１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオン酸菌発酵を用いた１，４−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（以下ＤＨＮＡともいう）の高濃度製造法とその培養物の風味改善技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＮＡは、従来、染料、顔料及び感光材料として工業材料として有用であることが知られており、これまでにも有機化学合成法により種々の合成法が開発されている。本発明者らは、これらに変わるＤＨＮＡの製造法について検討した結果、プロピオン酸菌により菌体内外に大量に産生されることを見出すと共に、この培養物から採取したＤＨＮＡ含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩には、乳糖不耐症の牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状を低減する作用を有すること、代謝性骨疾患の予防治療に有用であることを見出した（特許文献１）。本法により、ＤＨＮＡを飲食品や医薬品に用いることを可能にしたが、ＤＨＮＡ含有組成物は、風味の点で必ずしも満足のゆくものではなく、商品に多用することが困難であった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０３／０１６５４４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的はプロピオン酸菌発酵による風味の改善されたＤＨＮＡ含有組成物の効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、苦みの抑制されたＤＨＮＡ含有組成物を得るために各方面から鋭意検討した結果、全く意外にも、プロピオン酸菌発酵中の一定の時期に培地のエアレーションを行うことで、培養物中のＤＨＮＡ濃度が高まるという有用な新知見を得た。また、培養後の培養物にプロピオン酸菌の炭素源を添加し、弱アルカリ条件下低温保存することによっても、培養が終了しているにもかかわらず、ＤＨＮＡ濃度が高まることを見出した。さらに、かくして得られたＤＨＮＡ含有組成物は苦みが抑制され、風味が良好であり飲食品や医薬品として有用であることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ条件下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物の腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤の製造のための使用を提供するものである。
さらにまた、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物の有効量を投与することを特徴とする腹部不快症状の処置方法又は代謝性骨疾患の処置方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ＤＨＮＡが効率良く生産でき、かつ得られたＤＨＮＡ含有組成物は風味が良好で飲食品、医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合のＤＨＮＡ濃度の変化を示す。
【図２】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合の乳糖濃度の変化を示す。
【図３】エアレーションへの切替え時期とプロピオン酸菌数の変化を示す。
【図４】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合のプロピオン酸濃度を示す。
【図５】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合の酢酸濃度を示す。
【図６】エアレーションの流量を変化させた場合のＤＨＮＡ濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の製造法に用いられるプロピオン酸菌としては、ＤＨＮＡ産生菌であれば特に限定されないが、プロピオニバクテリウム属に属する菌が好ましく、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・トエニー（Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）などのチーズ用の菌、プロピオニバクテリウム・アビダム（Ｐ．ａｖｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム（Ｐ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム（Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓａｍ）などを挙げることができる。このうち、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒが好ましく、さらにＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＩＦＯ １２４２４及びＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＡＴＣＣ ６２０７、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４５４）が特に好ましい。
【０００９】
本発明方法に用いる培地は、炭素源を含有する培地が好ましく、本発明における炭素源とは、プロピオン酸菌が資化できる炭素源をいう。例えば乳糖、ブドウ糖、乳酸、グリセロール、グルテン、セルロース等が挙げられ、特に乳糖が好ましい。培養開始前の培地中の炭素源含有量は４〜８質量％、さらに４〜７質量％、特に４〜６．７質量％が好ましい。このうち、炭素源として乳糖を含有させた培地としては、ホエイ粉、カゼイン、脱脂粉乳、或いはホエイを透析処理して乳糖含量を減らしたホエイ蛋白質濃縮物、或いは乳糖含量を更に高純度に分離したホエイ蛋白質分離物が挙げられる。これらはそのまま、或いはプロテアーゼ処理して用いることも可能であり、酵母エキス、トリプチケース等のペプトンと、ブドウ糖、乳糖、乳糖のラクターゼ処理物等プロピオン酸菌が資化する炭素源となり得る単糖類及び／又は２糖類等の適量の糖類と、乳酸、グリセロール、グルテン、セルロース、乳清ミネラル等のミネラル分、必要に応じて牡蠣、生姜等ミネラル分を多く含む動植物性食品又はその抽出物を添加することにより培地を調製することができる。以下に、培地原料に脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を主成分とする培地調製法の一例を示す。
【００１０】
脱脂粉乳を１０〜２０質量％になるように水で溶解し、温度を４７℃に調整する。これにプロテアーゼを脱脂粉乳量の２．５質量％を添加し、脱脂粉乳溶液中のタンパク質を分解する。プロテアーゼとしては、動植物由来又は細菌由来のタンパク質分解酵素が挙げられ、酸性、中性、アルカリ性を問わず使用することができる。分解は６時間行い、分解中の温度は４７℃、ｐＨは６．８に調整する。ｐＨの調整には炭酸カリウム水溶液を用いる。プロテアーゼによる分解が終了したら脱脂粉乳溶液を８０℃に加温し、１０分間保持することでプロテアーゼを失活させる。失活後に脱脂粉乳の質量濃度が１０％となるように水でメスアップし、脱脂粉乳の１〜１０質量％、好適には３〜７質量％のビール酵母エキスを添加した後、滅菌する。滅菌条件はオートクレーブを用いる場合が１２１℃で７分以上、滅菌プレートを用いる場合が１４０℃以上で４秒以上とする。こうして得られた培地中には通常４〜５質量％の乳糖が含まれている。
【００１１】
培養は、嫌気的条件下で行われる。嫌気的条件は、例えば窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、その他不活性ガスを１種又は２種以上組み合わせることが可能で、中でも窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件とするのが好ましい。より具体的には、ファーメンター中に窒素ガス、炭酸ガス等を上面通気で流し、撹拌を行い、培地温度を３３℃に調整する。培地温度が３３℃で安定したら、プロピオン酸菌スターターを接種して嫌気的条件下培養を開始する。スターターには、プロピオン酸菌の賦活培養液や、培養液の菌体濃縮物などが利用可能である。培地への添加量は、前者の場合培地に対して０．０５％、後者の場合０．３％程度が目安となるが、これらの量は必要に応じて適宜変更してもかまわない。
【００１２】
培養温度は、２０〜４０℃、培地のｐＨは中性〜微酸性（好ましくはｐＨ５．５〜７．５）の条件下で培養する。培養中の酸度上昇を抑制するには、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等、中和剤として知られている公知のものを使用することができる。
【００１３】
次に培地にエアレーションする方法について説明する。この手段によりＤＨＮＡの生産量が増大することは、驚くべきことである。エアレーションを継続的に行うことによりＤＨＮＡの生産量が増大する理由は明らかではないが、このエアレーションによって、プロピオン酸菌がプロピオン酸の消費を開始する。
【００１４】
エアレーションを開始する時期は、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点であるが、プロピオン酸菌の炭素源が枯渇する２４時間前が一つの目安になる。エアレーション開始時期は、さらに、炭素源濃度が１．０〜３．５質量％となった時点、特に１．５〜３．０質量％となった時点がより好ましい。炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点でエアレーションすることでプロピオン酸菌は、炭素源に加えプロピオン酸も消費するようになり、最終的に炭素源はほぼ枯渇する。エアレーション開始時の培地中のプロピオン酸菌数は、１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）以上、さらに１．４×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．１ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）以上が好ましい。こうすることにより、培地中の炭素源をほぼ枯渇させることができる。前述の乳糖含有培地及び培養条件では、培養開始後約４８時間後に、乳糖濃度が３．５質量％以下になり、エアレーション開始時期となる。なお、乳糖、ブドウ糖といったプロピオン酸菌の炭素源となる糖類を途中添加する培養法も知られているが（例えば特許文献１、特開平１０−３０４８７１号公報）、本発明においては、これら糖類を途中添加はせず枯渇させることが好ましい。
【００１５】
エアレーションによる空気の供給量としては、プロピオン酸菌に刺激を与える程度の量が好ましい。この条件に相当する一例としてラボスケール（１．５Ｌ容量）での具体例を挙げると、スパージャーを使用し撹拌バネで１５０ｒｐｍの条件下培養を行う場合、空気の供給量は２Ｌ以上／分、より好ましくは２Ｌ／分〜４Ｌ／分であるが、容量、撹拌速度、装置等に合わせ適宜調整することができる。なお、液中の溶存酸素量が必要以上に高くなった場合には、プロピオン酸菌の生育が休止し、ＤＨＮＡの産生も止まる。前記の培地及び培養条件の場合、通常培養開始から約１６８時間で培養を終了する。
【００１６】
エアレーションの方法としては、培地に多孔性の通気チューブを挿入して、チューブ全面で空気を送り込む方法や、スパージャーで気泡を送り込む方法が挙げられる。
【００１７】
このようにして、培地及び菌体に蓄積されたＤＨＮＡは、培養を停止し、直ちにその培養物よりＤＨＮＡの採取に供することができる。また、培養の終点としては、菌数が定常期に達し、培地中の炭素源が枯渇してから３〜５日が目安となる。
【００１８】
次に、培養終了後の培養物にプロピオン酸菌の炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存してＤＨＮＡを製造する方法について説明する。ここで培養物は、前記のエアレーション後の培養物でもよいが、エアレーションを経由しない通常の嫌気的又は微好気的条件下による培養終了後の培養物でもよい。
【００１９】
培養物への炭素源添加量は、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３．０質量％、さらに０．４〜２．５質量％、特に０．８〜２．２質量％となるよう設定することが好ましい。また、弱アルカリ下にするには、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩基を添加して培養物のｐＨが７〜９、特に７．５〜８．５になるようにするのが好ましい。また、保存温度は３〜２０℃、特に３〜１５℃、さらに５〜１５℃が好ましい。保存期間は、１〜３週間、特に１〜２週間が好ましい。
【００２０】
このような弱アルカリ下の低温保存により培養物中のＤＨＮＡ含量が向上する。こうして、新たな設備を必要とせず、省スペースで、しかも保存中にＤＨＮＡ量を増大できる本方法は極めて有用かつ効果的な製造法といえる。
【００２１】
次に、ＤＨＮＡの採取方法について説明する。得られた培養物を吸着クロマトグラフィーに付すのが好ましい。吸着剤としては、活性炭や合成吸着剤（例えばダイアイオンＨＰ−２０、三菱化学（株）製）などの逆相系の吸着剤を広く使用することができる。まず、吸着剤をカラムに充填し、０．５％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム水溶液で洗浄する。次いで、得られた培養物をカラムに添加し（通過液をｐａｓｓとした）、さらに０．５％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム水溶液で水溶性画分を除去する。その後、０．５％（ｗ／ｖ）量アスコルビン酸ナトリウムを添加したエタノールで溶出し、このエタノール溶出画分を濃縮することで、ＤＨＮＡを高濃度に含む組成物を得ることができる。さらに、精製を行い、純粋なＤＨＮＡ又はその塩を得ることができる。尚、カラムからのＤＨＮＡの溶出液としてエタノールの代わりにメタノール等の他のアルコールを用いてもよい。また、これに代わる方法として、培養物を遠心分離し回収した上澄み液から、液体クロマトグラフィーを用いてＤＨＮＡを分取することも可能である。なお、アスコルビン酸ナトリウムに代わり、エリソルビン酸ナトリウムを用いることも好ましく、これらは、ＤＨＮＡの安定化剤として用いられるが、本発明では、アスコルビン酸、エリソルビン酸、これらの遊離の酸のほか、脂肪酸エステルその他各種のエステル類、アルカリ金属塩、その他の塩類も同様に使用することができる。
【００２２】
ＤＨＮＡの塩としては、薬学的又は食品学的に許容できる塩が挙げられ、代表的な塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム等の一価金属塩、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の多価金属塩、アンモニア、エタノールアミン等の無機あるいは有機アミン塩等が挙げられる。また、自体公知の反応を用いることにより、塩交換を行うこともできる。該塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭気水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられるが、これらは例示であって、本発明はこれらの塩に限定されない。
【００２３】
ＤＨＮＡは、ＤＨＮＡ産生菌の培養物中（菌体内及び／又は外）に含有されているので、吸着クロマトグラフィーを適用せずに培養物それ自体をロータリーエバポレーター等を使用し、濃縮することによってＤＨＮＡを高濃度に含有する組成物を得ることができる。また、通常の遠心分離法によって培養物から菌体を分離し得られた上清を濃縮することも好ましい。こうして得られた組成物は、利用する形態にあわせ、液状のまま用いてもよいし、粉末状に加工することもできる。
【００２４】
かくして得られたＤＨＮＡ含有組成物はＤＨＮＡ濃度が高く、苦みが抑制され、風味が良好である。従って、本発明のＤＨＮＡ含有組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩は、飲食用又は医薬品いずれの形態でも利用することができ、例えば、医薬品として直接投与することにより、或いは特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品として直接摂取することにより、あるいはまた、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラストその他）に添加しておき、これを摂取することによって、腸内フローラの改善や牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状の低減、代謝性骨疾患の予防治療することができる。
【００２５】
前記食品を製造するために、主成分として、水やタンパク質、糖質、脂質、ビタミン及びミネラル類、有機酸、果汁、フレーバー類等を組み合わせることができる。例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物、バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分；蔗糖、ブドウ糖、果糖、糖アルコール類、麦芽糖、オリゴ糖類、化工澱粉（デキストリンのほか、ソリュブルスターチ、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維等の炭水化物；ラード、魚油などの動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油等の植物性油脂、これらの分別油、水添油、エステル交換油等の植物性油脂；ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、エリソルビン酸、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシット、コリン、葉酸などの各種ビタミン；カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、塩素、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、フッ素、ケイ素、ヨウ素等のミネラル；リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等の有機酸や有機酸塩などがあげられ、これらから選択される１種又は２種以上を適宜選択して添加することができる。これら各種成分は合成品の他、必要に応じこれらを多く含む食品で添加することも望ましい。また、その形態としては、前記食品に限らず、最終製品で活性が維持されていれば特に限定されることなく、液状、固形状（顆粒、粉末、タブレット、ゲル状を含む）、半固形状（ゼリー状を含む）、ペースト状、乳化状等のいずれでもよい。
【００２６】
本発明に係る組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、試験例、実施例を挙げ本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、以下の試験例及び実施例においてＤＨＮＡの定量はＷＯ０３／０１６５４４第９頁に記載の方法に従って行った。乳糖濃度の測定は、乳糖電極を用いたフローインジェクション分析法（王子計測機器（株）製、フローインジェクション分析装置、Ｂｉｏ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）使用）によって行った。プロピオン酸菌数の測定は、ＢＬ寒天培地で行った。プロピオン酸、酢酸濃度は、ＨＰＬＣ法（カラム：ＲＳ ｐａｋ ＫＣ−８１１＋プレカラムＫＣ−Ｇ、検出：ＵＶ４４５ｎｍ）で測定した。
［試験例１］エアレーション切替え時期の検討
（１）培地の調製
【００２８】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１５０ｇを水１０００ｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを３．７５ｇ添加して４７℃で６時間タンパク質の分解を行った。タンパク質分解中のｐＨは６．６〜６．８に炭酸カリウム溶液を用いて調整した。タンパク質分解後、８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキスを７．５ｇ添加し、炭酸カリウム水溶液を用いてｐＨを６．９５に調整した。水で溶液の容量を１５００ｍＬに調整し、２Ｌ容量のファーメンターに入れ、培地滅菌を行った。滅菌条件は１２１℃、７分とした。
（２）培養条件
【００２９】
ファーメンター中に窒素ガスを通気し、培地温度を３３℃で安定させて、凍結濃縮スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を０．７５ｍＬ添加し、培養を開始した。発酵中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は４０％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養方法としては、以下の５種類を実施した。
１）培養開始から終了まで窒素ガス通気を継続、
２）培養開始から７２時間後、９６時間後に培養液の２％重量の乳糖を添加する以外は１）と同様、
３）培養開始から２４時間後に窒素ガス通気をエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
４）培養開始から４８時間後にエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
５）培養開始から７２時間後にエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
これらはすべて培養開始１６８時間後に培養を終了した。
（３）結果
【００３０】
ＤＨＮＡ濃度、乳糖濃度、プロピオン酸菌数、プロピオン酸濃度、酢酸濃度の経時変化をそれぞれ図１、図２、図３、図４、図５に示す。この結果から明らかなように、４）、５）により得られた培養物は、ＤＨＮＡの濃度が約４５μｇ／ｍＬとなった（図１）。また、４）、５）において、９６時間後に乳糖がほぼ枯渇し（図２）、培養開始から増加していたプロピオン酸濃度も緩やかに減少することが確認された（図４）。プロピオン酸菌数は、３）を除き、培養終了時にはすべて１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）を越え、４）、５）は、ほぼ１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１１．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）に達していた（図３）。
【００３１】
以上より、培養開始から少なくとも４８時間経過した後に窒素通気からエアレーションに切替えることで、ＤＨＮＡが高濃度に含まれる培養物が得られることが確認された（図６）。また、切替え時の乳糖濃度は、４）が３．３質量％、５）が２．９質量％であった（図２）。
［試験例２］エアレーション量の検討
【００３２】
エアレーション量を変更する以外は、試験例１の５）と同様の条件で、培養を行った。発酵開始から７２時間後に０．５Ｌ／分、１．０Ｌ／分、２．０Ｌ／分、４．０Ｌ／分にエアレーションの流量を変更し培養を行った。その結果、流量を２．０／分以上とすることで、培養開始から１４４時間後にＤＨＮＡ濃度が約４０μｇ／ｍＬとなることがわかった。
［実施例１］
【００３３】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１８０ｇを水１０００ｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを３．７５ｇ添加して４７℃で３時間タンパク質の分解を行った。タンパク質分解中のｐＨは６．６〜６．８に炭酸カリウム水溶液を用いて調整した。タンパク質分解後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス７．５ｇ、乳糖１５ｇを添加し、炭酸カリウム水溶液を用いてｐＨを６．９５に調整した。水で溶液の容量を１５００ｍＬに調整し、２Ｌ容量のファーメンターに入れ、培地滅菌を行った（乳糖濃度質量約６．１％）。滅菌条件は１２１℃、７分とした。滅菌後、ファーメンター中に窒素ガスを通気し、培地温度を３３℃で安定させて、凍結濃縮スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を０．７５ｍＬ添加し、培養を開始した。培養中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整には４０％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替え、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は、２Ｌ／分、撹拌速度は、１５０ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が５２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。７２時間後の乳糖濃度は約１．９質量％、プロピオン酸菌数は３．５×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例２］
【００３４】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１２０ｋｇを水７５０ｋｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを２．５ｋｇ添加し、ｐＨを７．６に調整し４７℃で３時間タンパク質の分解を行った。分解終了後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス５ｋｇ、乳糖１０ｋｇを添加し、１４０℃、４秒で培地滅菌した。滅菌開始前の培地ｐＨは６．９であった。滅菌後、水で培地量を１０００Ｌに合わせ（乳糖濃度約６．１質量％）、ファーメンター中に窒素ガスを２０Ｌ／分で通気し、培地温度を３３℃で安定させて、スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を３．０Ｌ添加した。発酵中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は２３％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替えて、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は２００Ｌ／分、撹拌速度は５２ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が４２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。なお、培養開始７２時間後の乳糖濃度は約１．５質量％、プロピオン酸菌数は３．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例３］
【００３５】
前記実施例２で得られたＤＨＮＡ含有培養物に、アスコルビン酸ナトリウムを１．０％、乳糖を２．０％添加して、ｐＨを８．０に調整してから、１０℃で２週間保存した結果、ＤＨＮＡ濃度が５５μｇ／ｍＬとなった。
また、乳糖をブドウ糖に替え、同様にして保存したところ、培養終了時よりＤＨＮＡ濃度が増加した。
［比較例］
【００３６】
培養中、エアレーションに切り替えず、窒素ガス通気を継続する以外は、実施例１とすべて同様の条件で行った。この結果、ＤＨＮＡの濃度が３２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。
［実施例４］
【００３７】
前記実施例１で得られたＤＨＮＡ含有培養物を１２０ｇのプレーンヨーグルト（明治乳業（株）製）に加え、調製したヨーグルトの官能評価を表１及び表２に示す。本発明法により得られたＤＨＮＡ含有培養物を加えたヨーグルトは、ＤＨＮＡ濃度が高く、従来法（プレーンヨーグルトに比較例で得られたＤＨＮＡ含有培養物を添加したもの）と比較し、酸味がなく、苦みも感じられないことが確認された。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
［実施例５］
【００４１】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１２０ｋｇを水７５０ｋｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを２．５ｋｇ添加し、ｐＨを７．６に調整し４７℃で６時間タンパク質の分解を行った。分解終了後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス５ｋｇ、乳糖１０ｋｇを添加し、１４０℃、４秒で培地滅菌した。滅菌開始前の培地ｐＨは６．９であった。滅菌後、水で培地量を１０００Ｌに合わせ（乳糖濃度約６．１質量％）、ファーメンター中に窒素ガスを２０Ｌ／分で通気し、培地温度を３３℃で安定させて、スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を３．０Ｌ添加した。培養中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は２３％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替えて、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は２００Ｌ／分、撹拌速度は５２ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が４８μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。なお、培養開始７２時間後の乳糖濃度は約３．０質量％、プロピオン酸菌数は２．９×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例６］
【００４２】
前記実施例５で得られたＤＨＮＡ含有培養物に、アスコルビン酸ナトリウムを１．０％、乳糖を１．０％添加して、ｐＨを８．０に調整してから、１０℃で２週間保存した結果、ＤＨＮＡ濃度が６０μｇ／ｍＬとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオン酸菌発酵を用いた１，４−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（以下ＤＨＮＡともいう）の高濃度製造法とその培養物の風味改善技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＮＡは、従来、染料、顔料及び感光材料として工業材料として有用であることが知られており、これまでにも有機化学合成法により種々の合成法が開発されている。本発明者らは、これらに変わるＤＨＮＡの製造法について検討した結果、プロピオン酸菌により菌体内外に大量に産生されることを見出すと共に、この培養物から採取したＤＨＮＡ含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩には、乳糖不耐症の牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状を低減する作用を有すること、代謝性骨疾患の予防治療に有用であることを見出した（特許文献１）。本法により、ＤＨＮＡを飲食品や医薬品に用いることを可能にしたが、ＤＨＮＡ含有組成物は、風味の点で必ずしも満足のゆくものではなく、商品に多用することが困難であった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０３／０１６５４４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的はプロピオン酸菌発酵による風味の改善されたＤＨＮＡ含有組成物の効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、苦みの抑制されたＤＨＮＡ含有組成物を得るために各方面から鋭意検討した結果、全く意外にも、プロピオン酸菌発酵中の一定の時期に培地のエアレーションを行うことで、培養物中のＤＨＮＡ濃度が高まるという有用な新知見を得た。また、培養後の培養物にプロピオン酸菌の炭素源を添加し、弱アルカリ条件下低温保存することによっても、培養が終了しているにもかかわらず、ＤＨＮＡ濃度が高まることを見出した。さらに、かくして得られたＤＨＮＡ含有組成物は苦みが抑制され、風味が良好であり飲食品や医薬品として有用であることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ条件下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤を提供するものである。
また、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物の腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤の製造のための使用を提供するものである。
さらにまた、本発明は前記の如くして得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物の有効量を投与することを特徴とする腹部不快症状の処置方法又は代謝性骨疾患の処置方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ＤＨＮＡが効率良く生産でき、かつ得られたＤＨＮＡ含有組成物は風味が良好で飲食品、医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合のＤＨＮＡ濃度の変化を示す。
【図２】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合の乳糖濃度の変化を示す。
【図３】エアレーションへの切替え時期とプロピオン酸菌数の変化を示す。
【図４】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合のプロピオン酸濃度を示す。
【図５】エアレーションへの切替え時期を変化させた場合の酢酸濃度を示す。
【図６】エアレーションの流量を変化させた場合のＤＨＮＡ濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の製造法に用いられるプロピオン酸菌としては、ＤＨＮＡ産生菌であれば特に限定されないが、プロピオニバクテリウム属に属する菌が好ましく、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・トエニー（Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）などのチーズ用の菌、プロピオニバクテリウム・アビダム（Ｐ．ａｖｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム（Ｐ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム（Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓａｍ）などを挙げることができる。このうち、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒが好ましく、さらにＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＩＦＯ １２４２４及びＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＡＴＣＣ ６２０７、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４５４）が特に好ましい。
【０００９】
本発明方法に用いる培地は、炭素源を含有する培地が好ましく、本発明における炭素源とは、プロピオン酸菌が資化できる炭素源をいう。例えば乳糖、ブドウ糖、乳酸、グリセロール、グルテン、セルロース等が挙げられ、特に乳糖が好ましい。培養開始前の培地中の炭素源含有量は４〜８質量％、さらに４〜７質量％、特に４〜６．７質量％が好ましい。このうち、炭素源として乳糖を含有させた培地としては、ホエイ粉、カゼイン、脱脂粉乳、或いはホエイを透析処理して乳糖含量を減らしたホエイ蛋白質濃縮物、或いは乳糖含量を更に高純度に分離したホエイ蛋白質分離物が挙げられる。これらはそのまま、或いはプロテアーゼ処理して用いることも可能であり、酵母エキス、トリプチケース等のペプトンと、ブドウ糖、乳糖、乳糖のラクターゼ処理物等プロピオン酸菌が資化する炭素源となり得る単糖類及び／又は２糖類等の適量の糖類と、乳酸、グリセロール、グルテン、セルロース、乳清ミネラル等のミネラル分、必要に応じて牡蠣、生姜等ミネラル分を多く含む動植物性食品又はその抽出物を添加することにより培地を調製することができる。以下に、培地原料に脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を主成分とする培地調製法の一例を示す。
【００１０】
脱脂粉乳を１０〜２０質量％になるように水で溶解し、温度を４７℃に調整する。これにプロテアーゼを脱脂粉乳量の２．５質量％を添加し、脱脂粉乳溶液中のタンパク質を分解する。プロテアーゼとしては、動植物由来又は細菌由来のタンパク質分解酵素が挙げられ、酸性、中性、アルカリ性を問わず使用することができる。分解は６時間行い、分解中の温度は４７℃、ｐＨは６．８に調整する。ｐＨの調整には炭酸カリウム水溶液を用いる。プロテアーゼによる分解が終了したら脱脂粉乳溶液を８０℃に加温し、１０分間保持することでプロテアーゼを失活させる。失活後に脱脂粉乳の質量濃度が１０％となるように水でメスアップし、脱脂粉乳の１〜１０質量％、好適には３〜７質量％のビール酵母エキスを添加した後、滅菌する。滅菌条件はオートクレーブを用いる場合が１２１℃で７分以上、滅菌プレートを用いる場合が１４０℃以上で４秒以上とする。こうして得られた培地中には通常４〜５質量％の乳糖が含まれている。
【００１１】
培養は、嫌気的条件下で行われる。嫌気的条件は、例えば窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、その他不活性ガスを１種又は２種以上組み合わせることが可能で、中でも窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件とするのが好ましい。より具体的には、ファーメンター中に窒素ガス、炭酸ガス等を上面通気で流し、撹拌を行い、培地温度を３３℃に調整する。培地温度が３３℃で安定したら、プロピオン酸菌スターターを接種して嫌気的条件下培養を開始する。スターターには、プロピオン酸菌の賦活培養液や、培養液の菌体濃縮物などが利用可能である。培地への添加量は、前者の場合培地に対して０．０５％、後者の場合０．３％程度が目安となるが、これらの量は必要に応じて適宜変更してもかまわない。
【００１２】
培養温度は、２０〜４０℃、培地のｐＨは中性〜微酸性（好ましくはｐＨ５．５〜７．５）の条件下で培養する。培養中の酸度上昇を抑制するには、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等、中和剤として知られている公知のものを使用することができる。
【００１３】
次に培地にエアレーションする方法について説明する。この手段によりＤＨＮＡの生産量が増大することは、驚くべきことである。エアレーションを継続的に行うことによりＤＨＮＡの生産量が増大する理由は明らかではないが、このエアレーションによって、プロピオン酸菌がプロピオン酸の消費を開始する。
【００１４】
エアレーションを開始する時期は、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点であるが、プロピオン酸菌の炭素源が枯渇する２４時間前が一つの目安になる。エアレーション開始時期は、さらに、炭素源濃度が１．０〜３．５質量％となった時点、特に１．５〜３．０質量％となった時点がより好ましい。炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点でエアレーションすることでプロピオン酸菌は、炭素源に加えプロピオン酸も消費するようになり、最終的に炭素源はほぼ枯渇する。エアレーション開始時の培地中のプロピオン酸菌数は、１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）以上、さらに１．４×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．１ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）以上が好ましい。こうすることにより、培地中の炭素源をほぼ枯渇させることができる。前述の乳糖含有培地及び培養条件では、培養開始後約４８時間後に、乳糖濃度が３．５質量％以下になり、エアレーション開始時期となる。なお、乳糖、ブドウ糖といったプロピオン酸菌の炭素源となる糖類を途中添加する培養法も知られているが（例えば特許文献１、特開平１０−３０４８７１号公報）、本発明においては、これら糖類を途中添加はせず枯渇させることが好ましい。
【００１５】
エアレーションによる空気の供給量としては、プロピオン酸菌に刺激を与える程度の量が好ましい。この条件に相当する一例としてラボスケール（１．５Ｌ容量）での具体例を挙げると、スパージャーを使用し撹拌バネで１５０ｒｐｍの条件下培養を行う場合、空気の供給量は２Ｌ以上／分、より好ましくは２Ｌ／分〜４Ｌ／分であるが、容量、撹拌速度、装置等に合わせ適宜調整することができる。なお、液中の溶存酸素量が必要以上に高くなった場合には、プロピオン酸菌の生育が休止し、ＤＨＮＡの産生も止まる。前記の培地及び培養条件の場合、通常培養開始から約１６８時間で培養を終了する。
【００１６】
エアレーションの方法としては、培地に多孔性の通気チューブを挿入して、チューブ全面で空気を送り込む方法や、スパージャーで気泡を送り込む方法が挙げられる。
【００１７】
このようにして、培地及び菌体に蓄積されたＤＨＮＡは、培養を停止し、直ちにその培養物よりＤＨＮＡの採取に供することができる。また、培養の終点としては、菌数が定常期に達し、培地中の炭素源が枯渇してから３〜５日が目安となる。
【００１８】
次に、培養終了後の培養物にプロピオン酸菌の炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存してＤＨＮＡを製造する方法について説明する。ここで培養物は、前記のエアレーション後の培養物でもよいが、エアレーションを経由しない通常の嫌気的又は微好気的条件下による培養終了後の培養物でもよい。
【００１９】
培養物への炭素源添加量は、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３．０質量％、さらに０．４〜２．５質量％、特に０．８〜２．２質量％となるよう設定することが好ましい。また、弱アルカリ下にするには、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩基を添加して培養物のｐＨが７〜９、特に７．５〜８．５になるようにするのが好ましい。また、保存温度は３〜２０℃、特に３〜１５℃、さらに５〜１５℃が好ましい。保存期間は、１〜３週間、特に１〜２週間が好ましい。
【００２０】
このような弱アルカリ下の低温保存により培養物中のＤＨＮＡ含量が向上する。こうして、新たな設備を必要とせず、省スペースで、しかも保存中にＤＨＮＡ量を増大できる本方法は極めて有用かつ効果的な製造法といえる。
【００２１】
次に、ＤＨＮＡの採取方法について説明する。得られた培養物を吸着クロマトグラフィーに付すのが好ましい。吸着剤としては、活性炭や合成吸着剤（例えばダイアイオンＨＰ−２０、三菱化学（株）製）などの逆相系の吸着剤を広く使用することができる。まず、吸着剤をカラムに充填し、０．５％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム水溶液で洗浄する。次いで、得られた培養物をカラムに添加し（通過液をｐａｓｓとした）、さらに０．５％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム水溶液で水溶性画分を除去する。その後、０．５％（ｗ／ｖ）量アスコルビン酸ナトリウムを添加したエタノールで溶出し、このエタノール溶出画分を濃縮することで、ＤＨＮＡを高濃度に含む組成物を得ることができる。さらに、精製を行い、純粋なＤＨＮＡ又はその塩を得ることができる。尚、カラムからのＤＨＮＡの溶出液としてエタノールの代わりにメタノール等の他のアルコールを用いてもよい。また、これに代わる方法として、培養物を遠心分離し回収した上澄み液から、液体クロマトグラフィーを用いてＤＨＮＡを分取することも可能である。なお、アスコルビン酸ナトリウムに代わり、エリソルビン酸ナトリウムを用いることも好ましく、これらは、ＤＨＮＡの安定化剤として用いられるが、本発明では、アスコルビン酸、エリソルビン酸、これらの遊離の酸のほか、脂肪酸エステルその他各種のエステル類、アルカリ金属塩、その他の塩類も同様に使用することができる。
【００２２】
ＤＨＮＡの塩としては、薬学的又は食品学的に許容できる塩が挙げられ、代表的な塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム等の一価金属塩、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の多価金属塩、アンモニア、エタノールアミン等の無機あるいは有機アミン塩等が挙げられる。また、自体公知の反応を用いることにより、塩交換を行うこともできる。該塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭気水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられるが、これらは例示であって、本発明はこれらの塩に限定されない。
【００２３】
ＤＨＮＡは、ＤＨＮＡ産生菌の培養物中（菌体内及び／又は外）に含有されているので、吸着クロマトグラフィーを適用せずに培養物それ自体をロータリーエバポレーター等を使用し、濃縮することによってＤＨＮＡを高濃度に含有する組成物を得ることができる。また、通常の遠心分離法によって培養物から菌体を分離し得られた上清を濃縮することも好ましい。こうして得られた組成物は、利用する形態にあわせ、液状のまま用いてもよいし、粉末状に加工することもできる。
【００２４】
かくして得られたＤＨＮＡ含有組成物はＤＨＮＡ濃度が高く、苦みが抑制され、風味が良好である。従って、本発明のＤＨＮＡ含有組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩は、飲食用又は医薬品いずれの形態でも利用することができ、例えば、医薬品として直接投与することにより、或いは特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品として直接摂取することにより、あるいはまた、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラストその他）に添加しておき、これを摂取することによって、腸内フローラの改善や牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状の低減、代謝性骨疾患の予防治療することができる。
【００２５】
前記食品を製造するために、主成分として、水やタンパク質、糖質、脂質、ビタミン及びミネラル類、有機酸、果汁、フレーバー類等を組み合わせることができる。例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物、バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分；蔗糖、ブドウ糖、果糖、糖アルコール類、麦芽糖、オリゴ糖類、化工澱粉（デキストリンのほか、ソリュブルスターチ、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維等の炭水化物；ラード、魚油などの動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油等の植物性油脂、これらの分別油、水添油、エステル交換油等の植物性油脂；ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、エリソルビン酸、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシット、コリン、葉酸などの各種ビタミン；カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、塩素、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、フッ素、ケイ素、ヨウ素等のミネラル；リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等の有機酸や有機酸塩などがあげられ、これらから選択される１種又は２種以上を適宜選択して添加することができる。これら各種成分は合成品の他、必要に応じこれらを多く含む食品で添加することも望ましい。また、その形態としては、前記食品に限らず、最終製品で活性が維持されていれば特に限定されることなく、液状、固形状（顆粒、粉末、タブレット、ゲル状を含む）、半固形状（ゼリー状を含む）、ペースト状、乳化状等のいずれでもよい。
【００２６】
本発明に係る組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、試験例、実施例を挙げ本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、以下の試験例及び実施例においてＤＨＮＡの定量はＷＯ０３／０１６５４４第９頁に記載の方法に従って行った。乳糖濃度の測定は、乳糖電極を用いたフローインジェクション分析法（王子計測機器（株）製、フローインジェクション分析装置、Ｂｉｏ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）使用）によって行った。プロピオン酸菌数の測定は、ＢＬ寒天培地で行った。プロピオン酸、酢酸濃度は、ＨＰＬＣ法（カラム：ＲＳ ｐａｋ ＫＣ−８１１＋プレカラムＫＣ−Ｇ、検出：ＵＶ４４５ｎｍ）で測定した。
［試験例１］エアレーション切替え時期の検討
（１）培地の調製
【００２８】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１５０ｇを水１０００ｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを３．７５ｇ添加して４７℃で６時間タンパク質の分解を行った。タンパク質分解中のｐＨは６．６〜６．８に炭酸カリウム溶液を用いて調整した。タンパク質分解後、８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキスを７．５ｇ添加し、炭酸カリウム水溶液を用いてｐＨを６．９５に調整した。水で溶液の容量を１５００ｍＬに調整し、２Ｌ容量のファーメンターに入れ、培地滅菌を行った。滅菌条件は１２１℃、７分とした。
（２）培養条件
【００２９】
ファーメンター中に窒素ガスを通気し、培地温度を３３℃で安定させて、凍結濃縮スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を０．７５ｍＬ添加し、培養を開始した。発酵中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は４０％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養方法としては、以下の５種類を実施した。
１）培養開始から終了まで窒素ガス通気を継続、
２）培養開始から７２時間後、９６時間後に培養液の２％重量の乳糖を添加する以外は１）と同様、
３）培養開始から２４時間後に窒素ガス通気をエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
４）培養開始から４８時間後にエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
５）培養開始から７２時間後にエアレーション（２Ｌ／分）に切替え、
これらはすべて培養開始１６８時間後に培養を終了した。
（３）結果
【００３０】
ＤＨＮＡ濃度、乳糖濃度、プロピオン酸菌数、プロピオン酸濃度、酢酸濃度の経時変化をそれぞれ図１、図２、図３、図４、図５に示す。この結果から明らかなように、４）、５）により得られた培養物は、ＤＨＮＡの濃度が約４５μｇ／ｍＬとなった（図１）。また、４）、５）において、９６時間後に乳糖がほぼ枯渇し（図２）、培養開始から増加していたプロピオン酸濃度も緩やかに減少することが確認された（図４）。プロピオン酸菌数は、３）を除き、培養終了時にはすべて１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１０．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）を越え、４）、５）は、ほぼ１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ（１１．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ）に達していた（図３）。
【００３１】
以上より、培養開始から少なくとも４８時間経過した後に窒素通気からエアレーションに切替えることで、ＤＨＮＡが高濃度に含まれる培養物が得られることが確認された（図６）。また、切替え時の乳糖濃度は、４）が３．３質量％、５）が２．９質量％であった（図２）。
［試験例２］エアレーション量の検討
【００３２】
エアレーション量を変更する以外は、試験例１の５）と同様の条件で、培養を行った。発酵開始から７２時間後に０．５Ｌ／分、１．０Ｌ／分、２．０Ｌ／分、４．０Ｌ／分にエアレーションの流量を変更し培養を行った。その結果、流量を２．０／分以上とすることで、培養開始から１４４時間後にＤＨＮＡ濃度が約４０μｇ／ｍＬとなることがわかった。
［実施例１］
【００３３】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１８０ｇを水１０００ｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを３．７５ｇ添加して４７℃で３時間タンパク質の分解を行った。タンパク質分解中のｐＨは６．６〜６．８に炭酸カリウム水溶液を用いて調整した。タンパク質分解後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス７．５ｇ、乳糖１５ｇを添加し、炭酸カリウム水溶液を用いてｐＨを６．９５に調整した。水で溶液の容量を１５００ｍＬに調整し、２Ｌ容量のファーメンターに入れ、培地滅菌を行った（乳糖濃度質量約６．１％）。滅菌条件は１２１℃、７分とした。滅菌後、ファーメンター中に窒素ガスを通気し、培地温度を３３℃で安定させて、凍結濃縮スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を０．７５ｍＬ添加し、培養を開始した。培養中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整には４０％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替え、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は、２Ｌ／分、撹拌速度は、１５０ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が５２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。７２時間後の乳糖濃度は約１．９質量％、プロピオン酸菌数は３．５×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例２］
【００３４】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１２０ｋｇを水７５０ｋｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを２．５ｋｇ添加し、ｐＨを７．６に調整し４７℃で３時間タンパク質の分解を行った。分解終了後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス５ｋｇ、乳糖１０ｋｇを添加し、１４０℃、４秒で培地滅菌した。滅菌開始前の培地ｐＨは６．９であった。滅菌後、水で培地量を１０００Ｌに合わせ（乳糖濃度約６．１質量％）、ファーメンター中に窒素ガスを２０Ｌ／分で通気し、培地温度を３３℃で安定させて、スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を３．０Ｌ添加した。発酵中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は２３％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替えて、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は２００Ｌ／分、撹拌速度は５２ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が４２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。なお、培養開始７２時間後の乳糖濃度は約１．５質量％、プロピオン酸菌数は３．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例３］
【００３５】
前記実施例２で得られたＤＨＮＡ含有培養物に、アスコルビン酸ナトリウムを１．０％、乳糖を２．０％添加して、ｐＨを８．０に調整してから、１０℃で２週間保存した結果、ＤＨＮＡ濃度が５５μｇ／ｍＬとなった。
また、乳糖をブドウ糖に替え、同様にして保存したところ、培養終了時よりＤＨＮＡ濃度が増加した。
［比較例］
【００３６】
培養中、エアレーションに切り替えず、窒素ガス通気を継続する以外は、実施例１とすべて同様の条件で行った。この結果、ＤＨＮＡの濃度が３２μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。
［実施例４］
【００３７】
前記実施例１で得られたＤＨＮＡ含有培養物を１２０ｇのプレーンヨーグルト（明治乳業（株）製）に加え、調製したヨーグルトの官能評価を表１及び表２に示す。本発明法により得られたＤＨＮＡ含有培養物を加えたヨーグルトは、ＤＨＮＡ濃度が高く、従来法（プレーンヨーグルトに比較例で得られたＤＨＮＡ含有培養物を添加したもの）と比較し、酸味がなく、苦みも感じられないことが確認された。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
［実施例５］
【００４１】
脱脂粉乳（明治乳業（株）製）１２０ｋｇを水７５０ｋｇに溶解し、温度を４７℃に調整した。これにプロテアーゼを２．５ｋｇ添加し、ｐＨを７．６に調整し４７℃で６時間タンパク質の分解を行った。分解終了後に８０℃まで加温し１０分保持することでプロテアーゼを失活させ、ビール酵母エキス５ｋｇ、乳糖１０ｋｇを添加し、１４０℃、４秒で培地滅菌した。滅菌開始前の培地ｐＨは６．９であった。滅菌後、水で培地量を１０００Ｌに合わせ（乳糖濃度約６．１質量％）、ファーメンター中に窒素ガスを２０Ｌ／分で通気し、培地温度を３３℃で安定させて、スターター（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３）を３．０Ｌ添加した。培養中の温度は３３℃、ｐＨは６．５に調整し、窒素ガスを通気した。ｐＨの調整は２３％（ｗｔ／ｗｔ）の炭酸カリウム水溶液を使用した。培養開始７２時間後に窒素ガスの通気からエアレーションに切替えて、培養開始１６８時間後に培養を終了した。エアレーション時の空気流量は２００Ｌ／分、撹拌速度は５２ｒｐｍとした。この結果、ＤＨＮＡの濃度が４８μｇ／ｍＬとなる培養物が得られた。なお、培養開始７２時間後の乳糖濃度は約３．０質量％、プロピオン酸菌数は２．９×１０１０ｃｆｕ／ｍＬであった。
［実施例６］
【００４２】
前記実施例５で得られたＤＨＮＡ含有培養物に、アスコルビン酸ナトリウムを１．０％、乳糖を１．０％添加して、ｐＨを８．０に調整してから、１０℃で２週間保存した結果、ＤＨＮＡ濃度が６０μｇ／ｍＬとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項２】
培地が、炭素源４〜８質量％を含有する培地である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
嫌気的条件が、窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件である請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項５】
培養物への炭素源添加量が、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３質量％となる量である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
保存が、培養物のｐＨを７〜９とし、３〜２０℃で１週間〜３週間保存するものである請求項４又は５記載の製造法。
【請求項７】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ条件下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項８】
培地が、炭素源４〜８質量％を含有する培地である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
嫌気的条件が、窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件である請求項７又は８記載の製造法。
【請求項１０】
培養物への炭素源添加量が、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３質量％となる量である請求項７〜９のいずれか１項記載の製造法。
【請求項１１】
保存が、培養物のｐＨを７〜９とし、３〜２０℃で１週間〜３週間保存するものである請求項７〜９のいずれか１項記載の製造法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物。
【請求項１３】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善用飲食品。
【請求項１４】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善剤。
【請求項１５】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する代謝性骨疾患の予防治療用飲食品。
【請求項１６】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する代謝性骨疾患予防治療剤。
【請求項１７】
請求項１２記載の組成物の腹部不快症状改善用飲食品製造のための使用。
【請求項１８】
請求項１２記載の組成物の腹部不快症状改善剤製造のための使用。
【請求項１９】
請求項１２記載の組成物の代謝性骨疾患予防治療用飲食品製造のための使用。
【請求項２０】
請求項１２記載の組成物の代謝性骨疾患予防治療剤製造のための使用。
【請求項２１】
請求項１２記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする腹部不快症状の処置方法。
【請求項２２】
請求項１２記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする代謝性骨疾患の処置方法。
【請求項１】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項２】
培地が、炭素源４〜８質量％を含有する培地である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
嫌気的条件が、窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件である請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項５】
培養物への炭素源添加量が、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３質量％となる量である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
保存が、培養物のｐＨを７〜９とし、３〜２０℃で１週間〜３週間保存するものである請求項４又は５記載の製造法。
【請求項７】
プロピオン酸菌に属する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸生産菌を嫌気的条件下で培養を開始し、培地中の炭素源濃度が３．５質量％以下になった時点で培地にエアレーションして培養し、得られた培養物に炭素源を添加し、弱アルカリ条件下で３〜２０℃に保存することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法。
【請求項８】
培地が、炭素源４〜８質量％を含有する培地である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
嫌気的条件が、窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件である請求項７又は８記載の製造法。
【請求項１０】
培養物への炭素源添加量が、培養物中の炭素源濃度が０．２〜３質量％となる量である請求項７〜９のいずれか１項記載の製造法。
【請求項１１】
保存が、培養物のｐＨを７〜９とし、３〜２０℃で１週間〜３週間保存するものである請求項７〜９のいずれか１項記載の製造法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物。
【請求項１３】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善用飲食品。
【請求項１４】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する腹部不快症状改善剤。
【請求項１５】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する代謝性骨疾患の予防治療用飲食品。
【請求項１６】
請求項１２記載の組成物を有効成分として含有する代謝性骨疾患予防治療剤。
【請求項１７】
請求項１２記載の組成物の腹部不快症状改善用飲食品製造のための使用。
【請求項１８】
請求項１２記載の組成物の腹部不快症状改善剤製造のための使用。
【請求項１９】
請求項１２記載の組成物の代謝性骨疾患予防治療用飲食品製造のための使用。
【請求項２０】
請求項１２記載の組成物の代謝性骨疾患予防治療剤製造のための使用。
【請求項２１】
請求項１２記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする腹部不快症状の処置方法。
【請求項２２】
請求項１２記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする代謝性骨疾患の処置方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３３２３
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４４４９（Ｐ２００５−５１４４４９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３９４
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３９４
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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