高発現ベクター、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法
【目的】 バチルス属細菌内に高発現ベクターを安定に保持させ、かつペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産させる。
【構成】 高発現ベクターは、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含む。また、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍には、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向、すなわち、従来とは逆方向であるカナマイシン耐性遺伝子の方向に、ＳＤ配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結する。前記高発現ベクターによりバチルス属細菌を形質転換し、形質転換株を培養すると、多量のペプチド又は蛋白質が得られる。
【構成】 高発現ベクターは、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含む。また、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍には、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向、すなわち、従来とは逆方向であるカナマイシン耐性遺伝子の方向に、ＳＤ配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結する。前記高発現ベクターによりバチルス属細菌を形質転換し、形質転換株を培養すると、多量のペプチド又は蛋白質が得られる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、枯草菌を代表とするバチルス属細菌で利用可能な新規な高発現ベクター、このベクターを保有するバチルス属細菌、およびこのバチルス属細菌によるペプチド又は蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】枯草菌（Bacillus subtilis）を代表とするバチルス（Bacillus）属細菌は、古くから種々の菌体外酵素の生産菌として、工業的に利用されている。例えば、枯草菌の仲間は、日本において古くから納豆の製造に使用されており、大腸菌などで問題となるエンドトキシンを生産しないこと、人体に寄生しないことなどの理由から、極めて安全性の高い微生物である。このように、枯草菌は、ペプチド又は蛋白質の工業的な生産菌として、優れた性質を有し、その有用性が注目されている。例えば、特開昭５６−１３７９８６号公報には、前記菌体外酵素の遺伝子のプロモーター、ＳＤ配列（シャイン−ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列）、シグナル遺伝子をコードするＤＮＡをクローニングし、その下流に目的とするペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを枯草菌に導入し、目的とするペプチド又は蛋白質を菌体外に分泌生産させている。
【０００３】しかしながら、枯草菌におけるペプチド又は蛋白質の生産は、枯草菌自体が産生するα−アミラーゼやプロテアーゼなどが主である。すなわち、枯草菌が高い分泌生産能を有するにも拘らず、他の微生物由来の酵素及び比較的分子量の小さな哺乳類の生理活性ペプチドなどを生産させると、菌体自体が菌体外に多量に分泌する各種のプロテアーゼにより生産物が分解され、高い収率で有用生産物を回収できない。
【０００４】そこで、宿主枯草菌のプロテアーゼ活性を低下させるための研究がなされている。例えば、プロテアーゼ活性の低い枯草菌として、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼである中性プロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼの両者を欠失したバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）１０４ＨＬ株［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys.Res. Commun.), 128; 601-606, 1985］が知られている。また、本出願人は、特開昭６４−３７２８４号公報において、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株に、pap 遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）を提案した。
【０００５】一方、枯草菌ベクターの開発も、宿主の開発と同様に古くから行なわれている。例えば、枯草菌自体や、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・リケニホルミスなどの類縁菌のα−アミラーゼ、または中性及びアルカリプロテアーゼの遺伝子のプロモーター、リボソーム結合領域（ＳＤ配列）、シグナル配列を利用した分泌ベクターが発表されている。これらの分泌ベクターにより、それぞれ本来のα−アミラーゼやプロテアーゼの分泌だけでなく、例えばプロテインＡなどの他の有用酵素、およびインターフェロン、ヒト成長ホルモンなどの生理活性ペプチドを生産できる。
【０００６】しかしながら、枯草菌が分泌生産という有用性を有するにも拘らず、大腸菌に比べて、遺伝子組換えの宿主としての利用が遅れている。このことは、遺伝子産物の生産量が少ないことに起因する。すなわち、大腸菌系では、多くの強いプロモーター系と、極めて正確な制御系とが確立され、これらが多コピープラスミド上で安定に機能している。これに対して、枯草菌の系においては、多くの試みにも拘らず、大腸菌のように確立された系は、存在しない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、バチルス属細菌内に安定に保持され、かつペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産させることができる高発現ベクターを提供することにある。
【０００８】本発明の他の目的は、前記高発現ベクターを保有し、ペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産するバチルス属細菌を提供することにある。
【０００９】本発明のさらに他の目的は、ペプチド又は蛋白質を効率よく多量に得ることができるペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【発明の構成】本発明者らは、高い分泌能を有するバチルス属細菌に着目し、その分泌ベクターの開発を鋭意研究した結果、枯草菌において一般に使用されているベクタープラスミドｐＵＢ１１０のクローニングサイトＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、高い翻訳能力を有する遺伝子を特定の方向に導入すると、分泌ベクターが少なくともバチルス属細菌内で安定に保持され、かつ分泌ベクターにより所望の遺伝子産物が多量に分泌発現することを見いだし、本発明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明は、少なくともｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含むｐＵＢ１１０由来のベクターであって、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向に、ＳＤ配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されている高発現ベクターを提供する。
【００１２】本発明は、前記高発現ベクターを保有するバチルス属細菌を提供する。
【００１３】さらに本発明は、前記バチルス属細菌を培養し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド又は蛋白質の製造方法を提供する。
【００１４】本明細書において、塩基配列における核酸の表示はＩＵＰＡＣにより採択されている表示法に従うものとする。
【００１５】本発明の高発現ベクターは、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０に由来し、ｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含んでいる。ｐＵＢ１１０はその全塩基配列を有している必要はなく、少なくともＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を有していればよく、ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を有するｐＵＢ１１０由来のベクターであってもよい。なお、ｐＵＢ１１０は黄色ブドウ状球菌［スタフィロコッカス(Staphylococcus ) ］属に由来する多コピープラスミドであり、カナマイシン耐性遺伝子を有し、その制限地図は確立されている。図１にベクタープラスミドｐＵＢ１１０の制限酵素地図の概要を示す。
【００１６】ｐＵＢ１１０とペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子との連結部位は、制限酵素ＢａｍＨＩ部位に限らず、その近傍、例えば、ＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの間などであってもよい。すなわち、ＥｃｏＲＩ部位や、ＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの領域に存在するＡｖａＩ部位、ＸｂａＩ部位に、ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結してもよい。
【００１７】クローニングサイトＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍には、高い翻訳能力を有する遺伝子、すなわちＳＤ配列を有するペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子が連結されている。
【００１８】本発明の主たる特徴は、前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が、従来とは逆の方向であるＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向、すなわちカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されている点にある。このような特定の方向にペプチド又は蛋白質をコードする構造遺伝子を導入すると、宿主微生物により、ペプチド又は蛋白質を多量に分泌生産させることができる。
【００１９】前記ペプチド又は蛋白質は、特に限定されず、酵素、原核細胞および真核細胞を問わず、動物性細胞由来のペプチド又は蛋白質であってもよい。ペプチド及び蛋白質には、例えば、インスリン、ガストリン、各種オピオノイドペプチド、上皮細胞成長因子、エンドセリン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド［Vasoactive Intestinal Polypeptide （ＶＩＰ）］、心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ）、サブスタンスＰ、カルシトニン、インシュリン様成長因子Ｉ，ＩＩ、ガラニン、モチリン、バソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−２などの各種の生理活性ペプチドまたはこれらの前駆体；α−アミラーゼ、プロテインＡ、ヒルジン、エグリンＣ、分泌性白血球由来プロテアーゼインヒビターなどの阻害剤、ヒトアルブミン、血液凝固因子、リンフォカイン、神経成長因子、肝細胞再生因子などの各種の分化誘導因子、成長因子などの蛋白質またはこれらの前駆体が含まれる。
【００２０】前記ＳＤ配列は、特に制限されず、例えば、枯草菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡの配列に対応して合成した下記のＳＤ配列であってもよく、５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣ下記のＳＤ配列などであってもよい。
【００２１】５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＴＴＣ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴこれらのＳＤ配列を導入すると、僅の発現の差異が認められるものの、ベクタープラスミドによる効果が本質的に損われるものではない。ＳＤ配列は、リボソーム結合部位として機能し、その下流には、開始コドンが存在する。
【００２２】なお、従来、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切断部位が関与して、何かしらの転写が行なわれていることが知られていた［Bruchner, R.,et al., Gene 32, 151-160 (1984)およびCurran, J.F., and Stewart, C.J., Virology, 142, 98-111 (1985) ］。しかしながら、この知見を積極的に利用した例はない。このことは、各種のファクターが転写の強さについて及ぼす影響を正確に定量化できていなかったことに他ならない。
【００２３】前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を、ＳＤ配列と共に、ベクターＤＮＡに前記特定の方向に連結することにより、プロモーターを導入しなくても、ＳＤ配列の強さに応じてペプチド又は蛋白質を生産できる。従って、強いＳＤ配列であれば、プロモーターは必ずしも必要ではないが、ＳＤ配列の５′側にプロモーターを連結するのが好ましい。プロモーターとしては、例えば、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００２４】構造遺伝子の下流、すなわちペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の３′側に、ターミネーターが連結されていなくても、ベクターによる効果が特に損われることはないが、構造遺伝子の下流には、ターミネーターが連結されているのが好ましい。ターミネーターは、特に限定されず、例えば、枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーターや、これに対応して化学合成したターミネーターなどであってもよい。
【００２５】本発明の高発現ベクターおよびこのベクターを保有するバチルス属細菌は、種々の方法で構築できる。例えば、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩで解裂し、アルカリホスファターゼで処理する。また、所望のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の５′側にプロモーターおよびＳＤ配列を、３′側にターミネーターを連結し、ＤＮＡ断片を調製する。このＤＮＡ断片をｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に導入する。なお、前記ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ部位とのサイトが合わない場合には、両断片を平滑末端としたり、適当な制限酵素リンカーを用いればよい。ｐＵＢ１１０にペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が導入されたキメラプラスミドにより、宿主微生物であるバチルス属細菌を形質転換する。得られた形質転換株から、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に前記遺伝子が導入されたプラスミドを選択することにより、前記高発現ベクターを保有するバチルス属細菌が得られる。
【００２６】しかし、この方法では、前記制限酵素による切断部位が、目的とするペプチド又は蛋白質ペプチドの遺伝子に存在しない場合には、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に構造遺伝子を両方向に導入し、得られたキメラプラスミドの中から、目的とするベクターを捜し出す必要がある。この方法では、目的蛋白質が枯草菌由来のα−アミラーゼであっても、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に遺伝子が導入されたプラスミドを得る確率は、通常、比較的小さい。すなわち、枯草菌由来の構造遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されたプラスミドは、逆方向に導入されたプラスミドに比べて、例えば、１／４０程度しか得られない。さらに、枯草菌以外のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を導入すると、枯草菌の生育阻害が顕著となり、目的とするプラスミドが得られにくくなる。このことを解決するためには、例えば、次の２つの方法が採用できる。
【００２７】第１の方法では、ｐＵＢ１１０をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理する。一方、所望のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の５′側をＢａｍＨＩ部位、３′側をＥｃｏＲＩ部位となるように切断するか、又は合成ＤＮＡリンカーを用いてＤＮＡ断片を調製する。そして、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位の間に、前記ＤＮＡ断片を方向性をもって導入する。なお、この方法において、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩ、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩなどで切断し、上記と同様にして、目的の遺伝子を方向性を考慮して導入してもよい。
【００２８】第２の方法では、先ずｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、得られた約１キロベースペア（Ｋｂｐ）の遺伝子断片を、大腸菌のベクター、例えば、プラスミドｐＵＣ１９などのポリリンカーサイトＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ間に導入する。得られたプラスミドのｐＵＢ１１０に由来する遺伝子のうち、例えば、ＢａｍＨＩ部位に、前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を導入し、宿主大腸菌、例えばＨＢ１０１などを形質転換する。得られた形質転換株からプラスミドを調製し、目的の方向に遺伝子が導入されたプラスミドを選択する。この際、ｐＵＢ１１０上に、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドが多量に得られる。例えば、目的の方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドと、逆方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドとの割合は、１：１程度である。
【００２９】前記構造遺伝子がクローニングされたプラスミドのうち、ｐＵＢ１１０に由来する領域を、例えば、制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩなどのように目的遺伝子を導入可能な制限酵素で切出す。一方、上記と同じ制限酵素、例えば、ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとでｐＵＢ１１０を切断し、前記切出したＤＮＡ断片と連結し、宿主であるバチルス属細菌を形質転換する。得られた形質転換株の殆どは、目的とするペプチド又は蛋白質を多量に生産できる方向に連結されたプラスミドを保有する。
【００３０】前記のようにして得られた高発現ベクターにより、宿主バチルス属細菌を形質転換することにより、ペプチド又は蛋白質を多量に生産する微生物が得られる。前記ベクターによるバチルス属細菌の形質転換は、慣用の方法、例えば、チャン(Chang) らのプロトプラスト化法［Chang, S., et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)］などを利用して行なうことができる。
【００３１】前記宿主微生物は、バチルス（Bacillus）属の微生物であり、その菌株は、遺伝子産物が安定である限り特に制限されない。好ましい宿主は、安全性が高く、菌体外にペプチド又は蛋白質を多量に分泌するバチルス・ズブチリス（Bacillussubtilis）である。さらに、バチルス・ズブチリスの中で、突然変異などの手法により菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が好ましい。このような菌株をプラスミドにより形質転換する場合には、分子量の小さなペプチドであっても、宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制できる。
【００３２】プロテアーゼ活性の低い枯草菌としては、例えば、前記バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株；バチルス・サブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）；アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、spo OA△677 変異遺伝子を導入した菌株などが挙げられる。特に好ましい菌株には、例えば、特願平１−２８１４４０号において、本出願人が提案したように、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰ０１１株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株（微工研菌寄第１０９８８号）などが含まれる。
【００３３】特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、野生株に比べてプロテアーゼ活性が１／５０００以下であり、生産物の安定性が極めて良好であること、アミノ酸要求性を２種類有し、胞子を形成しないため、自然界における生育が不可能と考えられることから、実験室における遺伝子組換えだけでなく、有用生産物の工業生産のための宿主として極めて有用な菌である。
【００３４】なお、spo OA変異は、胞子形成の最も初期の段階において胞子形成を遮断する突然変異である。この変異遺伝子は、枯草菌が熱、紫外線、化学薬品及び乾燥などに晒された場合、通常自然に生存する形態である胞子を生成する能力を破壊する。この突然変異を起す具体的な方法として、ＫＮＯ3 をＮ源とする培地で、対数増殖期末期に達した枯草菌の細胞を繰り返し継代培養する方法が知られている（別冊蛋白質核酸酵素、細菌ファージ遺伝実験法、第213 頁 (1972) ）。
【００３５】前記ペプチド又は蛋白質は、前記形質転換されたバチルス属細菌を培養することにより得られる。形質転換されたバチルス属細菌の培養は、慣用の液体培養に準じて行なうことができる。すなわち、形質転換株の培養は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養又は通気撹拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨは、例えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養に採用される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で行なうことができる。
【００３６】なお、宿主微生物が生産したペプチド又は蛋白質の分離精製は、慣用の方法、例えば、塩析、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、電気溶出(electro elution) 法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法や、これらを組合せた方法で行なうことができる。ペプチドなどが菌体内やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方法、例えば、菌体を破砕し、前記分離精製に供することにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができる。
【００３７】
【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例により限定されるものではない。
【００３８】実施例１アッセイ系としてα−アミラーゼ遺伝子を選び、分泌生産されるα−アミラーゼの量を指標として、高発現の分泌ベクターを構築した。
（１）バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株の作製spo OA遺伝子及びリンコマイシン耐性遺伝子（以下、Ｌｉｎr と称する）を有する枯草菌として知られているバチルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株を、表１に示すＬＢ培地を用いて３７℃で対数増殖期まで振盪培養した。
【００３９】
【表１】
培養液５０ｍｌ中の菌体を集め、斉藤・三浦の方法［H. Saito, K. Miura, Biochem. Biophis. Acta, 72, 619 (1963)］により染色体ＤＮＡを抽出精製した。
【００４０】得られた染色体ＤＮＡを用いてコンピテントセル形質転換法によりバチルス・サブチリスＤＹ−１６株を形質転換した。形質転換した枯草菌を、ヒスチジンを５０ｍｇ／ｌ含む最小寒天培地にまき、３７℃で４８時間培養した。胞子形成能欠損株を、以下の指標に従って選択した。
【００４１】１．胞子形成培地に植菌し、そのコロニーがメラニン色素生産能を失ったこと２．８０℃、１０分の熱処理に耐性を示すこと３．顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと以下の方法でプロテアーゼ活性を測定し、得られた胞子欠損株１７３株のうち最もプロテアーゼ活性の低下した株を選出した。
【００４２】先ず、１％カゼインを含むＬＢ寒天平板培地に、それぞれの胞子欠損形質転換株と、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株を別々に植菌し、３７℃で２４時間培養した。菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分解されるので、カゼインの分解に伴なって形成される菌体の周りのハローの大きさを指標として、親株であるバチルス・サブチリスＤＹ−１６株よりもプロテアーゼ生産能が低下した４０株を分離した。
【００４３】さらに、これらの株をＬＢ培地で液体培養し、その培養上清に存在するプロテアーゼ活性を、ＦＩＴＣ−カゼイン（ジクマ社）を基質として測定した。すなわち、バチルス・ズブチリスＤＹ−１６及びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株４０株をそれぞれ、ＬＢ培地１０ｍｌを用いて一晩培養し、その培養液１ｍｌを遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素液とした。
【００４４】酵素液５０μｌと、０．２μｇのＦＩＴＣ−カゼインとを、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および２ｍＭのＣａＣｌ2 の緩衝液中（２００μｌ）で３７℃で２時間反応した。反応液に２００μｌの７．５％トリクロロ酢酸を添加し、遠心分離した後、その上清１００μｌに、５００ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ８．５）９００μｌを添加し、プロテアーゼ活性を、螢光光度計を用い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ600 ）により測定した。
【００４５】なお、プロテアーゼ活性（ＰＵＤ）は、３７℃、ｐＨ７．５において、カゼインから１分間に１μモルのチロシンＴｙｒに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊離する酵素量を１ＰＵＤとして、算出した。その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリスＤＹ−１６株に比べ極端に低下した４株（バチルス・サブチリスＳＰＬ９，１１，１４，３９）を得た。
【００４６】これら４株のプロテアーゼ活性をさらに詳しく測定した。バチルス・サブチリスＤＹ−１６株及びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株４株を１０ｍｌのＬＢ培地で１８時間培養した後、５０ｍｌのＭｅｄｉｕｍ Ａ培地に菌体を移し、培養２４時間及び４８時間後の培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
得られたこれらの株は、親株に比べプロテアーゼ活性が１／２０以下と低いことが確認された。特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、プロテアーゼ活性が低い。また、いずれの株においてもヒスチジンとロイシンに対する要求性を有しており、遺伝子組換え実験における宿主として要求される複数の栄養要求性を確認した。これらの菌株は、ペプチドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ有効に用いることができる。
（２）α−アミラーゼ遺伝子のプローモーターの合成以下のような枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のプローモーター配列をそれぞれ化学合成し、両遺伝子をアニーリングした後、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの間に挿入し、図２に示すようにプラスミドｐＭＤ３００３を構築した。
【００４８】
5'- AATTCAGGATCCTTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTAAAATGTAAGCGTGAACAAAATTCTCCAGT-3'5'-ACTGGAGAATTTTGTTCACGCTTACATTTTAAATTATCACAATCACTCTATCAAAACAACTTGGCAGAGTGAATACAAATCAAGATCCTG-3'（３）ＳＤ配列の合成枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子及び黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ遺伝子のＳＤ配列、及び枯草菌１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の配列を参考として、以下の塩基配列で表されるＳＤ配列を、ＡＢＩ社ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。なお、遺伝子の５′側にはプローモーターとの連結部位であるＸｂａＩ部位を、３′領域にはα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列との連結部位であるＮｒｕＩ部位を導入した。
【００４９】CTAGAAAGGAGGTGATCTAGAATTCATGTTCGTTTCCTCCACTACATCTTAAGTACAAGC（４）α−アミラーゼ遺伝子バチルス・サブチリス１Ａ４１２株［オハイオ州立大学のバチルス・ジェネティク・ストック・センター（Bacillus Genetic Stock Center)(BGSC)より入手した］から前記斉藤・三浦の方法により調製した染色体ＤＮＡ１０μｇを、１００μｌのＳａｕ３ＡＩ溶液［１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００ｍＭのＮａＣｌ）に溶解し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１単位加え、３７℃で１０分間反応させ、フェノール溶液［フェノールをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で飽和したもの］を添加し、反応を停止した後、エタノール沈澱物として、枯草菌染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩの部分分解物を得た。
【００５０】一方、１μｇの枯草菌ベクターｐＵＢ１１０を、ＢａｍＨＩ溶液［１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）］中で５単位の制限酵素ＢａｍＨＩと３７℃で１時間反応させ、フェノール溶液で処理した後、エタノール沈澱物をｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ分解物として得た。
【００５１】次いで、得られた上記二つのＤＮＡ断片のリゲーションを行った。すなわち、上記のようにして調製したそれぞれのＤＮＡ断片を、１０μｌのリゲーション溶液［６６ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．１ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）］に溶解した後、混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０単位を添加し、２０℃で１時間反応を行った。
【００５２】このＤＮＡ溶液を用いて、バチルス・サブチリス１Ａ２８９株（ＢＧＳＣより入手）をプロトプラスト化法（Chan, S., Cohen, N., Molec, gen. Genet., 168, 111-115 (1979) ）により形質転換した。
【００５３】形質転換株を寒天培地で培養し、カナマイシン耐性を示す約２万個のコロニーが得られ、寒天平板培地上でのヨード・デンプン反応により、このうち１株が菌体外にα−アミラーゼを分泌生産していることが確認された。
【００５４】この株からプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素による解析を行なったところ、図３に示すような制限酵素地図が得られ、前記プラスミドをｐＤＣＡ１００と命名した。ｐＤＣＡ１００は、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に３．１ＫｂのＳａｕ３ＡＩ断片が挿入された７．６Ｋｂのプラスミドである。前記３．１ＫｂのＳａｕ３ＡＩ断片の中には、枯草菌由来のα−アミラーゼ遺伝子［Yamazaki, H.et al., J. Bacteriol., 156 , 327 (1984)］と全く同じ制限酵素パターンが認められたことから、α−アミラーゼ遺伝子がクローニングされていることが確認された。
【００５５】ｐＤＣＡ１００のα−アミラーゼ遺伝子と同一と考えられるα−アミラーゼ遺伝子が導入された菌株は、アメリカ合衆国オハイオ大学バチルス・ジェネテック・ストック・センター（ＢＧＳＣ）にＥＣＥ３５株として登録されている。
（５）α−アミラーゼ遺伝子とＳＤ配列の連結クローニングされたα−アミラーゼ遺伝子と合成ＳＤ配列とを、以下の塩基配列で表される合成遺伝子を介して連結した。
【００５６】
5'-CGAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTTGCTGGATTTTTATTGCTGTTTTATTTGGTTCTGGCAGGAC-3'5'-CGGTCCTGCCAGAACCAAATAAAAACAGCAATAAAAATCCAGCGAATAACGGCAGTAAAGAGGTTTTGAATCGTTTTCG-3'この合成遺伝子は、α−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列部分のアミノ酸配列（Yamazaki, H. et al., J. Bacteriol., 156 , 327 (1984)）に従って塩基配列を決定し、化学合成した。常法に従って精製した後、アニーリングし、合成ＤＮＡリンカーとした。
（６）ターミネーターの作製枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーターを参考として、以下のターミネーターをそれぞれ合成した。なお、５′末端側には、ＢｇｌＩＩ部位を、３′末端側にはＳｐｈＩ部位を設けた。また、３′末端のすぐ近くにはＢａｍＨＩ部位を設けた。合成した後、両合成遺伝子をアニーリングし、ターミネーター断片とした。
【００５７】
5'-GATCTATAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCTTCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTGGATCCGCATG-3'5'-CGGATCCAACATCAGGATGCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGTGGAACCTGCTTCTTTTTATA-3'（７）ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーターの連結ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーターを、図４に示すように連結し、プラスミドｐＭＤ３０６２を得た。すなわち、ＤＮＡ合成したＳＤ配列、リンカーＤＮＡ、ターミネーター断片をＤＮＡキナーゼを用いてカイネーションした。α−アミラーゼ遺伝子は、ｐＤＣＡ１００から、ＨｐａＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片として回収した。これらの遺伝子と、アルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１９のＸｂａＩ−ＳｐｈＩ切断断片と、α−アミラーゼ遺伝子部分を混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、目的とするプラスミドｐＭＤ３０６２を得た。
（８）ｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築とα−アミラーゼの生産プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図を図５に示す。
【００５８】先ず、ｐＭＤ３００３を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩとで切断し、プローモーターを切り出した。また、ｐＭＤ３０６２をＸｂａＩとＢａｍＨＩとを用いて切断し、ＳＤ配列からターミネーターまでの領域を含むα−アミラーゼ遺伝子部分を得た。そして、これらの遺伝子を、アルカリホスファターゼ処理したｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ消化物と混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株をプロトプラスト化法により形質転換した。
【００５９】得られたカナマイシン耐性形質転換株の中から、α−アミラーゼ生産能を示す２００株の形質転換株を分離した。これらの形質転換株の中から、α−アミラーゼ遺伝子の方向性の異なる２種類のプラスミドが得られた。ｐＵＢ１１０中のカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向で遺伝子が導入されたプラスミドをｐＭＤ３０８２Ｂ１、その逆方向に導入されたプラスミドをｐＭＤ３０８２Ｂ２とした。それらの構成比は前者：後者＝１：４０であった。
【００６０】次いで、これらのプラスミドを有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を１２時間浸透培養し、得られたα−アミラーゼ活性を比較検討したところ、ｐＭＤ３０８２Ｂ１の方がｐＭＤ３０８２Ｂ２よりも約３倍のα−アミラーゼを生産し、培養１２時間後には２０００ユニット／ｍｌのα−アミラーゼを生産した（表３参照）。なお、α−アミラーゼ活性は、不破らの方法（Fuwa, H., J. Biochem, 41, 583-603 (1954)）に従って測定した。
【００６１】
【表３】
（９）プローモーターを除去したときのα−アミラーゼ活性ｐＭＤ３０６２をＸｂａＩで切断し、ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーター遺伝子部分を回収し、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＵＣ１１８のＸｂａＩ切断部位に連結した。α−アミラーゼ遺伝子の５′側に、ｐＵＣ１１８に存在するポリリンカー部位であるＢａｍＨＩ部位を位置させて連結したプラスミドをｐＭＤ３０００１とした。
【００６２】このｐＭＤ３０００１を、制限酵素ＢａｍＨＩにより切断することにより、プローモーターが存在しないα−アミラーゼ遺伝子を回収できる。そこで、ｐＭＤ３００１をＢａｍＨＩで切断した後、アルカリホスファターゼで処理したｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切断断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性形質転換株を培養し、それぞれプラスミドＤＮＡを調製し、α−アミラーゼ遺伝子の方向性を調べたところ、ｐＵＢ１１０にα−アミラーゼ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されたプラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△と、逆方向に導入されたｐＭＤ３０８２Ｂ２△を得た。プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△およびｐＭＤ３０８２Ｂ２△の構築図を図６に示す。
【００６３】それぞれのプラスミドを保有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を培養し、得られた培養濾液中のα−アミラーゼ活性を調べたところ、表４に示す結果を得た。すなわち、ｐＭＤ３０８２Ｂ２△を保有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培養１２時間後にα−アミラーゼを１０ユニットしか生産せず、プラスミドを保有していないＳＰＬ１４株の生産するα−アミラーゼ活性と変りがなかった。一方、ｐＭＤ３０８２Ｂ１△を有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培養１２時間後にα−アミラーゼを８００ユニット／ｍｌ生産した。
【００６４】
【表４】
実施例２プラスミドｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの小さな約１Ｋｂｐの断片を得た。プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１９のポリリンカーサイトに、ＤＮＡリガーゼを用いて前記約１Ｋｂｐの断片を導入し、プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂを構築した。プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図を図７に示す。
【００６５】このプラスミドベクター上のｐＵＢ１１０部分に存在するＢａｍＨＩ部位を酵素ＢａｍＨＩにより解裂し、アルカリホスファターゼ処理した。また、前記ｐＭＤ３０８２Ｂ１からα−アミラーゼ遺伝子部分を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し回収した。両遺伝子断片を混合し、リガーゼにより連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。
【００６６】得られたアンピシリン耐性を有する形質転換株から、プラスミドを調製し、遺伝子の導入方向を調べたところ、供試４８株のうち２３株が、目的の方向に遺伝子が導入されたプラスミドを有していた。
【００６７】得られたプラスミドを、制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ＤＮＡ断片を調製した。また、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて、前記ＤＮＡ断片と連結することにより、遺伝子を、目的のカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に１００％導入できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベクタープラスミドｐＵＢ１１０の概略制限酵素地図である。
【図２】プラスミドｐＭＤ３００３の構築図である。
【図３】プラスミドｐＤＣＡ１００の制限酵素地図である。
【図４】プラスミドｐＭＤ３０６２の構築図である。
【図５】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図である。
【図６】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△及びｐＭＤ３０８２Ｂ２△の構築図である。
【図７】プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図である。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、枯草菌を代表とするバチルス属細菌で利用可能な新規な高発現ベクター、このベクターを保有するバチルス属細菌、およびこのバチルス属細菌によるペプチド又は蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】枯草菌（Bacillus subtilis）を代表とするバチルス（Bacillus）属細菌は、古くから種々の菌体外酵素の生産菌として、工業的に利用されている。例えば、枯草菌の仲間は、日本において古くから納豆の製造に使用されており、大腸菌などで問題となるエンドトキシンを生産しないこと、人体に寄生しないことなどの理由から、極めて安全性の高い微生物である。このように、枯草菌は、ペプチド又は蛋白質の工業的な生産菌として、優れた性質を有し、その有用性が注目されている。例えば、特開昭５６−１３７９８６号公報には、前記菌体外酵素の遺伝子のプロモーター、ＳＤ配列（シャイン−ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列）、シグナル遺伝子をコードするＤＮＡをクローニングし、その下流に目的とするペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを枯草菌に導入し、目的とするペプチド又は蛋白質を菌体外に分泌生産させている。
【０００３】しかしながら、枯草菌におけるペプチド又は蛋白質の生産は、枯草菌自体が産生するα−アミラーゼやプロテアーゼなどが主である。すなわち、枯草菌が高い分泌生産能を有するにも拘らず、他の微生物由来の酵素及び比較的分子量の小さな哺乳類の生理活性ペプチドなどを生産させると、菌体自体が菌体外に多量に分泌する各種のプロテアーゼにより生産物が分解され、高い収率で有用生産物を回収できない。
【０００４】そこで、宿主枯草菌のプロテアーゼ活性を低下させるための研究がなされている。例えば、プロテアーゼ活性の低い枯草菌として、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼである中性プロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼの両者を欠失したバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）１０４ＨＬ株［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys.Res. Commun.), 128; 601-606, 1985］が知られている。また、本出願人は、特開昭６４−３７２８４号公報において、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株に、pap 遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）を提案した。
【０００５】一方、枯草菌ベクターの開発も、宿主の開発と同様に古くから行なわれている。例えば、枯草菌自体や、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・リケニホルミスなどの類縁菌のα−アミラーゼ、または中性及びアルカリプロテアーゼの遺伝子のプロモーター、リボソーム結合領域（ＳＤ配列）、シグナル配列を利用した分泌ベクターが発表されている。これらの分泌ベクターにより、それぞれ本来のα−アミラーゼやプロテアーゼの分泌だけでなく、例えばプロテインＡなどの他の有用酵素、およびインターフェロン、ヒト成長ホルモンなどの生理活性ペプチドを生産できる。
【０００６】しかしながら、枯草菌が分泌生産という有用性を有するにも拘らず、大腸菌に比べて、遺伝子組換えの宿主としての利用が遅れている。このことは、遺伝子産物の生産量が少ないことに起因する。すなわち、大腸菌系では、多くの強いプロモーター系と、極めて正確な制御系とが確立され、これらが多コピープラスミド上で安定に機能している。これに対して、枯草菌の系においては、多くの試みにも拘らず、大腸菌のように確立された系は、存在しない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、バチルス属細菌内に安定に保持され、かつペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産させることができる高発現ベクターを提供することにある。
【０００８】本発明の他の目的は、前記高発現ベクターを保有し、ペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産するバチルス属細菌を提供することにある。
【０００９】本発明のさらに他の目的は、ペプチド又は蛋白質を効率よく多量に得ることができるペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【発明の構成】本発明者らは、高い分泌能を有するバチルス属細菌に着目し、その分泌ベクターの開発を鋭意研究した結果、枯草菌において一般に使用されているベクタープラスミドｐＵＢ１１０のクローニングサイトＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、高い翻訳能力を有する遺伝子を特定の方向に導入すると、分泌ベクターが少なくともバチルス属細菌内で安定に保持され、かつ分泌ベクターにより所望の遺伝子産物が多量に分泌発現することを見いだし、本発明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明は、少なくともｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含むｐＵＢ１１０由来のベクターであって、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向に、ＳＤ配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されている高発現ベクターを提供する。
【００１２】本発明は、前記高発現ベクターを保有するバチルス属細菌を提供する。
【００１３】さらに本発明は、前記バチルス属細菌を培養し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド又は蛋白質の製造方法を提供する。
【００１４】本明細書において、塩基配列における核酸の表示はＩＵＰＡＣにより採択されている表示法に従うものとする。
【００１５】本発明の高発現ベクターは、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０に由来し、ｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含んでいる。ｐＵＢ１１０はその全塩基配列を有している必要はなく、少なくともＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を有していればよく、ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を有するｐＵＢ１１０由来のベクターであってもよい。なお、ｐＵＢ１１０は黄色ブドウ状球菌［スタフィロコッカス(Staphylococcus ) ］属に由来する多コピープラスミドであり、カナマイシン耐性遺伝子を有し、その制限地図は確立されている。図１にベクタープラスミドｐＵＢ１１０の制限酵素地図の概要を示す。
【００１６】ｐＵＢ１１０とペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子との連結部位は、制限酵素ＢａｍＨＩ部位に限らず、その近傍、例えば、ＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの間などであってもよい。すなわち、ＥｃｏＲＩ部位や、ＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの領域に存在するＡｖａＩ部位、ＸｂａＩ部位に、ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結してもよい。
【００１７】クローニングサイトＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍には、高い翻訳能力を有する遺伝子、すなわちＳＤ配列を有するペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子が連結されている。
【００１８】本発明の主たる特徴は、前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が、従来とは逆の方向であるＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向、すなわちカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されている点にある。このような特定の方向にペプチド又は蛋白質をコードする構造遺伝子を導入すると、宿主微生物により、ペプチド又は蛋白質を多量に分泌生産させることができる。
【００１９】前記ペプチド又は蛋白質は、特に限定されず、酵素、原核細胞および真核細胞を問わず、動物性細胞由来のペプチド又は蛋白質であってもよい。ペプチド及び蛋白質には、例えば、インスリン、ガストリン、各種オピオノイドペプチド、上皮細胞成長因子、エンドセリン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド［Vasoactive Intestinal Polypeptide （ＶＩＰ）］、心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ）、サブスタンスＰ、カルシトニン、インシュリン様成長因子Ｉ，ＩＩ、ガラニン、モチリン、バソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−２などの各種の生理活性ペプチドまたはこれらの前駆体；α−アミラーゼ、プロテインＡ、ヒルジン、エグリンＣ、分泌性白血球由来プロテアーゼインヒビターなどの阻害剤、ヒトアルブミン、血液凝固因子、リンフォカイン、神経成長因子、肝細胞再生因子などの各種の分化誘導因子、成長因子などの蛋白質またはこれらの前駆体が含まれる。
【００２０】前記ＳＤ配列は、特に制限されず、例えば、枯草菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡの配列に対応して合成した下記のＳＤ配列であってもよく、５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣ下記のＳＤ配列などであってもよい。
【００２１】５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＴＴＣ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴこれらのＳＤ配列を導入すると、僅の発現の差異が認められるものの、ベクタープラスミドによる効果が本質的に損われるものではない。ＳＤ配列は、リボソーム結合部位として機能し、その下流には、開始コドンが存在する。
【００２２】なお、従来、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切断部位が関与して、何かしらの転写が行なわれていることが知られていた［Bruchner, R.,et al., Gene 32, 151-160 (1984)およびCurran, J.F., and Stewart, C.J., Virology, 142, 98-111 (1985) ］。しかしながら、この知見を積極的に利用した例はない。このことは、各種のファクターが転写の強さについて及ぼす影響を正確に定量化できていなかったことに他ならない。
【００２３】前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を、ＳＤ配列と共に、ベクターＤＮＡに前記特定の方向に連結することにより、プロモーターを導入しなくても、ＳＤ配列の強さに応じてペプチド又は蛋白質を生産できる。従って、強いＳＤ配列であれば、プロモーターは必ずしも必要ではないが、ＳＤ配列の５′側にプロモーターを連結するのが好ましい。プロモーターとしては、例えば、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００２４】構造遺伝子の下流、すなわちペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の３′側に、ターミネーターが連結されていなくても、ベクターによる効果が特に損われることはないが、構造遺伝子の下流には、ターミネーターが連結されているのが好ましい。ターミネーターは、特に限定されず、例えば、枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーターや、これに対応して化学合成したターミネーターなどであってもよい。
【００２５】本発明の高発現ベクターおよびこのベクターを保有するバチルス属細菌は、種々の方法で構築できる。例えば、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩで解裂し、アルカリホスファターゼで処理する。また、所望のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の５′側にプロモーターおよびＳＤ配列を、３′側にターミネーターを連結し、ＤＮＡ断片を調製する。このＤＮＡ断片をｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に導入する。なお、前記ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ部位とのサイトが合わない場合には、両断片を平滑末端としたり、適当な制限酵素リンカーを用いればよい。ｐＵＢ１１０にペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が導入されたキメラプラスミドにより、宿主微生物であるバチルス属細菌を形質転換する。得られた形質転換株から、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に前記遺伝子が導入されたプラスミドを選択することにより、前記高発現ベクターを保有するバチルス属細菌が得られる。
【００２６】しかし、この方法では、前記制限酵素による切断部位が、目的とするペプチド又は蛋白質ペプチドの遺伝子に存在しない場合には、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に構造遺伝子を両方向に導入し、得られたキメラプラスミドの中から、目的とするベクターを捜し出す必要がある。この方法では、目的蛋白質が枯草菌由来のα−アミラーゼであっても、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に遺伝子が導入されたプラスミドを得る確率は、通常、比較的小さい。すなわち、枯草菌由来の構造遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されたプラスミドは、逆方向に導入されたプラスミドに比べて、例えば、１／４０程度しか得られない。さらに、枯草菌以外のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を導入すると、枯草菌の生育阻害が顕著となり、目的とするプラスミドが得られにくくなる。このことを解決するためには、例えば、次の２つの方法が採用できる。
【００２７】第１の方法では、ｐＵＢ１１０をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理する。一方、所望のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の５′側をＢａｍＨＩ部位、３′側をＥｃｏＲＩ部位となるように切断するか、又は合成ＤＮＡリンカーを用いてＤＮＡ断片を調製する。そして、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位の間に、前記ＤＮＡ断片を方向性をもって導入する。なお、この方法において、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩ、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩなどで切断し、上記と同様にして、目的の遺伝子を方向性を考慮して導入してもよい。
【００２８】第２の方法では、先ずｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、得られた約１キロベースペア（Ｋｂｐ）の遺伝子断片を、大腸菌のベクター、例えば、プラスミドｐＵＣ１９などのポリリンカーサイトＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ間に導入する。得られたプラスミドのｐＵＢ１１０に由来する遺伝子のうち、例えば、ＢａｍＨＩ部位に、前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を導入し、宿主大腸菌、例えばＨＢ１０１などを形質転換する。得られた形質転換株からプラスミドを調製し、目的の方向に遺伝子が導入されたプラスミドを選択する。この際、ｐＵＢ１１０上に、カナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドが多量に得られる。例えば、目的の方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドと、逆方向に構造遺伝子が導入されたプラスミドとの割合は、１：１程度である。
【００２９】前記構造遺伝子がクローニングされたプラスミドのうち、ｐＵＢ１１０に由来する領域を、例えば、制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩなどのように目的遺伝子を導入可能な制限酵素で切出す。一方、上記と同じ制限酵素、例えば、ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとでｐＵＢ１１０を切断し、前記切出したＤＮＡ断片と連結し、宿主であるバチルス属細菌を形質転換する。得られた形質転換株の殆どは、目的とするペプチド又は蛋白質を多量に生産できる方向に連結されたプラスミドを保有する。
【００３０】前記のようにして得られた高発現ベクターにより、宿主バチルス属細菌を形質転換することにより、ペプチド又は蛋白質を多量に生産する微生物が得られる。前記ベクターによるバチルス属細菌の形質転換は、慣用の方法、例えば、チャン(Chang) らのプロトプラスト化法［Chang, S., et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)］などを利用して行なうことができる。
【００３１】前記宿主微生物は、バチルス（Bacillus）属の微生物であり、その菌株は、遺伝子産物が安定である限り特に制限されない。好ましい宿主は、安全性が高く、菌体外にペプチド又は蛋白質を多量に分泌するバチルス・ズブチリス（Bacillussubtilis）である。さらに、バチルス・ズブチリスの中で、突然変異などの手法により菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が好ましい。このような菌株をプラスミドにより形質転換する場合には、分子量の小さなペプチドであっても、宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制できる。
【００３２】プロテアーゼ活性の低い枯草菌としては、例えば、前記バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株；バチルス・サブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）；アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、spo OA△677 変異遺伝子を導入した菌株などが挙げられる。特に好ましい菌株には、例えば、特願平１−２８１４４０号において、本出願人が提案したように、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰ０１１株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株（微工研菌寄第１０９８８号）などが含まれる。
【００３３】特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、野生株に比べてプロテアーゼ活性が１／５０００以下であり、生産物の安定性が極めて良好であること、アミノ酸要求性を２種類有し、胞子を形成しないため、自然界における生育が不可能と考えられることから、実験室における遺伝子組換えだけでなく、有用生産物の工業生産のための宿主として極めて有用な菌である。
【００３４】なお、spo OA変異は、胞子形成の最も初期の段階において胞子形成を遮断する突然変異である。この変異遺伝子は、枯草菌が熱、紫外線、化学薬品及び乾燥などに晒された場合、通常自然に生存する形態である胞子を生成する能力を破壊する。この突然変異を起す具体的な方法として、ＫＮＯ3 をＮ源とする培地で、対数増殖期末期に達した枯草菌の細胞を繰り返し継代培養する方法が知られている（別冊蛋白質核酸酵素、細菌ファージ遺伝実験法、第213 頁 (1972) ）。
【００３５】前記ペプチド又は蛋白質は、前記形質転換されたバチルス属細菌を培養することにより得られる。形質転換されたバチルス属細菌の培養は、慣用の液体培養に準じて行なうことができる。すなわち、形質転換株の培養は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養又は通気撹拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨは、例えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養に採用される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で行なうことができる。
【００３６】なお、宿主微生物が生産したペプチド又は蛋白質の分離精製は、慣用の方法、例えば、塩析、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、電気溶出(electro elution) 法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法や、これらを組合せた方法で行なうことができる。ペプチドなどが菌体内やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方法、例えば、菌体を破砕し、前記分離精製に供することにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができる。
【００３７】
【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例により限定されるものではない。
【００３８】実施例１アッセイ系としてα−アミラーゼ遺伝子を選び、分泌生産されるα−アミラーゼの量を指標として、高発現の分泌ベクターを構築した。
（１）バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株の作製spo OA遺伝子及びリンコマイシン耐性遺伝子（以下、Ｌｉｎr と称する）を有する枯草菌として知られているバチルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株を、表１に示すＬＢ培地を用いて３７℃で対数増殖期まで振盪培養した。
【００３９】
【表１】
培養液５０ｍｌ中の菌体を集め、斉藤・三浦の方法［H. Saito, K. Miura, Biochem. Biophis. Acta, 72, 619 (1963)］により染色体ＤＮＡを抽出精製した。
【００４０】得られた染色体ＤＮＡを用いてコンピテントセル形質転換法によりバチルス・サブチリスＤＹ−１６株を形質転換した。形質転換した枯草菌を、ヒスチジンを５０ｍｇ／ｌ含む最小寒天培地にまき、３７℃で４８時間培養した。胞子形成能欠損株を、以下の指標に従って選択した。
【００４１】１．胞子形成培地に植菌し、そのコロニーがメラニン色素生産能を失ったこと２．８０℃、１０分の熱処理に耐性を示すこと３．顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと以下の方法でプロテアーゼ活性を測定し、得られた胞子欠損株１７３株のうち最もプロテアーゼ活性の低下した株を選出した。
【００４２】先ず、１％カゼインを含むＬＢ寒天平板培地に、それぞれの胞子欠損形質転換株と、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株を別々に植菌し、３７℃で２４時間培養した。菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分解されるので、カゼインの分解に伴なって形成される菌体の周りのハローの大きさを指標として、親株であるバチルス・サブチリスＤＹ−１６株よりもプロテアーゼ生産能が低下した４０株を分離した。
【００４３】さらに、これらの株をＬＢ培地で液体培養し、その培養上清に存在するプロテアーゼ活性を、ＦＩＴＣ−カゼイン（ジクマ社）を基質として測定した。すなわち、バチルス・ズブチリスＤＹ−１６及びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株４０株をそれぞれ、ＬＢ培地１０ｍｌを用いて一晩培養し、その培養液１ｍｌを遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素液とした。
【００４４】酵素液５０μｌと、０．２μｇのＦＩＴＣ−カゼインとを、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および２ｍＭのＣａＣｌ2 の緩衝液中（２００μｌ）で３７℃で２時間反応した。反応液に２００μｌの７．５％トリクロロ酢酸を添加し、遠心分離した後、その上清１００μｌに、５００ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ８．５）９００μｌを添加し、プロテアーゼ活性を、螢光光度計を用い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ600 ）により測定した。
【００４５】なお、プロテアーゼ活性（ＰＵＤ）は、３７℃、ｐＨ７．５において、カゼインから１分間に１μモルのチロシンＴｙｒに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊離する酵素量を１ＰＵＤとして、算出した。その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリスＤＹ−１６株に比べ極端に低下した４株（バチルス・サブチリスＳＰＬ９，１１，１４，３９）を得た。
【００４６】これら４株のプロテアーゼ活性をさらに詳しく測定した。バチルス・サブチリスＤＹ−１６株及びプロテアーゼ活性が低下した形質転換株４株を１０ｍｌのＬＢ培地で１８時間培養した後、５０ｍｌのＭｅｄｉｕｍ Ａ培地に菌体を移し、培養２４時間及び４８時間後の培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
得られたこれらの株は、親株に比べプロテアーゼ活性が１／２０以下と低いことが確認された。特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、プロテアーゼ活性が低い。また、いずれの株においてもヒスチジンとロイシンに対する要求性を有しており、遺伝子組換え実験における宿主として要求される複数の栄養要求性を確認した。これらの菌株は、ペプチドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ有効に用いることができる。
（２）α−アミラーゼ遺伝子のプローモーターの合成以下のような枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のプローモーター配列をそれぞれ化学合成し、両遺伝子をアニーリングした後、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの間に挿入し、図２に示すようにプラスミドｐＭＤ３００３を構築した。
【００４８】
5'- AATTCAGGATCCTTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTAAAATGTAAGCGTGAACAAAATTCTCCAGT-3'5'-ACTGGAGAATTTTGTTCACGCTTACATTTTAAATTATCACAATCACTCTATCAAAACAACTTGGCAGAGTGAATACAAATCAAGATCCTG-3'（３）ＳＤ配列の合成枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子及び黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ遺伝子のＳＤ配列、及び枯草菌１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の配列を参考として、以下の塩基配列で表されるＳＤ配列を、ＡＢＩ社ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。なお、遺伝子の５′側にはプローモーターとの連結部位であるＸｂａＩ部位を、３′領域にはα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列との連結部位であるＮｒｕＩ部位を導入した。
【００４９】CTAGAAAGGAGGTGATCTAGAATTCATGTTCGTTTCCTCCACTACATCTTAAGTACAAGC（４）α−アミラーゼ遺伝子バチルス・サブチリス１Ａ４１２株［オハイオ州立大学のバチルス・ジェネティク・ストック・センター（Bacillus Genetic Stock Center)(BGSC)より入手した］から前記斉藤・三浦の方法により調製した染色体ＤＮＡ１０μｇを、１００μｌのＳａｕ３ＡＩ溶液［１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００ｍＭのＮａＣｌ）に溶解し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１単位加え、３７℃で１０分間反応させ、フェノール溶液［フェノールをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で飽和したもの］を添加し、反応を停止した後、エタノール沈澱物として、枯草菌染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩの部分分解物を得た。
【００５０】一方、１μｇの枯草菌ベクターｐＵＢ１１０を、ＢａｍＨＩ溶液［１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）］中で５単位の制限酵素ＢａｍＨＩと３７℃で１時間反応させ、フェノール溶液で処理した後、エタノール沈澱物をｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ分解物として得た。
【００５１】次いで、得られた上記二つのＤＮＡ断片のリゲーションを行った。すなわち、上記のようにして調製したそれぞれのＤＮＡ断片を、１０μｌのリゲーション溶液［６６ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．１ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）］に溶解した後、混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０単位を添加し、２０℃で１時間反応を行った。
【００５２】このＤＮＡ溶液を用いて、バチルス・サブチリス１Ａ２８９株（ＢＧＳＣより入手）をプロトプラスト化法（Chan, S., Cohen, N., Molec, gen. Genet., 168, 111-115 (1979) ）により形質転換した。
【００５３】形質転換株を寒天培地で培養し、カナマイシン耐性を示す約２万個のコロニーが得られ、寒天平板培地上でのヨード・デンプン反応により、このうち１株が菌体外にα−アミラーゼを分泌生産していることが確認された。
【００５４】この株からプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素による解析を行なったところ、図３に示すような制限酵素地図が得られ、前記プラスミドをｐＤＣＡ１００と命名した。ｐＤＣＡ１００は、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位に３．１ＫｂのＳａｕ３ＡＩ断片が挿入された７．６Ｋｂのプラスミドである。前記３．１ＫｂのＳａｕ３ＡＩ断片の中には、枯草菌由来のα−アミラーゼ遺伝子［Yamazaki, H.et al., J. Bacteriol., 156 , 327 (1984)］と全く同じ制限酵素パターンが認められたことから、α−アミラーゼ遺伝子がクローニングされていることが確認された。
【００５５】ｐＤＣＡ１００のα−アミラーゼ遺伝子と同一と考えられるα−アミラーゼ遺伝子が導入された菌株は、アメリカ合衆国オハイオ大学バチルス・ジェネテック・ストック・センター（ＢＧＳＣ）にＥＣＥ３５株として登録されている。
（５）α−アミラーゼ遺伝子とＳＤ配列の連結クローニングされたα−アミラーゼ遺伝子と合成ＳＤ配列とを、以下の塩基配列で表される合成遺伝子を介して連結した。
【００５６】
5'-CGAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTTGCTGGATTTTTATTGCTGTTTTATTTGGTTCTGGCAGGAC-3'5'-CGGTCCTGCCAGAACCAAATAAAAACAGCAATAAAAATCCAGCGAATAACGGCAGTAAAGAGGTTTTGAATCGTTTTCG-3'この合成遺伝子は、α−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列部分のアミノ酸配列（Yamazaki, H. et al., J. Bacteriol., 156 , 327 (1984)）に従って塩基配列を決定し、化学合成した。常法に従って精製した後、アニーリングし、合成ＤＮＡリンカーとした。
（６）ターミネーターの作製枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーターを参考として、以下のターミネーターをそれぞれ合成した。なお、５′末端側には、ＢｇｌＩＩ部位を、３′末端側にはＳｐｈＩ部位を設けた。また、３′末端のすぐ近くにはＢａｍＨＩ部位を設けた。合成した後、両合成遺伝子をアニーリングし、ターミネーター断片とした。
【００５７】
5'-GATCTATAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCTTCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTGGATCCGCATG-3'5'-CGGATCCAACATCAGGATGCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGTGGAACCTGCTTCTTTTTATA-3'（７）ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーターの連結ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーターを、図４に示すように連結し、プラスミドｐＭＤ３０６２を得た。すなわち、ＤＮＡ合成したＳＤ配列、リンカーＤＮＡ、ターミネーター断片をＤＮＡキナーゼを用いてカイネーションした。α−アミラーゼ遺伝子は、ｐＤＣＡ１００から、ＨｐａＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片として回収した。これらの遺伝子と、アルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１９のＸｂａＩ−ＳｐｈＩ切断断片と、α−アミラーゼ遺伝子部分を混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、目的とするプラスミドｐＭＤ３０６２を得た。
（８）ｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築とα−アミラーゼの生産プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図を図５に示す。
【００５８】先ず、ｐＭＤ３００３を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩとで切断し、プローモーターを切り出した。また、ｐＭＤ３０６２をＸｂａＩとＢａｍＨＩとを用いて切断し、ＳＤ配列からターミネーターまでの領域を含むα−アミラーゼ遺伝子部分を得た。そして、これらの遺伝子を、アルカリホスファターゼ処理したｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ消化物と混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株をプロトプラスト化法により形質転換した。
【００５９】得られたカナマイシン耐性形質転換株の中から、α−アミラーゼ生産能を示す２００株の形質転換株を分離した。これらの形質転換株の中から、α−アミラーゼ遺伝子の方向性の異なる２種類のプラスミドが得られた。ｐＵＢ１１０中のカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向で遺伝子が導入されたプラスミドをｐＭＤ３０８２Ｂ１、その逆方向に導入されたプラスミドをｐＭＤ３０８２Ｂ２とした。それらの構成比は前者：後者＝１：４０であった。
【００６０】次いで、これらのプラスミドを有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を１２時間浸透培養し、得られたα−アミラーゼ活性を比較検討したところ、ｐＭＤ３０８２Ｂ１の方がｐＭＤ３０８２Ｂ２よりも約３倍のα−アミラーゼを生産し、培養１２時間後には２０００ユニット／ｍｌのα−アミラーゼを生産した（表３参照）。なお、α−アミラーゼ活性は、不破らの方法（Fuwa, H., J. Biochem, 41, 583-603 (1954)）に従って測定した。
【００６１】
【表３】
（９）プローモーターを除去したときのα−アミラーゼ活性ｐＭＤ３０６２をＸｂａＩで切断し、ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーター遺伝子部分を回収し、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＵＣ１１８のＸｂａＩ切断部位に連結した。α−アミラーゼ遺伝子の５′側に、ｐＵＣ１１８に存在するポリリンカー部位であるＢａｍＨＩ部位を位置させて連結したプラスミドをｐＭＤ３０００１とした。
【００６２】このｐＭＤ３０００１を、制限酵素ＢａｍＨＩにより切断することにより、プローモーターが存在しないα−アミラーゼ遺伝子を回収できる。そこで、ｐＭＤ３００１をＢａｍＨＩで切断した後、アルカリホスファターゼで処理したｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切断断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性形質転換株を培養し、それぞれプラスミドＤＮＡを調製し、α−アミラーゼ遺伝子の方向性を調べたところ、ｐＵＢ１１０にα−アミラーゼ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されたプラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△と、逆方向に導入されたｐＭＤ３０８２Ｂ２△を得た。プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△およびｐＭＤ３０８２Ｂ２△の構築図を図６に示す。
【００６３】それぞれのプラスミドを保有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株を培養し、得られた培養濾液中のα−アミラーゼ活性を調べたところ、表４に示す結果を得た。すなわち、ｐＭＤ３０８２Ｂ２△を保有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培養１２時間後にα−アミラーゼを１０ユニットしか生産せず、プラスミドを保有していないＳＰＬ１４株の生産するα−アミラーゼ活性と変りがなかった。一方、ｐＭＤ３０８２Ｂ１△を有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培養１２時間後にα−アミラーゼを８００ユニット／ｍｌ生産した。
【００６４】
【表４】
実施例２プラスミドｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までの小さな約１Ｋｂｐの断片を得た。プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１９のポリリンカーサイトに、ＤＮＡリガーゼを用いて前記約１Ｋｂｐの断片を導入し、プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂを構築した。プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図を図７に示す。
【００６５】このプラスミドベクター上のｐＵＢ１１０部分に存在するＢａｍＨＩ部位を酵素ＢａｍＨＩにより解裂し、アルカリホスファターゼ処理した。また、前記ｐＭＤ３０８２Ｂ１からα−アミラーゼ遺伝子部分を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し回収した。両遺伝子断片を混合し、リガーゼにより連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。
【００６６】得られたアンピシリン耐性を有する形質転換株から、プラスミドを調製し、遺伝子の導入方向を調べたところ、供試４８株のうち２３株が、目的の方向に遺伝子が導入されたプラスミドを有していた。
【００６７】得られたプラスミドを、制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ＤＮＡ断片を調製した。また、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて、前記ＤＮＡ断片と連結することにより、遺伝子を、目的のカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に１００％導入できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベクタープラスミドｐＵＢ１１０の概略制限酵素地図である。
【図２】プラスミドｐＭＤ３００３の構築図である。
【図３】プラスミドｐＤＣＡ１００の制限酵素地図である。
【図４】プラスミドｐＭＤ３０６２の構築図である。
【図５】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図である。
【図６】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△及びｐＭＤ３０８２Ｂ２△の構築図である。
【図７】プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 少なくともｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含むｐＵＢ１１０由来のベクターであって、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向に、ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されている高発現ベクター。
【請求項２】 ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の３′側にターミネーターが連結されている請求項１記載の高発現ベクター。
【請求項３】 ＳＤ配列の５′側にプロモーターが連結されている請求項１又は２記載の高発現ベクター。
【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の高発現ベクターを保有するバチルス属細菌。
【請求項５】 請求項４記載のバチルス属細菌を培養し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１】 少なくともｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含むｐＵＢ１１０由来のベクターであって、ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向に、ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列を有するペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されている高発現ベクター。
【請求項２】 ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の３′側にターミネーターが連結されている請求項１記載の高発現ベクター。
【請求項３】 ＳＤ配列の５′側にプロモーターが連結されている請求項１又は２記載の高発現ベクター。
【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の高発現ベクターを保有するバチルス属細菌。
【請求項５】 請求項４記載のバチルス属細菌を培養し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド又は蛋白質の製造方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図７】
【図６】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図７】
【図６】
【公開番号】特開平５−２５２９６４
【公開日】平成５年（１９９３）１０月５日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−６８９８８
【出願日】平成３年（１９９１）３月８日
【出願人】（０００１０３０７９）エム・ディ・リサーチ株式会社 (2)
【公開日】平成５年（１９９３）１０月５日
【国際特許分類】
【出願日】平成３年（１９９１）３月８日
【出願人】（０００１０３０７９）エム・ディ・リサーチ株式会社 (2)
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