間葉系幹細胞の分化誘導方法
【課題】間葉系幹細胞の分化誘導に関する新たな技術の提供。
【解決手段】ヒト間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）の分化誘導の方法であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法。末端にＤ−グルコースが結合した世代数の異なるデントリマーで修飾された平面培養面を備える市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル）を使用。
【解決手段】ヒト間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）の分化誘導の方法であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法。末端にＤ−グルコースが結合した世代数の異なるデントリマーで修飾された平面培養面を備える市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル）を使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の再生医療研究の大きな流れの１つは、未分化な幹細胞を人為的に分化誘導し、目的とする組織や臓器を体外又は体内で再構築させようとすることである。そのなかでも間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells: MSCs）は、その多様な分化能から、再生医療へ応用できる有力な細胞供給源として期待されている。その一方で、間葉系幹細胞を目的の分化状態へ分化誘導する方法は現在研究開発段階にある。現在の間葉系幹細胞の分化誘導用法に関する研究の多くは、液相での可溶性因子（培地成分）による分化制御に関するものである。
【０００３】
なお、細胞を培養する容器の培養面（培養培地が接触する底面）を修飾する技術の１つに、培養面をデンドリマー化合物で修飾する技術がある。下記特許文献１及び２は、細胞のトランスポータが取り込み可能な物質（Ｄ−グルコース）を末端に有するデンドリマー化合物で修飾された培養面、及び、前記培養面により細胞の固定化を促進することを開示する。下記非特許文献１及び２は、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面で培養されたヒト上皮細胞における、焦点接着の促進、及び形態変化を報告する。下記非特許文献３は、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面で培養されたラビット関節軟骨細胞における、形態変化及び移動への影響を報告する。さらに、下記非特許文献４は、マウスのＥＳ細胞（胚性幹細胞）の未分化状態が、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面を用いた培養で維持されることを報告する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２４０６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２２４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 103 (2007) 192-199, "Response of Human Epithelial Cells to Culture Surfaces with Varied Roughness Prepared by Immobilizing Dendrimers with/without D-Glucose Display"
【非特許文献２】Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol.105 (2008) 319-326, "Glucose Transporter Mediation Responsible for Morphological Changes of Human Epithelial Cells on Glucose-Displayed Surfaces"
【非特許文献３】M. Kino-oka et al. Biomaterials 28 (2007) 1680-1688, "Morphological regulation of rabbit chondrocytes on glucose-displayed surface"
【非特許文献４】S. Mashayekhan et al. Biomaterials 29 (2008) 4236-4243, "Enrichment of undifferentiated mouse embryonic stem cells on a culture surface with a glucose-displaying dendrimer"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、間葉系幹細胞の分化誘導に関する新たな技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、間葉系幹細胞の分化を誘導方法であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む間葉系幹細胞の分化誘導方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、間葉系幹細胞の分化誘導の因子として、固相因子であるデンドリマー修飾培養面を提供できる。また、本発明よれば、間葉系幹細胞の分化誘導の固相因子としてのデンドリマー修飾培養面の使用を含む間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。さらにまた、本発明によれば、好ましくは、細胞増殖を伴う間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、コントロール面（ＰＳ面）（ａ）、世代数１のデンドリマー修飾面（Ｇ１面）（ｂ）、世代数３のデンドリマー修飾面（Ｇ３面）（ｃ）、及び世代数５のデンドリマー修飾面（Ｇ５面）（ｄ）の培養面で培養された間葉系幹細胞の、培養１日後、３日後、及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【図２】図２は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、横紋筋・平滑筋細胞の分化マーカーであるデスミンの染色（緑）と、核染色（赤）とを行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【図３】図３は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、軟骨系細胞の分化マーカーであるＩＩ型コラーゲンの染色（赤）を行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【図４】図４は、０％、５０％、及び１００％のＤ−グルコースが提示された世代数が３、４、及び５（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）のデンドリマー修飾培養面上で培養された間葉系幹細胞の、培養４日後及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【図５】図５は、間葉系幹細胞をＧ５面の培養面上で７日間培養して得られた細胞集塊を、デスミン、ＭＨＣ Fast Skeletal、ｃＴｎＴ及びＩＩ型コラーゲンのそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro-3，青）した顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図６】図６は、本発明にかかるデンドリマー修飾面の培養面を使用せずに作製した間葉系幹細胞の細胞集塊を、デスミン、ＭＨＣ Fast Skeletal、ｃＴｎＴ、ＩＩ型コラーゲン及びＣＤ１０５のそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro-3，青）した顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図７】図７は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、デスミン、ｃＴｎＴ及びミオシン重鎖のそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro，青）を行った顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図８】図８は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を培養した場合の、培養時間と細胞密度との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、ＰＳ面又はＧ５面で７日間培養した後、細胞をトリプシン処理してＰＳ面上で再培養して５日目の細胞を顕微鏡観察した写真の一例を示す。
【図１０】図１０は、ＰＳ面又はＧ５面で７日間培養した後、細胞をトリプシン処理してＰＳ面上で再培養して５日目の細胞の、デスミン、ｃＴｎＴ、ＭＨＣ Fast Skeletal及びα-平滑筋アクチンのそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro，青）後の顕微鏡観察写真の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、デンドリマー化合物で修飾された培養面で間葉系幹細胞を培養すると、汎用される平面培養面での培養では分化を誘導しない培養条件、例えば、分化誘導のための培地成分又は分化誘導培地を添加若しくは使用しない培養条件であっても、間葉系幹細胞の分化を誘導できるという知見に基づく。本発明は、好ましくは、さらに、前記の間葉系幹細胞の分化誘導が細胞増殖を伴いながら行うことができるという知見に基づく。
【００１１】
すなわち、本発明は下記を含む；
［１］間葉系幹細胞の分化を誘導方法（以下、「本発明の分化誘導方法」ともいう。）であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［２］前記分化が横紋筋・平滑筋系の細胞への分化であり、前記デンドリマー化合物の世代数が１以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［３］前記分化が軟骨系の細胞への分化であり、前記デンドリマー化合物の世代数が４以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［４］前記分化が、心筋系細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
［５］前記細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、［１］から［４］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［６］前記デンドリマー化合物は、カチオン性基を有する構成単位を含む、［１］から［５］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［７］前記細胞のトランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、［５］又は［６］に記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［８］間葉系幹細胞を［１］から［７］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法；
［９］前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、［８］記載の細胞の製造方法；
［１０］［８］又は［９］記載の細胞の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞；
［１１］間葉系幹細胞を［１］から［６］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料の製造方法；
［１２］前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、［１１］記載の生体材料の製造方法；［１３］［１１］又は［１２］記載の生体材料の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料；
［１４］間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、［１］から［７］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法が記載された取扱説明書を含む、間葉系幹細胞の分化誘導キット；
［１５］デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来の丸い形態をした細胞集塊を製造する方法；
［１６］前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、［１５］記載の製造方法；
［１７］間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、［１５］又は［１６］に記載の製造方法；
［１８］前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、［１７］記載の製造方法。
【００１２】
［間葉系幹細胞］
本明細書において、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）とは、好ましくは、多種類の間葉系組織を構成する細胞に分化し得る体性幹細胞をいう。間葉系幹細胞としては、ヒトへの臨床応用の点から、哺乳類の間葉系幹細胞が好ましく、霊長類の間葉系幹細胞がより好ましく、ヒトの間葉系幹細胞がさらに好ましい。また、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、筋肉等に存在しうるが、本発明における間葉系幹細胞としては、特に制限されず、骨髄、脂肪、筋肉のいずれの組織から得られた間葉系幹細胞であってもよい。したがって、本明細書において間葉系幹細胞を使用することは、間葉系幹細胞を含む細胞集団を使用することを含んでもよい。また、本発明における間葉系幹細胞は、市販のものや細胞バンクから得られるものであってもよい。
【００１３】
本発明における間葉系幹細胞は、継代培養されたものであってもよい。継代回数は特に制限されないが、分化能の維持という観点から、１〜５０回が好ましく、１〜３０回がより好ましく、１〜１０回がさらに好ましい。本発明における間葉系幹細胞は、軟骨系の細胞及び横紋筋・平滑筋系の細胞への分化能を有することが好ましい。
【００１４】
本発明における間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞のマーカーが陽性であることが好ましい。間葉系幹細胞のマーカーとしては公知のマーカーを使用できる。ヒト間葉系幹細胞の場合、例えば、ＣＤ１０５、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１０６、及びＣＤ２７１の少なくとも１つの細胞表面マーカーが陽性であることが好ましい。
【００１５】
［間葉系幹細胞の分化誘導］
本明細書において、間葉系幹細胞の分化誘導とは、間葉系幹細胞を未分化状態から分化を開始させることを含み、好ましくは、未分化状態から未分化状態では検出されない間葉系組織特異的な分化マーカーが検出され得る状態とすることを含む。当業者であれば、間葉系組織特異的な分化マーカー及びその検出方法を適宜選択し、該分化マーカーが検出されるか否かを判断することができる。
【００１６】
間葉系組織特異的な分化マーカーとしては、細胞膜に存在する糖、タンパク質などを含む細胞表面マーカー；細胞内に存在するｍＲＮＡ、タンパク質、酵素などを含む細胞内マーカー；細胞外に分泌されるペプチド、タンパク質、酵素、化合物などを含む細胞外マーカー；などが挙げられる。分化マーカーの検出方法としては、特に制限されず、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。
【００１７】
間葉系組織特異的な分化マーカーの検出法としては、以下の方法が挙げられる。軟骨系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＩＩ型コラーゲン染色法が挙げられる。脂肪細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、オイルレッドＯ染色法が挙げられる。骨系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＡＬＰ染色法が挙げられ、横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、デスミン染色法が挙げられる。心筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ｃＴｎＴ（cardiac troponic T）染色法が挙げられる。骨格筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ミオシン重鎖染色法が挙げられる。血管系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＣＤ３１染色法が挙げられる。但し、分化マーカーの検出方法は、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において、「軟骨系細胞」とは、軟骨細胞、軟骨芽細胞、及び軟骨細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、軟骨細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはＩＩ型コラーゲン染色法で染色され得る細胞を含む。また、本明細書において、「横紋筋・平滑筋系細胞」とは、筋芽細胞、横紋筋及び又は平滑筋の筋細胞、筋芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、筋芽細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはデスミン染色法で染色され得る細胞を含む。本明細書において、「心筋系細胞」とは、心筋細胞、心筋芽細胞、心筋組織を構成し得る細胞、心筋細胞又は心筋芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、心筋細胞又は心筋芽細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはｃＴｎＴ染色法で染色され得る細胞を含む。本明細書において、「骨系細胞」とは、骨芽細胞、骨細胞、及び骨芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含む。
【００１９】
本明細書において、「分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞」とは、未分化の間葉系幹細胞よりも特定の間葉系組織の細胞に特異的な性質を示すように変化した細胞をいい、好ましくは、未分化の間葉系幹細胞では発現していない或いは検出されない分化マーカーを発現している或いは検出され得る細胞をいう。
【００２０】
［デンドリマー化合物］
本明細書において、デンドリマー化合物は、培養面の修飾に用いられる。デンドリマー化合物の修飾により、平面な培養面にナノメートルオーダーの凹凸が形成されうる。デンドリマー化合物としては、特に制限されず、上述のように、培養面にナノメートルオーダーの凹凸を形成できるものを使用でき、例えば、公知のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーや、特開２００５−１９２４０６号公報に開示される下記式（I）又は（II）で表わされるポリイミノアミンデンドリマーなどが挙げられる。また、細胞の培養面への固定化を促進する点からは、本発明に用いるデンドリマー化合物は、デンドリマー化合物の枝状部分を構成する分子（デンドロン）がカチオン性であることが好ましく、特に末端基がアミノ基であることがより好ましい。
【００２１】
【化１】
【００２２】
上記式（I）及び（II）において、Ｘは培養面又は培養面に結合した結合性基を示す。また、上記式（I）において、ｎは１以上の整数である。
【００２３】
培養面を修飾するデンドリマー化合物の形成方法としては、デンドリマー化合物の枝状部分を構成する分子（デンドロン）を平面培養面に直接、或いはリンカーとなる化合物を介して結合させて形成する方法（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ法）が挙げられる。具体的には上記非特許文献１（Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 103 (2007) 192-199）に開示される方法が挙げられる。なお、本明細書においてデンドリマー化合物の世代数とは、枝状部分の分岐数をいい、例えば、上記式（I）で表わされるデンドリマー化合物においてｎ＝１のとき、世代数は２であり、以下Ｇ２と表すこともある。また、上記式（II）で表されるデンドリマー化合物の世代数は１であり、Ｇ１と表すこともある。デンドリマー化合物の世代数は当業者であれば目的の世代数に適宜設計でき、具体的には後述する実施例のように設計できる。
【００２４】
培養面を修飾するデンドリマー化合物の分岐方向の末端（例えば、上記式（I）及び（II）におけるアミノ基）には、必要に応じて、様々な物質を結合させてもよい。所望の物質を末端に結合することにより、該物質を培養する間葉系幹細胞に提示することができる。細胞の培養面への固定化を促進する点からは、デンドリマー化合物の末端に結合させる物質としては、細胞のトランスポータが取り込み可能な物質であることが好ましい。細胞のトランスポータが取り込み可能な物質としては、間葉系幹細胞の形態変化及び又は分化誘導を促進する点から、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましい。一方、好ましさは劣る実施形態において、取り込み可能なトランスポータが細胞に存在しない物質（例えば、Ｌ−グルコース）をデンドリマー化合物の末端に結合させてもよい。
【００２５】
［培養面］
本発明に用いる培養面は、上述したとおり、デンドリマー化合物で修飾された培養面であって、培養面にナノメートルオーダーの凹凸が形成されている培養面であることが好ましい。前記凹凸は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で測定される表面粗さ（Ｒａ）が、１〜１０ｎｍであることが好ましく、２〜７ｎｍがより好ましい。上述したとおり、間葉系幹細胞の形態変化及び又は分化誘導を促進する点から、培養面には前記の細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が提示されていることが好ましい。
【００２６】
［間葉系幹細胞の分化誘導方法］
本発明の間葉系幹細胞の分化誘導方法は、上述のようにデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で、間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。前記細胞培養容器は、修飾培養面を備える以外は通常の細胞培養で用いられるものと同様の材質、形状、大きさの細胞培養容器を使用できる。培養条件も、通常の条件、例えば４−６％ＣＯ2、好ましくは５％ＣＯ2下、例えば３５−３８℃、好ましくは３７℃という条件を採用できる。培養培地は、間葉系幹細胞を未分化状態で培養する培地又は間葉系幹細胞の増殖用の培地を使用できる。すなわち、間葉系幹細胞の分化誘導が起こらない培養条件（例えば、分化誘導のための培地や分化誘導のための培地成分を使用しない培養条件）であっても、平面培養面をデンドリマー修飾培養面とするだけで間葉系幹細胞の分化誘導が行え、好ましくは、細胞増殖を伴う分化誘導が行える。但し、本発明の分化誘導方法は、デンドリマー修飾培養面の使用に加え、分化誘導のための培地及び又は培地の使用を含んでもよい。
【００２７】
したがって、本発明によれば、間葉系幹細胞の分化誘導の因子として、固相因子であるデンドリマー修飾培養面を提供できる。そして、本発明よれば、間葉系幹細胞の分化誘導の固相因子であるデンドリマー修飾培養面の使用を含む、間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。さらに、本発明によれば、好ましくは、細胞増殖を伴う間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。なお、細胞増殖促進の観点からは、デンドリマー化合物の世代数が若いほど好ましい。
【００２８】
さらにまた、本発明によれば、後述するとおり、デンドリマー化合物の世代数を調節することにより、間葉系幹細胞に対して異なる細胞への分化の方向付けをすることができる。例えば、世代数１以上であれば、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けが可能となり、世代数４以上であれば、さらに、軟骨系細胞及び心筋系細胞へ分化の方向付けが可能となる。
【００２９】
［横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導］
したがって、本発明の一実施形態は、間葉系幹細胞の横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導方法であって、世代数が１以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、好ましくは、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、さらに好ましくは、細胞増殖を伴う、間葉系幹細胞の横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となる。デンドリマー化合物の世代数としては、好ましくは、１〜１０、１〜８、又は１〜６である。細胞が培養面の平面方向に伸びた形態の細胞集団を得る点からは、世代数は１〜３が好ましい。また、細胞が丸い形態をした細胞集塊を得る点からは、世代数は、４以上が好ましく、４〜７がさらに好ましく、４〜６がより好ましい。
【００３０】
横紋筋・平滑筋系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、横紋筋・平滑筋系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、横紋筋・平滑筋系細胞への分化は、例えば、横紋筋・平滑筋系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、デスミン）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３１】
［軟骨系細胞への分化誘導］
また、本発明のその他の実施形態は、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化誘導方法であって、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する軟骨系細胞への分化の方向付けが可能となり、さらに好ましくは、細胞増殖を伴う、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化の方向付けが可能となる。軟骨系細胞への分化を促進する点からは、前記世代数は、４〜１０又は４〜８が好ましく、４〜６がより好ましく、５がさらに好ましい。
【００３２】
軟骨系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、軟骨系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、軟骨系細胞への分化は、例えば、軟骨系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、II型コラーゲン）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３３】
［心筋系細胞への分化誘導］
また、本発明のその他の実施形態は、間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法であって、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する心筋系細胞への分化の方向付けが可能となる。心筋系細胞への分化を促進する点からは、前記世代数は、４〜１０又は４〜８が好ましく、４〜６がより好ましく、５又は６がさらに好ましい。
【００３４】
心筋系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、心筋系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、心筋系細胞への分化は、例えば、心筋系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、ｃＴｎＴ）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３５】
世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面で間葉系幹細胞を培養すると、前述のとおり、丸い形態をした細胞集塊を形成できる。後述の実施例で示すとおり、この細胞集塊の表面部（表層部）に位置する細胞は、II型コラーゲン陽性の軟骨系細胞への分化の方向付けがされた細胞となる傾向を示す。一方、該細胞集塊の表面部（表層部）以外の部分に相当する内部に位置する細胞は、心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞となる傾向を示す。なお、細胞集塊における表面部（表層部）及び内部は、後述する実施例に示すようにマーカー染色したデータを参照して判断することができる。
【００３６】
したがって、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化誘導方法にかかる一実施形態においては、さらに、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で培養することで得られた細胞集塊から該細胞集塊の表面部（表層部）に位置する細胞であって、好ましくは軟骨系細胞への分化の方向付けがされた細胞を分離することを含んでもよい。
【００３７】
同様に、間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法にかかる一実施形態においては、さらに、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で培養することで得られた細胞集塊から該細胞集塊の内部に位置する細胞であって、好ましくは心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞を分離することを含んでもよい。
【００３８】
間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法にかかるその他の実施形態においては、分離された該細胞集塊の内部に位置する細胞、好ましくは心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞を、デンドリマー修飾されていない平面培養面の細胞培養容器で培養することを含んでもよい。該細胞集塊から分離された心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、デンドリマー修飾されていない平面培養面に戻して培養してもｃＴｎＴなどの心筋系細胞に特異的な分化マーカーの陽性を維持できる。
【００３９】
前述のとおり、本発明の分化誘導方法によれば、好ましくは、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４０】
［細胞の製造方法］
したがって、本発明は、その他の態様として、本発明の分化誘導方法により間葉系幹細胞に対して分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法（以下、「本発明の細胞の製造方法」ともいう。）に関する。本発明の細胞の製造方法によれば、好ましくは、細胞増殖を伴いながら、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。また、本発明の細胞の製造方法によれば、組織工学、再生医療、再生医工学等における生体材料又は細胞供給源（細胞ソース）として使用可能な、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞を製造できる。
【００４１】
本発明の細胞の製造方法により製造され得る細胞としては、前述のとおり、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞、及び、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞が挙げられる。
【００４２】
本発明の細胞の製造方法の一実施形態として、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。また、本発明の細胞の製造方法のその他の実施形態として、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した軟骨系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。さらにまた、本発明の細胞の製造方法のその他の実施形態として、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した心筋系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。
【００４３】
本発明は、さらにその他の態様として、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料又は細胞供給源の製造方法であって、本発明の分化誘導方法により間葉系幹細胞に対して分化の方向付けを行うこと、或いは、本発明の細胞の製造方法により分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造することを含む、製造方法に関する。本発明の生体材料又は細胞供給源の製造方法によれば、好ましくは、細胞増殖を伴いながら、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料又は細胞供給源を製造できる。
【００４４】
また、前述のとおり、本発明の分化誘導方法は、従来間葉系幹細胞の分化誘導に使用される分化誘導のための培地及び又は分化誘導のための培地成分を使用しなくても行うことができるから、本発明の細胞の製造方法によれば、好ましくは、これらの分化誘導培地及び又は培地成分と未接触である（接触した経歴がない）、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞を製造でき、さらに好ましくは、細胞増殖を伴いながら、前記細胞を製造できる。
【００４５】
本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源は、好ましくは、再生医療の分野に使用され得る。例えば、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、心筋の修復に適用され、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、関節軟骨の修復に適用され、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、筋肉組織の修復に適用され得る。或いは、本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源は、好ましくは、創薬スクリーニングにおける細胞アッセイの用途にも使用され得る。但し、本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源の用途はこれらに限定されない。
【００４６】
［キット］
本発明は、さらにその他の態様として、間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、本発明の分化誘導方法を説明する記載を含む取扱説明書を含む間葉系幹細胞の分化誘導キット（以下、「本発明の分化誘導キット」ともいう。）に関する。本発明の分化誘導キットは、さらに、間葉系幹細胞を含んでもよい。なお、本発明の分化誘導キットにおける取扱説明書は、本発明の分化誘導キットに同梱されることなくウェブ上で提供される形態であってもよい。本発明の分化誘導キットにおける培養面及び細胞培養容器は、前述のものを使用できる。分化誘導の効率化の点から、前述のとおり、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。
【００４７】
本発明の分化誘導キットの一実施形態は、細胞培養容器が世代数１以上、好ましくは１〜１０、１〜８、１〜６、１〜３、又は４〜６のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有し、間葉系幹細胞に対して横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導を行うキットである。この実施形態における本発明の分化誘導キットによれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、好ましくは、横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造でき、より好ましくは、細胞増殖を伴いながら、横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４８】
本発明の分化誘導キットのその他の実施形態は、細胞培養容器が世代数４以上、好ましくは４〜１０又は４〜８、より好ましくは４〜６、さらに好ましくは５のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有し、間葉系幹細胞に対して軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化誘導を行うキットである。この実施形態における本発明の分化誘導キットによれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、好ましくは、軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造でき、より好ましくは、細胞増殖を伴いながら、軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４９】
［治療方法］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の細胞の製造方法で製造され得る細胞の使用を含む治療方法及び又は再生医療方法に関する。例えば、軟骨を欠損した対象の間葉系幹細胞を用いて本発明の細胞の製造方法により軟骨系細胞への分化が誘導された細胞を調製し、前記細胞を対象の軟骨欠損部位に移植する治療又は再生医療の方法が挙げられる。前記移植は、例えば、コラーゲンゲルスポンジなどに前記細胞を播種し、そのスポンジを欠損部に配置するなどして行うことができる。また、例えば、拡張型心筋症の対象の間葉系幹細胞を用いて本発明の細胞の製造方法により横紋筋・平滑筋系細胞又は心筋系細胞への分化が誘導された細胞を調製し、それらの細胞から筋芽細胞シート（心機能回復材）を製造する拡張型心筋症の治療又は再生医療の方法が挙げられる。すなわち、本発明の治療方法及び又は再生医療方法は、前記心機能回復材を対象の心臓の外部に被覆して心臓壁面への血管を誘導し、心筋細胞を修復し、心機能の回復を目指す、拡張型心筋症の治療又は再生医療の方法である。なお、本発明における治療方法及び又は再生医療方法はこれらに限定されない。
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５１】
末端にＤ−グルコースが結合した世代数の異なるデントリマーで修飾された培養面においてヒト間葉系幹細胞を培養した。培養面の作製方法及び細胞培養条件は、下記のとおり。
【００５２】
［培養面の準備］
デンドリマーで修飾された培養面は、平面培養面（Ｐｌａｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ）を備える出発材料として市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル、Ｎｕｎｃ社製）を使用し、下記のように作製した。また、この８ウェルプレートの平面培養面をコントロール面（以下、「ＰＳ面」ともいう。）として使用した。
【００５３】
〔世代数１（Ｇ１）のＤ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
Ｇ１のＤ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ１面）は、無菌条件下において下記４ステップで作製した。
ステップ１：出発材料である前記平面培養面上にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍｌのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液をウェルに添加し、室温で１時間静置した。その後、前記ウェルを滅菌水で３回洗浄した。
ステップ２：３６０μｍｏｌ／ｍｌのグルタルアルデヒド水溶液を前記ウェルに添加し、室温で１時間静置し、その後多量の滅菌水で洗浄した。前記ウェルに３６０μｍｏｌ／ｍｌのトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して１時間静置してデンドロン構造を形成し、滅菌水で洗浄した。
ステップ３：デンドリマー末端にＤ−グルコースを提示させるため、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を前記ウェルに添加して２時間静置した。
ステップ４：０．５μｍｏｌ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を前記ウェルに添加して２４時間静置した。前記ウェルを滅菌水で洗浄し、Ｄ−グルコースが提示されたデンドリマーで修飾された培養面を得た。
【００５４】
〔世代数３及び５（Ｇ３及びＧ５）のＤ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
Ｇ３及びＧ５のＤ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３面及びＧ５面）は、上記ステップ１の後、上記ステップ２をそれぞれ３回及び５回繰り返してデンドリマーの世代数を３及び５とし、その後、上記ステップ３及びステップ４を行うことにより作製した。
【００５５】
［使用した細胞］
ヒト間葉系幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００５６】
［使用した培地］
上記デンドリマー修飾培養面上での培養培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。また、前記間葉系幹細胞の増殖用培地としては、ヒト骨髄間葉系幹細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００５７】
［培養条件］
細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で行った。なお、細胞のウェルへの接種濃度
は、５×１０3ｃｅｌｌ／ｃｍ2とした。
【００５８】
［培細胞分化評価］
間葉系幹細胞の分化は、下記表１の分化マーカー染色法を用いて確認した。なお、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、ＰＳ面で培養したヒト間葉系幹細胞は、下記表１の分化マーカー染色に対して全てが陰性であった。
【００５９】
【表１】
【００６０】
［細胞形態変化及びその結果］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面上で上記間葉系幹細胞を上記培養条件で培養し、１、３、及び７日後の細胞の形態を顕微鏡観察した。その結果の一例を図１に示す。図１は、ＰＳ面（ａ）、Ｇ１面（ｂ）、Ｇ３面（ｃ）、及びＧ５面（ｄ）の培養面で培養された間葉系幹細胞の、培養１日後、３日後、及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【００６１】
図１に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は平面方向に伸張した形態を示す傾向があった。一方、Ｇ５面の培養面上で培養した場合、細胞の形態は丸くなり、幾つかの細胞が塊になって球状の細胞集塊が形成された。また、該細胞集塊は、培養日数とともに大きくなる傾向があった。
【００６２】
［分化の方向付けの確認：横紋筋・平滑筋系への分化］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、デスミン染色を行って、該分化マーカーの有無を確認した。その結果の一例を図２に示す。図２は、横紋筋・平滑筋系細胞及び平滑筋系細胞の分化マーカーであるデスミンの染色（緑）と核染色（赤）とを行った顕微鏡観察写真を示す図である。なお、Ｇ５面での培養結果については、平面（上面）の写真に加え、断側面の共焦点顕微鏡観察写真を示す。
【００６３】
図２に示すとおり、ＰＳ面の培養面上で培養した間葉系幹細胞ではデスミン染色陰性であったが、Ｇ１面及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞はデスミン染色陽性であった。したがって、Ｇ１面及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、横紋筋・平滑筋系の細胞への分化の方向付けがされたことがわかる。
【００６４】
また、Ｇ５面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、前述のとおり細胞集塊を形成し、デスミン染色したところ、図２に示すとおり、細胞集塊の表面に位置する細胞がデスミン染色陽性を示した。
【００６５】
［分化の方向付けの確認：軟骨系への分化］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、ＩＩ型コラーゲン染色を行って、該分化マーカーの有無を確認した。その結果の一例を図３に示す。図３は、軟骨系細胞の分化マーカーであるＩＩ型コラーゲンの染色（赤）を行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【００６６】
図３に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面で培養した間葉系幹細胞ではＩＩ型コラーゲン染色陰性であったが、Ｇ５面の培養面で培養した間葉系幹細胞はデスミン染色陽性であった。したがって、Ｇ５面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、軟骨系細胞への分化の方向付けがされたことがわかる。
【００６７】
以上、示したとおり、ＰＳ面での培養においてはヒト間葉系幹細胞の分化の誘導が起こらない培養条件（例えば、分化誘導のための馴化培地や分化誘導のための培地成分を使用しない培養条件）であっても、培養面をＰＳ面からＧ１又はＧ３面とするだけでヒト間葉系幹細胞の分化の誘導及び横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けができ、培養面をＰＳ面からＧ５面とするだけでヒト間葉系幹細胞の分化の誘導及び横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向に加え、軟骨系細胞への分化の方向付けができることが示された。
【実施例２】
【００６８】
提示されるＤ−グルコースの量が０％、５０％、及び１００％となるデンドリマー修飾培養面を作製し、これらの培養面においてヒト間葉系幹細胞を培養した。培養面の作製方法及び細胞培養条件は、下記のとおり。Ｄ−グルコースの提示量は、Ｌ−グルコースの混合率で調節した。なお、ヒト細胞には、Ｌ−グルコースを取り込み可能なトランスポータが存在しない。
【００６９】
［培養面の準備］
デンドリマーで修飾された培養面は、平面培養面（Ｐｌａｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ）を備える出発材料として市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル、Ｎｕｎｃ社製）を使用し、下記のように作製した。
【００７０】
〔１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
世代数３、４、及び５（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面は、無菌条件下において下記４ステップで作製した。
ステップ１：出発材料である前記平面培養面上にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍｌのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液をウェルに添加し、室温で１時間静置した。その後、前記ウェルを滅菌水で３回洗浄した。
ステップ２：３６０μｍｏｌ／ｍｌのグルタルアルデヒド水溶液を前記ウェルに添加し、室温で１時間静置し、その後多量の滅菌水で洗浄した。前記ウェルに３６０μｍｏｌ／ｍｌのトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して１時間静置してデンドロン構造を形成し、滅菌水で洗浄した。Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５の培養面を作製する場合、このステップ２を、それぞれ、３、４、及び５回繰り返した。
ステップ３：デンドリマー末端にＤ−グルコースを提示させるため、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を前記ウェルに添加して２時間静置した。
ステップ４：０．５μｍｏｌ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を前記ウェルに添加して２４時間静置した。前記ウェルを滅菌水で洗浄し、１００％のＤ−グルコースが提示されたデンドリマー培養面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）を得た。
【００７１】
〔０％及び５０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）は、上記ステップ３における０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＬ−グルコース水溶液とした以外は前述の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）と同様にして作製した。また、５０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）は、上記ステップ３における０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を、Ｄ−グルコース及びＬ−グルコースを等量含みグルコース濃度が０．５μｍｏｌ／ｍｌのグルコース水溶液とした以外は前述の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）と同様にして作製した。
【００７２】
［使用した細胞］
ヒト間葉系幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００７３】
［使用した培地］
上記デンドリマー修飾培養面上での培養培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。また、前記間葉系幹細胞の増殖用培地としては、ヒト骨髄間葉系幹細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００７４】
［培養条件］
細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で行った。なお、細胞のウェルへの接種濃度は、５×１０3ｃｅｌｌ／ｃｍ2とした。
【００７５】
［細胞形態変化及びその結果］
０％、５０％、及び１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）で修飾された培養面上で上記間葉系幹細胞を上記培養条件で培養し、４及び７日後の細胞の形態を顕微鏡観察した。その結果の一例を図４に示す。
【００７６】
図４に示すとおり、Ｇ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、グルコースの提示量に関らず、平面方向に伸張した形態を示した。一方、Ｇ４及びＧ５面の培養面上で培養した場合、細胞の形態は丸くなり、幾つかの細胞が塊になって球状の細胞集塊が形成された。細胞集塊を形成する細胞の数は、Ｇ４面よりもＧ５面の方が多かった。また、細胞集塊を形成する細胞の数は、Ｄ−グルコースの提示が多いほど多かった。よって、細胞集塊の形成は、デンドリマーの世代数が多いほど、また、Ｄ−グルコースの提示が多いほど、促進されることが示された。
【実施例３】
【００７７】
［分化の方向付けの確認：心筋系への分化］
Ｇ５面の培養面上で、間葉系幹細胞を７日間培養して細胞集塊を得た。使用した間葉系幹細胞、培養条件等は、実施例１と同様である。次に、この細胞集塊に対して、骨格筋系細胞に特異的なマーカー（デスミン、ＭＨＣ fast Skeletal）、心筋系細胞に特異的なマーカー（デスミン、ｃＴｎＴ）、及び軟骨系細胞に特異的なマーカー（ＩＩ型コラーゲン）に対する蛍光免疫染色を行った。染色の程度を確認するためＴｏｐｒｏ−３により核染色も同時に行った。その観察結果を図５に示す。
【００７８】
図５に示すとおり、デスミン及びｃＴｎＴは、細胞集塊全体的に発現していた。一方、ＭＨＣ fast Skeletal及びII型コラーゲンは、表面（表層部）において発現が確認された。したがって、該細胞集塊においては、表面（表層部）の細胞は軟骨系細胞への分化の方向付けがされているが、該細胞集塊の内部の細胞は心筋系細胞への分化の方向付けがされていることが確認された。
【００７９】
［デンドリマー修飾面の役割の確認］
上記のような心筋系細胞への分化誘導には、デンドリマー修飾培養面上での培養が必要であることを確認するため、細胞非接着性の丸底９８ウェルプレートを利用して間葉系幹細胞の細胞集塊を作製した。細胞培養容器を細胞非接着性の丸底９８ウェルプレートとした以外は、細胞培養条件は実施例１と同様とした。次に、得られた細胞集塊に対してデスミン、ＭＨＣ fast Skeletal、ｃＴｎＴ、ＩＩ型コラーゲン、及びＣＤ１０５の各マーカーに対する蛍光免疫染色を行った。なお、ＣＤ１０５は、未分化の間葉系幹細胞のマーカーの１つである。その観察結果を図６に示す。
【００８０】
図６に示すとおり、デスミンが細胞集塊の周囲で若干の発現が観察されたが、図５とは対照的に、ＭＨＣ fast Skeletal、ｃＴｎＴ、及びＩＩ型コラーゲンの各マーカーについては陰性であった。また、間葉系幹細胞の未分化状態を示すＣＤ１０５が陽性であった。したがって、間葉系幹細胞を単に細胞集塊とするだけでは心筋細胞の分化誘導には不十分であり、デンドリマー修飾培養面上での培養が必要であることが確認された。
【００８１】
［ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面における心筋系細胞への分化の有無］
ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面における心筋系細胞への分化誘導の有無を確認した。実施例１に記載の培養条件と同様の条件下において、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した。その後、デスミン、ＭＨＣ fast Skeletal、及びｃＴｎＴに対する蛍光免疫染色を行って顕微鏡観察した。その結果を図７に示す。
【００８２】
図７に示すとおり、細胞集塊を形成しないＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面では、ｃＴｎＴマーカーが陰性であった。よって、心筋系細胞への分化誘導には、デンドリマー修飾培養面上での細胞集塊の形成が必要であることが示唆された。
【００８３】
［分化誘導と細胞増殖の関係］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を培養するときの培養時間と細胞増殖の関係を確認した。具体的には、実施例１に記載の細胞培養条件下で培養し、所定の時間ごとに細胞密度を計測した。その結果を図８に示す。
【００８４】
図８に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面上では、間葉系幹細胞に由来する細胞は増殖し続けた。一方、Ｇ５面上での培養では間葉系幹細胞に由来する細胞はある一定の時間から増殖が止まった。Ｇ５面上での増殖停止は、心筋系細胞への分化との関連が示唆される。
【００８５】
なお、本実施例３の結果は、ロット違いのヒト骨髄間葉系幹細胞でも再現された。
【実施例４】
【００８６】
［細胞分化可塑性］
Ｇ５面の培養面で間葉系幹細胞を７日間培養して心筋系細胞への分化が方向付けられた細胞集塊を得て、その細胞集塊をトリプシン処理して乖離させた細胞をＰＳ面の培養面に移して再培養した。対照として、ＰＳ面の培養面で７日間培養した間葉系幹細胞を同様にトリプシン処理したのち、ＰＳ面の培養面で再培養した。使用した細胞、培養条件は実施例１と同様である。再培養の５日目に顕微鏡観察により細胞の形態を確認し、さらに、様々な分化マーカーの発現を確認した。
【００８７】
細胞の形態観察結果を図９に示す。Ｇ５面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞（図９下）は、通常の間葉系幹細胞及びＰＳ面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞（図９上）に比べてやや扁平な多角形状を示した。
【００８８】
次に、デスミン、ｃＴｎＴ、ＭＨＣ Fast Skeletal及びα-平滑筋アクチンのマーカーに対する蛍光免疫染色の結果を図１０に示す。ＰＳ面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞では、これらのマーカーは全て陰性であった。一方、Ｇ５面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞の多くは、デスミン及びｃＴｎＴのマーカーが陽性であった。したがって、Ｇ５面の培養面で誘導された心筋系細胞へ分化は、細胞分化安定性的に優れていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、例えば、組織工学の分野、再生医療の分野、再生医工学の分野などにおいて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の再生医療研究の大きな流れの１つは、未分化な幹細胞を人為的に分化誘導し、目的とする組織や臓器を体外又は体内で再構築させようとすることである。そのなかでも間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells: MSCs）は、その多様な分化能から、再生医療へ応用できる有力な細胞供給源として期待されている。その一方で、間葉系幹細胞を目的の分化状態へ分化誘導する方法は現在研究開発段階にある。現在の間葉系幹細胞の分化誘導用法に関する研究の多くは、液相での可溶性因子（培地成分）による分化制御に関するものである。
【０００３】
なお、細胞を培養する容器の培養面（培養培地が接触する底面）を修飾する技術の１つに、培養面をデンドリマー化合物で修飾する技術がある。下記特許文献１及び２は、細胞のトランスポータが取り込み可能な物質（Ｄ−グルコース）を末端に有するデンドリマー化合物で修飾された培養面、及び、前記培養面により細胞の固定化を促進することを開示する。下記非特許文献１及び２は、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面で培養されたヒト上皮細胞における、焦点接着の促進、及び形態変化を報告する。下記非特許文献３は、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面で培養されたラビット関節軟骨細胞における、形態変化及び移動への影響を報告する。さらに、下記非特許文献４は、マウスのＥＳ細胞（胚性幹細胞）の未分化状態が、Ｄ−グルコースを提示するデンドリマー修飾培養面を用いた培養で維持されることを報告する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２４０６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２２４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 103 (2007) 192-199, "Response of Human Epithelial Cells to Culture Surfaces with Varied Roughness Prepared by Immobilizing Dendrimers with/without D-Glucose Display"
【非特許文献２】Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol.105 (2008) 319-326, "Glucose Transporter Mediation Responsible for Morphological Changes of Human Epithelial Cells on Glucose-Displayed Surfaces"
【非特許文献３】M. Kino-oka et al. Biomaterials 28 (2007) 1680-1688, "Morphological regulation of rabbit chondrocytes on glucose-displayed surface"
【非特許文献４】S. Mashayekhan et al. Biomaterials 29 (2008) 4236-4243, "Enrichment of undifferentiated mouse embryonic stem cells on a culture surface with a glucose-displaying dendrimer"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、間葉系幹細胞の分化誘導に関する新たな技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、間葉系幹細胞の分化を誘導方法であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む間葉系幹細胞の分化誘導方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、間葉系幹細胞の分化誘導の因子として、固相因子であるデンドリマー修飾培養面を提供できる。また、本発明よれば、間葉系幹細胞の分化誘導の固相因子としてのデンドリマー修飾培養面の使用を含む間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。さらにまた、本発明によれば、好ましくは、細胞増殖を伴う間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、コントロール面（ＰＳ面）（ａ）、世代数１のデンドリマー修飾面（Ｇ１面）（ｂ）、世代数３のデンドリマー修飾面（Ｇ３面）（ｃ）、及び世代数５のデンドリマー修飾面（Ｇ５面）（ｄ）の培養面で培養された間葉系幹細胞の、培養１日後、３日後、及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【図２】図２は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、横紋筋・平滑筋細胞の分化マーカーであるデスミンの染色（緑）と、核染色（赤）とを行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【図３】図３は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、軟骨系細胞の分化マーカーであるＩＩ型コラーゲンの染色（赤）を行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【図４】図４は、０％、５０％、及び１００％のＤ−グルコースが提示された世代数が３、４、及び５（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）のデンドリマー修飾培養面上で培養された間葉系幹細胞の、培養４日後及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【図５】図５は、間葉系幹細胞をＧ５面の培養面上で７日間培養して得られた細胞集塊を、デスミン、ＭＨＣ Fast Skeletal、ｃＴｎＴ及びＩＩ型コラーゲンのそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro-3，青）した顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図６】図６は、本発明にかかるデンドリマー修飾面の培養面を使用せずに作製した間葉系幹細胞の細胞集塊を、デスミン、ＭＨＣ Fast Skeletal、ｃＴｎＴ、ＩＩ型コラーゲン及びＣＤ１０５のそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro-3，青）した顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図７】図７は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、デスミン、ｃＴｎＴ及びミオシン重鎖のそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro，青）を行った顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図８】図８は、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を培養した場合の、培養時間と細胞密度との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、ＰＳ面又はＧ５面で７日間培養した後、細胞をトリプシン処理してＰＳ面上で再培養して５日目の細胞を顕微鏡観察した写真の一例を示す。
【図１０】図１０は、ＰＳ面又はＧ５面で７日間培養した後、細胞をトリプシン処理してＰＳ面上で再培養して５日目の細胞の、デスミン、ｃＴｎＴ、ＭＨＣ Fast Skeletal及びα-平滑筋アクチンのそれぞれのマーカーに対する蛍光免疫染色（緑）並びに核染色（Topro，青）後の顕微鏡観察写真の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、デンドリマー化合物で修飾された培養面で間葉系幹細胞を培養すると、汎用される平面培養面での培養では分化を誘導しない培養条件、例えば、分化誘導のための培地成分又は分化誘導培地を添加若しくは使用しない培養条件であっても、間葉系幹細胞の分化を誘導できるという知見に基づく。本発明は、好ましくは、さらに、前記の間葉系幹細胞の分化誘導が細胞増殖を伴いながら行うことができるという知見に基づく。
【００１１】
すなわち、本発明は下記を含む；
［１］間葉系幹細胞の分化を誘導方法（以下、「本発明の分化誘導方法」ともいう。）であって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［２］前記分化が横紋筋・平滑筋系の細胞への分化であり、前記デンドリマー化合物の世代数が１以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［３］前記分化が軟骨系の細胞への分化であり、前記デンドリマー化合物の世代数が４以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［４］前記分化が、心筋系細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、［１］記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
［５］前記細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、［１］から［４］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［６］前記デンドリマー化合物は、カチオン性基を有する構成単位を含む、［１］から［５］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［７］前記細胞のトランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、［５］又は［６］に記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法；
［８］間葉系幹細胞を［１］から［７］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法；
［９］前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、［８］記載の細胞の製造方法；
［１０］［８］又は［９］記載の細胞の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞；
［１１］間葉系幹細胞を［１］から［６］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料の製造方法；
［１２］前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、［１１］記載の生体材料の製造方法；［１３］［１１］又は［１２］記載の生体材料の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料；
［１４］間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、［１］から［７］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法が記載された取扱説明書を含む、間葉系幹細胞の分化誘導キット；
［１５］デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来の丸い形態をした細胞集塊を製造する方法；
［１６］前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、［１５］記載の製造方法；
［１７］間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、［１５］又は［１６］に記載の製造方法；
［１８］前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、［１７］記載の製造方法。
【００１２】
［間葉系幹細胞］
本明細書において、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）とは、好ましくは、多種類の間葉系組織を構成する細胞に分化し得る体性幹細胞をいう。間葉系幹細胞としては、ヒトへの臨床応用の点から、哺乳類の間葉系幹細胞が好ましく、霊長類の間葉系幹細胞がより好ましく、ヒトの間葉系幹細胞がさらに好ましい。また、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、筋肉等に存在しうるが、本発明における間葉系幹細胞としては、特に制限されず、骨髄、脂肪、筋肉のいずれの組織から得られた間葉系幹細胞であってもよい。したがって、本明細書において間葉系幹細胞を使用することは、間葉系幹細胞を含む細胞集団を使用することを含んでもよい。また、本発明における間葉系幹細胞は、市販のものや細胞バンクから得られるものであってもよい。
【００１３】
本発明における間葉系幹細胞は、継代培養されたものであってもよい。継代回数は特に制限されないが、分化能の維持という観点から、１〜５０回が好ましく、１〜３０回がより好ましく、１〜１０回がさらに好ましい。本発明における間葉系幹細胞は、軟骨系の細胞及び横紋筋・平滑筋系の細胞への分化能を有することが好ましい。
【００１４】
本発明における間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞のマーカーが陽性であることが好ましい。間葉系幹細胞のマーカーとしては公知のマーカーを使用できる。ヒト間葉系幹細胞の場合、例えば、ＣＤ１０５、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１０６、及びＣＤ２７１の少なくとも１つの細胞表面マーカーが陽性であることが好ましい。
【００１５】
［間葉系幹細胞の分化誘導］
本明細書において、間葉系幹細胞の分化誘導とは、間葉系幹細胞を未分化状態から分化を開始させることを含み、好ましくは、未分化状態から未分化状態では検出されない間葉系組織特異的な分化マーカーが検出され得る状態とすることを含む。当業者であれば、間葉系組織特異的な分化マーカー及びその検出方法を適宜選択し、該分化マーカーが検出されるか否かを判断することができる。
【００１６】
間葉系組織特異的な分化マーカーとしては、細胞膜に存在する糖、タンパク質などを含む細胞表面マーカー；細胞内に存在するｍＲＮＡ、タンパク質、酵素などを含む細胞内マーカー；細胞外に分泌されるペプチド、タンパク質、酵素、化合物などを含む細胞外マーカー；などが挙げられる。分化マーカーの検出方法としては、特に制限されず、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。
【００１７】
間葉系組織特異的な分化マーカーの検出法としては、以下の方法が挙げられる。軟骨系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＩＩ型コラーゲン染色法が挙げられる。脂肪細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、オイルレッドＯ染色法が挙げられる。骨系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＡＬＰ染色法が挙げられ、横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、デスミン染色法が挙げられる。心筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ｃＴｎＴ（cardiac troponic T）染色法が挙げられる。骨格筋系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ミオシン重鎖染色法が挙げられる。血管系細胞への分化誘導を確認する方法としては、例えば、ＣＤ３１染色法が挙げられる。但し、分化マーカーの検出方法は、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において、「軟骨系細胞」とは、軟骨細胞、軟骨芽細胞、及び軟骨細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、軟骨細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはＩＩ型コラーゲン染色法で染色され得る細胞を含む。また、本明細書において、「横紋筋・平滑筋系細胞」とは、筋芽細胞、横紋筋及び又は平滑筋の筋細胞、筋芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、筋芽細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはデスミン染色法で染色され得る細胞を含む。本明細書において、「心筋系細胞」とは、心筋細胞、心筋芽細胞、心筋組織を構成し得る細胞、心筋細胞又は心筋芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含み、好ましくは、心筋細胞又は心筋芽細胞特異的な分化マーカーを発現する細胞を含み、より好ましくはｃＴｎＴ染色法で染色され得る細胞を含む。本明細書において、「骨系細胞」とは、骨芽細胞、骨細胞、及び骨芽細胞への分化が方向付けされた細胞を含む。
【００１９】
本明細書において、「分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞」とは、未分化の間葉系幹細胞よりも特定の間葉系組織の細胞に特異的な性質を示すように変化した細胞をいい、好ましくは、未分化の間葉系幹細胞では発現していない或いは検出されない分化マーカーを発現している或いは検出され得る細胞をいう。
【００２０】
［デンドリマー化合物］
本明細書において、デンドリマー化合物は、培養面の修飾に用いられる。デンドリマー化合物の修飾により、平面な培養面にナノメートルオーダーの凹凸が形成されうる。デンドリマー化合物としては、特に制限されず、上述のように、培養面にナノメートルオーダーの凹凸を形成できるものを使用でき、例えば、公知のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーや、特開２００５−１９２４０６号公報に開示される下記式（I）又は（II）で表わされるポリイミノアミンデンドリマーなどが挙げられる。また、細胞の培養面への固定化を促進する点からは、本発明に用いるデンドリマー化合物は、デンドリマー化合物の枝状部分を構成する分子（デンドロン）がカチオン性であることが好ましく、特に末端基がアミノ基であることがより好ましい。
【００２１】
【化１】
【００２２】
上記式（I）及び（II）において、Ｘは培養面又は培養面に結合した結合性基を示す。また、上記式（I）において、ｎは１以上の整数である。
【００２３】
培養面を修飾するデンドリマー化合物の形成方法としては、デンドリマー化合物の枝状部分を構成する分子（デンドロン）を平面培養面に直接、或いはリンカーとなる化合物を介して結合させて形成する方法（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ法）が挙げられる。具体的には上記非特許文献１（Kim et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 103 (2007) 192-199）に開示される方法が挙げられる。なお、本明細書においてデンドリマー化合物の世代数とは、枝状部分の分岐数をいい、例えば、上記式（I）で表わされるデンドリマー化合物においてｎ＝１のとき、世代数は２であり、以下Ｇ２と表すこともある。また、上記式（II）で表されるデンドリマー化合物の世代数は１であり、Ｇ１と表すこともある。デンドリマー化合物の世代数は当業者であれば目的の世代数に適宜設計でき、具体的には後述する実施例のように設計できる。
【００２４】
培養面を修飾するデンドリマー化合物の分岐方向の末端（例えば、上記式（I）及び（II）におけるアミノ基）には、必要に応じて、様々な物質を結合させてもよい。所望の物質を末端に結合することにより、該物質を培養する間葉系幹細胞に提示することができる。細胞の培養面への固定化を促進する点からは、デンドリマー化合物の末端に結合させる物質としては、細胞のトランスポータが取り込み可能な物質であることが好ましい。細胞のトランスポータが取り込み可能な物質としては、間葉系幹細胞の形態変化及び又は分化誘導を促進する点から、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましい。一方、好ましさは劣る実施形態において、取り込み可能なトランスポータが細胞に存在しない物質（例えば、Ｌ−グルコース）をデンドリマー化合物の末端に結合させてもよい。
【００２５】
［培養面］
本発明に用いる培養面は、上述したとおり、デンドリマー化合物で修飾された培養面であって、培養面にナノメートルオーダーの凹凸が形成されている培養面であることが好ましい。前記凹凸は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で測定される表面粗さ（Ｒａ）が、１〜１０ｎｍであることが好ましく、２〜７ｎｍがより好ましい。上述したとおり、間葉系幹細胞の形態変化及び又は分化誘導を促進する点から、培養面には前記の細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が提示されていることが好ましい。
【００２６】
［間葉系幹細胞の分化誘導方法］
本発明の間葉系幹細胞の分化誘導方法は、上述のようにデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で、間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。前記細胞培養容器は、修飾培養面を備える以外は通常の細胞培養で用いられるものと同様の材質、形状、大きさの細胞培養容器を使用できる。培養条件も、通常の条件、例えば４−６％ＣＯ2、好ましくは５％ＣＯ2下、例えば３５−３８℃、好ましくは３７℃という条件を採用できる。培養培地は、間葉系幹細胞を未分化状態で培養する培地又は間葉系幹細胞の増殖用の培地を使用できる。すなわち、間葉系幹細胞の分化誘導が起こらない培養条件（例えば、分化誘導のための培地や分化誘導のための培地成分を使用しない培養条件）であっても、平面培養面をデンドリマー修飾培養面とするだけで間葉系幹細胞の分化誘導が行え、好ましくは、細胞増殖を伴う分化誘導が行える。但し、本発明の分化誘導方法は、デンドリマー修飾培養面の使用に加え、分化誘導のための培地及び又は培地の使用を含んでもよい。
【００２７】
したがって、本発明によれば、間葉系幹細胞の分化誘導の因子として、固相因子であるデンドリマー修飾培養面を提供できる。そして、本発明よれば、間葉系幹細胞の分化誘導の固相因子であるデンドリマー修飾培養面の使用を含む、間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。さらに、本発明によれば、好ましくは、細胞増殖を伴う間葉系幹細胞の分化誘導が可能となる。なお、細胞増殖促進の観点からは、デンドリマー化合物の世代数が若いほど好ましい。
【００２８】
さらにまた、本発明によれば、後述するとおり、デンドリマー化合物の世代数を調節することにより、間葉系幹細胞に対して異なる細胞への分化の方向付けをすることができる。例えば、世代数１以上であれば、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けが可能となり、世代数４以上であれば、さらに、軟骨系細胞及び心筋系細胞へ分化の方向付けが可能となる。
【００２９】
［横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導］
したがって、本発明の一実施形態は、間葉系幹細胞の横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導方法であって、世代数が１以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、好ましくは、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、さらに好ましくは、細胞増殖を伴う、間葉系幹細胞の横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となる。デンドリマー化合物の世代数としては、好ましくは、１〜１０、１〜８、又は１〜６である。細胞が培養面の平面方向に伸びた形態の細胞集団を得る点からは、世代数は１〜３が好ましい。また、細胞が丸い形態をした細胞集塊を得る点からは、世代数は、４以上が好ましく、４〜７がさらに好ましく、４〜６がより好ましい。
【００３０】
横紋筋・平滑筋系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、横紋筋・平滑筋系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、横紋筋・平滑筋系細胞への分化は、例えば、横紋筋・平滑筋系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、デスミン）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３１】
［軟骨系細胞への分化誘導］
また、本発明のその他の実施形態は、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化誘導方法であって、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する軟骨系細胞への分化の方向付けが可能となり、さらに好ましくは、細胞増殖を伴う、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化の方向付けが可能となる。軟骨系細胞への分化を促進する点からは、前記世代数は、４〜１０又は４〜８が好ましく、４〜６がより好ましく、５がさらに好ましい。
【００３２】
軟骨系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、軟骨系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、軟骨系細胞への分化は、例えば、軟骨系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、II型コラーゲン）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３３】
［心筋系細胞への分化誘導］
また、本発明のその他の実施形態は、間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法であって、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む分化誘導方法である。この実施形態における本発明によれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する心筋系細胞への分化の方向付けが可能となる。心筋系細胞への分化を促進する点からは、前記世代数は、４〜１０又は４〜８が好ましく、４〜６がより好ましく、５又は６がさらに好ましい。
【００３４】
心筋系細胞への分化を促進する点からは、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、心筋系細胞への分化を促進する点から、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。上述のとおり、心筋系細胞への分化は、例えば、心筋系細胞に特異的な分化マーカー（例えば、ｃＴｎＴ）が陽性であることを基準に判断できる。
【００３５】
世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面で間葉系幹細胞を培養すると、前述のとおり、丸い形態をした細胞集塊を形成できる。後述の実施例で示すとおり、この細胞集塊の表面部（表層部）に位置する細胞は、II型コラーゲン陽性の軟骨系細胞への分化の方向付けがされた細胞となる傾向を示す。一方、該細胞集塊の表面部（表層部）以外の部分に相当する内部に位置する細胞は、心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞となる傾向を示す。なお、細胞集塊における表面部（表層部）及び内部は、後述する実施例に示すようにマーカー染色したデータを参照して判断することができる。
【００３６】
したがって、間葉系幹細胞の軟骨系細胞への分化誘導方法にかかる一実施形態においては、さらに、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で培養することで得られた細胞集塊から該細胞集塊の表面部（表層部）に位置する細胞であって、好ましくは軟骨系細胞への分化の方向付けがされた細胞を分離することを含んでもよい。
【００３７】
同様に、間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法にかかる一実施形態においては、さらに、世代数が４以上のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で培養することで得られた細胞集塊から該細胞集塊の内部に位置する細胞であって、好ましくは心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞を分離することを含んでもよい。
【００３８】
間葉系幹細胞の心筋系細胞への分化誘導方法にかかるその他の実施形態においては、分離された該細胞集塊の内部に位置する細胞、好ましくは心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞を、デンドリマー修飾されていない平面培養面の細胞培養容器で培養することを含んでもよい。該細胞集塊から分離された心筋系細胞への分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、デンドリマー修飾されていない平面培養面に戻して培養してもｃＴｎＴなどの心筋系細胞に特異的な分化マーカーの陽性を維持できる。
【００３９】
前述のとおり、本発明の分化誘導方法によれば、好ましくは、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４０】
［細胞の製造方法］
したがって、本発明は、その他の態様として、本発明の分化誘導方法により間葉系幹細胞に対して分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法（以下、「本発明の細胞の製造方法」ともいう。）に関する。本発明の細胞の製造方法によれば、好ましくは、細胞増殖を伴いながら、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。また、本発明の細胞の製造方法によれば、組織工学、再生医療、再生医工学等における生体材料又は細胞供給源（細胞ソース）として使用可能な、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞を製造できる。
【００４１】
本発明の細胞の製造方法により製造され得る細胞としては、前述のとおり、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞、及び、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞が挙げられる。
【００４２】
本発明の細胞の製造方法の一実施形態として、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。また、本発明の細胞の製造方法のその他の実施形態として、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した軟骨系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。さらにまた、本発明の細胞の製造方法のその他の実施形態として、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞の製造方法であって、上述した心筋系細胞への分化誘導方法により間葉系幹細胞を培養することを含む製造方法が挙げられる。
【００４３】
本発明は、さらにその他の態様として、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料又は細胞供給源の製造方法であって、本発明の分化誘導方法により間葉系幹細胞に対して分化の方向付けを行うこと、或いは、本発明の細胞の製造方法により分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造することを含む、製造方法に関する。本発明の生体材料又は細胞供給源の製造方法によれば、好ましくは、細胞増殖を伴いながら、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料又は細胞供給源を製造できる。
【００４４】
また、前述のとおり、本発明の分化誘導方法は、従来間葉系幹細胞の分化誘導に使用される分化誘導のための培地及び又は分化誘導のための培地成分を使用しなくても行うことができるから、本発明の細胞の製造方法によれば、好ましくは、これらの分化誘導培地及び又は培地成分と未接触である（接触した経歴がない）、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来細胞を製造でき、さらに好ましくは、細胞増殖を伴いながら、前記細胞を製造できる。
【００４５】
本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源は、好ましくは、再生医療の分野に使用され得る。例えば、心筋系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、心筋の修復に適用され、軟骨系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、関節軟骨の修復に適用され、横紋筋・平滑筋系細胞へ分化の方向付けがされた細胞は、好ましくは、筋肉組織の修復に適用され得る。或いは、本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源は、好ましくは、創薬スクリーニングにおける細胞アッセイの用途にも使用され得る。但し、本発明により製造され得る細胞、生体材料、又は細胞供給源の用途はこれらに限定されない。
【００４６】
［キット］
本発明は、さらにその他の態様として、間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、本発明の分化誘導方法を説明する記載を含む取扱説明書を含む間葉系幹細胞の分化誘導キット（以下、「本発明の分化誘導キット」ともいう。）に関する。本発明の分化誘導キットは、さらに、間葉系幹細胞を含んでもよい。なお、本発明の分化誘導キットにおける取扱説明書は、本発明の分化誘導キットに同梱されることなくウェブ上で提供される形態であってもよい。本発明の分化誘導キットにおける培養面及び細胞培養容器は、前述のものを使用できる。分化誘導の効率化の点から、前述のとおり、間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が、デンドリマー化合物の末端に結合することにより、前記修飾培養面に提示されていることが好ましく、前記物質としては、Ｌ−アミノ酸、及びＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどの糖が好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースがさらに好ましい。
【００４７】
本発明の分化誘導キットの一実施形態は、細胞培養容器が世代数１以上、好ましくは１〜１０、１〜８、１〜６、１〜３、又は４〜６のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有し、間葉系幹細胞に対して横紋筋・平滑筋系細胞への分化誘導を行うキットである。この実施形態における本発明の分化誘導キットによれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、好ましくは、横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造でき、より好ましくは、細胞増殖を伴いながら、横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４８】
本発明の分化誘導キットのその他の実施形態は、細胞培養容器が世代数４以上、好ましくは４〜１０又は４〜８、より好ましくは４〜６、さらに好ましくは５のデンドリマー化合物で修飾された培養面を有し、間葉系幹細胞に対して軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化誘導を行うキットである。この実施形態における本発明の分化誘導キットによれば、間葉系幹細胞に対する分化誘導とともに、間葉系幹細胞に対する軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けが可能となり、好ましくは、軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造でき、より好ましくは、細胞増殖を伴いながら、軟骨系細胞及び／又は心筋系細胞への分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を製造できる。
【００４９】
［治療方法］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の細胞の製造方法で製造され得る細胞の使用を含む治療方法及び又は再生医療方法に関する。例えば、軟骨を欠損した対象の間葉系幹細胞を用いて本発明の細胞の製造方法により軟骨系細胞への分化が誘導された細胞を調製し、前記細胞を対象の軟骨欠損部位に移植する治療又は再生医療の方法が挙げられる。前記移植は、例えば、コラーゲンゲルスポンジなどに前記細胞を播種し、そのスポンジを欠損部に配置するなどして行うことができる。また、例えば、拡張型心筋症の対象の間葉系幹細胞を用いて本発明の細胞の製造方法により横紋筋・平滑筋系細胞又は心筋系細胞への分化が誘導された細胞を調製し、それらの細胞から筋芽細胞シート（心機能回復材）を製造する拡張型心筋症の治療又は再生医療の方法が挙げられる。すなわち、本発明の治療方法及び又は再生医療方法は、前記心機能回復材を対象の心臓の外部に被覆して心臓壁面への血管を誘導し、心筋細胞を修復し、心機能の回復を目指す、拡張型心筋症の治療又は再生医療の方法である。なお、本発明における治療方法及び又は再生医療方法はこれらに限定されない。
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５１】
末端にＤ−グルコースが結合した世代数の異なるデントリマーで修飾された培養面においてヒト間葉系幹細胞を培養した。培養面の作製方法及び細胞培養条件は、下記のとおり。
【００５２】
［培養面の準備］
デンドリマーで修飾された培養面は、平面培養面（Ｐｌａｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ）を備える出発材料として市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル、Ｎｕｎｃ社製）を使用し、下記のように作製した。また、この８ウェルプレートの平面培養面をコントロール面（以下、「ＰＳ面」ともいう。）として使用した。
【００５３】
〔世代数１（Ｇ１）のＤ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
Ｇ１のＤ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ１面）は、無菌条件下において下記４ステップで作製した。
ステップ１：出発材料である前記平面培養面上にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍｌのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液をウェルに添加し、室温で１時間静置した。その後、前記ウェルを滅菌水で３回洗浄した。
ステップ２：３６０μｍｏｌ／ｍｌのグルタルアルデヒド水溶液を前記ウェルに添加し、室温で１時間静置し、その後多量の滅菌水で洗浄した。前記ウェルに３６０μｍｏｌ／ｍｌのトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して１時間静置してデンドロン構造を形成し、滅菌水で洗浄した。
ステップ３：デンドリマー末端にＤ−グルコースを提示させるため、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を前記ウェルに添加して２時間静置した。
ステップ４：０．５μｍｏｌ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を前記ウェルに添加して２４時間静置した。前記ウェルを滅菌水で洗浄し、Ｄ−グルコースが提示されたデンドリマーで修飾された培養面を得た。
【００５４】
〔世代数３及び５（Ｇ３及びＧ５）のＤ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
Ｇ３及びＧ５のＤ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３面及びＧ５面）は、上記ステップ１の後、上記ステップ２をそれぞれ３回及び５回繰り返してデンドリマーの世代数を３及び５とし、その後、上記ステップ３及びステップ４を行うことにより作製した。
【００５５】
［使用した細胞］
ヒト間葉系幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００５６】
［使用した培地］
上記デンドリマー修飾培養面上での培養培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。また、前記間葉系幹細胞の増殖用培地としては、ヒト骨髄間葉系幹細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００５７】
［培養条件］
細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で行った。なお、細胞のウェルへの接種濃度
は、５×１０3ｃｅｌｌ／ｃｍ2とした。
【００５８】
［培細胞分化評価］
間葉系幹細胞の分化は、下記表１の分化マーカー染色法を用いて確認した。なお、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、ＰＳ面で培養したヒト間葉系幹細胞は、下記表１の分化マーカー染色に対して全てが陰性であった。
【００５９】
【表１】
【００６０】
［細胞形態変化及びその結果］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面上で上記間葉系幹細胞を上記培養条件で培養し、１、３、及び７日後の細胞の形態を顕微鏡観察した。その結果の一例を図１に示す。図１は、ＰＳ面（ａ）、Ｇ１面（ｂ）、Ｇ３面（ｃ）、及びＧ５面（ｄ）の培養面で培養された間葉系幹細胞の、培養１日後、３日後、及び７日後の顕微鏡観察写真を示す図である。
【００６１】
図１に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は平面方向に伸張した形態を示す傾向があった。一方、Ｇ５面の培養面上で培養した場合、細胞の形態は丸くなり、幾つかの細胞が塊になって球状の細胞集塊が形成された。また、該細胞集塊は、培養日数とともに大きくなる傾向があった。
【００６２】
［分化の方向付けの確認：横紋筋・平滑筋系への分化］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、デスミン染色を行って、該分化マーカーの有無を確認した。その結果の一例を図２に示す。図２は、横紋筋・平滑筋系細胞及び平滑筋系細胞の分化マーカーであるデスミンの染色（緑）と核染色（赤）とを行った顕微鏡観察写真を示す図である。なお、Ｇ５面での培養結果については、平面（上面）の写真に加え、断側面の共焦点顕微鏡観察写真を示す。
【００６３】
図２に示すとおり、ＰＳ面の培養面上で培養した間葉系幹細胞ではデスミン染色陰性であったが、Ｇ１面及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞はデスミン染色陽性であった。したがって、Ｇ１面及びＧ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、横紋筋・平滑筋系の細胞への分化の方向付けがされたことがわかる。
【００６４】
また、Ｇ５面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、前述のとおり細胞集塊を形成し、デスミン染色したところ、図２に示すとおり、細胞集塊の表面に位置する細胞がデスミン染色陽性を示した。
【００６５】
［分化の方向付けの確認：軟骨系への分化］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した後、ＩＩ型コラーゲン染色を行って、該分化マーカーの有無を確認した。その結果の一例を図３に示す。図３は、軟骨系細胞の分化マーカーであるＩＩ型コラーゲンの染色（赤）を行った顕微鏡観察写真を示す図である。
【００６６】
図３に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面で培養した間葉系幹細胞ではＩＩ型コラーゲン染色陰性であったが、Ｇ５面の培養面で培養した間葉系幹細胞はデスミン染色陽性であった。したがって、Ｇ５面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、軟骨系細胞への分化の方向付けがされたことがわかる。
【００６７】
以上、示したとおり、ＰＳ面での培養においてはヒト間葉系幹細胞の分化の誘導が起こらない培養条件（例えば、分化誘導のための馴化培地や分化誘導のための培地成分を使用しない培養条件）であっても、培養面をＰＳ面からＧ１又はＧ３面とするだけでヒト間葉系幹細胞の分化の誘導及び横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向付けができ、培養面をＰＳ面からＧ５面とするだけでヒト間葉系幹細胞の分化の誘導及び横紋筋・平滑筋系細胞への分化の方向に加え、軟骨系細胞への分化の方向付けができることが示された。
【実施例２】
【００６８】
提示されるＤ−グルコースの量が０％、５０％、及び１００％となるデンドリマー修飾培養面を作製し、これらの培養面においてヒト間葉系幹細胞を培養した。培養面の作製方法及び細胞培養条件は、下記のとおり。Ｄ−グルコースの提示量は、Ｌ−グルコースの混合率で調節した。なお、ヒト細胞には、Ｌ−グルコースを取り込み可能なトランスポータが存在しない。
【００６９】
［培養面の準備］
デンドリマーで修飾された培養面は、平面培養面（Ｐｌａｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ）を備える出発材料として市販の角型８ウェルプレート（ポリスチレン製、表面積９．６ｃｍ2／ウェル、Ｎｕｎｃ社製）を使用し、下記のように作製した。
【００７０】
〔１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
世代数３、４、及び５（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面は、無菌条件下において下記４ステップで作製した。
ステップ１：出発材料である前記平面培養面上にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍｌのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液をウェルに添加し、室温で１時間静置した。その後、前記ウェルを滅菌水で３回洗浄した。
ステップ２：３６０μｍｏｌ／ｍｌのグルタルアルデヒド水溶液を前記ウェルに添加し、室温で１時間静置し、その後多量の滅菌水で洗浄した。前記ウェルに３６０μｍｏｌ／ｍｌのトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して１時間静置してデンドロン構造を形成し、滅菌水で洗浄した。Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５の培養面を作製する場合、このステップ２を、それぞれ、３、４、及び５回繰り返した。
ステップ３：デンドリマー末端にＤ−グルコースを提示させるため、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を前記ウェルに添加して２時間静置した。
ステップ４：０．５μｍｏｌ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を前記ウェルに添加して２４時間静置した。前記ウェルを滅菌水で洗浄し、１００％のＤ−グルコースが提示されたデンドリマー培養面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）を得た。
【００７１】
〔０％及び５０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面の作製〕
０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）は、上記ステップ３における０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を、０．５μｍｏｌ／ｍｌのＬ−グルコース水溶液とした以外は前述の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）と同様にして作製した。また、５０％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）は、上記ステップ３における０．５μｍｏｌ／ｍｌのＤ−グルコース水溶液を、Ｄ−グルコース及びＬ−グルコースを等量含みグルコース濃度が０．５μｍｏｌ／ｍｌのグルコース水溶液とした以外は前述の１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー面（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）と同様にして作製した。
【００７２】
［使用した細胞］
ヒト間葉系幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００７３】
［使用した培地］
上記デンドリマー修飾培養面上での培養培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。また、前記間葉系幹細胞の増殖用培地としては、ヒト骨髄間葉系幹細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。
【００７４】
［培養条件］
細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で行った。なお、細胞のウェルへの接種濃度は、５×１０3ｃｅｌｌ／ｃｍ2とした。
【００７５】
［細胞形態変化及びその結果］
０％、５０％、及び１００％Ｄ−グルコース提示デンドリマー（Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５）で修飾された培養面上で上記間葉系幹細胞を上記培養条件で培養し、４及び７日後の細胞の形態を顕微鏡観察した。その結果の一例を図４に示す。
【００７６】
図４に示すとおり、Ｇ３面の培養面上で培養した間葉系幹細胞は、グルコースの提示量に関らず、平面方向に伸張した形態を示した。一方、Ｇ４及びＧ５面の培養面上で培養した場合、細胞の形態は丸くなり、幾つかの細胞が塊になって球状の細胞集塊が形成された。細胞集塊を形成する細胞の数は、Ｇ４面よりもＧ５面の方が多かった。また、細胞集塊を形成する細胞の数は、Ｄ−グルコースの提示が多いほど多かった。よって、細胞集塊の形成は、デンドリマーの世代数が多いほど、また、Ｄ−グルコースの提示が多いほど、促進されることが示された。
【実施例３】
【００７７】
［分化の方向付けの確認：心筋系への分化］
Ｇ５面の培養面上で、間葉系幹細胞を７日間培養して細胞集塊を得た。使用した間葉系幹細胞、培養条件等は、実施例１と同様である。次に、この細胞集塊に対して、骨格筋系細胞に特異的なマーカー（デスミン、ＭＨＣ fast Skeletal）、心筋系細胞に特異的なマーカー（デスミン、ｃＴｎＴ）、及び軟骨系細胞に特異的なマーカー（ＩＩ型コラーゲン）に対する蛍光免疫染色を行った。染色の程度を確認するためＴｏｐｒｏ−３により核染色も同時に行った。その観察結果を図５に示す。
【００７８】
図５に示すとおり、デスミン及びｃＴｎＴは、細胞集塊全体的に発現していた。一方、ＭＨＣ fast Skeletal及びII型コラーゲンは、表面（表層部）において発現が確認された。したがって、該細胞集塊においては、表面（表層部）の細胞は軟骨系細胞への分化の方向付けがされているが、該細胞集塊の内部の細胞は心筋系細胞への分化の方向付けがされていることが確認された。
【００７９】
［デンドリマー修飾面の役割の確認］
上記のような心筋系細胞への分化誘導には、デンドリマー修飾培養面上での培養が必要であることを確認するため、細胞非接着性の丸底９８ウェルプレートを利用して間葉系幹細胞の細胞集塊を作製した。細胞培養容器を細胞非接着性の丸底９８ウェルプレートとした以外は、細胞培養条件は実施例１と同様とした。次に、得られた細胞集塊に対してデスミン、ＭＨＣ fast Skeletal、ｃＴｎＴ、ＩＩ型コラーゲン、及びＣＤ１０５の各マーカーに対する蛍光免疫染色を行った。なお、ＣＤ１０５は、未分化の間葉系幹細胞のマーカーの１つである。その観察結果を図６に示す。
【００８０】
図６に示すとおり、デスミンが細胞集塊の周囲で若干の発現が観察されたが、図５とは対照的に、ＭＨＣ fast Skeletal、ｃＴｎＴ、及びＩＩ型コラーゲンの各マーカーについては陰性であった。また、間葉系幹細胞の未分化状態を示すＣＤ１０５が陽性であった。したがって、間葉系幹細胞を単に細胞集塊とするだけでは心筋細胞の分化誘導には不十分であり、デンドリマー修飾培養面上での培養が必要であることが確認された。
【００８１】
［ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面における心筋系細胞への分化の有無］
ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面における心筋系細胞への分化誘導の有無を確認した。実施例１に記載の培養条件と同様の条件下において、ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を７日間培養した。その後、デスミン、ＭＨＣ fast Skeletal、及びｃＴｎＴに対する蛍光免疫染色を行って顕微鏡観察した。その結果を図７に示す。
【００８２】
図７に示すとおり、細胞集塊を形成しないＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面では、ｃＴｎＴマーカーが陰性であった。よって、心筋系細胞への分化誘導には、デンドリマー修飾培養面上での細胞集塊の形成が必要であることが示唆された。
【００８３】
［分化誘導と細胞増殖の関係］
ＰＳ面、Ｇ１面、Ｇ３面、及びＧ５面の培養面上で間葉系幹細胞を培養するときの培養時間と細胞増殖の関係を確認した。具体的には、実施例１に記載の細胞培養条件下で培養し、所定の時間ごとに細胞密度を計測した。その結果を図８に示す。
【００８４】
図８に示すとおり、ＰＳ面、Ｇ１面、及びＧ３面の培養面上では、間葉系幹細胞に由来する細胞は増殖し続けた。一方、Ｇ５面上での培養では間葉系幹細胞に由来する細胞はある一定の時間から増殖が止まった。Ｇ５面上での増殖停止は、心筋系細胞への分化との関連が示唆される。
【００８５】
なお、本実施例３の結果は、ロット違いのヒト骨髄間葉系幹細胞でも再現された。
【実施例４】
【００８６】
［細胞分化可塑性］
Ｇ５面の培養面で間葉系幹細胞を７日間培養して心筋系細胞への分化が方向付けられた細胞集塊を得て、その細胞集塊をトリプシン処理して乖離させた細胞をＰＳ面の培養面に移して再培養した。対照として、ＰＳ面の培養面で７日間培養した間葉系幹細胞を同様にトリプシン処理したのち、ＰＳ面の培養面で再培養した。使用した細胞、培養条件は実施例１と同様である。再培養の５日目に顕微鏡観察により細胞の形態を確認し、さらに、様々な分化マーカーの発現を確認した。
【００８７】
細胞の形態観察結果を図９に示す。Ｇ５面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞（図９下）は、通常の間葉系幹細胞及びＰＳ面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞（図９上）に比べてやや扁平な多角形状を示した。
【００８８】
次に、デスミン、ｃＴｎＴ、ＭＨＣ Fast Skeletal及びα-平滑筋アクチンのマーカーに対する蛍光免疫染色の結果を図１０に示す。ＰＳ面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞では、これらのマーカーは全て陰性であった。一方、Ｇ５面の培養後にＰＳ面で再培養した細胞の多くは、デスミン及びｃＴｎＴのマーカーが陽性であった。したがって、Ｇ５面の培養面で誘導された心筋系細胞へ分化は、細胞分化安定性的に優れていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、例えば、組織工学の分野、再生医療の分野、再生医工学の分野などにおいて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の分化誘導の方法であって、
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項２】
前記分化が、横紋筋・平滑筋系の細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、１以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項３】
前記分化が、軟骨系の細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項４】
前記分化が、心筋系細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、請求項１から４のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項６】
前記デンドリマー化合物は、カチオン性基を有する構成単位を含む、請求項１から５のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項７】
前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、請求項５又は６に記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項８】
間葉系幹細胞を請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法。
【請求項９】
前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、請求項８記載の細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞。
【請求項１１】
間葉系幹細胞を請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料の製造方法。
【請求項１２】
前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、請求項１１記載の生体材料の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の生体材料の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、
請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法が記載された取扱説明書を含む、間葉系幹細胞の分化誘導キット。
【請求項１５】
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来の丸い形態をした細胞集塊を製造する方法。
【請求項１６】
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１】
間葉系幹細胞の分化誘導の方法であって、
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で前記間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項２】
前記分化が、横紋筋・平滑筋系の細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、１以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項３】
前記分化が、軟骨系の細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項４】
前記分化が、心筋系細胞への分化であり、
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、請求項１から４のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項６】
前記デンドリマー化合物は、カチオン性基を有する構成単位を含む、請求項１から５のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項７】
前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、請求項５又は６に記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法。
【請求項８】
間葉系幹細胞を請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞の製造方法。
【請求項９】
前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、請求項８記載の細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞。
【請求項１１】
間葉系幹細胞を請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法により分化の方向付けを行うことを含む、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料の製造方法。
【請求項１２】
前記分化の方向付けは、細胞増殖を伴う、請求項１１記載の生体材料の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の生体材料の製造方法により製造され得る、分化の方向付けがされた間葉系幹細胞由来の細胞を含む生体材料。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の分化誘導を行うためのキットであって、
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器、及び、
請求項１から７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化誘導方法が記載された取扱説明書を含む、間葉系幹細胞の分化誘導キット。
【請求項１５】
デンドリマー化合物で修飾された培養面を有する細胞培養容器で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来の丸い形態をした細胞集塊を製造する方法。
【請求項１６】
前記デンドリマー化合物の世代数が、４以上である、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
間葉系幹細胞のトランスポータが取り込み可能な物質が前記培養面に提示されており、
前記化合物は前記デンドリマー化合物の末端に結合している、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記トランスポータが取り込み可能な物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、及びＤ−ガラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖である、請求項１７記載の製造方法。
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−２００７４５（Ｐ２０１０−２００７４５Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８５１９１（Ｐ２００９−１８５１９１）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
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