間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤
【課題】本発明は、腸炎の優れた予防・治療剤を提供することを目的とする。
【解決手段】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤である。かかるＭＳＣの培養上清としては、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清であることが好ましい。また、ＭＳＣとしては、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）であることが好ましい。
【解決手段】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤である。かかるＭＳＣの培養上清としては、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清であることが好ましい。また、ＭＳＣとしては、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸炎の予防・治療剤に関し、より詳細には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸炎は腸に炎症を引き起こす症候群の総称であり、原因が特定されている特異性腸炎と、原因が不明な非特異性腸炎が含まれる。特異性腸炎には、細菌やウイルスの感染による感染性腸炎、抗がん剤や抗生物質等の薬剤による薬剤性腸炎、放射線による放射性腸炎、腸管の虚血による血管性腸炎などが含まれ、非特異性腸炎には、潰瘍性大腸炎、クローン病、非特異性多発小腸潰瘍、急性出血直腸潰瘍、単純潰瘍、好酸球性胃腸症、直腸粘膜脱症候群、アフタ性大腸炎などが含まれ、中でも、潰瘍性大腸炎とクローン病などは頻度が高く、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease；ＩＢＤ）と呼ばれている。
【０００３】
炎症性腸疾患は、最も難治性な消化器疾患の１つであり、患者の生活の質を著しく低下させ、若年患者の結腸直腸癌のリスクを高めることが知られている。現在行なわれている炎症性腸疾患の治療方法として、ヒト化抗ＴＮＦα抗体（インフリキシマブ）（例えば、特許文献１参照）の投与が行なわれているが、決定的な治療は困難なままである。その他、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む炎症性腸疾患を治療する方法（例えば、特許文献２参照）も知られている。
【０００４】
本発明者らは、これまでにも、炎症性腸疾患等の腸炎の予防、治療に関して研究を行っており、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で腸炎を誘導したラットに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を尾静脈から投与すると、腸炎からの回復を促進する効果が得られることを見いだしている（非特許文献１参照）。ＭＳＣ投与によるこの効果は、粘膜固有層の間質に時折生着したＭＳＣが再プログラミングされて、周皮細胞、血管平滑筋細胞、筋繊維芽細胞などの筋系細胞に分化することによると考えられた。しかし、かかる非特許文献１のように、ＭＳＣ自体を薬剤として投与する場合には、厳格な基準をクリアする細胞調製施設が必要であり、また、ドナー不足が叫ばれる中、拒絶反応を考慮したドナーの選別が必要であった。そのため、患者に適合するＭＳＣを、必要な時期に必要な量を確保することが比較的困難であり、実際上は、ＭＳＣ投与のタイミングが制限される可能性が高いという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，２７７，９６９号明細書
【特許文献２】特表２００４−５３７５４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Myogenic lineage differentiated mesenchymal stem cells enhance recovery from dextran sulfate sodium-induced colitis in the rat”;J Gastroenterol(2011) 46:143-152
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、腸炎の優れた予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の非特許文献１は、ＭＳＣ投与によって、腸炎からの回復が促進されることを開示している。しかし、かかる効果は、粘膜固有層の間質に時折生着したＭＳＣが再プログラミングされて、周皮細胞、血管平滑筋細胞、筋繊維芽細胞などの筋系細胞に分化することによると考えられた。すなわち、腸炎の回復を促進するためには、ＭＳＣ自体が必須であると考えられた。しかし、本発明者らは、腸炎の予防や、治療に関して、従来の知見に囚われることなく鋭意研究を進めたところ、意外なことに、ＭＳＣの培養上清が腸炎の予防・治療効果を有していることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤や、（２）ＭＳＣの培養上清が、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である上記（１）に記載の腸炎の予防・治療剤や、（３）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）である上記（１）又は（２）に記載の腸炎の予防・治療剤や、（４）腸炎が、炎症性腸疾患である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の腸炎の予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、腸炎の予防、治療や、改善が可能となる。また、本発明によると、ＭＳＣ自体を用いる非特許文献１のような場合とは違って、薬剤を調製する施設は通常の施設でもよいため、必要な時期に必要な量を確保し易く、また、患者の拒絶反応を考慮する必要がないので、ＭＳＣ自体を用いる場合と比較して簡便性及び利便性に非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】３種類（低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）のｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）で処理したＩＥＣ−６細胞をＭＴＴアッセイした結果を示す図である。縦軸に、生細胞におけるＭＴＴ還元物質の発色の程度の指標となる吸光度を示し、横軸に処理後の経過時間を示す。グラフは、各経過時間において、左から順に、無血清ＤＭＥＭ（ｍｅｄｉｕｍ）、低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）処理を示す。
【図２】血清枯渇前のＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図３】血清存在下で４８時間培養したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図４】血清枯渇により４８時間培養したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図５】４８時間ｎｏｒＣＭ処理したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図６】４８時間ｈｙｐｏＣＭ処理したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図７】ＴＵＮＥＬによりＩＥＣ−６細胞におけるアポトーシスを解析した結果を示す図である。「＊」は、ＩＦＮγ４８とｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝９．１Ｅ−７）、ＩＦＮγ４８とｎｏｒＣＭ（Ｐ＝０．０２３）、及びｎｏｒＣＭとｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０１２）との間の統計的有意性を示す。なお、各群に用いたＣＭの量は１．５ｍＬであった。
【図８】スクラッチアッセイによりＩＥＣ−６細胞遊走を解析した結果を示す図である。縦軸には、各グループにおける２４時間後のスクラッチ領域と０時間のスクラッチ領域との比率を示す。２４時間後のスクラッチ領域は、［２４時間後のスクラッチ領域］＝１００×［２４時間時点のスクラッチ領域面積］／［０時間時点のスクラッチ領域面積］としてコンピューターで算出した。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。なお、各群に用いた馴化培地（ＣＭ）の量は１．５ｍｇ（１．５ｍＬ）であった。「＊」は、対照である無血清ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉｕｍ）とｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０２４４５）、γＣＭとｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０２２６７）との間の統計的有意性を示す。
【図９】ＩＥＣ−６細胞およびＭＳＣにおけるＡｋｔ及びＭＡＰＫシグナル活性をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図である。左パネルは、４種類の培地（ＤＭＥＭ［ＦＢＳ＋］、ＤＭＥＭ［ＦＢＳ−］、ｎｏｒＣＭ、及びｈｙｐｏＣＭ）条件下でＩＥＣ−６細胞を培養した後、それぞれの培養液から得られたＩＥＣ−６細胞を解析した結果を示し、右パネルは、３種類の培地（ＤＭＥＭ［ＦＢＳ−］、ｎｏｒＣＭ、及びｈｙｐｏＣＭ）で培養したＭＳＣを解析した結果を示す。
【図１０】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。括弧付きの矢頭は、ＣＭ５００×３投与群において、ＭＳＣ−ＣＭが投与されなかった日を示す。「＊」は、ＣＭ５００×５投与群とＰＢＳ投与群（１３、１４、及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０４７、０．０３２、及び１Ｐ＝０．０１９）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１１】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットのＤＡＩスコアの経時的変化を示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、「＊」又は「＊＊」は、５００×５ ＭＳＣ−ＣＭ投与群とＰＢＳ投与群（９、１１、１２、１３、１４、及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００４、３．４８Ｅ−４、０．００５、０．０１４、０．００１、及び０．００２）との間；ＣＭ５００×３投与群とＰＢＳ投与群（１４日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０２６及び０．００９）との間；ＣＭ２００×３投与群とＰＢＳ投与群（１４日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０２９及び０．００１４）との間；及びＣＭ５００×５投与群とＣＭ５００×３投与群（１１日目にＰ＝０．００４７）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１２】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの下痢スコア（ＤＡＩスコアの詳細）の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。「＊」又は「＊＊」は、ＣＭ５００×５投与群とＰＢＳ投与群（１１、１２、１３、及び１５日目にそれぞれＰ＝２．０６Ｅ−４、０．００５、０．００５、及び３．８２Ｅ−４）との間；ＣＭ５００×３投与群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００９及び３．８２Ｅ−４）との間；ＣＭ２００×３投与群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００２及び０．０００１）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１３】３種類の経路による投与群（腹腔内投与［ＩＰ群］、腸管内投与、すなわち注腸［ＩＣ群］及び静脈内投与［ＩＶ群］）とＰＢＳ投与群（静脈内投与）における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「■」でドットされるグラフは腹腔内［ＩＰ］投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは腸管内［ＩＣ、即ち注腸］投与群の結果を表し、「●」でドットされるグラフは静脈内［ＩＶ］投与群の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。なお、各群に用いたＣＭの量は５００μｇであった。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。「＊」は、ＩＣ群とＰＢＳ投与群（１２、１３、及び１４日目にそれぞれＰ＝０．０３３、０．０３５、及び０．０４２）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１４】３種類の経路による投与群（腹腔内投与［ＩＰ群］、腸管内投与、すなわち注腸［ＩＣ群］及び静脈内投与［ＩＶ群］）とＰＢＳ投与群（静脈内投与）における、ＤＳＳ腸炎ラットのＤＡＩスコアの経時的変化を示す図である。「■」でドットされるグラフは腹腔内［ＩＰ］投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは腸管内［ＩＣ、即ち注腸］投与群の結果を表し、「●」でドットされるグラフは静脈内［ＩＶ］投与群の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。なお、各群に用いたＣＭの量は５００μｇであった。また、「＊」又は「＊＊」は、ＩＰ群とＩＣ群（１１日目及び１２日目にそれぞれＰ＝０．０２１及び０．０１１）との間；ＩＶ群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１２日目にそれぞれＰ＝０．００４及び０．００６）との間；並びにＩＰ群とＰＢＳ投与群（１２、１３、及び１４日目にそれぞれＰ＝３．７４０Ｅ−４、０．００８、及び０．００６）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１５】ＤＭＥＭ、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重（上段）及びＤＡＩスコア（下段）の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフはｎｏｒＣＭ投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフはＤＭＥＭ投与群の結果を表し「■」でドットされるグラフはｈｙｐｏＣＭ投与群の結果を表す。なお、ｎｏｒＣＭ投与群及びｈｙｐｏＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＤＭＥＭ投与群に用いたＤＭＥＭの量は５００μＬであった。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ投与群の各日数に示される「＊」は、ＤＭＥＭ投与群に対する統計的有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１６】ＰＢＳ及びＭＳＣ−ＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎急性期及び回復期の病理組織学的評価を示す図である。縦軸には、組織学的スコアを示し、横軸には、腸炎の急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）の各サンプルを示し、グラフはそれぞれ左から順に、ＰＢＳ投与群及びＭＳＣ−ＣＭ投与群を示す。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＰＢＳ投与群に用いたＰＢＳの量は５００μＬであった。「＊」は、ＰＢＳ投与群とＭＳＣ−ＣＭ投与群との間の統計的有意性を示す（Ｐ＝７．９８Ｅ−５）。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１７】ＰＢＳ及びＭＳＣ−ＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎急性期及び回復期の大腸細胞数を解析した結果を示す図である。縦軸には、Ｋｉ−６７陽性細胞を指標とした値を示し、横軸には、急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）の各サンプルを示し、グラフはそれぞれ左から順に、ＰＢＳ投与群及びＭＳＣ−ＣＭ投与群を示す。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＰＢＳ投与群に用いたＰＢＳの量は５００μＬであった。また、Ｋｉ−６７陽性細胞数としては、代表的な５つの標本中のクリプトの全有核数に対するＫｉ−６７陽性細胞数の割合の平均値を示した。「＊」は、ＰＢＳ投与群とＭＳＣ−ＣＭ投与群との間の統計的有意性を示す（Ｐ＝１．４３Ｅ−４）。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１８】ｈｙｐｏＣＭ及びｎｏｒＣＭに含まれるラット炎症性サイトカインのタンパク質量を、Rat Cytokine Antibody Array G Series 2により解析した結果を示す図である。縦軸には、標準化したアレイの値を示し、横軸には、解析した３４種類のタンパク質を示し、各タンパク質のグラフはそれぞれ左から順に、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の腸炎の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含んでいる限り特に制限されず、本発明における腸炎としては、腸炎である限り特に制限されず、具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗がん剤や抗生物質等の薬剤による薬剤性腸炎、放射線による放射線腸炎等を好適に例示することができ、中でも、潰瘍性大腸炎、クローン病を好適に例示することができる。本発明の作用機序の詳細は不明であるが、ＭＳＣの培養上清に含まれている、ＭＳＣ由来の何らかの活性成分が、腸炎に対して予防・治療効果を発揮しているものと考えられる。
【００１３】
本明細書における「ＭＳＣの培養上清」とは、ＭＳＣが増殖し得る条件の下、ＭＳＣが増殖し得る培養液でＭＳＣを培養して得られた培養液（培養後の培養液）からＭＳＣを除去したものを意味するが、かかる培養上清から、例えば、残存培地成分（培養前の培養液の成分のうち、培養後の培養液中に残存している成分）、培養液の水分などの、本発明における腸炎の予防・治療効果に寄与しない成分の少なくとも一部をさらに除去したものも、便宜上、本明細書におけるＭＳＣの培養上清に含まれる。なお、簡便性の観点からは、培養後の培養液からＭＳＣを除去したものをそのまま培養上清として用いることが好ましい。
【００１４】
前述のＭＳＣが増殖し得る培養液としては、本発明における腸炎の予防・治療効果が得られる限り、特に制限されないが、イーグル最小必須培地（Eagle’s Minimum Essential Medium：ＥＭＥＭ）、最小必須培地α（Minimum Essential Medium α：ＭＥＭα）、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ＤＭＥＭ）などの哺乳動物細胞用の細胞培地を例示することができ、中でも、ＤＭＥＭを好適に例示することができ、中でも、グルコースを１，０００ｍｇ／ｍＬ、グルタミンを５８４ｍｇ／ｍＬ含有するＤＭＥＭをより好適に例示することができ、中でも、Invitrogen社製のＤＭＥＭをさらに好適に例示することができる。なお、培養液は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を添加したものであってもよいが、哺乳動物に投与した際の抗原抗体反応を避ける観点から、無血清の培養液を好適に例示することができる。培養液の原材料は市販されているものを適宜利用することができる。
【００１５】
ＭＳＣを培養する際の培養条件としては、ＭＳＣが増殖し得る培養条件である限り、特に制限されないが、より優れた腸炎の予防・治療効果を得る観点から、通常の大気中の酸素濃度（２０％）よりも低い酸素濃度下（本明細書において、「低酸素濃度下」とも表示する。）で培養することが好ましい。前述の低酸素濃度下としては、培養中の培養液に接している気体中の濃度が好ましくは１〜１９％の範囲内、より好ましくは１〜１５％の範囲内、さらに好ましくは１．５〜１０％の範囲内、さらにより好ましくは２〜８％の範囲内の条件下であることを好適に含む。かかる低酸素濃度下での培養は、例えば、市販の低酸素チャンバー（低温Ｏ２／ＣＯ２インキュベータ９２００ＥＸ、和研薬株式会社製）内で培養することによって、行うことができる。
【００１６】
上記の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としては、未分化の間葉系細胞である限り特に制限はされず、哺乳動物の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血等から常法に従い採取した後、未分化のＭＳＣをプラスチック付着性の有無等により選択することができる。即ち、骨髄等に含まれる細胞の中で付着性を有するものを選択することによりＭＳＣを得ることができる。ここで、ＭＳＣとしては、本発明のより優れた効果を得る観点から、骨髄間葉系幹細胞を用いることが好ましい。かかる骨髄間葉系幹細胞は、例えば骨髄間質細胞から分離することができる。また、上記のＭＳＣとしては、本発明の予防・治療剤の投与対象と同種の哺乳動物由来のＭＳＣを用いることが好ましく、投与対象以外の同種の哺乳動物由来のＭＳＣや、投与対象自身のＭＳＣ（自家細胞）を用いることができる。なお、培養上清を作製する際の培養に用いるＭＳＣとしては、ＭＳＣを７０〜９０％コンフルエント（好ましくは８０％コンフルエント）まで増殖させて得られた細胞をゼロ継代とし、それをさらに増殖させて３〜５継代のＭＳＣを用いることができる。
【００１７】
本発明における腸炎の予防・治療効果とは、いずれかの腸炎の発症を予防及び／又は治療する効果を意味する。かかる治療効果には、その腸炎を完全に治癒する効果だけでなく、そのいずれかの症状を軽減、改善する効果の他、かかる症状の悪化の速度を低下させる効果も含まれる。
【００１８】
本発明の予防・治療剤は、本発明における腸炎の予防・治療効果が得られる限り、ＭＳＣの培養上清以外の腸炎の予防・治療剤などの任意成分をさらに含んでいてもよいし、生理食塩水等で希釈されていてもよい。
【００１９】
本発明の予防・治療剤に含有されるＭＳＣの培養上清は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、腸炎に対する優れた予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＭＳＣの培養上清を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＭＳＣの培養上清を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００２０】
本発明の予防・治療剤の投与方法としては特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を好適に例示することができ、中でも、血管内投与をより好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の予防・治療剤の投与量としては、腸炎の種類や、その症状の度合い、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、ＭＳＣの培養上清（非乾燥重量）換算で、例えば、１日当たり、０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの範囲を好適に例示することができ、中でも、１μｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの範囲をより好適に例示することができる。なお、本発明の予防・治療剤の投与は、１日のうち１〜複数回に分けて行ってもよい。また、本発明の予防・治療剤の投与は継続的に行うことが好ましい。例えば、３日に１回以上の頻度で、２回以上継続して投与することが好ましく、中でも、２日に１回以上の頻度で、３回以上継続して投与することがより好ましく、中でも、１日に１回以上の頻度で４回以上継続して投与することが好ましい。
【００２２】
本発明の予防・治療剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤に含まれる「ＭＳＣの培養上清」における「ＭＳＣ」の由来である哺乳動物の種類は、本発明の予防・治療剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、腸炎に対するより安定して優れた予防・治療効果を得る観点から好ましい。
【００２３】
なお、本発明の他の態様として、本発明の腸炎の予防・治療剤や改善剤の調製に使用するためのＭＳＣの培養上清の使用や、ＭＳＣの培養上清を、上記の腸炎の予防・治療や改善に使用する方法や、ＭＳＣの培養上清を対象哺乳動物に投与することにより、上記の腸炎を予防・治療あるいは改善する方法を挙げることができる。
【００２４】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［細胞培養及び実験動物］
ラット骨髄間葉系幹細胞（Rat Mesenchymal stem cells；ｒＭＳＣ）を８週齢のLewisラット（Charles River研究所）の骨髄から採取し、文献に記載の通りに培養した（Javazon EH, Colter DC, Schwarz EJ, Prockop DJ. Rat marrow stromalcells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromalcells. Stem Cells 2001;19:219-225.）。すなわち、大腿骨及び脛骨の骨幹に針を刺して骨髄細胞を採取し、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全α改変イーグル培地（ＭＥＭα、Invitrogen社製, Carlsbad, CA）３０ｍｌで洗浄した後、骨髄細胞懸濁液を７０μｍナイロンフィルター（Becton Dickinson社製, Franklin Lakes, NJ）でろ過し、７５ｃｍ２フラスコにプレートした。完全ＭＥＭα（１５％ＦＢＳ）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で骨髄細胞を増殖させ、３日後に上記培地を新しい完全ＭＥＭα培地（１５％ＦＢＳ）に交換し、接着した骨髄細胞を８０％コンフルエントまで増殖させ、得られた細胞試料をゼロ継代（passage 0）と定義した。３継代〜５継代の細胞を実験に用いた。American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手したラット小腸由来の細胞（ＩＥＣ−６細胞）及びヒト結腸癌由来の細胞（Ｃａｃｏ−２細胞）を通常（２０％）酸素下でＤＭＥＭ（Invitrogen社製）及びＭＥＭ（Invitrogen社製）で各々維持した。札幌医科大学動物実験委員会のガイドラインに従い、Lewisラットを飼養した。札幌医科大学の組換えＤＮＡ実験の安全性のための動物実験委員会が、全ての実験プロトコルを検討、承認した。ラットは全て雄で、使用時には８週齢、体重は２５０ｇ以下であった。
【００２６】
［ｒＭＳＣの免疫表現型、インビトロでの分化、及び蛍光免疫組織染色］
ｒＭＳＣの免疫表現型を、ラット表面抗原ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、及びＣＤ９０に対する特異的抗体（イムノテック社製）を用いてFACSCalibur（BD Biosciences社製, Franklin Lakes, NJ）により決定した（Javazon EH, Colter DC, Schwarz EJ, Prockop DJ. Rat marrow stromalcells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem Cells 2001;19:219-225.）。また、かかるｒＭＳＣのインビボでの骨細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞への分化能を確認した（Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymalstem cells: candidate MSC-Like cells from umbilical cord. Stem Cells 2003;21:105-110.）。
【００２７】
［ｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の調製］
インビボの治療に最適なｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）について検討するために、３種類の馴化培地（ＣＭ）、すなわち、通常酸素下でインキュベートした馴化培地（ｎｏｒＣＭ）、低酸素下でインキュベートした馴化培地（ｈｙｐｏＣＭ）、及び、ＩＮＦγで刺激した馴化培地（γＣＭ）を調製した。具体的には、以下のような方法で行った。
ｒＭＳＣ（４×１０５細胞）を１５０ｍｍの培養皿に適切なスケールで播種し、ｒＭＳＣがコンフルエントに達するまで完全ＭＥＭα（１５％ＦＢＳ）で培養した。かかるｒＭＳＣを以下の３種類のＣＭの調製に用いた。ｎｏｒＣＭの場合は、前述のｒＭＳＣを無血清ＤＭＥＭで、通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した。ｈｙｐｏＣＭの場合は、前述のｒＭＳＣを無血清ＤＭＥＭで、低酸素下（酸素濃度５％）、２４時間培養した。γＣＭの場合は、ラットＩＮＦγ（１００ｎｇ／ｍｌ、BioLegend社製）を含む無血清ＤＭＥＭで、前述のｒＭＳＣを通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、さらに無血清ＤＭＥＭで、通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した。
３種類それぞれの場合のＣＭを収集し、３００×ｇで５分間遠心し、最後に０．２２μｍのシリンジフィルターを用いてろ過し、使用時まで−８０℃で保存した。製造元の説明書に従い、カットオフ値が１０ｋＤａの遠心ろ過ユニット（Ultracel-10K Millipore社製）を用いて、限外ろ過により上記ＣＭ（ｎｏｒＣＭ、ｈｙｐｏＣＭ、又は、γＣＭ）をさらに濃縮（最終濃度１μｇ／μｌ）してインビボ実験用とした。なお、通常酸素下の培養は、標準的インキュベータ内において５％ＣＯ２及び２０％Ｏ２含有空気下で行い、低酸素下での培養は、製造元の説明書に従って最終酸素濃度５％の低酸素条件をセットした、低酸素チャンバー（低温Ｏ２／ＣＯ２インキュベータ９２００ＥＸ、和研薬株式会社製）内において行った。
【００２８】
［ＭＴＴアッセイ］
細胞生存率を、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド］発色還元アッセイにより測定した（Sladowski D, Steer SJ, Clothier RH, Balls M. An improved MTT assay. Immunol Methods 1993;157:203-207.）。すなわち、細胞を９６ウェルプレートに播種し、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所製）のアリコート１０μｌを上記９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートして反応させた。生細胞におけるＭＴＴ還元物質の発色の程度の指標となる吸光度に基づいて、ＭＴＴの発色が阻害される割合を導き、かかる割合を基に細胞生存率を算出した。ＭＴＴ還元物質の発色レベルは、波長４５０ｎｍの吸光度として測定した。
【００２９】
［細胞周期及びアポトーシスの解析］
フローサイトメトリー用として、ＩＥＣ−６単細胞懸濁液（Single cell suspension）を９０％低温エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ Ａで処理し、ヨウ化プロピジウムで染色した。フローサイトメトリーで測定されるサブＧ１のピークを、アポトーシス細胞分画とした。DeadEndColorimetric TUNELシステム（Promega社製）を用いて、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応を行った。製造元の説明書に従って、Ｋｉ６７免疫組織化学法（Abcam社製）を行った。少なくとも５つの異なる試料においてＫｉ６７陽性核及びＴＵＮＥＬ陽性核をカウントし、Ｋｉ６７標識指標及びアポトーシス指標を百分率で表した。
【００３０】
［スクラッチアッセイ］
ＩＥＣ−６細胞のインビトロの遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、即ち「スクラッチアッセイ」により測定した。ｐ２００ピペットの先端で、３５ｍｍ皿上のＩＥＣ−６単層に直線の傷を十字状につけて「スクラッチ」を作り、よく洗浄して、削られた細胞を除去した後、各々１．５ｍｌのＭＳＣ−ＣＭを加えた。画像を取得する際に位相差顕微鏡下で同一の区域を得ることができるように、上記スクラッチの近傍に、基準点として利用できる印をつけた。一定時間ごと（０、６、１２、及び２４時間）に観察するため、上記の皿を３７℃のインキュベータから取り出すことが可能であり、各々の時間枠経過後の画像を取得した後に戻して、インキュベートを再開した。各々の画像について、TScratch programソフトウェア（http://www.cse-lab.ethz.ch/software.htmlから無料で入手）を用いて各時間枠の、開放創（open wound）の区域面積を定量的に測定した。各実験は少なくとも３回繰り返した（Geback T, Schulz MMP, Koumoutsakos P, Detmar M. A novel and simple software tool for automated analysis of monolayer wound healing assays. BioTechniques2009;46:265-274.）。
【００３１】
［残存シグナルのウエスタンブロット解析］
各々のコンフルエント細胞を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、及び１％のTritonX-100、並びにプロテアーゼインヒビターカクテル錠Complete Mini（商標）（Roche Diagnostics社製）及びホスファターゼインヒビターカクテル錠PhosSTOP（Roche Diagnostics社製）を１錠ずつ含む放射線免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファーに溶解した。Bio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad社製）によりタンパク質量を算出した各々の溶解液４０μｇを、１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ溶液中でブロッキング処理した後、ｐａｎ−Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、Ｅｒｋ５、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ５、及びＪＮＫ１／３に対する一次抗体（Santa Cruz社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｐ３８、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８に対する一次抗体（Cell Signaling Technology社製）、並びにβアクチンに対する一次抗体（Sigma-Aldrich社製）と共に上記膜をインキュベートし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Santa Cruz社製）と共にインキュベートした。enhanced chemiluminescence kit（Amersham Biosciences社製）を用いて免疫反応を進行させた。
【００３２】
［実験腸炎モデル及び腸炎の重症度の評価］
５％ＤＳＳを含む飲水を７日間（０日目〜６日目）不断給餌することによりＤＳＳ腸炎を誘発させた。６日目に上記ＤＳＳ溶液を水に交換し、体重、文献（Cooper HS, Murthy SNS, Shah RS, Sedergran DJ. Clinicopathologicstudy of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest 1993;69:238-249.）に記載のDisease activity index score（ＤＡＩスコア）、及び組織学的スコアによる評価を行うまで、ラットに毎日普通の水を飲ませた。上記のＤＡＩスコアは、便性状（硬便＝０；軟便＝１；水様便＝２）、血便（なし＝０；少（付着程度）＝１；多（流出）＝２）、体重減少（基準から２％未満の減少＝０；基準から２％以上５％未満の減少＝１；基準から５％以上１０％未満の減少＝２；基準から１０％以上の減少＝３）と規定した上で、「便性状」×２＋「血便」×２＋体重減少＝ＤＡＩスコア、という式に基づいて算出した。また上記の組織学的スコアは、次の通りである：炎症重症度、なし＝０；軽度＝１；中程度＝２；炎症性細胞浸潤を伴う重度＝３。炎症の範囲、なし＝０；粘膜のみ＝１；粘膜及び粘膜下層＝２；貫壁性浸潤＝３。陰窩の損傷、損傷なし＝０、基底の１／３が損傷＝１、基底の２／３が損傷＝２、陰窩が消失しているが表層上皮が存在する場合＝３、陰窩及び表層上皮の両方が消失している場合＝３（Williams KL, et al. Enhanced survival and mucosal repair after dextransodium sulfate-induced colitis in transgenic mice that overexpressgrowth hormone. Gastroenterology 2001;120:925-937.）。上記グループ分けについて知らされていない病理医が、腸炎実験の最も炎症の重い病変、及び対照である腸管の対応する解剖学的切片について、代表的断面をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、組織学的スコアを独立に判定した。各ラット（ｎ＝１０）由来の３つの全周断面（全部で９０断面）を解析した。Ｋｉ６７に対するウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をAbcam社から購入した。
【００３３】
［ＭＳＣ−ＣＭに放出されたサイトカイン及びケモカインの検出］
製造元の説明書にしたがい、複数タンパク質ＥＬＩＳＡキット、Multi-AnalyteELISArray（商標）キット（SABioscience社製）を用いてラット炎症性サイトカインについてＭＳＣ−ＣＭを分析した。簡潔に述べれば、各々のＭＳＣ−ＣＭを、キットに付属するサンプル希釈用バッファーで十分に希釈した。このキットを用いてＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ，ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、及びＭＩＰ−１βの濃度を分析した。上記キットにより供給される陰性及び陽性対照も測定した（Sand KL, Rolin KJ, Al-Falahi Y, Maghazachi AA. Modulation of natural killer cell cytotoxicity and cytokine release by the drug glatiramer acetate. Cell Mol Life Sci2009;66:1446-1456.）。
【００３４】
［統計学的分析］
２つのグループを比較するため、独立ｔ検定及びマン−ホイットニーＵ検定を用いて、パラメトリック分析及びノンパラメトリック分析を各々行った。カイ二乗検定、ピアソンの統計に基づく実際のＰ値、又はモンテカルロ法を用いて分類に基づく変数（categorical variables）を比較した。多重比較のため、特に経時的評価においてＡＮＯＶＡを採用して、２要因反復測定（対象間―対象内混合（mixed between-within subject））ＡＮＯＶＡを行い、続いてボンフェローニ検定を適用した（Tabachnick BG, Fidell LS, eds. Using multivariate statistics (4th edn). New York: HarperCollins; 2001.）。全ての両側検定（two-tailed test）においてＰ＜０．０５の場合に有意性があるとみなした。全ての統計的検定に、SPSS Statisticsソフトウェア 17.0（Chicago, IL）を用いた。
【００３５】
［結果］
［インビトロの細胞生存性、細胞周期、アポトーシス、遊走、及び生存シグナル活性化に対するＭＳＣ−ＣＭの効果］
インビトロでのＩＥＣ−６細胞株の増殖に対する３種類（低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ））のｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の効果や培地濃度による効果を調べるため、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率（図１）及び細胞周期（図２〜６）を解析した。その結果、ＩＥＣ−６細胞の細胞生存率は、低酸素による前処理（ｈｙｐｏＣＭ）群で最も高く、特に処理後８７時間において顕著な差が認められた（図１）。また、フローサイトメトリーにより細胞周期を解析したところ、血清枯渇前のＩＥＣ−６細胞（図２）や血清存在下で培養したＩＥＣ−６細胞（図３）と比較して、血清枯渇により４８時間培養したＩＥＣ−６細胞は、サブＧ１のピークが上昇した（図４）。一方、ＩＥＣ−６細胞を４８時間血清飢餓状態に置いても、ｎｏｒＣＭ（図５）、又はｈｙｐｏＣＭ（図６）のいずれかを用いた場合において、かかるサブＧ１のピークの上昇は抑制された。これらの結果は、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭで培養を行うことにより、血清枯渇によるアポトーシスの誘導が阻害されたことを示唆している。そこで、ＴＵＮＥＬによりＩＥＣ−６細胞におけるアポトーシスを解析したところ、４８時間ＩＦＮ−γ刺激処理（ＩＦＮγ４８）した場合と比較して、通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）（Ｐ＝０．０２３）及び低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）（Ｐ＝９．１Ｅ−７）によりアポトーシスは有意に抑制されていることが示された（図７）。さらにｈｙｐｏＣＭ処理によるアポトーシスの抑制効果は、ｎｏｒＣＭ処理によるそれよりも有意に大きかった（Ｐ＝０．０１２、図７）。次に、インビトロのＩＥＣ−６細胞遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、すなわち「スクラッチアッセイ」により測定した（図８）。その結果、ｈｙｐｏＣＭによる処理は、ＤＭＥＭ培地（Ｐ＝０．０２４４５）及びγＣＭ処理（Ｐ＝０．０２２６７）と比較して傷の治癒を促進することが示された（図８）。さらに、ＩＥＣ−６におけるＡｋｔ及びＪＮＫ１／３シグナル活性を解析したところ、血清飢餓処理（ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−））と比較して、ＭＳＣ−ＣＭ（ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ）処理によりＩＥＣ−６細胞におけるリン酸化されたＡｋｔ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ）及びＪＮＫ１／３レベルが上昇した（図９）。これらの結果は、ＭＳＣ−ＣＭ（ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ）処理によりＡｋｔ及びＪＮＫ１／３シグナルが活性化された結果、細胞遊走が促進されたことを示している。
【００３６】
［腸炎に対するＭＳＣ−ＣＭインビボ投与の治療効果］
５％ＤＳＳで誘発させた急性腸炎（ＤＳＳ腸炎）ラットの尾静脈に、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を静脈注射し、ＭＳＣ−ＣＭにより治療効果があるかどうかを、体重（図１０）及び疾患活動性指標（ＤＡＩ）スコア（図１１）を指標に調べた。その結果、ＤＳＳに曝露させた期間の腸炎急性期（０日目〜６日目）では、有意な治療効果は見られなかったが、ＤＳＳ曝露を止めてＤＳＳを含まない飲水に代えた回復期間では、ＭＳＣ−ＣＭ投与により体重が有意に回復することが示された（図１０）。特に投与後１２日目〜１４日目（回復期間の５日目〜７日目）における急性腸炎ラットの体重変化から、ＭＳＣ−ＣＭ投与量依存的な治療効果があることを示された。同様に、ＭＳＣ−ＣＭ投与によりＤＡＩスコアが回復し、特に５００μｇ／日のＭＳＣ−ＣＭを投与した群では、対照（ＰＢＳ投与）と比べ優れた有意差を有していた（図１１）。さらにＤＡＩスコアを詳細に解析したところ、ＭＳＣ−ＣＭ投与により下痢症状が軽減した（図１２）。
【００３７】
［ＤＳＳ腸炎に対する最適なＭＳＣ−ＣＭの療法の検討］
次に、ＭＳＣ−ＣＭの投与方法により腸炎治療効果に違いがあるかどうかを調べた。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を、３種類の投与経路（腹腔内［ＩＰ］、腸管内［ＩＣ、即ち注腸］又は静脈内［ＩＶ］）により急性腸炎ラットへ投与し、体重（図１３）及びＤＡＩスコア（図１４）を指標に調べた。その結果、いずれの経路によるＭＳＣ−ＣＭの投与においても、対照（ＰＢＳ）と比べ体重の回復効果が認められたが、３種類の経路による投与方法の間で違いは認められなかった（図１３）。また、注腸（ＩＣ）に投与した場合、投与後１２日目〜１４日目（回復期間の５日目〜７日目）における体重は、対照（ＰＢＳ投与）と比べ有意差が認められた（図１３）。同様に、ＤＡＩスコアについても、３種類の経路によるＭＳＣ−ＣＭの投与により、対照（ＰＢＳ）と比べ回復していることが示された（図１４）。また、腹腔内投与（ＩＰ）と腸管内（ＩＣ）投与とを比較した場合、１１日目（Ｐ＝０．０１１）及び１２日目（Ｐ＝０．０２１）で有意差が認められた（図１４）。また、静脈内投与（ＩＶ）でも、腸管内（ＩＣ）投与と比較して好適な結果が得られた。次に、インビトロでの実験において、ｎｏｒＣＭ処理よりもｈｙｐｏＣＭ処理の方が効果的であったことから、インビボでの腸炎の治療においてもｈｙｐｏＣＭ処理が効果的であるどうかについて調べた。その結果、ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合と比べ、ｈｙｐｏＣＭを投与した場合の方が、体重の回復（図１５、上段）及びＤＡＩスコアの回復（図１５、下段）レベルがともに高かった。また、ｈｙｐｏＣＭを投与した場合のＤＡＩスコアの回復効果は、対照（ＤＭＥＭ）を投与した場合と比べ、投与後８〜１１及び１３日目に有意差が認められた（図１５、下段）。
【００３８】
［腸炎の急性期及び回復期の病理組織学的評価］
さらに、ＭＳＣ−ＣＭ療法効果を病理組織学的解析により詳細に解析した。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を、ＤＳＳ腸炎ラットへ投与し、大腸上皮の損傷レベルを、組織学的スコアを指標に解析し（図１６）、また大腸細胞数を、Ｋｉ−６７陽性細胞を指標に解析した（図１７）。その結果、腸炎の急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）において、ＭＳＣ−ＣＭで治療したラットの上皮傷害レベルは著しく抑制され（図１６）、またＫｉ−６７陽性細胞数は増加していることが示された（図１７）。特に、腸炎急性期（Inductive phase）において、ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合の上皮傷害レベル（Ｐ＝７／９８Ｅ−５）及びＫｉ−６７陽性細胞数（Ｐ＝１．４３Ｅ−４）は、対照（培養培地投与）と比べ、統計的有意性を示していた。また、ＭＳＣ−ＣＭ投与により、腸炎の急性期（Inductive phase）では、Ｋｉ−６７陽性細胞が陰窩の上方に顕著に増加していたが、回復期（Recovery phase）ではこの傾向は認められなかった。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与により、claudin-2（ｃｌｄｎ−２）タンパク質は、アップレギュレーションされて急性期（Inductive phase）では主に陰窩の基底部位に再分布したが、回復期（Recovery phase）にはダウンレギュレーションされることも確認した。対照的に、ＤＳＳ腸炎ラット対照群における急性期（Inductive phase）には、ｃｌｄｎ−２はダウンレギュレーションされ、また回復期（Recovery phase）にはアップレギュレーションされることも確認した。これらの結果から、ＭＳＣ−ＣＭは、腸炎急性期に上皮の細胞回転を著明に亢進させ、その傷害を低減することが示された。また、その際に、ｃｌｄｎ−２タンパクの誘導、再分布が認められたことから、ＭＳＣ−ＣＭは、上皮バリア機能回復にも寄与する可能性が認められた。
【００３９】
［ＭＳＣ−ＣＭの含有物の測定］
ＤＳＳ腸炎に対するｈｙｐｏＣＭ治療作用機構を調べるため、ＭＳＣ−ＣＭ中に含まれるラット炎症性サイトカインのタンパク質量をMulti-Analyte ELISArrayにより解析した（図１８）。３４種類の代表的なサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子のアレイを選択し、ｎｏｒＣＭ処理及びｈｙｐｏＣＭ処理した場合の培地に含まれる上記３４種類のタンパク質の発現量を比較した（図１８）。その結果、ＶＥＧＦとＭＣＰ−１の発現量は、ｎｏｒＣＭ処理した場合と比べ、ｈｙｐｏＣＭ処理した方が高く、有意差が認められた（図１８）。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、腸炎の予防・治療の分野に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸炎の予防・治療剤に関し、より詳細には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸炎は腸に炎症を引き起こす症候群の総称であり、原因が特定されている特異性腸炎と、原因が不明な非特異性腸炎が含まれる。特異性腸炎には、細菌やウイルスの感染による感染性腸炎、抗がん剤や抗生物質等の薬剤による薬剤性腸炎、放射線による放射性腸炎、腸管の虚血による血管性腸炎などが含まれ、非特異性腸炎には、潰瘍性大腸炎、クローン病、非特異性多発小腸潰瘍、急性出血直腸潰瘍、単純潰瘍、好酸球性胃腸症、直腸粘膜脱症候群、アフタ性大腸炎などが含まれ、中でも、潰瘍性大腸炎とクローン病などは頻度が高く、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease；ＩＢＤ）と呼ばれている。
【０００３】
炎症性腸疾患は、最も難治性な消化器疾患の１つであり、患者の生活の質を著しく低下させ、若年患者の結腸直腸癌のリスクを高めることが知られている。現在行なわれている炎症性腸疾患の治療方法として、ヒト化抗ＴＮＦα抗体（インフリキシマブ）（例えば、特許文献１参照）の投与が行なわれているが、決定的な治療は困難なままである。その他、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む炎症性腸疾患を治療する方法（例えば、特許文献２参照）も知られている。
【０００４】
本発明者らは、これまでにも、炎症性腸疾患等の腸炎の予防、治療に関して研究を行っており、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で腸炎を誘導したラットに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を尾静脈から投与すると、腸炎からの回復を促進する効果が得られることを見いだしている（非特許文献１参照）。ＭＳＣ投与によるこの効果は、粘膜固有層の間質に時折生着したＭＳＣが再プログラミングされて、周皮細胞、血管平滑筋細胞、筋繊維芽細胞などの筋系細胞に分化することによると考えられた。しかし、かかる非特許文献１のように、ＭＳＣ自体を薬剤として投与する場合には、厳格な基準をクリアする細胞調製施設が必要であり、また、ドナー不足が叫ばれる中、拒絶反応を考慮したドナーの選別が必要であった。そのため、患者に適合するＭＳＣを、必要な時期に必要な量を確保することが比較的困難であり、実際上は、ＭＳＣ投与のタイミングが制限される可能性が高いという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，２７７，９６９号明細書
【特許文献２】特表２００４−５３７５４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Myogenic lineage differentiated mesenchymal stem cells enhance recovery from dextran sulfate sodium-induced colitis in the rat”;J Gastroenterol(2011) 46:143-152
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、腸炎の優れた予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の非特許文献１は、ＭＳＣ投与によって、腸炎からの回復が促進されることを開示している。しかし、かかる効果は、粘膜固有層の間質に時折生着したＭＳＣが再プログラミングされて、周皮細胞、血管平滑筋細胞、筋繊維芽細胞などの筋系細胞に分化することによると考えられた。すなわち、腸炎の回復を促進するためには、ＭＳＣ自体が必須であると考えられた。しかし、本発明者らは、腸炎の予防や、治療に関して、従来の知見に囚われることなく鋭意研究を進めたところ、意外なことに、ＭＳＣの培養上清が腸炎の予防・治療効果を有していることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤や、（２）ＭＳＣの培養上清が、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である上記（１）に記載の腸炎の予防・治療剤や、（３）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）である上記（１）又は（２）に記載の腸炎の予防・治療剤や、（４）腸炎が、炎症性腸疾患である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の腸炎の予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、腸炎の予防、治療や、改善が可能となる。また、本発明によると、ＭＳＣ自体を用いる非特許文献１のような場合とは違って、薬剤を調製する施設は通常の施設でもよいため、必要な時期に必要な量を確保し易く、また、患者の拒絶反応を考慮する必要がないので、ＭＳＣ自体を用いる場合と比較して簡便性及び利便性に非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】３種類（低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）のｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）で処理したＩＥＣ−６細胞をＭＴＴアッセイした結果を示す図である。縦軸に、生細胞におけるＭＴＴ還元物質の発色の程度の指標となる吸光度を示し、横軸に処理後の経過時間を示す。グラフは、各経過時間において、左から順に、無血清ＤＭＥＭ（ｍｅｄｉｕｍ）、低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）処理を示す。
【図２】血清枯渇前のＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図３】血清存在下で４８時間培養したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図４】血清枯渇により４８時間培養したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図５】４８時間ｎｏｒＣＭ処理したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図６】４８時間ｈｙｐｏＣＭ処理したＩＥＣ−６細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図７】ＴＵＮＥＬによりＩＥＣ−６細胞におけるアポトーシスを解析した結果を示す図である。「＊」は、ＩＦＮγ４８とｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝９．１Ｅ−７）、ＩＦＮγ４８とｎｏｒＣＭ（Ｐ＝０．０２３）、及びｎｏｒＣＭとｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０１２）との間の統計的有意性を示す。なお、各群に用いたＣＭの量は１．５ｍＬであった。
【図８】スクラッチアッセイによりＩＥＣ−６細胞遊走を解析した結果を示す図である。縦軸には、各グループにおける２４時間後のスクラッチ領域と０時間のスクラッチ領域との比率を示す。２４時間後のスクラッチ領域は、［２４時間後のスクラッチ領域］＝１００×［２４時間時点のスクラッチ領域面積］／［０時間時点のスクラッチ領域面積］としてコンピューターで算出した。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。なお、各群に用いた馴化培地（ＣＭ）の量は１．５ｍｇ（１．５ｍＬ）であった。「＊」は、対照である無血清ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉｕｍ）とｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０２４４５）、γＣＭとｈｙｐｏＣＭ（Ｐ＝０．０２２６７）との間の統計的有意性を示す。
【図９】ＩＥＣ−６細胞およびＭＳＣにおけるＡｋｔ及びＭＡＰＫシグナル活性をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図である。左パネルは、４種類の培地（ＤＭＥＭ［ＦＢＳ＋］、ＤＭＥＭ［ＦＢＳ−］、ｎｏｒＣＭ、及びｈｙｐｏＣＭ）条件下でＩＥＣ−６細胞を培養した後、それぞれの培養液から得られたＩＥＣ−６細胞を解析した結果を示し、右パネルは、３種類の培地（ＤＭＥＭ［ＦＢＳ−］、ｎｏｒＣＭ、及びｈｙｐｏＣＭ）で培養したＭＳＣを解析した結果を示す。
【図１０】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。括弧付きの矢頭は、ＣＭ５００×３投与群において、ＭＳＣ−ＣＭが投与されなかった日を示す。「＊」は、ＣＭ５００×５投与群とＰＢＳ投与群（１３、１４、及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０４７、０．０３２、及び１Ｐ＝０．０１９）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１１】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットのＤＡＩスコアの経時的変化を示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、「＊」又は「＊＊」は、５００×５ ＭＳＣ−ＣＭ投与群とＰＢＳ投与群（９、１１、１２、１３、１４、及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００４、３．４８Ｅ−４、０．００５、０．０１４、０．００１、及び０．００２）との間；ＣＭ５００×３投与群とＰＢＳ投与群（１４日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０２６及び０．００９）との間；ＣＭ２００×３投与群とＰＢＳ投与群（１４日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．０２９及び０．００１４）との間；及びＣＭ５００×５投与群とＣＭ５００×３投与群（１１日目にＰ＝０．００４７）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１２】３種類のＭＳＣ−ＣＭ投与群（１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを５日間投与した群［ＣＭ５００×５投与群］、１日当り５００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ５００×３投与群］、及び１日当り２００μｇのＭＳＣ−ＣＭを３日間投与した群［ＣＭ２００×３投与群］）とＰＢＳ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの下痢スコア（ＤＡＩスコアの詳細）の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×５投与群］の結果を表し、「■」でドットされるグラフは［ＣＭ５００×３投与群］の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは［ＣＭ２００×３投与群］の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。「＊」又は「＊＊」は、ＣＭ５００×５投与群とＰＢＳ投与群（１１、１２、１３、及び１５日目にそれぞれＰ＝２．０６Ｅ−４、０．００５、０．００５、及び３．８２Ｅ−４）との間；ＣＭ５００×３投与群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００９及び３．８２Ｅ−４）との間；ＣＭ２００×３投与群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１５日目にそれぞれＰ＝０．００２及び０．０００１）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１３】３種類の経路による投与群（腹腔内投与［ＩＰ群］、腸管内投与、すなわち注腸［ＩＣ群］及び静脈内投与［ＩＶ群］）とＰＢＳ投与群（静脈内投与）における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「■」でドットされるグラフは腹腔内［ＩＰ］投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは腸管内［ＩＣ、即ち注腸］投与群の結果を表し、「●」でドットされるグラフは静脈内［ＩＶ］投与群の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。なお、各群に用いたＣＭの量は５００μｇであった。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。「＊」は、ＩＣ群とＰＢＳ投与群（１２、１３、及び１４日目にそれぞれＰ＝０．０３３、０．０３５、及び０．０４２）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１４】３種類の経路による投与群（腹腔内投与［ＩＰ群］、腸管内投与、すなわち注腸［ＩＣ群］及び静脈内投与［ＩＶ群］）とＰＢＳ投与群（静脈内投与）における、ＤＳＳ腸炎ラットのＤＡＩスコアの経時的変化を示す図である。「■」でドットされるグラフは腹腔内［ＩＰ］投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフは腸管内［ＩＣ、即ち注腸］投与群の結果を表し、「●」でドットされるグラフは静脈内［ＩＶ］投与群の結果を表し、「×」でドットされるグラフはＰＢＳ投与群の結果を表す。なお、各群に用いたＣＭの量は５００μｇであった。また、「＊」又は「＊＊」は、ＩＰ群とＩＣ群（１１日目及び１２日目にそれぞれＰ＝０．０２１及び０．０１１）との間；ＩＶ群とＰＢＳ投与群（１１日目及び１２日目にそれぞれＰ＝０．００４及び０．００６）との間；並びにＩＰ群とＰＢＳ投与群（１２、１３、及び１４日目にそれぞれＰ＝３．７４０Ｅ−４、０．００８、及び０．００６）との間の統計的有意性を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１５】ＤＭＥＭ、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎ラットの体重（上段）及びＤＡＩスコア（下段）の経時的変化及び治療プロトコルを示す図である。「●」でドットされるグラフはｎｏｒＣＭ投与群の結果を表し、「▲」でドットされるグラフはＤＭＥＭ投与群の結果を表し「■」でドットされるグラフはｈｙｐｏＣＭ投与群の結果を表す。なお、ｎｏｒＣＭ投与群及びｈｙｐｏＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＤＭＥＭ投与群に用いたＤＭＥＭの量は５００μＬであった。また、矢頭は、ＭＳＣ−ＣＭが投与された日を示す。ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ投与群の各日数に示される「＊」は、ＤＭＥＭ投与群に対する統計的有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１６】ＰＢＳ及びＭＳＣ−ＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎急性期及び回復期の病理組織学的評価を示す図である。縦軸には、組織学的スコアを示し、横軸には、腸炎の急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）の各サンプルを示し、グラフはそれぞれ左から順に、ＰＢＳ投与群及びＭＳＣ−ＣＭ投与群を示す。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＰＢＳ投与群に用いたＰＢＳの量は５００μＬであった。「＊」は、ＰＢＳ投与群とＭＳＣ−ＣＭ投与群との間の統計的有意性を示す（Ｐ＝７．９８Ｅ−５）。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１７】ＰＢＳ及びＭＳＣ−ＣＭ投与群における、ＤＳＳ腸炎急性期及び回復期の大腸細胞数を解析した結果を示す図である。縦軸には、Ｋｉ−６７陽性細胞を指標とした値を示し、横軸には、急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）の各サンプルを示し、グラフはそれぞれ左から順に、ＰＢＳ投与群及びＭＳＣ−ＣＭ投与群を示す。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与群に用いたＣＭの量はそれぞれ５００μｇであり、ＰＢＳ投与群に用いたＰＢＳの量は５００μＬであった。また、Ｋｉ−６７陽性細胞数としては、代表的な５つの標本中のクリプトの全有核数に対するＫｉ−６７陽性細胞数の割合の平均値を示した。「＊」は、ＰＢＳ投与群とＭＳＣ−ＣＭ投与群との間の統計的有意性を示す（Ｐ＝１．４３Ｅ−４）。各々の群は５匹のラットからなり、エラーバーは平均値±ＳＥを示す。
【図１８】ｈｙｐｏＣＭ及びｎｏｒＣＭに含まれるラット炎症性サイトカインのタンパク質量を、Rat Cytokine Antibody Array G Series 2により解析した結果を示す図である。縦軸には、標準化したアレイの値を示し、横軸には、解析した３４種類のタンパク質を示し、各タンパク質のグラフはそれぞれ左から順に、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の腸炎の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含んでいる限り特に制限されず、本発明における腸炎としては、腸炎である限り特に制限されず、具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗がん剤や抗生物質等の薬剤による薬剤性腸炎、放射線による放射線腸炎等を好適に例示することができ、中でも、潰瘍性大腸炎、クローン病を好適に例示することができる。本発明の作用機序の詳細は不明であるが、ＭＳＣの培養上清に含まれている、ＭＳＣ由来の何らかの活性成分が、腸炎に対して予防・治療効果を発揮しているものと考えられる。
【００１３】
本明細書における「ＭＳＣの培養上清」とは、ＭＳＣが増殖し得る条件の下、ＭＳＣが増殖し得る培養液でＭＳＣを培養して得られた培養液（培養後の培養液）からＭＳＣを除去したものを意味するが、かかる培養上清から、例えば、残存培地成分（培養前の培養液の成分のうち、培養後の培養液中に残存している成分）、培養液の水分などの、本発明における腸炎の予防・治療効果に寄与しない成分の少なくとも一部をさらに除去したものも、便宜上、本明細書におけるＭＳＣの培養上清に含まれる。なお、簡便性の観点からは、培養後の培養液からＭＳＣを除去したものをそのまま培養上清として用いることが好ましい。
【００１４】
前述のＭＳＣが増殖し得る培養液としては、本発明における腸炎の予防・治療効果が得られる限り、特に制限されないが、イーグル最小必須培地（Eagle’s Minimum Essential Medium：ＥＭＥＭ）、最小必須培地α（Minimum Essential Medium α：ＭＥＭα）、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ＤＭＥＭ）などの哺乳動物細胞用の細胞培地を例示することができ、中でも、ＤＭＥＭを好適に例示することができ、中でも、グルコースを１，０００ｍｇ／ｍＬ、グルタミンを５８４ｍｇ／ｍＬ含有するＤＭＥＭをより好適に例示することができ、中でも、Invitrogen社製のＤＭＥＭをさらに好適に例示することができる。なお、培養液は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を添加したものであってもよいが、哺乳動物に投与した際の抗原抗体反応を避ける観点から、無血清の培養液を好適に例示することができる。培養液の原材料は市販されているものを適宜利用することができる。
【００１５】
ＭＳＣを培養する際の培養条件としては、ＭＳＣが増殖し得る培養条件である限り、特に制限されないが、より優れた腸炎の予防・治療効果を得る観点から、通常の大気中の酸素濃度（２０％）よりも低い酸素濃度下（本明細書において、「低酸素濃度下」とも表示する。）で培養することが好ましい。前述の低酸素濃度下としては、培養中の培養液に接している気体中の濃度が好ましくは１〜１９％の範囲内、より好ましくは１〜１５％の範囲内、さらに好ましくは１．５〜１０％の範囲内、さらにより好ましくは２〜８％の範囲内の条件下であることを好適に含む。かかる低酸素濃度下での培養は、例えば、市販の低酸素チャンバー（低温Ｏ２／ＣＯ２インキュベータ９２００ＥＸ、和研薬株式会社製）内で培養することによって、行うことができる。
【００１６】
上記の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としては、未分化の間葉系細胞である限り特に制限はされず、哺乳動物の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血等から常法に従い採取した後、未分化のＭＳＣをプラスチック付着性の有無等により選択することができる。即ち、骨髄等に含まれる細胞の中で付着性を有するものを選択することによりＭＳＣを得ることができる。ここで、ＭＳＣとしては、本発明のより優れた効果を得る観点から、骨髄間葉系幹細胞を用いることが好ましい。かかる骨髄間葉系幹細胞は、例えば骨髄間質細胞から分離することができる。また、上記のＭＳＣとしては、本発明の予防・治療剤の投与対象と同種の哺乳動物由来のＭＳＣを用いることが好ましく、投与対象以外の同種の哺乳動物由来のＭＳＣや、投与対象自身のＭＳＣ（自家細胞）を用いることができる。なお、培養上清を作製する際の培養に用いるＭＳＣとしては、ＭＳＣを７０〜９０％コンフルエント（好ましくは８０％コンフルエント）まで増殖させて得られた細胞をゼロ継代とし、それをさらに増殖させて３〜５継代のＭＳＣを用いることができる。
【００１７】
本発明における腸炎の予防・治療効果とは、いずれかの腸炎の発症を予防及び／又は治療する効果を意味する。かかる治療効果には、その腸炎を完全に治癒する効果だけでなく、そのいずれかの症状を軽減、改善する効果の他、かかる症状の悪化の速度を低下させる効果も含まれる。
【００１８】
本発明の予防・治療剤は、本発明における腸炎の予防・治療効果が得られる限り、ＭＳＣの培養上清以外の腸炎の予防・治療剤などの任意成分をさらに含んでいてもよいし、生理食塩水等で希釈されていてもよい。
【００１９】
本発明の予防・治療剤に含有されるＭＳＣの培養上清は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、腸炎に対する優れた予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＭＳＣの培養上清を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＭＳＣの培養上清を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００２０】
本発明の予防・治療剤の投与方法としては特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を好適に例示することができ、中でも、血管内投与をより好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の予防・治療剤の投与量としては、腸炎の種類や、その症状の度合い、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、ＭＳＣの培養上清（非乾燥重量）換算で、例えば、１日当たり、０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの範囲を好適に例示することができ、中でも、１μｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの範囲をより好適に例示することができる。なお、本発明の予防・治療剤の投与は、１日のうち１〜複数回に分けて行ってもよい。また、本発明の予防・治療剤の投与は継続的に行うことが好ましい。例えば、３日に１回以上の頻度で、２回以上継続して投与することが好ましく、中でも、２日に１回以上の頻度で、３回以上継続して投与することがより好ましく、中でも、１日に１回以上の頻度で４回以上継続して投与することが好ましい。
【００２２】
本発明の予防・治療剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤に含まれる「ＭＳＣの培養上清」における「ＭＳＣ」の由来である哺乳動物の種類は、本発明の予防・治療剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、腸炎に対するより安定して優れた予防・治療効果を得る観点から好ましい。
【００２３】
なお、本発明の他の態様として、本発明の腸炎の予防・治療剤や改善剤の調製に使用するためのＭＳＣの培養上清の使用や、ＭＳＣの培養上清を、上記の腸炎の予防・治療や改善に使用する方法や、ＭＳＣの培養上清を対象哺乳動物に投与することにより、上記の腸炎を予防・治療あるいは改善する方法を挙げることができる。
【００２４】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［細胞培養及び実験動物］
ラット骨髄間葉系幹細胞（Rat Mesenchymal stem cells；ｒＭＳＣ）を８週齢のLewisラット（Charles River研究所）の骨髄から採取し、文献に記載の通りに培養した（Javazon EH, Colter DC, Schwarz EJ, Prockop DJ. Rat marrow stromalcells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromalcells. Stem Cells 2001;19:219-225.）。すなわち、大腿骨及び脛骨の骨幹に針を刺して骨髄細胞を採取し、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全α改変イーグル培地（ＭＥＭα、Invitrogen社製, Carlsbad, CA）３０ｍｌで洗浄した後、骨髄細胞懸濁液を７０μｍナイロンフィルター（Becton Dickinson社製, Franklin Lakes, NJ）でろ過し、７５ｃｍ２フラスコにプレートした。完全ＭＥＭα（１５％ＦＢＳ）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で骨髄細胞を増殖させ、３日後に上記培地を新しい完全ＭＥＭα培地（１５％ＦＢＳ）に交換し、接着した骨髄細胞を８０％コンフルエントまで増殖させ、得られた細胞試料をゼロ継代（passage 0）と定義した。３継代〜５継代の細胞を実験に用いた。American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手したラット小腸由来の細胞（ＩＥＣ−６細胞）及びヒト結腸癌由来の細胞（Ｃａｃｏ−２細胞）を通常（２０％）酸素下でＤＭＥＭ（Invitrogen社製）及びＭＥＭ（Invitrogen社製）で各々維持した。札幌医科大学動物実験委員会のガイドラインに従い、Lewisラットを飼養した。札幌医科大学の組換えＤＮＡ実験の安全性のための動物実験委員会が、全ての実験プロトコルを検討、承認した。ラットは全て雄で、使用時には８週齢、体重は２５０ｇ以下であった。
【００２６】
［ｒＭＳＣの免疫表現型、インビトロでの分化、及び蛍光免疫組織染色］
ｒＭＳＣの免疫表現型を、ラット表面抗原ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、及びＣＤ９０に対する特異的抗体（イムノテック社製）を用いてFACSCalibur（BD Biosciences社製, Franklin Lakes, NJ）により決定した（Javazon EH, Colter DC, Schwarz EJ, Prockop DJ. Rat marrow stromalcells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem Cells 2001;19:219-225.）。また、かかるｒＭＳＣのインビボでの骨細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞への分化能を確認した（Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymalstem cells: candidate MSC-Like cells from umbilical cord. Stem Cells 2003;21:105-110.）。
【００２７】
［ｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の調製］
インビボの治療に最適なｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）について検討するために、３種類の馴化培地（ＣＭ）、すなわち、通常酸素下でインキュベートした馴化培地（ｎｏｒＣＭ）、低酸素下でインキュベートした馴化培地（ｈｙｐｏＣＭ）、及び、ＩＮＦγで刺激した馴化培地（γＣＭ）を調製した。具体的には、以下のような方法で行った。
ｒＭＳＣ（４×１０５細胞）を１５０ｍｍの培養皿に適切なスケールで播種し、ｒＭＳＣがコンフルエントに達するまで完全ＭＥＭα（１５％ＦＢＳ）で培養した。かかるｒＭＳＣを以下の３種類のＣＭの調製に用いた。ｎｏｒＣＭの場合は、前述のｒＭＳＣを無血清ＤＭＥＭで、通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した。ｈｙｐｏＣＭの場合は、前述のｒＭＳＣを無血清ＤＭＥＭで、低酸素下（酸素濃度５％）、２４時間培養した。γＣＭの場合は、ラットＩＮＦγ（１００ｎｇ／ｍｌ、BioLegend社製）を含む無血清ＤＭＥＭで、前述のｒＭＳＣを通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、さらに無血清ＤＭＥＭで、通常酸素下（酸素濃度２０％）、２４時間培養した。
３種類それぞれの場合のＣＭを収集し、３００×ｇで５分間遠心し、最後に０．２２μｍのシリンジフィルターを用いてろ過し、使用時まで−８０℃で保存した。製造元の説明書に従い、カットオフ値が１０ｋＤａの遠心ろ過ユニット（Ultracel-10K Millipore社製）を用いて、限外ろ過により上記ＣＭ（ｎｏｒＣＭ、ｈｙｐｏＣＭ、又は、γＣＭ）をさらに濃縮（最終濃度１μｇ／μｌ）してインビボ実験用とした。なお、通常酸素下の培養は、標準的インキュベータ内において５％ＣＯ２及び２０％Ｏ２含有空気下で行い、低酸素下での培養は、製造元の説明書に従って最終酸素濃度５％の低酸素条件をセットした、低酸素チャンバー（低温Ｏ２／ＣＯ２インキュベータ９２００ＥＸ、和研薬株式会社製）内において行った。
【００２８】
［ＭＴＴアッセイ］
細胞生存率を、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド］発色還元アッセイにより測定した（Sladowski D, Steer SJ, Clothier RH, Balls M. An improved MTT assay. Immunol Methods 1993;157:203-207.）。すなわち、細胞を９６ウェルプレートに播種し、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所製）のアリコート１０μｌを上記９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートして反応させた。生細胞におけるＭＴＴ還元物質の発色の程度の指標となる吸光度に基づいて、ＭＴＴの発色が阻害される割合を導き、かかる割合を基に細胞生存率を算出した。ＭＴＴ還元物質の発色レベルは、波長４５０ｎｍの吸光度として測定した。
【００２９】
［細胞周期及びアポトーシスの解析］
フローサイトメトリー用として、ＩＥＣ−６単細胞懸濁液（Single cell suspension）を９０％低温エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ Ａで処理し、ヨウ化プロピジウムで染色した。フローサイトメトリーで測定されるサブＧ１のピークを、アポトーシス細胞分画とした。DeadEndColorimetric TUNELシステム（Promega社製）を用いて、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応を行った。製造元の説明書に従って、Ｋｉ６７免疫組織化学法（Abcam社製）を行った。少なくとも５つの異なる試料においてＫｉ６７陽性核及びＴＵＮＥＬ陽性核をカウントし、Ｋｉ６７標識指標及びアポトーシス指標を百分率で表した。
【００３０】
［スクラッチアッセイ］
ＩＥＣ−６細胞のインビトロの遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、即ち「スクラッチアッセイ」により測定した。ｐ２００ピペットの先端で、３５ｍｍ皿上のＩＥＣ−６単層に直線の傷を十字状につけて「スクラッチ」を作り、よく洗浄して、削られた細胞を除去した後、各々１．５ｍｌのＭＳＣ−ＣＭを加えた。画像を取得する際に位相差顕微鏡下で同一の区域を得ることができるように、上記スクラッチの近傍に、基準点として利用できる印をつけた。一定時間ごと（０、６、１２、及び２４時間）に観察するため、上記の皿を３７℃のインキュベータから取り出すことが可能であり、各々の時間枠経過後の画像を取得した後に戻して、インキュベートを再開した。各々の画像について、TScratch programソフトウェア（http://www.cse-lab.ethz.ch/software.htmlから無料で入手）を用いて各時間枠の、開放創（open wound）の区域面積を定量的に測定した。各実験は少なくとも３回繰り返した（Geback T, Schulz MMP, Koumoutsakos P, Detmar M. A novel and simple software tool for automated analysis of monolayer wound healing assays. BioTechniques2009;46:265-274.）。
【００３１】
［残存シグナルのウエスタンブロット解析］
各々のコンフルエント細胞を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、及び１％のTritonX-100、並びにプロテアーゼインヒビターカクテル錠Complete Mini（商標）（Roche Diagnostics社製）及びホスファターゼインヒビターカクテル錠PhosSTOP（Roche Diagnostics社製）を１錠ずつ含む放射線免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファーに溶解した。Bio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad社製）によりタンパク質量を算出した各々の溶解液４０μｇを、１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ溶液中でブロッキング処理した後、ｐａｎ−Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、Ｅｒｋ５、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ５、及びＪＮＫ１／３に対する一次抗体（Santa Cruz社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｐ３８、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８に対する一次抗体（Cell Signaling Technology社製）、並びにβアクチンに対する一次抗体（Sigma-Aldrich社製）と共に上記膜をインキュベートし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Santa Cruz社製）と共にインキュベートした。enhanced chemiluminescence kit（Amersham Biosciences社製）を用いて免疫反応を進行させた。
【００３２】
［実験腸炎モデル及び腸炎の重症度の評価］
５％ＤＳＳを含む飲水を７日間（０日目〜６日目）不断給餌することによりＤＳＳ腸炎を誘発させた。６日目に上記ＤＳＳ溶液を水に交換し、体重、文献（Cooper HS, Murthy SNS, Shah RS, Sedergran DJ. Clinicopathologicstudy of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest 1993;69:238-249.）に記載のDisease activity index score（ＤＡＩスコア）、及び組織学的スコアによる評価を行うまで、ラットに毎日普通の水を飲ませた。上記のＤＡＩスコアは、便性状（硬便＝０；軟便＝１；水様便＝２）、血便（なし＝０；少（付着程度）＝１；多（流出）＝２）、体重減少（基準から２％未満の減少＝０；基準から２％以上５％未満の減少＝１；基準から５％以上１０％未満の減少＝２；基準から１０％以上の減少＝３）と規定した上で、「便性状」×２＋「血便」×２＋体重減少＝ＤＡＩスコア、という式に基づいて算出した。また上記の組織学的スコアは、次の通りである：炎症重症度、なし＝０；軽度＝１；中程度＝２；炎症性細胞浸潤を伴う重度＝３。炎症の範囲、なし＝０；粘膜のみ＝１；粘膜及び粘膜下層＝２；貫壁性浸潤＝３。陰窩の損傷、損傷なし＝０、基底の１／３が損傷＝１、基底の２／３が損傷＝２、陰窩が消失しているが表層上皮が存在する場合＝３、陰窩及び表層上皮の両方が消失している場合＝３（Williams KL, et al. Enhanced survival and mucosal repair after dextransodium sulfate-induced colitis in transgenic mice that overexpressgrowth hormone. Gastroenterology 2001;120:925-937.）。上記グループ分けについて知らされていない病理医が、腸炎実験の最も炎症の重い病変、及び対照である腸管の対応する解剖学的切片について、代表的断面をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、組織学的スコアを独立に判定した。各ラット（ｎ＝１０）由来の３つの全周断面（全部で９０断面）を解析した。Ｋｉ６７に対するウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をAbcam社から購入した。
【００３３】
［ＭＳＣ−ＣＭに放出されたサイトカイン及びケモカインの検出］
製造元の説明書にしたがい、複数タンパク質ＥＬＩＳＡキット、Multi-AnalyteELISArray（商標）キット（SABioscience社製）を用いてラット炎症性サイトカインについてＭＳＣ−ＣＭを分析した。簡潔に述べれば、各々のＭＳＣ−ＣＭを、キットに付属するサンプル希釈用バッファーで十分に希釈した。このキットを用いてＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ，ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、及びＭＩＰ−１βの濃度を分析した。上記キットにより供給される陰性及び陽性対照も測定した（Sand KL, Rolin KJ, Al-Falahi Y, Maghazachi AA. Modulation of natural killer cell cytotoxicity and cytokine release by the drug glatiramer acetate. Cell Mol Life Sci2009;66:1446-1456.）。
【００３４】
［統計学的分析］
２つのグループを比較するため、独立ｔ検定及びマン−ホイットニーＵ検定を用いて、パラメトリック分析及びノンパラメトリック分析を各々行った。カイ二乗検定、ピアソンの統計に基づく実際のＰ値、又はモンテカルロ法を用いて分類に基づく変数（categorical variables）を比較した。多重比較のため、特に経時的評価においてＡＮＯＶＡを採用して、２要因反復測定（対象間―対象内混合（mixed between-within subject））ＡＮＯＶＡを行い、続いてボンフェローニ検定を適用した（Tabachnick BG, Fidell LS, eds. Using multivariate statistics (4th edn). New York: HarperCollins; 2001.）。全ての両側検定（two-tailed test）においてＰ＜０．０５の場合に有意性があるとみなした。全ての統計的検定に、SPSS Statisticsソフトウェア 17.0（Chicago, IL）を用いた。
【００３５】
［結果］
［インビトロの細胞生存性、細胞周期、アポトーシス、遊走、及び生存シグナル活性化に対するＭＳＣ−ＣＭの効果］
インビトロでのＩＥＣ−６細胞株の増殖に対する３種類（低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）、ＩＦＮ−γ刺激処理（γＣＭ）、及び通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ））のｒＭＳＣ由来馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の効果や培地濃度による効果を調べるため、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率（図１）及び細胞周期（図２〜６）を解析した。その結果、ＩＥＣ−６細胞の細胞生存率は、低酸素による前処理（ｈｙｐｏＣＭ）群で最も高く、特に処理後８７時間において顕著な差が認められた（図１）。また、フローサイトメトリーにより細胞周期を解析したところ、血清枯渇前のＩＥＣ−６細胞（図２）や血清存在下で培養したＩＥＣ−６細胞（図３）と比較して、血清枯渇により４８時間培養したＩＥＣ−６細胞は、サブＧ１のピークが上昇した（図４）。一方、ＩＥＣ−６細胞を４８時間血清飢餓状態に置いても、ｎｏｒＣＭ（図５）、又はｈｙｐｏＣＭ（図６）のいずれかを用いた場合において、かかるサブＧ１のピークの上昇は抑制された。これらの結果は、ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭで培養を行うことにより、血清枯渇によるアポトーシスの誘導が阻害されたことを示唆している。そこで、ＴＵＮＥＬによりＩＥＣ−６細胞におけるアポトーシスを解析したところ、４８時間ＩＦＮ−γ刺激処理（ＩＦＮγ４８）した場合と比較して、通常酸素前処理（ｎｏｒＣＭ）（Ｐ＝０．０２３）及び低酸素前処理（ｈｙｐｏＣＭ）（Ｐ＝９．１Ｅ−７）によりアポトーシスは有意に抑制されていることが示された（図７）。さらにｈｙｐｏＣＭ処理によるアポトーシスの抑制効果は、ｎｏｒＣＭ処理によるそれよりも有意に大きかった（Ｐ＝０．０１２、図７）。次に、インビトロのＩＥＣ−６細胞遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、すなわち「スクラッチアッセイ」により測定した（図８）。その結果、ｈｙｐｏＣＭによる処理は、ＤＭＥＭ培地（Ｐ＝０．０２４４５）及びγＣＭ処理（Ｐ＝０．０２２６７）と比較して傷の治癒を促進することが示された（図８）。さらに、ＩＥＣ−６におけるＡｋｔ及びＪＮＫ１／３シグナル活性を解析したところ、血清飢餓処理（ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−））と比較して、ＭＳＣ−ＣＭ（ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ）処理によりＩＥＣ−６細胞におけるリン酸化されたＡｋｔ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ）及びＪＮＫ１／３レベルが上昇した（図９）。これらの結果は、ＭＳＣ−ＣＭ（ｎｏｒＣＭ及びｈｙｐｏＣＭ）処理によりＡｋｔ及びＪＮＫ１／３シグナルが活性化された結果、細胞遊走が促進されたことを示している。
【００３６】
［腸炎に対するＭＳＣ−ＣＭインビボ投与の治療効果］
５％ＤＳＳで誘発させた急性腸炎（ＤＳＳ腸炎）ラットの尾静脈に、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を静脈注射し、ＭＳＣ−ＣＭにより治療効果があるかどうかを、体重（図１０）及び疾患活動性指標（ＤＡＩ）スコア（図１１）を指標に調べた。その結果、ＤＳＳに曝露させた期間の腸炎急性期（０日目〜６日目）では、有意な治療効果は見られなかったが、ＤＳＳ曝露を止めてＤＳＳを含まない飲水に代えた回復期間では、ＭＳＣ−ＣＭ投与により体重が有意に回復することが示された（図１０）。特に投与後１２日目〜１４日目（回復期間の５日目〜７日目）における急性腸炎ラットの体重変化から、ＭＳＣ−ＣＭ投与量依存的な治療効果があることを示された。同様に、ＭＳＣ−ＣＭ投与によりＤＡＩスコアが回復し、特に５００μｇ／日のＭＳＣ−ＣＭを投与した群では、対照（ＰＢＳ投与）と比べ優れた有意差を有していた（図１１）。さらにＤＡＩスコアを詳細に解析したところ、ＭＳＣ−ＣＭ投与により下痢症状が軽減した（図１２）。
【００３７】
［ＤＳＳ腸炎に対する最適なＭＳＣ−ＣＭの療法の検討］
次に、ＭＳＣ−ＣＭの投与方法により腸炎治療効果に違いがあるかどうかを調べた。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を、３種類の投与経路（腹腔内［ＩＰ］、腸管内［ＩＣ、即ち注腸］又は静脈内［ＩＶ］）により急性腸炎ラットへ投与し、体重（図１３）及びＤＡＩスコア（図１４）を指標に調べた。その結果、いずれの経路によるＭＳＣ−ＣＭの投与においても、対照（ＰＢＳ）と比べ体重の回復効果が認められたが、３種類の経路による投与方法の間で違いは認められなかった（図１３）。また、注腸（ＩＣ）に投与した場合、投与後１２日目〜１４日目（回復期間の５日目〜７日目）における体重は、対照（ＰＢＳ投与）と比べ有意差が認められた（図１３）。同様に、ＤＡＩスコアについても、３種類の経路によるＭＳＣ−ＣＭの投与により、対照（ＰＢＳ）と比べ回復していることが示された（図１４）。また、腹腔内投与（ＩＰ）と腸管内（ＩＣ）投与とを比較した場合、１１日目（Ｐ＝０．０１１）及び１２日目（Ｐ＝０．０２１）で有意差が認められた（図１４）。また、静脈内投与（ＩＶ）でも、腸管内（ＩＣ）投与と比較して好適な結果が得られた。次に、インビトロでの実験において、ｎｏｒＣＭ処理よりもｈｙｐｏＣＭ処理の方が効果的であったことから、インビボでの腸炎の治療においてもｈｙｐｏＣＭ処理が効果的であるどうかについて調べた。その結果、ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合と比べ、ｈｙｐｏＣＭを投与した場合の方が、体重の回復（図１５、上段）及びＤＡＩスコアの回復（図１５、下段）レベルがともに高かった。また、ｈｙｐｏＣＭを投与した場合のＤＡＩスコアの回復効果は、対照（ＤＭＥＭ）を投与した場合と比べ、投与後８〜１１及び１３日目に有意差が認められた（図１５、下段）。
【００３８】
［腸炎の急性期及び回復期の病理組織学的評価］
さらに、ＭＳＣ−ＣＭ療法効果を病理組織学的解析により詳細に解析した。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地（ｎｏｒＣＭ）を、ＤＳＳ腸炎ラットへ投与し、大腸上皮の損傷レベルを、組織学的スコアを指標に解析し（図１６）、また大腸細胞数を、Ｋｉ−６７陽性細胞を指標に解析した（図１７）。その結果、腸炎の急性期（Inductive phase）及び回復期（Recovery phase）において、ＭＳＣ−ＣＭで治療したラットの上皮傷害レベルは著しく抑制され（図１６）、またＫｉ−６７陽性細胞数は増加していることが示された（図１７）。特に、腸炎急性期（Inductive phase）において、ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合の上皮傷害レベル（Ｐ＝７／９８Ｅ−５）及びＫｉ−６７陽性細胞数（Ｐ＝１．４３Ｅ−４）は、対照（培養培地投与）と比べ、統計的有意性を示していた。また、ＭＳＣ−ＣＭ投与により、腸炎の急性期（Inductive phase）では、Ｋｉ−６７陽性細胞が陰窩の上方に顕著に増加していたが、回復期（Recovery phase）ではこの傾向は認められなかった。なお、ＭＳＣ−ＣＭ投与により、claudin-2（ｃｌｄｎ−２）タンパク質は、アップレギュレーションされて急性期（Inductive phase）では主に陰窩の基底部位に再分布したが、回復期（Recovery phase）にはダウンレギュレーションされることも確認した。対照的に、ＤＳＳ腸炎ラット対照群における急性期（Inductive phase）には、ｃｌｄｎ−２はダウンレギュレーションされ、また回復期（Recovery phase）にはアップレギュレーションされることも確認した。これらの結果から、ＭＳＣ−ＣＭは、腸炎急性期に上皮の細胞回転を著明に亢進させ、その傷害を低減することが示された。また、その際に、ｃｌｄｎ−２タンパクの誘導、再分布が認められたことから、ＭＳＣ−ＣＭは、上皮バリア機能回復にも寄与する可能性が認められた。
【００３９】
［ＭＳＣ−ＣＭの含有物の測定］
ＤＳＳ腸炎に対するｈｙｐｏＣＭ治療作用機構を調べるため、ＭＳＣ−ＣＭ中に含まれるラット炎症性サイトカインのタンパク質量をMulti-Analyte ELISArrayにより解析した（図１８）。３４種類の代表的なサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子のアレイを選択し、ｎｏｒＣＭ処理及びｈｙｐｏＣＭ処理した場合の培地に含まれる上記３４種類のタンパク質の発現量を比較した（図１８）。その結果、ＶＥＧＦとＭＣＰ−１の発現量は、ｎｏｒＣＭ処理した場合と比べ、ｈｙｐｏＣＭ処理した方が高く、有意差が認められた（図１８）。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、腸炎の予防・治療の分野に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤。
【請求項２】
ＭＳＣの培養上清が、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である請求項１に記載の腸炎の予防・治療剤。
【請求項３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）である請求項１又は２に記載の腸炎の予防・治療剤。
【請求項４】
腸炎が、炎症性腸疾患である請求項１〜３のいずれかに記載の腸炎の予防・治療剤。
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤。
【請求項２】
ＭＳＣの培養上清が、ＭＳＣを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である請求項１に記載の腸炎の予防・治療剤。
【請求項３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）である請求項１又は２に記載の腸炎の予防・治療剤。
【請求項４】
腸炎が、炎症性腸疾患である請求項１〜３のいずれかに記載の腸炎の予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１３−１８７５６（Ｐ２０１３−１８７５６Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５５１４２（Ｐ２０１１−１５５１４２）
【出願日】平成２３年７月１３日（２０１１．７．１３）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１３日（２０１１．７．１３）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
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