅い結合（Ｋｄ 約１０−１７〜１０−１８）を達成する。このことは、上記モチーフ内の脱プロトン化骨格アミド窒素によって一部達成される。ＰＲＬ−１について観察される極めて堅い結合および窒素原子からＮｉ連結への推定される寄与に鑑みれば、ＰＲＬ−１に由来する骨格アミドは、金属配位に関与し得る。いずれかのシステインの非存在が、結合を破壊し、短縮が両方の側鎖および骨格アミドを除去するので、金属交換反応が、変異誘発を使用して、Ｃ１７０およびＣ１７１に隣り合うアミド窒素に関わるという仮説を試験することは、可能でない。構造研究は、さらなる配位原子を同定する最もよい方法であり、これら研究は、本発明者らの実験室で進行中である。
【００７８】
（実施例７）
生理学的ｐＨにおけるＣｕ−ＮＣＣを、生理食塩水バッグによって囲まれたチューブの中に入れ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒにあるＨｏｇｌｕｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにおいて、標準的ＭＲＩを使用して画像化した（図４）。図４において、中心にある明るいシグナルは、上記Ｃｕ−ＮＣＣ錯体に対応するのに対して、あまり明るくないシグナルは、上記生理食塩水溶液に対応する。黒色は、上記チューブおよび空気に対応する。
【００７９】
従って、本発明は、言及した目的および利点、ならびにそこに固有のものを得るために十分に適合される。本発明は、その趣旨もしくは本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具現化され得る。記載される実施形態は、単なる例示として全ての観点において考慮されるべきであり、限定として考慮されるべきではない。本発明の範囲は、従って、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に入る全ての変更は、特許請求の範囲の範囲内に包含されるべきである。本明細書で記載される全ての参考文献は、具体的参照によって本明細書に参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願との相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６１／０５２，９１８号（２００８年５月１３日出願）に対する優先権を主張する。この仮特許出願は、参照により本願に援用される。
【０００２】
（政府の利益の陳述）
本発明は合衆国国立衛生研究所の助成金（Ｇｒａｎｔ Ｎｏ．Ｐ２０ ＲＲ−１７７０８）の下、開発された。合衆国政府は本発明に対し一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
以前に、金属を利用して、ポリペプチド（例えば、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント）を組成物から抽出することは、一般的な技術であった。このような抽出物は、上記組成物内の他の物質に優先して、金属が特定のポリペプチドと錯体形成する能力に基づいた。２つの異なるペプチドベースの金属結合タグが、組成物からペプチドを分離するために使用され得ることは、公知である。しかし、これら結合タグは、アミノ酸の特定のタイプ、および本発明に関連して記載されるものとは実質的に異なる結合を達成するために利用されるアミノ酸の特定の数もしくは特定の配列を有する。例えば、例えば、これら２種の結合タグは、同じタイプの金属に結合しなくてもよいし、本発明と同じ幾何的配置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を使用して結合しなくてもよい。第１の結合タグに関するさらなる情報は、特許文献１（Ｈａｒｏｏｎら）において得られ得、配列ＮＸＥＱＶＳＰを含むペプチドに関する。第２の結合タグに関する情報は、特許文献２（Ａｒｂｏｇａｓｔら）において得られ得、そこで記載されるタンパク質全体であるようであるタグの配列に関する。
【０００４】
タンパク質の組換え発現のために生物の遺伝物質においてコードされ得るタグは、タンパク質生成物の精製および同定のために広く利用されてきた。この最も顕著な例は、Ｈｉｓ−タグ技術であった。この技術は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、全細胞からタグ化したタンパク質を効率的に単離する容易な手段を提供する。多くの他のペプチドベースのタグは、ペプチドタグを認識する抗体を使用して、細胞培養アッセイもしくは細胞溶解物において上記タグ化タンパク質を検出するために開発されてきた。これら技術は、インサイチュアッセイもしくはインビトロアッセイにおいて有用であるが、一般に、それらはインビボ分析には適用可能でない。ペプチドタグの利点は、上記タグが、目的のタンパク質を標識するためのさらなる化学工程の必要なくして、上記タンパク質に共有結合することである。
【０００５】
ＭＲＩ画像化は、生きている動物およびヒトにおいて構造的特徴を調べるための一般的な方法である。上記技術は安全でありかつ非侵襲性である。造影剤は、上記方法の感度を改善するために開発されてきており、それらは、上記ＭＲＩ画像において認められる特徴を増強するために使用される。上記改善は、造影剤が、隣り合う分子（代表的には、水）からのシグナルを変化させる金属を含むことから、達成されてきた。最も一般に使用される薬剤は、Ｇｄ（ＩＩＩ）をキレート化するが、他の金属は、対比を増強するために使用され得る。Ｇｄ含有造影剤は、腎性全身性線維症もしくは腎性線維化性皮膚症として公知の重篤な合併症が生じ得るので、腎機能が損傷した患者において使用できなかった。このような患者の必要性に対処するために、代替の画像化剤が必要とされる。金属をキレート化する化合物はまた、分子レベルでの詳細を検討するために、ＰＥＴ画像化およびＳＰＥＣＴ画像化において使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，２０８，１３８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００１８９７４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本開示は、一般に、トリペプチドモチーフおよびこのようなモチーフを使用するための方法に関する。これらペプチドは、金属に結合する能力を有し、このことは、これらペプチドを種々の適用に有用にする。特に、本開示のトリペプチドは、画像化、研究、化学療法、およびキレーション療法（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）における適用を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む組成物であって、ここでＸは、ＸＣ１Ｃ２が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方において金属を結合し得るような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、組成物。
（項目２）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目５）
配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドおよび金属を含む組成物であって、ここで該金属は、該トリペプチドと錯体化しており；そしてここでＸは、トリペプチドおよび金属が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有する錯体を形成するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、組成物。
（項目６）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目３に記載の組成物。
（項目７）
前記金属は、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅからなる群より選択される、項目３に記載の組成物。
（項目８）
前記金属は、放射性同位体である、項目３に記載の組成物。
（項目９）
前記金属は、６２Ｃｕである、項目３に記載の組成物。
（項目１０）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の組成物。
（項目１１）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目３に記載の組成物。
（項目１２）
金属と、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドとを錯体化して、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を形成する工程を包含する方法であって；ここでＸは、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有するような任意のアミノ酸であり；そして
ここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される、方法。
（項目１３）
Ｘは、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンから選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記金属は、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅからなる群より選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
前記金属は、放射性同位体である、項目１２に記載の組成物。
（項目１６）
前記金属は、６２Ｃｕである、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含むポリペプチドをさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１８）
前記配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む非ペプチド実体をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１９）
前記金属は、生物学的サンプル中に存在する、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記金属は、被験体において見いだされる、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を検出する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
前記金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を画像化する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
【０００８】
特定の実施形態によれば、本開示は、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドを含む組成物を提供し；ここでＸは、ＸＣ１Ｃ２が平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方において金属を結合し得るような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【０００９】
他の実施形態によれば、本開示は、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドおよび金属を含む組成物を提供し；ここで上記金属は、上記トリペプチドと錯体化し；そしてここでＸは、トリペプチドおよび金属が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有する錯体を形成するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【００１０】
他の実施形態によれば、本開示は、金属と、配列ＸＣ１Ｃ２を有するトリペプチドとを錯体化して、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体を形成する工程を包含する方法を提供し；ここでＸは、金属−ＸＣ１Ｃ２錯体が、平面四角形配向もしくは四角錐配向またはその両方を有するような任意のアミノ酸であり；そしてここでＣ１およびＣ２は、同じであるかまたは異なっており；そしてここでＣ１およびＣ２は、システインおよびシステイン様非天然アミノ酸から個々に選択される。
【００１１】
本発明の特徴および利点は、以下の実施形態の説明を読めば、当業者に容易に明らかである。
【００１２】
（図面）
本開示のより完全な理解は、添付の図面とともに、以下の詳細な説明を参照することによって得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、構造１ ４Ｎ配位を有するＧＧＨ様金属錯体ＮＧＨを示す。構造２および構造３ いくつかの脱プロトン化骨格Ｎ原子によって上記金属の配位に影響を及ぼすＧＧＨ様配置を示す。
【図２】図２は、ヒトＰＲＬ酵素（ＰＲｌ−１、ＰＲＬ−２、およびＰＲＬ−３を含む）のＣ末端部分の配列アラインメントを示す。ＰＲＬ−１のＨ１６６は、青で示されるＮＧＨモチーフの一部である。ＰＲＬ−１の残基Ｃ１７０およびＣ１７１は、赤で示されるＣａａＸモチーフ（ボックスで囲った）の一部である。上記ＮＣＣモチーフは、太字が付されている。
【図３】図３は、Ａ． ｐＨ１０において獲得したニッケル結合トリペプチドのＥＳＩ−ＭＳ（ここで質量は、ニッケルが上記ペプチドに結合されていることを示す）、Ｂ．上記サンプルのｐＨを５に低下させた後のＥＳＩ−ＭＳスペクトル（ニッケルが、上記ペプチドから放出されたことを示す）を示す。
【図４】図４は、Ｃｕ−ＮＣＣ磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を示す。
【図５】図５は、Ｈｉｓ−タグの切断および除去後に、Ｎｉ（ＩＩ）（ｐＨ７．４）の存在下で精製した、精製ＷＴ ＰＲＬ−１の写真を示す。写真は、その特徴的なさび色を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｎｉ２＋イオンの存在下で精製したＰＲＬ−１改変体の電子吸収スペクトルを示す。各タンパク質改変体について３つの（２つの）スペクトルを８００〜２００ｎｍまで記録し、平均した。全ての改変体についてのタンパク質濃縮物は、Ａ２８０比較に基づいて、５ｍｇ／ｍＬから１０％以内までである。７００〜３００ｎｍまでのスペクトルを示す。目に見える特徴は、３１８ｎｍおよび４２１ｎｍでの吸収極大である。挿入図。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおいて吸収極大の可視化のために、より小さなスケールで、６００〜４００ｎｍまでのスペクトルが示される。曲線は、以下のとおりである：ＰＲＬ−１−ＷＴ、黒（一番上）；ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａ、赤（一番上から２番目）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ、橙色（一番下）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ、緑（一番下から２番目）；ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓ、青（真ん中）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＲＬ−１ ＷＴの分解スペクトル（Ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）。３００〜７００ｎｍの間のＮｉ精製ＰＲＬ−１ ＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分解は、５つの曲線を使用するデータと適合する。その３１８ｎｍのショルダーは、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおけるピークに分解される。上記分解された吸収ピーク（灰色破線）の和および生データ（黒実線）が、ともに示される。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおけるピークもまた、存在する。
【００１４】
特許および特許出願ファイルは、少なくとも１部のカラーで仕上げられた図面を含む。カラー図面付きのこの特許もしくは特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金を支払えば、特許庁によって提供される。
【００１５】
本開示は、種々の改変および代替の形態に影響されやすいが、特定の例示的実施形態は、図面に既に示されており、本明細書により詳細に記載される。しかし、特定の例示的実施形態の説明が、本発明を開示される特定の形態に限定すると意図されないが、一方で、この開示は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような全ての改変および等価物を網羅することが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（説明）
本発明は、一般に、短いペプチドモチーフおよびこのようなモチーフを使用するための方法に関する。これらペプチドは、選択的に金属に結合する能力を有し、このことは、これらペプチドを、種々の適用に有用にする。特に、本発明のペプチドは、画像化、研究、化学療法、およびキレーション療法における適用を有する。
【００１７】
一般に、本開示は、選択された金属と強く結合する短い新規なペプチドモチーフ（ＭＡＰタグといわれる）に関する。よって、これらＭＡＰタグは、とりわけ、上記選択された金属を、組成物から抽出するために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、３アミノ酸長であり、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくはその間の任意の位置において、より長いポリペプチドおよびタンパク質の中に含まれ得る。特定の実施形態において、しかし、上記ＭＡＰタグが、金属と結合するための上記ＭＡＰタグを表す、ポリペプチドもしくはタンパク質の配置に存在する（例えば、外部ループに存在する）ことは、有利であり得る。上記ＭＡＰタグはまた、非ペプチド実体に結合され得る。さらに、１種より多いＭＡＰタグは、特定の分子上に存在し得る。
【００１８】
多くのタンパク質が金属に結合することは公知である。しかし、このような結合は、代表的には、密な結合を達成し、次いで、開いた際に、容易に上記金属を放出するために、折りたたまれたタンパク質構造内で不連続なアミノ酸配列を利用する。他方で、ＭＡＰタグによる金属結合は、非常に密接して近くにある原子を使用して達成され、よって、極端な条件が、上記金属を放出するために必要とされる。上記タンパク質の熱変性および化学的変性は、上記金属のゆっくりとした放出を可能にする。例えば、極端な条件の使用（例えば、沸点温度、強酸）は、一定期間にわたって（例えば、数時間から長時間）上記金属をゆっくりと放出することをもたらし得る。
【００１９】
（Ａ．化学的構造）
特定の実施形態において、本開示は、新規なペプチドベースのタグもしくは金属の結合剤（ＭＡＰタグ）を提供する。上記ＭＡＰタグは、ポリペプチドもしくはタンパク質中に高親和性金属結合部位を直接コードするために使用され得る。本開示のＭＡＰタグは、平面四角形および／もしくは四角錐の幾何的配置において金属に結合し得るそれらの能力によって特徴付けられる。
【００２０】
（１．ペプチド配列）
本開示のＭＡＰタグは、一般に、金属に結合し得る、少なくとも３個連続するアミノ酸残基を含む。本開示のＭＡＰタグは、一般に、ＸＣ１Ｃ２によって表される配列を有し、ここでＣ１およびＣ２は、同じであってもよいし、異なっていてもよく、システイン、もしくはシステイン様非天然アミノ酸（例えば、硫黄含有α−アミノ酸もしくはβ−アミノ酸）であり得、そしてここでＸは、上記形成されるペプチドタグが、平面四角形／四角錐の幾何的配置において金属に結合し得る限りにおいて、別の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、またはアミノ酸アナログであり得る。本明細書において使用される場合、Ｌ鏡像異性アミノ酸の略語は、従来どおりであり、以下のとおりである：
【００２１】
【表１】
いくつかの実施形態において、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、もしくはアルギニン（Ｒ）であり得る。
【００２２】
アミノ酸配列が、一連の三文字アミノ酸略語もしくは一文字アミノ酸略語として表される場合、標準的な使用および慣例に従って、左側がアミノ末端方向であり、右側がカルボキシ末端方向であることが理解される。
【００２３】
本開示のＭＡＰタグは、任意の組換え技術システムを使用して、発現のための遺伝子もしくはヌクレオチド配列と一続きで（ｉｎ ｌｉｎｅ）コードされ得る。さらに、上記タグは、ペプチドもしくはタンパク質の生成のための任意の合成法もしくは生合成法を使用して、ペプチドもしくはタンパク質へと組み込まれ得る。適用において、上記ＭＡＰタグは、金属と自発的に反応して、ペプチド−金属錯体を形成する。このようなペプチド−金属錯体は、溶液中で、または金属交換反応（ｔｒａｎｓｍｅｔａｌｌａｔｉｏｎ）もしくは任意の他のプロセスを介して、形成し得る。
【００２４】
上記ＭＡＰタグは、単独で使用され得るか、あるいはＮ末端側、Ｃ末端側に結合され得るか、またはポリペプチド鎖内の可撓性リンカーもしくはループへと挿入され得るタグとして、使用され得る。上記ＭＡＰタグは、金属配位に関与する側鎖以外の任意の位置で改変され得る。よって、上記ＭＡＰタグは、Ｚ−ＸＣ１Ｃ２−Ｚ１のような配列を含み得、Ｚは、任意のアミノ酸もしくは任意のアミノ酸配列であり得、Ｚ１は、Ｚに等しいもしくは等しくない、任意のアミノ酸またはアミノ酸配列であり得る。上記アミノ酸は、上記表１と同様に示される。非天然のおよびアミノ酸のアナログは、上記表中には列挙されていないが、それらは、Ｚ、Ｚ１、および／もしくはＸに組み込まれ得る。
【００２５】
特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグは、別の分子に結合され得る。例えば、上記ＭＡＰタグは、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸）のような非ペプチド実体に結合され得る。上記結合は、共有結合であってもよいし、リンカーを介して行われていてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記ＭＡＰタグは、以下のような配列を含み得る：ＮＣ１Ｃ２；Ｚ−ＮＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＮＣ１Ｃ２；ＮＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＱＣ１Ｃ２；Ｚ−ＱＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＱＣ１Ｃ２；ＱＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＨＣ１Ｃ２；Ｚ−ＨＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＨＣ１Ｃ２；ＨＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＫＣ１Ｃ２；Ｚ−ＫＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＫＣ１Ｃ２；ＫＣ１Ｃ２−Ｚ１；ＲＣ１Ｃ２；Ｚ−ＲＣ１Ｃ２−Ｚ１；Ｚ−ＲＣ１Ｃ２；もしくはＲＣ１Ｃ２−Ｚ１。上記のように、Ｚは、任意のアミノ酸もしくは任意のアミノ酸配列であり得、Ｚ１は、またはＺに等しいかもしくは等しくない、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸配列であり得る。上記アミノ酸は、表１と同じように表される。非天然のおよびアミノ酸のアナログは、上記表中には列挙されていないが、それらは、化合物ＺおよびＺ１に組み込まれ得る。
【００２７】
一実施形態において、上記ＭＡＰタグは、以下の構造式を有するＮＣＣを含む：
【００２８】
【化１】
特定の実施形態において、本開示のＭＡＰタグは、金属とのＭＡＰタグ錯体化前、もしくは金属との錯体化後のいずれかに、上記ＭＡＰタグの標的化送達を提供する遺伝子もしくはヌクレオチド配列と一続きでコードされ得る。このことは、遺伝子、ペプチド、もしくは標的化に有用であることが公知の他のモチーフを使用して、達成され得る。例えば、ＭＡＰタグは、抗体、増殖因子、ペプチドなどと一緒に組み込まれ得る。
【００２９】
（２．金属結合）
特定の実施形態において、本開示のＭＡＰタグは、単独で、またはポリペプチドもしくはタンパク質に組み込まれる場合、金属と錯体化して、平面四角形／四角錐の幾何的配置を有するＭＡＰタグ−金属錯体を形成し得る。上記金属は、上記ＭＡＰタグと、２Ｎ：２Ｓ配位を介して錯体化し得る。上記ＭＡＰタグはまた、当業者によって認識される適切な条件下で、平面四角形の幾何的配置において多くの金属に結合し得る。一般に、本開示のＭＡＰタグは、ＩＵＰＡＣ Ｇｒｏｕｐを参照すると：３族金属（例えば、Ｙ）；５族金属（例えば、ＶおよびＵ）；６族金属（例えば、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ）；７族金属（例えば、Ｍｎ、Ｔｃ、Ｒｅ）；８族金属（例えば、ＦｅおよびＲｕ）；９族金属（例えば、Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ）；１０族金属（例えば、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ）；１１族金属（例えば、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）；１２族金属（例えば、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）；１３族金属（例えば、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）；１４族金属（例えば、ＳｎおよびＰｂ）；ならびに１５族金属（例えば、Ｂｉ）を結合し得る。特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグは、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｂ、およびＦｅと結合しかつＭＡＰタグ−金属錯体を形成し得る。
【００３０】
上記のように、上記金属を結合すると、上記ＭＡＰタグは、平面四角形の幾何的配置を有する。本開示はまた、種々の平面四角形配置にある、ＭＡＰタグ金属配位を企図する。例えば、上記ＭＡＰタグがＮＣＣでありかつ上記金属が上記のようにＭとして表される任意の金属である場合、上記ＭＡＰタグは、式１によって表される構造式を有し得る：
【００３１】
【化２】
他の構造的配置がまた、企図される。例えば、上記ＭＡＰタグがＮＣ１Ｃ２でありかつＣ１が非天然アミノ酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノ−２−メルカプト酢酸）でありかつＣ２がシステインである場合、上記ＭＡＰタグの構造式は、式２として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３２】
【化３】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＮＣ１Ｃ２であり、Ｃ２は、非天然アミノ酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノ−４−メルカプト酪酸であり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式３として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３３】
【化４】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＮＣ１Ｃ２であり、Ｃ２は、βアミノ酸（例えば、３−アミノ−２−メルカプトプロピオン酸であり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式４として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３４】
【化５】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＲＣＣであり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式５として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３５】
【化６】
別の例において、上記ＭＡＰタグは、ＱＣＣであり、上記ＭＡＰタグの構造式は、式６として表され得、ここでＭは、上記のように任意の金属である：
【００３６】
【化７】
（Ｂ．上記ＭＡＰタグの適用）
（１．金属抽出のためのＭＡＰタグ）
上記のように、ＭＡＰタグは、高親和性で金属を結合し得る。ＭＡＰタグはまた、液体から固体までの範囲に及ぶ種々の組成物から金属を抽出し得る。結論として、ＭＡＰタグが、配位を共有するのではなく上記金属を抽出する能力は、以下で依り詳細に記載されるように、上記タグを、特定の金属を別の組成物から分離することにおける使用に影響を受けやすくする。上記ＭＡＰタグは、上記金属と錯体化し、次いで、上記金属を組成物中の成分（例えば、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、または例えば、ＩＤＡもしくはＮＴＡと結合体化した固体支持体）から上記金属を抽出もしくは除去することによって、上記組成物から金属イオンを封鎖する。よって、上記ＭＡＰタグは、金属抽出ペプチド（ＭＡＰ）タグである。
【００３７】
さらに、少なくとも一部は、ＭＡＰタグが金属に選択的に結合する能力に起因して、本開示の実施形態は、キレーション療法に有用であり得る。従って、ＭＡＰタグは、生物学的に毒性の金属（例えば、鉛）を封鎖するために使用され得る。
【００３８】
同様に、ＭＡＰタグはまた、金属を水、他の水溶液、もしくは身体の外の任意の組成物から封鎖することにおいて有用であり得る。上記ＭＡＰタグ自体は、一般に、多くの溶媒中で可溶性である。しかし、特定の実施形態において、上記ＭＡＰタグ−金属錯体は、多くの有機溶媒中では溶解性が乏しく、いったん金属結合が起こると、沈殿し得る。このことは、有機溶媒からの抽出の間の効率的な分離を可能にする。
【００３９】
（２．画像化適用）
特定の実施形態において、本開示は、ＭＡＰタグを使用する、画像化のための方法を提供する。このような方法は、治療的画像化および医療的画像化、または他の画像化適用のために使用され得る。上記ＭＡＰタグと錯体化するように選択される金属は、上記特定の適用および画像化技術に依存する。例えば、常磁性金属は、画像化技術（例えば、ＭＲＩ、ＮＭＲおよびＥＰＲ）との使用に選択され得る一方で、金は、電子顕微鏡のような技術のために選択され得る。その一方で亜鉛は、蛍光のような適用のために選択され得る。どの金属が所定の適用および画像化技術に適しているかは、当業者によく知られている。
【００４０】
一実施形態において、ＭＡＰタグは、画像化技術において使用するための試薬を調製するために利用される。すなわち、ＭＡＰタグは、金属に結合し、続いて、画像化のために使用され得る（例えば、上記金属が画像化のために使用され得るように、被験体の身体において使用され得る）錯体を提供する。適切な画像化技術の例としては、単独でもしくは組み合わせにおいて、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放出型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）、電子顕微鏡、蛍光画像法などが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態において、ＭＡＰタグは、被験体の一部に局在するポリペプチドもしくはタンパク質、または非タンパク質実体へと組み込まれ得る。ここでＭＡＰタグ−金属錯体の金属部分は、局在部位（例えば、組織もしくは腫瘍）を画像化する能力を提供する。例えば、上記ＭＡＰタグ−金属錯体は、上記ＭＡＰタグ化分子の標的化部分に対するレセプターおよび／もしくは結合パートナーを発現する組織もしくは他の構造を同定するために使用され得る。上記金属を可視化し得る画像化技術は、このような特徴の同定のために使用され得る。
【００４２】
例えば、ＭＲＩ造影剤は、隣り合う原子の緩和を変化させて、上記造影剤が存在する領域と、存在しない領域との間で検出されるシグナルの差異を発生させる、代表的には、金属中心を含む常磁性種である。ＭＡＰタグは、Ｃｕと錯体化される場合には、常磁性であり得る。従って、ＭＡＰタグ−金属錯体は、ＭＲＩ造影剤として使用するための能力を有する。大部分の造影剤は、顕微鏡レベルで標的化されないが、身体もしくは組織中の肉眼的構造および欠損を明らかにするために使用される。適用のこのタイプにおいて、上記造影剤の濃度は、非常に高い。造影剤を、選択された組織もしくは顕微鏡的構造に標的化することは、細胞レベルでの異常の同定を可能にする点で有益である。例えば、上記ＭＡＰタグは、特定のレセプターを発現する癌細胞を認識する抗体上のタグとして発現され得る。標的化された送達は、より低い濃度の造影剤が投与されることを可能にする。このことは、とりわけ、毒性および他の副作用を最小にする助けになり得る。
【００４３】
６２Ｃｕが、身体内の分子的な詳細を画像化し得る、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ画像化において使用される放射活性同位体であることは公知である。よって、ＭＡＰタグは、Ｃｕ（もしくは別の金属）の適切な放射性同位体を添加され得、これら画像化技術でのトレーサーとして使用され得る。同様に、上記タグを、任意のタンパク質もしくはペプチド、または細胞の部分セットを結合する他の分子に融合することによって、標的化された画像化が、達成され得る。
【００４４】
上記ＭＡＰタグは、特定の金属に対して高い親和性を有する短い配列であるので、とりわけ有利である。従って、発現されたタンパク質もしくは他の分子においてＭＡＰタグをコードすることによって、生物内の特定の細胞タイプへの標的化された送達は、可能である。さらに、細胞の部分セットを標的化することは、画像化に必要とされる造影剤の量の減少を可能にする。
【００４５】
（３．化学療法）
本発明はまた、化学療法を補助するために使用され得る。例えば、ＭＡＰタグは、白金および／もしくは放射性核種との錯体を形成し得、特定の細胞もしくは細胞タイプへの標的化された送達を提供するために使用され得る。
【００４６】
本発明のよりよい理解を促進するために、以下の特定の実施形態の実施例が提供される。以下の実施例が、本発明の範囲全体を限定するようにも、規定するようにも、決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
変異誘発技術を、選択された金属と強い結合親和性を有する上記ペプチドモチーフを同定するために使用した。簡潔には、ヒトＰＲＬ−１遺伝子を、ｐＥＴ−３０ Ｘａ ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ＰＣＲベースのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して変異させた。Ｃ１７０Ｓ、Ｃ１７１Ｓ、およびＨ１６６Ａ変異体を生成するプライマー（５’から３’）は、それぞれ、
【００４８】
【数１】
および
【００４９】
【数２】
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）であった。大文字は、変異した塩基を示す。ＰＣＲ反応物をＤｐｎＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、１．５時間にわたって３７℃において処理し、ＮｏｖａＢｌｕｅ ＧｉｇａＳｉｎｇｌｅｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に直接形質転換し、３０ｍｇ／ｍＬ カナマイシン選択でＬＢ上にまいた。個々のコロニーを、選択的ＬＢ中で３７℃において一晩増殖させた。得られたＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。全ての変異を、ＤＮＡ色素−ターミネーター配列決定によって確認した（Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄｓ ＤＮＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｍｉｄｊｉ，ＭＮ）。上記二重変異体Ｃ１７０Ｓ／Ｃ１７１Ｓを、第２回の変異誘発によって生成し、同様に確認した。
【００５０】
ＰＲＬ−１および関連する変異遺伝子を有するベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換し、選択的ＬＢ上で３７℃において一晩増殖させた。選択されたコロニーを、選択的Ｍ９ＺＢブロス中で、一晩３７℃において増殖させた。次いで、一晩の培養物を、５００ｍＬの非標識最小培地に移し、０．６〜０．８の間のＯＤ５５０において、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ＮＭＲ実験のために発現させたタンパク質は、１５Ｎ−塩化アンモニウムを含む最小培地中で増殖させた。上記組換えタンパク質の過剰発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細胞を、４４００×ｇでの遠心分離によってペレット化し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５１】
一連のＰＲＬ−１変異体を、金属配位に関与する残基を同定するために試験した。ＧＧＨ様モチーフを含むモデルペプチドは、極めて高い親和性でＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を配位することを示した。このモチーフにおいて、２つのＧｌｙ位置のうちのいずれかにおける置換が、ごくわずかに結合を低下させるのに対して、Ｈｉｓの変異は、結合を破壊する。ＰＲＬ−１は、ＮＧＨ、ＧＧＨ様コンセンサスモチーフを、そのＣ末端付近においてコードする（図２）。従って、ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを、ＰＲＬ−１に含まれる上記ＮＧＨ配列が、金属結合を担うという仮説を試験するために作製した。ＰＲＬ−１およびＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを、それぞれ、約１２０μＭおよび６０μＭのＮｉを結合したＩＣＰ−ＭＳによって、並行して分析した。吸収分光法によって測定した場合に、わずか２０％のシグナルの低下が、Ｈ１６６Ａについて認められた。タンパク質シグナルが、等しい程度にまで減少され、可視領域のシグナルの損失が、タンパク質不安定性に起因することはまた、吸収スペクトルから明らかである。タンパク質不安定性は、上記２つの検出法における不均衡が原因のようである。なぜなら、ＩＣＰ−ＭＳは、分析する前に、実質的により多くのサンプル操作を要するからである。上記ヒスチジン変異体は、堅い結合を保持したままであったので、Ｃ１７０および／もしくはＣ１７１における変異を、チオールがＮｉ配位にしばしば関与することから、作製した。個々のシステイン変異体、ならびに二重変異体におけるＮｉレベルは、野生型タンパク質と比較して、大いに低下した。このことは、両方のＣｙｓ残基が、金属配位に影響を及ぼすことを示す。Ｃ１７０Ｓ変異体においても、上記Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ二重変異体においてもＮｉが検出されなかったが、約１７μＭの小さなシグナルが、ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓについて認められた。
【００５２】
（実施例２）
タンパク質精製技術を使用して、上記タンパク質−金属錯体を精製した。簡潔には、細胞ペレットを、３０ｍＬ 緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４、Ａｒ散布した）中に再懸濁し、１５，０００ｐｓｉにおいて、フレンチプレッシャーセル（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して溶解した。緩衝液のアルゴン散布を行って、酸素を置換した。次いで、サンプルを、２１，０００×ｇにおいて遠心分離し、その上清を、０．２μｍ ナイロンフィルタを通して濾過した。（Ｈｉｓ）６−タグ化ＰＲＬ−１の精製を、流速１ｍＬ／分において、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムを使用して行った。サンプルを、金属添加した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せ、載せた後に、５×カラム容積ですすいだ。溶出を、１３×カラム容積かけて６０％ 緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４、アルゴン散布ありもしくはなし）へ、３×カラム容積かけて１００％ Ｂへの直線勾配を使用して達成し、および４×カラム容積かけて１００％ Ｂにおいて維持した。溶出を、２８０ｎｍでの吸収によってモニターし、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して純度について試験した。適切な画分をプールし、Ａｒ散布したもしくはＡｒ散布していない１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析した。上記（Ｈｉｓ）６−タグを、第Ｘａ因子プロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、室温において一晩使用して、上記標的タンパク質から切断した。ＸａｒｒｅｓｔＴＭアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、プロテアーゼを除去し、上記カラムに再度載せて上記タグおよび任意の非切断タンパク質を除去する前に０．２μｍ ナイロンフィルタで濾過した。上記タンパク質を、透析緩衝液中の上記カラムに載せ、最初のフロースルーを集めて、上記タンパク質サンプルを作製した。サンプルを濃縮し、（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離フィルタを使用して、Ａｒ散布１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．４中で、少なくとも１０６倍交換した。上記サンプルの純度および変異体確認を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＳＩ−ＭＳによって確認した。カラムを、１Ｍ ＮａＯＨで処理し、２×カラム容積の１００ｍＭ ＥＤＴＡでストリッピングし、Ａｒ散布した１００ｍＭ ＮｉＳＯ４、１００ｍＭ ＣｕＳＯ４、１００ｍＭ ＣｕＣｌ２もしくは１００ｍＭ ＺｎＣｌ２を、各使用の直前に再度充填した。
【００５３】
図５は、上記Ｈｉｓ−タグの切断および除去後の精製ＰＲＬ−１を示す。上記ｈｉｓ−タグに結合した金属は、八面体の幾何的配置を有し、これは、青緑色であり、このような配位事象に対応する吸収は、スペクトルのうちの７００〜８００ｎｍ領域において現れる。Ｎｉ（ＩＩ），ｐＨ７．４の存在下で精製したＷＴ ＰＲＬ−１の写真は、その特徴的なさび色を示す。上記精製した野生型ＰＲＬ−１タンパク質は、予測外のさび色を有する（図５）。このことは、芳香族残基（すなわち、ＴｒｐもしくはＴｙｒ）の金属錯体化もしくは酸化から生じ得る。
【００５４】
芳香族残基の酸化は、上記タンパク質のインタクトなおよびトリプシン消化研究からの質量分析データに基づいて容易に排除された。さらに、本発明者らは、上記さび色のタンパク質が、高速遠心分離の間にチューブの底で濃縮されるので、上記タンパク質の密度が、予測されるより高いことを観察した。金属配位が上記タンパク質錯体の密度を増加させるので、本発明者らは、上記発色団が、上記タンパク質との金属錯体の形成によって生成される可能性をさらに調べた。金属キレート化クロマトグラフィーを使用して、ＰＲＬ−１を精製したので、金属イオンのもっとも可能性のある供給源は、上記ＩＭＡＣ樹脂に由来するＮｉであった。
【００５５】
組換えＷＴ ＰＲＬ−１を含む細胞溶解物が、等しく分けて、Ｎｉ２＋充填した、Ｃｕ２＋充填したもしくはＺｎ２＋充填したＩＭＡＣ樹脂を使用して並行して（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）精製した場合、上記タンパク質は、上記キレート化樹脂に結合した金属を抽出する。金属交換反応の速度は、ニッケルで最も速く、続いて、銅であった。亜鉛は、全てのサンプルにおいてある程度存在し、このことは、上記タンパク質が亜鉛をインビボで拾い上げることを示す。亜鉛が上記カラムに結合される場合、亜鉛のみが、上記タンパク質中で認められる。Ａｐｏ ＰＲＬ−１は、可溶性が乏しく、金属の損失が沈殿をもたらす。誘導結合型プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって試験した場合に各精製からの可溶性物質は、結合した金属の等しい割合を有する。
【００５６】
（実施例３）
ＩＣＰ−ＭＳを使用して、上記結合した金属を特徴付けした。簡潔には、精製タンパク質サンプルを、ＰＦＡ微小遠心分離管（Ｓａｖｉｌｌｅｘ，＃ｓ ７２４０、７２４１）において濃硝酸中、６８±１℃で１６．５±０．７時間にわたって消化した。消化前のタンパク質定量に基づいて、次いで、上記サンプルを、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中で１．５μＭへと希釈し、０．２μｍ ナイロンフィルタを通して濾過し、微小同軸ネブライザ（ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）を装備したＶＧ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ＶＧＩＩ＋ＸＳ Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒへと注入した。最小で、２つの別個に調製したサンプルを、各タンパク質改変体について分析した。各サンプルを２回スキャンし、標準物質を、各サンプルスキャンの前、その間、およびその後に走らせた。ドリフトを、サンプルの注入と標準物質の注入との両方のスキャンの間の洗浄している間にモニターした。
【００５７】
上記発色団が、荷電したＩＭＡＣマトリクスからの金属のタンパク質抽出から生じるという本発明者らの仮説を調査するために、サンプルを、半定量的分析のためにＩＣＰ−ＭＳに供した。バックグラウンド金属を除去するために激しい洗浄を使用したので、この方法から得られた値は、結合した金属量より本質的に小さく見積もられるが、上記タンパク質に対して異なる金属の相対的親和性を評価するために使用され得る。さらに、上記細胞における発現の間にＰＲＬ−１に結合してしまった可能性のある内因性の金属リガンドを同定するために、ＩＣＰ−ＭＳを使用して、周期表中の最初の２列の遷移金属、および他の一般的に生物学的に関連する金属の存在を探した。顕著なことには、上記データは、Ｚｎおよび特定の金属（例えば、Ｎｉ）にのみ結合したＰＲＬ−１が、精製の間に上記ＩＭＡＣカラムで使用されたことを示した。１６時間にわたって７０℃において硝酸中で消化した、平均して５００μＭ Ｎｉ精製タンパク質サンプルは、約１８０μＭ Ｎｉを含むと決定され、これは、１：２．７＋／−０．７のＮｉ 対 タンパク質化学量論を生じた。Ｚｎはまた、約６０μＭにおいて上記Ｎｉ精製サンプル中で検出された。別個に、Ｚｎ−ＩＭＡＣを使用するＰＲＬ−１の精製は、Ｚｎが、２７０μＭにおいて多い量で存在する唯一の金属であり［１ Ｚｎ：１．８ タンパク質］、これらタンパク質サンプルが、Ｎｉのわずかなバックグラウンドレベルを含むことを示した。Ｎｉ精製ＰＲＬ−１およびＺｎ精製ＰＲＬ−１の両方のＩＣＰ−ＭＳは、顕著な量で他の金属を示さず、このことは、亜鉛が、インビボで配位され、上記ニッケルのクロマトグラフィー精製の間に、Ｎｉ２＋によって部分的に置換されたことを示唆する。ＩＣＰ−ＭＳ分析は、Ａｒ流中で行われ、Ａｒの最も量の多い同位体がＣａと同じ質量を有するので、Ｃａ結合は、一次質量シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｓｓ ｓｉｇｎａｌ）からは決定できない。にも関わらず、遙かに多い量のＣａが、Ｚｎと比較すると細胞培養培地中に存在し、それでもなお上記ＩＣＰ−ＭＳシグナルが、主に亜鉛に対応するので、上記タンパク質は、カルシウムに結合しないようである。上記ＩＣＰ−ＭＳデータは、ＰＲＬ−１がＮｉ−ＩＭＡＣを使用して精製される場合、Ｚｎが評価できる程度の量で存在することを示す。このことは、Ｚｎ結合が細胞において存在することを示唆する。
【００５８】
（実施例４）
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、上記ＰＲＬ−１タンパク質の濃度を測定するために使用した。簡潔には、精製ＰＲＬ−１アナログの濃度を、２８０ｎｍにおいて測定し、１９４２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して計算した。高い２００ｎｍ領域での考えられる金属−タンパク質吸収干渉が原因で、上記ＵＶ−Ｖｉｓ定量法の有効性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって確認した。１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、および１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＲＬ−１アナログのスペクトルを、８００〜２００ｎｍまで、Ｃａｒｙ １００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で集めた。上記分析における散乱効果を較正するために、ＰＲＬ−１−ＷＴスペクトルを、上記ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓスペクトルを差し引くことによって調整した。なぜなら、上記ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓスペクトルは、金属を結合しないからである。得られたスペクトルを分解し、ピーク位置を、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ ７．００ソフトウェアを使用して評価した。３つの方法は、金属置換を目的とした。第１において、ＰＲＬ−１−ＷＴ（例えば、野生型）サンプルを、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を使用して還元し、イミダゾールを、１０ｍＭの濃度になるように添加した。０．５ｍＭ タンパク質サンプルに対して、これは、ＢＭＥの４００倍溶液過剰に対応して、上記２つのＣ末端システインチオールと競合し、イミダゾールの２００倍溶液過剰に対応して、単一のＣ末端ヒスチジンイミダゾール側鎖と競合する。新たなベースラインをとり、スペクトルを再計算した。第２の方法において、ベースラインを、１００μＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液について再計算し、１００μＭ ＥＤＴＡ中で１０００万倍交換した上記ＰＲＬ−１−ＷＴサンプルに対するスペクトルを、記録した。最後に、１０ｍｇ／ｍＬ タンパク質サンプルを、５．６Ｍ グアニジウム塩酸塩中で変性させ、９０℃へと加熱し、新たなベースラインをとり、そのスペクトルを、０時間、２時間、４時間、および６時間で集めた。
【００５９】
よって、ＰＲＬ−１による金属配位の特徴を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法で決定した。ＰＲＬ−１およびその変異体が使用した上記金属配位幾何的配置を、８００〜２００ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法を使用して分析した。ＰＲＬ−１の吸収スペクトルは、２８０ｎｍおよび２２０ｎｍにおいてピークを生成した。このことは、上記タンパク質内の芳香族およびペプチド結合から生じ、上記Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定される濃度とよく一致する。金属含有化合物は、可視範囲においていくつかの波長でしばしば吸収し、上記Ｎｉ精製およびＣｕ精製のＰＲＬ−１タンパク質はまた、可視範囲においてピークを表し、これは、上記サンプルのさび色に対応する。ＰＲＬ−１ ＷＴは、３１８ｎｍにおいて最大（非常に大きな２８０バンドのショルダーとして明らか）、４２１ｎｍにおいてより広いシグナル、および５２６ｎｍにおいて非常に広いピークを示す（図６Ａ）。Ｃｕ精製ＰＲＬ−１は、Ｎｉ精製ＰＲｌ−１と同様のスペクトルプロフィールを生じる（データは示さず）；しかし、小さい青色のシフトは、上記個々のスペクトルピークに対して観察され、このことは、ＣｕをＮｉの代わりに使用した場合に予測される。予測されるように、Ｚｎを充填した樹脂を使用して上記タンパク質を精製した場合には、吸収も目に見える色も認められなかった。このことは、Ｚｎ（ＩＩ）が完結したｄ殻を有し、よって、可視スペクトルにおいて電子移動を示すはずがないという事実に起因する。
【００６０】
上記ＷＴタンパク質と比較して、上記Ｈ１６６Ａ改変体は、同じ吸収プロフィールを示したが、上記ピークは、上記ＩＣＰ−ＭＳ結果と一致して、ある程度強度が低下した。ＰＲＬ−１−ＷＴおよびＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａのスペクトルは、可視領域において上記システイン変異体のものとは異なる。等しい濃度において、システイン１７０および／もしくはシステイン１７１におけるセリンでの個々の置換は、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍでのシグナルの完全な損失を示す。これら変異タンパク質を、１０ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍＭ）と同程度の濃度において試験したところ、特異的吸収バンドは検出されなかった。上記ＷＴからのシグナルは、０．１ｍｇ／ｍＬにおいて明らかであり、このことは、Ｎｉの結合が、各変異によって、少なくとも１００倍低下することを示す。
【００６１】
較正したＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのデコンボルーションを、３００ｎｍ〜７００ｎｍの間で行った。すると、３１８ｎｍピークが、それぞれ、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおいて、全ての複合ピーク吸収に対して５４％、３８％および７％寄与する３つの別個の吸収バンドから構成されることが明らかになる（図６Ｂ）。上記ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａの吸収プロフィールは、上記野生型タンパク質スペクトルと非常に似ている。残基１６６における上記イミダゾール基の非存在は、吸収極大をシフトもせず、３１８ｎｍ吸収の成分バンドに顕著に寄与もしない。このことは、上記ＮＧＨモチーフ内のヒスチジンに由来するイミダゾールが、Ｎｉを直接配位しないことをさらに示す。
【００６２】
ＰＲＬ−１におけるＮｉ結合は、ＰＲＬ−１の活性部位におけるジスルフィド結合の還元によって影響を受けない。２０ｍＭ ＢＭＥの添加は、上記スペクトル吸収プロフィールのＵＶもしくは可視領域を変化させず、このことは、金属結合が、上記タンパク質の還元および上記還元剤の存在によって大きく影響を受けないことを示す。上記還元型スペクトルを、上記酸化型から差し引くと、上記還元型ＷＴサンプルと、上記酸化型ＷＴサンプルとの間には、金属配位に有意差がないことが確認される。Ｈｉｓからの小さな貢献がなされるか否かを調べるために、さらなるイミダゾールを、上記溶液に添加して、一時的な会合のシグナル強度を増大させた。１０ｍＭ イミダゾールの添加は、上記吸収プロフィールに対して影響がなかった。このことは、上記Ｎｉへの接近が制限されていることを示唆する。さらに、上記Ｎｉ精製サンプルが、イミダゾールの存在下で還元された場合に、スペクトル変化は認められなかった。Ｎｉ精製ＷＴサンプルの、１００μＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液への１０００万倍の交換は、上記スペクトルに対してほとんど影響がなく、このサンプルに対する吸光度値は、上記ＷＴ吸光度の誤差範囲内であった。７．４から８．５へとｐＨを上げると、モル吸収係数（ε）を約６倍増大させるはずであるが、興味深いことには、ｐＨが上昇した場合に、εの変化は認められなかった。このことは、上記結合したＮｉが、ＰＲＬ−１に接近できない溶媒であることを示唆し得る。しかし、６．５へと上記ｐＨを下げると、目に見えるピークの強度は低下する（データは示さず）。
【００６３】
Ｎｉ結合は、ｐＨ７．４において不可逆性になるようである。なぜなら、Ｎｉ精製ＰＲＬ−１に由来するＮｉの移動が、攻撃的な手段を要するからである。Ｎｉ精製ＰＲＬ−１を、５．６Ｍ グアニジウム塩酸塩で９０℃において処理した場合に、３１８ｎｍ、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおける上記ピークは、６時間かけて徐々に消失するに過ぎない（データは示さず）。７５０ｎｍにおけるシグナルの付随した出現は、６時間かけて観察された。このことは、Ｎｉが、上記タンパク質から放出され、八面体の幾何的配置において水によって配意されたことを示す。図６Ａは、Ｎｉ２＋イオンの存在下で精製したＰＲＬ−１改変体の電子吸収スペクトルを示す。各タンパク質改変体に対する３つのスペクトルを、８００〜２００ｎｍで記録し、平均した。全ての改変体についてのタンパク質濃度は、Ａ２８０比較に基づいて、５ｍｇ／ｍＬから１０％以内までである。７００〜３００ｎｍのスペクトルが示される。目に見える特徴は、３１８ｎｍおよび４２１ｎｍにおける吸収極大である。図６Ａにおいて、曲線は、以下のとおりである：ＰＲＬ−１−ＷＴ、黒色；ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａ、赤色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓ、橙色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ、緑色；ＰＲＬ−１−Ｃ１７１Ｓ、青色。
【００６４】
図６Ｂは、ＰＲＬ−１ ＷＴの分解したスペクトルを示す。３００〜７００ｎｍの間でのＮｉ精製ＰＲＬ−１ ＷＴタンパク質の上記ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分解は、５つの曲線を使用した上記データと適合する。上記３１８ｎｍのショルダーは、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおけるピークに分解される。上記分解された吸収ピークの和（灰色破線）および生データ（黒色実線）が、両方示される。４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおけるピークも、存在する。
【００６５】
図６Ｂの挿入図は、６００〜４００ｎｍのスペクトルを示し、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍにおける吸収極大の可視化のために拡大スケールで示される。
【００６６】
（実施例５）
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して、上記サンプルを分析した。簡潔には、ＥＳＩスペクトルを、ＭＳモードで操作したＱ−Ｔｏｆ−２（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ ＵＫ） Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで獲得し、感度について８０００分解（ＦＷＨＨ）に離調した（ｄｅ−ｔｕｎｅｄ）フライトアナライザーの時間とともにデータを獲得した。全タンパク質ＥＳＩスペクトルについては、精製タンパク質サンプルを、未処理（「酸化」）２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中で１μｇ／μＬに希釈し、室温でインキュベートした。精製後１日目、４日目、および７日目の時点で採取し、使用する準備が出来るまで−８０℃で凍結した。サンプルを、短い（３ｃｍ×１ｍｍ内径）逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣカラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ１，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）で脱塩した。サンプルを、タンパク質（５μｇ）を含む１％ ギ酸溶液から上記カラムに載せ、同じ溶液中で洗浄し、９０％ ＭｅＯＨ／０．５％ ギ酸で、上記ＥＳＩ源へと直接溶出した。コーン電圧（ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）は、６０ｅＶであり、衝突セル上の電圧は、２０Ｖであった。８００〜３０００ｕの質量範囲にわたってスペクトルを獲得し、１サイクルあたり５秒にわたってデータを蓄積した。
【００６７】
トリプシン消化のために、ＰＲＬ−１−ＷＴ、ＰＲＬ−１−Ｈ１６６ＡおよびＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓを、２０ｍＭ β−メルカプトエタノールありまたはなしの炭酸水素アンモニウム中（ｐＨ８．２）で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１：５０比のプロテアーゼ：タンパク質（ｗ／ｗ）で添加し、３７℃において１６時間にわたってインキュベートした。完全な消化を確認するために、種々の時点でのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、銀染色で可視化した。ＭＳ分析と組み合わせて、キャピラリーＨＰＬＣ分離を、１０μＬ／分での勾配を発生させるクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ ｃａｐＬＣ ＸＬ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）とともに、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって充填されたＺｏｒｂａｘ ＳＢＣ１８ ＲＰカラム（５ｃｍ×０．３２ｍｍ内径，３．５μｍ ビーズサイズ、３００Å ポアサイズ）を使用して行った。２０％から８０％ Ｂへの直線勾配を、１２０分かけて適用した。溶媒は、以下であった：Ａ ９９％ Ｈ２Ｏ、１％ ＭｅＯＨ、Ｂ ９９％ ＭｅＯＨ、１％ Ｈ２Ｏ（ともに０．０８％ ギ酸）。アルゴンを、上記ビームを約２０％まで減衰させる圧力で、上記衝突セルに入れた。このことは、供給調節器での１６ｐｓｉに、または衝突セル付近にあるペニングゲージでの５．３×１０−５ｍＢａｒに対応する。上記衝突セルを、最大移動のために８Ｖで操作し、スペクトルを、２５０〜２０００ｕの範囲にわたって獲得し、１サイクルあたり８秒間のデータを蓄積した。
【００６８】
ＮＭＲ実験を行って、上記サンプルを分析した。簡潔には、２Ｄ １Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを、パルスフィールド勾配を備えた低温の三重共鳴（ｔｒｉｐｌｅ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）プローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ８００ ＭＨｚ ＮＭＲ分光器で獲得した。水抑制を、フリップ−バック（ｆｌｉｐ−ｂａｃｋ）パルスを使用して達成した。全てのスペクトルを、３７℃において得、１Ｈにおいて２０４８ポイントでの１６回のスキャンで獲得した。２５６増分もしくは１２８増分を、それぞれ、ＷＴおよびＣ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓの１５Ｎにおいて集めた。サンプルを、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中に調製し、５％ Ｄ２Ｏを含めた。ＷＴ ＰＲＬ−１およびＰＲＬ−１−Ｃ１７０Ｓ−Ｃ１７１Ｓの濃度は、それぞれ、１．０ｍＭおよび０．８ｍＭであった。サンプル還元を、スペクトル獲得の前に、１０ｍＭ ＤＴＴを少なくとも２４時間添加することによって達成した。１Ｈ化学シフトを、Ｄ２Ｏ中の外部ＤＳＳ標準に関して参照した（２９）。１Ｈに対する間接的な参照は、１３Ｃおよび１５Ｎに対して決定し、このことから、比１３Ｃ／１Ｈ＝０．２５１４４９５３０および１５Ｎ／１Ｈ＝０．１０１３２９１１８を想定した。コンピュータープログラムｎｍｒＰｉｐｅおよびＳｐａｒｋｙを、データ処理およびスペクトル分析のために使用した。
【００６９】
（実施例６）
上記ＭＡＰタグモチーフが金属結合を完全に担うことを確認するために、本発明者らは、ＮＣＣを合成した。上記ＮＣＣペプチドを合成し、精製し、上記ペプチドを、金属充填ＩＭＡＣ樹脂とともにインキュベートした。錯体形成を、陰イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して確認した（図３）。
【００７０】
上記ＮＣＣペプチドにおいて、吸収シグナルは、ＰＲＬ−１中に埋まった上記ペプチド−金属錯体について観察したことを模倣するが、上記錯体は、上記トリペプチドの中により露出している。上記可視範囲における吸収は、そのｐＨが６から７．４へと上昇する場合に強くなる。酸性化は、そのシグナル強度を減少させ、より塩基性のｐＨに戻った場合に、完全なシグナルが戻ることはない。このことは、上記平面四角形の幾何的配置からいくつかの金属の不可逆的な損失が起こり得ることを示す。上記ｐＨを１０へと上昇させると、第５の配位子である、おそらく水もしくはヒドロキシドが、配位し、四角錐配置を生じることが示唆される。ｐＨ７．４において、この配位子は、おそらく高度に交換可能であり、吸収分光法によって検出するにはあまりに一過性過ぎる。上記交換可能な配位子は、上記バルク溶媒の常磁性緩和への達成方法を提供し、ＭＲＩによって検出され得る（図４）。さらに、上記金属塩を、上記ペプチドを含む水溶液へと混合することによって、上記金属を添加した。条件に依存して、上記ペプチドの吸収スペクトルは、金属移動を介して形成された上記錯体に類似であったか、または全長タンパク質について得られたものとは全く異なっていたかのいずれかであった。上記異なるスペクトルは、上記金属が、この場合、硫黄によってのみ配位されている可能性があることを明らかにする。上記ＮＣＣペプチドは、金属結合を付与するに十分であるが、生成される錯体のタイプは、上記金属が上記ペプチドに導入される方法に依存する。金属交換反応は、上記金属を、上記ＮＣＣトリペプチドに組み込んで、極めて高親和性の平面四角形の錯体を生成するための効率的な方法を提供する。
【００７１】
ＮＧＨのＧＧＨ様金属錯体は、図１の構造１に示される。本発明者らは、上記金属結合ＮＣＣ錯体について２つの考えられる化学的構造を想定した。これらを、図１の構造２および構造３に示す。構造２は、いくつかの脱プロトン化骨格Ｎ原子によって上記金属の配位を伴うＧＧＨ様配置に対応する。この場合、Ｈｉｓに由来するイミダゾリウム窒素は、ＮＣＣにおいて、配位した錯体における３位でＣｙｓ由来の硫黄と交換される。この錯体は、３Ｎ：１Ｓ配位を有し、このことは、本発明者らの吸収スペクトルとは一致しない。上記ＮＣＣによる独特の特異的配位を確認するために、ＮＧＣも合成し、金属結合における中心的Ｃｙｓ側鎖の重要性を確認した。上記ＩＭＡＣ樹脂とともにインキュベートした上記ＮＧＣペプチドは、上記金属結合したＮＣＣもしくはＰＲＬ−１スペクトルと似た吸収スペクトルを生じない。よって、本発明者らは、ＧＧＨ様配位が利用されず、上記特定の幾何的配置において金属を結合するために遙かに低い親和性を有するはずであると結論づけた。
【００７２】
構造３は、上記ペプチド単独、およびより大きなタンパク質の状況にある上記ペプチドの両方について得られたデータと完全に一致している。両方についての上記吸収スペクトルは、２つに硫黄原子が、２つの窒素原子とともに上記錯体に関与していることを示し、上記窒素原子のうちの一方は脱プロトン化され、他方は、１つのプロトンが結合されている。構造３は、Ｎ末端アミン基を伴わなくてもよく、このアミン基は、上記ペプチドおよびタンパク質のスペクトルに差異を引き起こすようである。なぜならこの原子は、上記タンパク質中のペプチド結合に埋め込まれているからである。一部はこの構造に基づいて、Ｑ、Ｈ、Ｋ、もしくはＲに由来する窒素は、上記モチーフの１位におけるＮの代わりに使用され得る。
【００７３】
上記金属結合部位および配位の幾何的配置を研究した。ＰＲＬ−１が二価金属カチオンに結合するという知見は、興味深い。なぜなら、他のＰＴＰａｓｅによる特異的金属配位は報告されていなかったからである。ＰＲＬ−１のＣ末端配列は、この酵素ファミリーの中でも独特であり、ＧＧＨ様モチーフ（特定の場合においては、金属に結合し得るが、この場合では、結合しない）および上記新規なＭＡＰタグモチーフの両方をコードする。上記ＧＧＨ様モチーフの幾何的配置は、平面四角形である。濃縮したＰＲＬ−１サンプルで認められた徴的なさび色は、上記ＧＧＨペプチドの色と類似する。このことは、Ｎｉ配位が、平面四角形の幾何的配置において起こることを示唆する。本発明者らの研究から、ＮｉがＰＲＬ−１のＣ末端において結合されることがさらに明らかになっている。金属配位は、ＰＲＬ−１中の上記ＧＧＨ様モチーフによって達成されない。なぜなら、上記おそらく必須のＨｉｓの変異は、結合に対してほとんど影響を有さないからである。両方のトリペプチドが平面四角形の配位を使用して結合するという事実にも拘わらず、各々についての化学現象は異なる。
【００７４】
Ｎｉ精製ＷＴ ＰＲＬ−１から得られたＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、３１８ｎｍ、４２１ｎｍおよび５２６ｎｍ付近にバンドを示す。平面四角形の幾何的配置において窒素配位子を介してＮｉを結合したペプチドおよび有機分子については、４２０ｎｍ付近の特徴的なｄ−ｄバンドが、文献中で頻繁に報告されている。Ｍａｒｏｎｅｙらは、最初から計算を行い、平面四角形の幾何的配置を使用して、Ｎｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を配位する合成ペプチド模倣物のスペクトル割り当てを行った。１つのバンドを除いて、彼らの観察および計算は、ＰＲＬ−１から観察されたスペクトルと非常に近く一致している。別個に、ＮｉＳＯＤの還元した平面四角形形態を、密度汎関数理論を使用して分析した。その結果は、類似の関連する特徴を示す。これらシステムにおける上記バンドの位置およびそれらの相対強度の傾向は、上記ＰＲＬ−１タンパク質スペクトルにおいて十分に保存されている。これらおよび他の研究に基づいて、５２６ｎｍバンドは、Ｎｉｘｙ−−＞Ｎｉｘ２−ｙ２転移から生じるようである。同様に、上記４２１ｎｍバンドは、Ｎｉｚ２−−＞Ｎｉｘ２−ｙ２転移からくる可能性がある。強い上記３１８ｎｍバンドは、上記配位子−金属電荷転移バンド（ＬＭＣＴ）を反映する。上記スペクトルの分解から、この吸収が、３０６ｎｍ、３２５ｎｍ、および３７２ｎｍにおける３つのバンドが複合しているようであることが明らかにされている。他のガイドとしての構造を使用して、３０６ｎｍにおける最も鋭く最も強いバンドが、硫黄原子からの転移に対応し、他の２つのバンドは、窒素供与またはおそらくより弱い硫黄供与から生じる可能性がある。
【００７５】
一連のＣ末端変異体の中で、Ｃ１７０およびＣ１７１を含む変異のみが、これら波長でのシグナルを破壊した。最も顕著なことには、上記ＬＭＣＴに対応する３１８ｎｍエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）は、上記システイン変異スペクトル中に不足している。全体の吸収プロフィールに関して、上記システイン変異体の低い３００ｎｍ領域における上記小さな非常に広い吸収は、より低い波長における高強度のバンド、または散乱効果からの人工産物であるようである。なぜなら、それは、上記３１８ｎｍの成分バンドのうちの１つであると不正確に位置づけられているからである。Ｎｉ ｄ軌道（４２１ｎｍ、５２６ｎｍ）内の転移に特徴があり得るバンドはまた、硫黄が酸素によって置換される場合には存在しない。元のバンドは存在せず、さらなるバンドは、Ｃ１７０もしくはＣ１７１のいずれかの変異の際に吸収スペクトル中に現れる。また、これら残基に関わるジスルフィド結合は、上記ＭＳデータにおいて観察されない。よって、両方のシステインが、金属配位に直接関与するようである。本発明者らのＩＣＰ−ＭＳデータは、Ｃ１７０およびＣ１７１に由来する両方の硫黄原子が、堅いＮｉ結合に必要とされることをさらに示す。なぜなら、いずれの硫黄原子も、単独では十分ではないようであるからである。
【００７６】
ＰＲＬ−１によって生成されるスペクトル特徴はまた、Ｎｉが、残っている２つの位置における窒素原子によって配位されることを示唆する。頻繁には、Ｈｉｓに由来するイミダゾリウムのＮもしくは骨格アミドのＮは、金属（例えば、Ｚｎ、ＣｕおよびＮｉ）を配位することが観察される。平面四角形の幾何的配置を使用して、Ｎｉを結合するモデルペプチドおよびタンパク質において、上記繋がる窒素基のうちのいくつかは、脱プロトン化され、負に荷電した種が、上記金属を結合する。上記５２６ｎｍにおける吸収バンドは、ＰＲＬ−１が、脱プロトン化窒素を介してＮｉを配位することを示すのに対して、上記ＰＲＬ−１スペクトルにおいて生じた４２１ｎｍ吸収は、単独でプロトン化された窒素による配位を反映する。ＰＲＬ−１−Ｈ１６６Ａを作製するための上記ＧＧＨ様モチーフにおけるＨｉｓの変異は、このヒスチジンの側鎖が、Ｎｉ結合に実質的に影響を及ぼさないことを明らかにした。ＰＲＬ−１は、Ｈ１６６に加えて、３つの他のＨｉｓをコードする。Ｈ２３、Ｈ６４およびＨ１０３は、上記配列の異なる領域に位置し、変性条件下で堅く結合したままである可能性は低い。上記金属を放出するために上記タンパク質を解こうとする試みは、高温で数時間にわたる高濃度の変性剤での激しい処理を必要とした。化学的変性および熱変性は、Ｎｉのゆっくりとした放出のみを可能にし、ＣＤデータは、Ｎｉが放出される十分前にＰＲＬ−１が完全に解かれることを示すので、上記金属は、上記タンパク質の短いセグメントにおいてクラスター形成した原子によって配位されるようである。
【００７７】
上記ＧＧＨタイプペプチドは、極めて堅い結合（Ｋｄ 約１０−１７〜１０−１８）を達成する。このことは、上記モチーフ内の脱プロトン化骨格アミド窒素によって一部達成される。ＰＲＬ−１について観察される極めて堅い結合および窒素原子からＮｉ連結への推定される寄与に鑑みれば、ＰＲＬ−１に由来する骨格アミドは、金属配位に関与し得る。いずれかのシステインの非存在が、結合を破壊し、短縮が両方の側鎖および骨格アミドを除去するので、金属交換反応が、変異誘発を使用して、Ｃ１７０およびＣ１７１に隣り合うアミド窒素に関わるという仮説を試験することは、可能でない。構造研究は、さらなる配位原子を同定する最もよい方法であり、これら研究は、本発明者らの実験室で進行中である。
【００７８】
（実施例７）
生理学的ｐＨにおけるＣｕ−ＮＣＣを、生理食塩水バッグによって囲まれたチューブの中に入れ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒにあるＨｏｇｌｕｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにおいて、標準的ＭＲＩを使用して画像化した（図４）。図４において、中心にある明るいシグナルは、上記Ｃｕ−ＮＣＣ錯体に対応するのに対して、あまり明るくないシグナルは、上記生理食塩水溶液に対応する。黒色は、上記チューブおよび空気に対応する。
【００７９】
従って、本発明は、言及した目的および利点、ならびにそこに固有のものを得るために十分に適合される。本発明は、その趣旨もしくは本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具現化され得る。記載される実施形態は、単なる例示として全ての観点において考慮されるべきであり、限定として考慮されるべきではない。本発明の範囲は、従って、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に入る全ての変更は、特許請求の範囲の範囲内に包含されるべきである。本明細書で記載される全ての参考文献は、具体的参照によって本明細書に参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公開番号】特開２０１３−１０７９０１（Ｐ２０１３−１０７９０１Ａ）
【公開日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１３−３７０２７（Ｐ２０１３−３７０２７）
【出願日】平成２５年２月２７日（２０１３．２．２７）
【分割の表示】特願２０１１−５０９６６０（Ｐ２０１１−５０９６６０）の分割
【原出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０８１７６４４１）ユニバーシティ・オブ・カンザス (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−３７０２７（Ｐ２０１３−３７０２７）
【出願日】平成２５年２月２７日（２０１３．２．２７）
【分割の表示】特願２０１１−５０９６６０（Ｐ２０１１−５０９６６０）の分割
【原出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０８１７６４４１）ユニバーシティ・オブ・カンザス (9)
【Ｆターム（参考）】
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