ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
クロマトグラフィー処理以外では困難であった高純度のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＨＰＬＣ純度９５％以上）を、クロマトグラフィー処理を用いることなく、単純な操作で容易に、しかも収率よく取得できる方法を提供する。 高純度のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法であって、以下の工程１〜４の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。 工程１：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、 工程２：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、 工程３：有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程 工程４：沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖合成の重要な原料であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖に関する構造及び機能に関する研究が急速に進み、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖蛋白質等の医薬品又は機能性素材としての用途開発が注目を集めている。中でも、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウィルス感染の際の受容体となる等の重要な機能を有する糖鎖として知られている。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖は、一般にシアル酸転移酵素の触媒により合成される。なお、シアル酸転移酵素とは、シチジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体とし、受容体となる糖鎖にシアル酸を転移させる酵素である。
【０００４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、基本的にはシチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を基質として、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により合成されている。
【０００５】
しかしながら、糖供与体として用いるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、非常に不安定で大量調製が困難であることから極めて高価であり、かつ量的にも試薬レベルでの僅かな量でしか供給されていない。また、供給されている製品の純度も悪く（従来、純度９５％以上の高純度品を取得することが容易ではなく、ＨＰＬＣ検定上、通常９０％前後の純度を有している）、シアル酸含有糖鎖等の製造原料としては不適切なものとならざるを得ない。
【０００６】
従来、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの精製法としては、反応工程中あるいは精製工程中に分解されて生成する、あるいは合成反応液中に残存するシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）、シチジン５’−ジリン酸（５’−ＣＤＰ）及び５’−ＣＴＰとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとを分離することが非常に困難であるため、仔ウシ由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いて共存する５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ及び５’−ＣＴＰのリン酸を除去してすべてをシチジンにした後、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理によりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを分離する方法が好ましい方法として報告されている。（特許文献１〜３、非特許文献１）
【特許文献１】特開平５−２７６９７３号公報
【特許文献２】特公平５−７３３９１号公報
【特許文献３】特開平８−７３４８０号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９−７１６３（１９８８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来法では、手間やコスト高につながる各種クロマトグラフィー処理を必須としており、必ずしも工業的レベルの大量製造時の精製法としては好適なものとは言えなかった。また、ホスファターゼ処理に使用する仔ウシ由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）は、現在のところ大量調製が困難な酵素であり、本酵素以外のホスファターゼを使用することも要望されていた。
【０００８】
また、クロマトグラフィー処理を必須としない、溶媒に対する溶解度の差を利用した分別沈殿法も報告されているものの（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９−７１６３（１９８８））、分別沈殿法でのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収率及び純度とも上記クロマトグラフィー処理法には到底及ばず、実用的な方法とはなっていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、クロマトグラフィー処理を必要とせず、高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを収率良く大量に製造するための方法に関し鋭意検討を重ねた結果、（１）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素による触媒反応終了後、速やかにリン酸と不溶性沈殿を形成しうるカルシウム、マンガン等の２価カチオンを添加することで、反応液中に混在する無機リン酸及びピロリン酸をリン酸塩として沈殿させ、また未反応基質である５’−ＣＴＰも塩として沈殿させることができること、（２）２価カチオンを添加しても、ホスファターゼ反応は何ら影響されず、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンに分解できること、（３）２価カチオンを添加することで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのアルコール等の有機溶媒に対する沈降性が選択的に高まり、シチジン及びＮｅｕＡｃとの分別沈殿が極めて容易になること、等を確認し、本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の通りである。
（１）高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法であって、以下の工程１〜４の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
工程１：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程
工程４：沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程
【００１１】
（２）工程１、工程２、工程３、工程４の順に実施する、上記（１）記載の方法。
（３）工程２、工程１、工程３、工程４の順に実施する、上記（１）記載の方法。
（４）工程１と工程２を同時に行う、上記（１）記載の方法。
（５）工程３と工程４を複数回実施する、上記（１）記載の方法。
（６）２価カチオンがカルシウムイオン又はマンガンイオンである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８）有機溶媒が、炭素数５以下のアルコールである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（９）工程４のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収後、さらに塩交換反応に付し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの塩を置換する、上記（１）記載の製造法。
（１０）イオン交換樹脂を用いる塩交換反応である、上記（９）記載の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、クロマトグラフィー処理以外では困難であった高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（ＨＰＬＣ純度９５％以上）を、クロマトグラフィー処理を用いることなく、単純な操作で容易に、しかも収率よく取得できるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ製造工程は、上記の通り、工程１〜工程４を基本としている。以下、各工程毎に詳述する。
（工程１）
工程１は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程である。
【００１４】
工程１（もしくは工程２）に供するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液としては、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する水溶液であれば特に限定されず、例えば酵素を用いたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成の反応混合液を挙げることができ、具体的には、５’−ＣＴＰとＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により合成されＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液を例示することができる。
【００１５】
添加する２価カチオンとしては、無機リン酸、ピロリン酸もしくはヌクレオチドと不溶性の沈殿を形成するものであれば特に限定されず、例えばカルシウム又はマンガンの各イオンを挙げることができる。具体的には、カルシウムイオンを添加する場合には、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩を使用することができ、マンガンイオンを添加する場合には塩化マンガン、硫酸マンガン等の水溶性マンガン塩を使用することができる。添加濃度としては、０．１〜２０００ｍＭの範囲から適宜設定すればよい。
【００１６】
このような２価カチオンをＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に添加し、温度０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００１７】
（工程２）
工程２は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程である。
【００１８】
反応に使用するホスファターゼとしては、ヌクレオチドのリン酸残基を脱リン酸してヌクレシドに変換できる酵素で、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンまで加水分解できる酵素であれば特に限定されず、特に、反応時におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの安定性や酵素調製の容易性等を考慮すると、アルカリホスファターゼ、特に大腸菌アルカリホスファターゼが好適である。
【００１９】
ホスファターゼ反応は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液１ｍｌ当たり０．０１ユニット以上、好ましくは０．１〜５０ユニット添加し、７０℃以下、好ましくは２０〜６０℃で０．１〜５０時間程度、必要により撹拌し、ｐＨを調整しながら反応させることにより実施できる。
【００２０】
なお、上記工程１と工程２は、順序は特に関係なく、どちらを先に行ってもかまわず、同時に行っても良い。例えば、工程１、工程２の順番で実施した場合、反応後、反応液中に２価イオンが存在するため、ホスファターゼ処理中あるいは処理後、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００２１】
（工程３）
工程３は、有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程である。
【００２２】
添加する有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、具体的にはメタノール、エタノール、イソプロパノール等を使用することができる。また、有機溶媒の添加量としては、反応液当たり０．１〜２０倍量の範囲から適宜設定することができる。
【００２３】
このような有機溶媒を上記工程１又は工程２の処理後の液に添加し、温度−８０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが沈降してくる。
【００２４】
（工程４）
工程４は、沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程である。
【００２５】
回収の方法は、通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）によって行うことができ、回収後、必要により乾燥させて製品とする。
【００２６】
また、上記工程３と本工程４を複数回（通常、２〜５回程度）実施することで、より高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを取得することができる。
【００２７】
（付加工程）
上記工程４終了後、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃはカルシウム塩、マンガン塩等の塩となっているため、必要に応じて、例えばナトリウム塩等に変換することも可能である。
【００２８】
塩の交換反応は、回収した沈殿を再溶解し、例えば、目的とする塩に置換したカチオン交換樹脂に接触（当該樹脂カラムへ通液等）させることで実施することができる。
このようにして得られたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃはＨＰＬＣよる純度が９５％以上で、５’−ＣＭＰ等の夾雑物が極めて少ない高純度の製品である。
【実施例１】
【００２９】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの定量はＨＰＬＣ法を用いて行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶離液として０．１Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）を用いた。
【００３０】
実施例１
（１）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの調製
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ５１９０７Ｄ）をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：５’−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）
プライマー（Ｂ）：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号２）
ＰＣＲ法によるｎｅｕＡ遺伝子の増幅は、１００μＬ中に、５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）及び（Ｂ）各々０．２μＭ、及びＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含む反応液を用い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断しＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片と、同じく制限酵素ＮｃｏＩＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結したＤＮＡを含有する反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを単離した。ｐＴｒｃｓｉａＢＮＰは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切断部位にｎｅｕＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素液とし、この酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を測定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’−ＣＴＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
【００３１】
（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の測定と単位の算出法）
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＴＰおよび１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加して３７℃で５分反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
反応液に２倍量の７０％エタノールを添加して反応を停止し、これを希釈した後、ＨＰＬＣによる分析を行った。分離にはＹＭＣ社製ＨＳ−３０２カラムを用い、溶出液として５０ｍＭ酢酸マグネシウム水溶液と１ｍＭテトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する活性を１単位（ユニット）としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を算出した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
（２）大腸菌アルカリホスファターゼの調製
大腸菌ＪＭ１０５株（タカラバイオ（株））の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））に従って調製した。このＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、ＰＣＲ法により大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子（ＥＭＢＬ／ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ ＤＡＴＡ ＢＡＮＫＳ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１４５．１）を増幅した。
プライマー（Ｃ）：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号３）
プライマー（Ｄ）：５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＴＴ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ法によるｐｈｏＡ遺伝子の増幅は、１００μＬ中に、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）及び（Ｄ）各々０．２ｍＭ、及びＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含む反応液を用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。当該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断しＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結したＤＮＡを含有する反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株））を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｐｈｏＡを単離した。
ｐＴｒｃ−ｐｈｏＡは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流の切断部位に大腸菌ｐｈｏＡ構造遺伝子およびリボソーム結合部位を含有するＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃ−ｐｈｏＡを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２２時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２５ｍＬの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ塩化マグネシウム）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
続いて得られた上清画分を８０℃、１５分間の熱処理を行った後に遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去し、これを合計２Ｌの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム）を用いて４℃、一晩の透析を行い、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このようにして得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるアルカリホスファターゼ活性を測定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株）と共に下記表２に示す。なお、本発明におけるアルカリホスファターゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
【００３４】
（アルカリホスファターゼ活性の測定と単位の算出法）
４００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）及び２０ｍＭウリジン５’−モノリン酸を含む溶液に酵素液を添加して，４０℃で５〜１５分反応させる。また、アルカリホスファターゼの代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。反応液に等量の０．５Ｍリン酸２水素カリウム溶液を添加することで反応を停止させた後、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応液中のウリジン量を定量した。３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのウリジンを生成する活性を１単位（ユニット）としてアルカリホスファターゼ活性を算出した。
【００３５】
【表２】
【００３６】
（３）２価イオンの添加効果
０．２Ｍ ＮｅｕＡｃ溶液を５ｍＬ、０．２５Ｍ ＣＴＰ・３Ｎａ溶液を４ｍＬ、及び１Ｍ塩化マグネシウム溶液を混合後、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１０に調整し、蒸留水で５０ｍＬにフィルアップした。４０℃に加温した後、７０ユニットのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、攪拌しながら反応を開始した。反応中、反応液のｐＨを８．５付近を維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００３７】
反応開始１時間後、１Ｍ塩化カルシウム溶液３ｍＬを添加後、続けて５ユニットの大腸菌アルカリホスファターゼを添加し、さらに４０℃で攪拌しながら反応を行った。反応中、反応液のｐＨを９．０付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。３０分後、一部をサンプリングしてＨＰＬＣにより反応液組成を分析したところ、下記表３に示すような結果が得られた。
【００３８】
また、上記と同様にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成を１時間行った後、１Ｍ塩化マンガン溶液３ｍＬもしくは蒸留水３ｍＬ添加後、同様に大腸菌アルカリホスファターゼ反応を行い、３０分後にサンプリングした時の反応液組成も併記した。
【００３９】
表３より、２価カチオンを添加することで大腸菌アルカリホスファターゼ反応を効率良く行え、特にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとの分離が困難であるＣＭＰを効率的に除去できることが明らかになった。
【００４０】
【表３】
【実施例２】
【００４１】
エタノール沈殿への２価イオン添加効果
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・２ナトリウム塩粉末７０ｍｇ（シグマ社製）を蒸留水で溶解し、５００μＬに調製した（約０．２Ｍ溶液）。これを１００μＬずつ分取した後、それぞれＡ．１Ｍ塩化カルシウム溶液、Ｂ．１Ｍ塩化マンガン溶液、Ｃ．蒸留水を５０μＬ添加した。続いてそれぞれに３００μＬのエタノールを添加し、４℃で一晩静置した後、１２１，０００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清の２７０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた測定値から沈殿画分としての回収率を算出したところ、表４に示す結果が得られた。
【００４２】
表４から明らかなように、リン酸と不溶性の沈殿を形成しうる２価カチオンを添加することでエタノール沈殿処理におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収率が飛躍的に向上することが明らかとなった。
【００４３】
【表４】
【実施例３】
【００４４】
ＮｅｕＡｃを１２．４ｇ（マルキン忠勇社製）、５’−ＣＴＰ・２Ｎａ塩を２４．２ｇ（ヤマサ醤油社製）、１Ｍ塩化マグネシウム溶液を１００ｍＬ添加、溶解した後、１Ｍ 水酸化ナトリウムでｐＨを９．５に調整し、蒸留水で２Ｌにフィルアップした。４０℃に加温した後、２，８１０ユニットのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、攪拌しながら反応を開始した。反応中にｐＨを８．５付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００４５】
反応開始１時間後、２．５Ｍ塩化カルシウム５０ｍＬを添加後、続けて２００ユニットの大腸菌アルカリホスファターゼを添加し、さらに４０℃で攪拌しながら反応を行った。反応中にｐＨを９．０付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００４６】
ホスファターゼ反応１時間後、反応液を４℃まで冷却した。一晩放置後、遠心分離（１５，０００ｘｇ、１５分）により沈殿物を除去した。得られた上清を１Ｍ塩化水素溶液でｐＨ７．０に調整後、カーボン粉末２ｇ添加し、氷中で１時間攪拌した。０．４５μｍフィルターを用いてカーボン粉末を除去した後、得られたろ液２．０３Ｌをエバポレーターで約１００ｍＬまで濃縮した。
【００４７】
濃縮中に生成した沈殿をＧ３ガラスフィルターを用いて除去した後、得られたろ液１４０ｍＬに対してエタノールを６６０ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、さらに４℃で攪拌、一晩放置した。
【００４８】
Ｇ３ガラスフィルターで沈殿を回収した後、減圧乾燥を行い、これを蒸留水で１５０ｍＬに溶解し、エタノールを４５０ｍＬ添加、室温で攪拌後、さらに４℃で攪拌、一晩放置した。
【００４９】
Ｇ３ガラスフィルターで沈殿を回収後、減圧乾燥を行い、これを蒸留水で２５０ｍＬに溶解し、ナトリウムイオンで置換させたＰＫ２１６（Ｎａ）樹脂（三菱化学社製）カラム１００ｍＬに４００〜４５０ｍＬ／ｈの流速で通液させた。
【００５０】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含む画分３７０ｍＬを回収し、エバポレーターで５０ｍＬ位まで濃縮した後、１Ｍ 塩化水素溶液でｐＨを７．０に調整した。
【００５１】
これにカーボン粉末０．５ｇ添加、水中で約１時間攪拌した後、０．４５μｍフィルターを用いてカーボン粉末を除去した。得られたろ液７０ｍＬに対してエタノールを４００ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、さらに４℃で一晩攪拌した。沈殿をＧ３ガラスフィルターを用いて回収し、これを減圧乾燥することでＨＰＬＣ純度９８．８％のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・２ナトリウム塩粉末（１８．４ｇ）を取得した。
このＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのＨＰＬＣの分析結果は以下の通りである。
＜分析条件＞
カラム：ＯＤＳ−ＨＳ３０２（ＹＭＣ社製）
溶離液：０．１Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）
＜分析結果＞
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ ９８．８％
５’−ＣＭＰ １．２％
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖合成の重要な原料であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖に関する構造及び機能に関する研究が急速に進み、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖蛋白質等の医薬品又は機能性素材としての用途開発が注目を集めている。中でも、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウィルス感染の際の受容体となる等の重要な機能を有する糖鎖として知られている。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖は、一般にシアル酸転移酵素の触媒により合成される。なお、シアル酸転移酵素とは、シチジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体とし、受容体となる糖鎖にシアル酸を転移させる酵素である。
【０００４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、基本的にはシチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を基質として、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により合成されている。
【０００５】
しかしながら、糖供与体として用いるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、非常に不安定で大量調製が困難であることから極めて高価であり、かつ量的にも試薬レベルでの僅かな量でしか供給されていない。また、供給されている製品の純度も悪く（従来、純度９５％以上の高純度品を取得することが容易ではなく、ＨＰＬＣ検定上、通常９０％前後の純度を有している）、シアル酸含有糖鎖等の製造原料としては不適切なものとならざるを得ない。
【０００６】
従来、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの精製法としては、反応工程中あるいは精製工程中に分解されて生成する、あるいは合成反応液中に残存するシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）、シチジン５’−ジリン酸（５’−ＣＤＰ）及び５’−ＣＴＰとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとを分離することが非常に困難であるため、仔ウシ由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いて共存する５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ及び５’−ＣＴＰのリン酸を除去してすべてをシチジンにした後、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理によりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを分離する方法が好ましい方法として報告されている。（特許文献１〜３、非特許文献１）
【特許文献１】特開平５−２７６９７３号公報
【特許文献２】特公平５−７３３９１号公報
【特許文献３】特開平８−７３４８０号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９−７１６３（１９８８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来法では、手間やコスト高につながる各種クロマトグラフィー処理を必須としており、必ずしも工業的レベルの大量製造時の精製法としては好適なものとは言えなかった。また、ホスファターゼ処理に使用する仔ウシ由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）は、現在のところ大量調製が困難な酵素であり、本酵素以外のホスファターゼを使用することも要望されていた。
【０００８】
また、クロマトグラフィー処理を必須としない、溶媒に対する溶解度の差を利用した分別沈殿法も報告されているものの（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９−７１６３（１９８８））、分別沈殿法でのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収率及び純度とも上記クロマトグラフィー処理法には到底及ばず、実用的な方法とはなっていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、クロマトグラフィー処理を必要とせず、高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを収率良く大量に製造するための方法に関し鋭意検討を重ねた結果、（１）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素による触媒反応終了後、速やかにリン酸と不溶性沈殿を形成しうるカルシウム、マンガン等の２価カチオンを添加することで、反応液中に混在する無機リン酸及びピロリン酸をリン酸塩として沈殿させ、また未反応基質である５’−ＣＴＰも塩として沈殿させることができること、（２）２価カチオンを添加しても、ホスファターゼ反応は何ら影響されず、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンに分解できること、（３）２価カチオンを添加することで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのアルコール等の有機溶媒に対する沈降性が選択的に高まり、シチジン及びＮｅｕＡｃとの分別沈殿が極めて容易になること、等を確認し、本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の通りである。
（１）高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法であって、以下の工程１〜４の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
工程１：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程
工程４：沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程
【００１１】
（２）工程１、工程２、工程３、工程４の順に実施する、上記（１）記載の方法。
（３）工程２、工程１、工程３、工程４の順に実施する、上記（１）記載の方法。
（４）工程１と工程２を同時に行う、上記（１）記載の方法。
（５）工程３と工程４を複数回実施する、上記（１）記載の方法。
（６）２価カチオンがカルシウムイオン又はマンガンイオンである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８）有機溶媒が、炭素数５以下のアルコールである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（９）工程４のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収後、さらに塩交換反応に付し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの塩を置換する、上記（１）記載の製造法。
（１０）イオン交換樹脂を用いる塩交換反応である、上記（９）記載の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、クロマトグラフィー処理以外では困難であった高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（ＨＰＬＣ純度９５％以上）を、クロマトグラフィー処理を用いることなく、単純な操作で容易に、しかも収率よく取得できるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ製造工程は、上記の通り、工程１〜工程４を基本としている。以下、各工程毎に詳述する。
（工程１）
工程１は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程である。
【００１４】
工程１（もしくは工程２）に供するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液としては、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する水溶液であれば特に限定されず、例えば酵素を用いたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成の反応混合液を挙げることができ、具体的には、５’−ＣＴＰとＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により合成されＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液を例示することができる。
【００１５】
添加する２価カチオンとしては、無機リン酸、ピロリン酸もしくはヌクレオチドと不溶性の沈殿を形成するものであれば特に限定されず、例えばカルシウム又はマンガンの各イオンを挙げることができる。具体的には、カルシウムイオンを添加する場合には、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩を使用することができ、マンガンイオンを添加する場合には塩化マンガン、硫酸マンガン等の水溶性マンガン塩を使用することができる。添加濃度としては、０．１〜２０００ｍＭの範囲から適宜設定すればよい。
【００１６】
このような２価カチオンをＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に添加し、温度０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００１７】
（工程２）
工程２は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程である。
【００１８】
反応に使用するホスファターゼとしては、ヌクレオチドのリン酸残基を脱リン酸してヌクレシドに変換できる酵素で、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンまで加水分解できる酵素であれば特に限定されず、特に、反応時におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの安定性や酵素調製の容易性等を考慮すると、アルカリホスファターゼ、特に大腸菌アルカリホスファターゼが好適である。
【００１９】
ホスファターゼ反応は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液１ｍｌ当たり０．０１ユニット以上、好ましくは０．１〜５０ユニット添加し、７０℃以下、好ましくは２０〜６０℃で０．１〜５０時間程度、必要により撹拌し、ｐＨを調整しながら反応させることにより実施できる。
【００２０】
なお、上記工程１と工程２は、順序は特に関係なく、どちらを先に行ってもかまわず、同時に行っても良い。例えば、工程１、工程２の順番で実施した場合、反応後、反応液中に２価イオンが存在するため、ホスファターゼ処理中あるいは処理後、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００２１】
（工程３）
工程３は、有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程である。
【００２２】
添加する有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、具体的にはメタノール、エタノール、イソプロパノール等を使用することができる。また、有機溶媒の添加量としては、反応液当たり０．１〜２０倍量の範囲から適宜設定することができる。
【００２３】
このような有機溶媒を上記工程１又は工程２の処理後の液に添加し、温度−８０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが沈降してくる。
【００２４】
（工程４）
工程４は、沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程である。
【００２５】
回収の方法は、通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）によって行うことができ、回収後、必要により乾燥させて製品とする。
【００２６】
また、上記工程３と本工程４を複数回（通常、２〜５回程度）実施することで、より高純度のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを取得することができる。
【００２７】
（付加工程）
上記工程４終了後、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃはカルシウム塩、マンガン塩等の塩となっているため、必要に応じて、例えばナトリウム塩等に変換することも可能である。
【００２８】
塩の交換反応は、回収した沈殿を再溶解し、例えば、目的とする塩に置換したカチオン交換樹脂に接触（当該樹脂カラムへ通液等）させることで実施することができる。
このようにして得られたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃはＨＰＬＣよる純度が９５％以上で、５’−ＣＭＰ等の夾雑物が極めて少ない高純度の製品である。
【実施例１】
【００２９】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの定量はＨＰＬＣ法を用いて行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶離液として０．１Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）を用いた。
【００３０】
実施例１
（１）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの調製
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ５１９０７Ｄ）をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：５’−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）
プライマー（Ｂ）：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号２）
ＰＣＲ法によるｎｅｕＡ遺伝子の増幅は、１００μＬ中に、５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）及び（Ｂ）各々０．２μＭ、及びＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含む反応液を用い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断しＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片と、同じく制限酵素ＮｃｏＩＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結したＤＮＡを含有する反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを単離した。ｐＴｒｃｓｉａＢＮＰは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切断部位にｎｅｕＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素液とし、この酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を測定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’−ＣＴＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
【００３１】
（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の測定と単位の算出法）
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＴＰおよび１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加して３７℃で５分反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
反応液に２倍量の７０％エタノールを添加して反応を停止し、これを希釈した後、ＨＰＬＣによる分析を行った。分離にはＹＭＣ社製ＨＳ−３０２カラムを用い、溶出液として５０ｍＭ酢酸マグネシウム水溶液と１ｍＭテトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する活性を１単位（ユニット）としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を算出した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
（２）大腸菌アルカリホスファターゼの調製
大腸菌ＪＭ１０５株（タカラバイオ（株））の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））に従って調製した。このＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、ＰＣＲ法により大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子（ＥＭＢＬ／ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ ＤＡＴＡ ＢＡＮＫＳ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１４５．１）を増幅した。
プライマー（Ｃ）：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号３）
プライマー（Ｄ）：５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＴＴ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ法によるｐｈｏＡ遺伝子の増幅は、１００μＬ中に、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）及び（Ｄ）各々０．２ｍＭ、及びＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含む反応液を用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。当該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断しＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結したＤＮＡを含有する反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株））を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｐｈｏＡを単離した。
ｐＴｒｃ−ｐｈｏＡは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流の切断部位に大腸菌ｐｈｏＡ構造遺伝子およびリボソーム結合部位を含有するＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃ−ｐｈｏＡを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２２時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２５ｍＬの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ塩化マグネシウム）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
続いて得られた上清画分を８０℃、１５分間の熱処理を行った後に遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去し、これを合計２Ｌの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム）を用いて４℃、一晩の透析を行い、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このようにして得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるアルカリホスファターゼ活性を測定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株）と共に下記表２に示す。なお、本発明におけるアルカリホスファターゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
【００３４】
（アルカリホスファターゼ活性の測定と単位の算出法）
４００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）及び２０ｍＭウリジン５’−モノリン酸を含む溶液に酵素液を添加して，４０℃で５〜１５分反応させる。また、アルカリホスファターゼの代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。反応液に等量の０．５Ｍリン酸２水素カリウム溶液を添加することで反応を停止させた後、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応液中のウリジン量を定量した。３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのウリジンを生成する活性を１単位（ユニット）としてアルカリホスファターゼ活性を算出した。
【００３５】
【表２】
【００３６】
（３）２価イオンの添加効果
０．２Ｍ ＮｅｕＡｃ溶液を５ｍＬ、０．２５Ｍ ＣＴＰ・３Ｎａ溶液を４ｍＬ、及び１Ｍ塩化マグネシウム溶液を混合後、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１０に調整し、蒸留水で５０ｍＬにフィルアップした。４０℃に加温した後、７０ユニットのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、攪拌しながら反応を開始した。反応中、反応液のｐＨを８．５付近を維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００３７】
反応開始１時間後、１Ｍ塩化カルシウム溶液３ｍＬを添加後、続けて５ユニットの大腸菌アルカリホスファターゼを添加し、さらに４０℃で攪拌しながら反応を行った。反応中、反応液のｐＨを９．０付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。３０分後、一部をサンプリングしてＨＰＬＣにより反応液組成を分析したところ、下記表３に示すような結果が得られた。
【００３８】
また、上記と同様にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成を１時間行った後、１Ｍ塩化マンガン溶液３ｍＬもしくは蒸留水３ｍＬ添加後、同様に大腸菌アルカリホスファターゼ反応を行い、３０分後にサンプリングした時の反応液組成も併記した。
【００３９】
表３より、２価カチオンを添加することで大腸菌アルカリホスファターゼ反応を効率良く行え、特にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとの分離が困難であるＣＭＰを効率的に除去できることが明らかになった。
【００４０】
【表３】
【実施例２】
【００４１】
エタノール沈殿への２価イオン添加効果
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・２ナトリウム塩粉末７０ｍｇ（シグマ社製）を蒸留水で溶解し、５００μＬに調製した（約０．２Ｍ溶液）。これを１００μＬずつ分取した後、それぞれＡ．１Ｍ塩化カルシウム溶液、Ｂ．１Ｍ塩化マンガン溶液、Ｃ．蒸留水を５０μＬ添加した。続いてそれぞれに３００μＬのエタノールを添加し、４℃で一晩静置した後、１２１，０００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清の２７０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた測定値から沈殿画分としての回収率を算出したところ、表４に示す結果が得られた。
【００４２】
表４から明らかなように、リン酸と不溶性の沈殿を形成しうる２価カチオンを添加することでエタノール沈殿処理におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収率が飛躍的に向上することが明らかとなった。
【００４３】
【表４】
【実施例３】
【００４４】
ＮｅｕＡｃを１２．４ｇ（マルキン忠勇社製）、５’−ＣＴＰ・２Ｎａ塩を２４．２ｇ（ヤマサ醤油社製）、１Ｍ塩化マグネシウム溶液を１００ｍＬ添加、溶解した後、１Ｍ 水酸化ナトリウムでｐＨを９．５に調整し、蒸留水で２Ｌにフィルアップした。４０℃に加温した後、２，８１０ユニットのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、攪拌しながら反応を開始した。反応中にｐＨを８．５付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００４５】
反応開始１時間後、２．５Ｍ塩化カルシウム５０ｍＬを添加後、続けて２００ユニットの大腸菌アルカリホスファターゼを添加し、さらに４０℃で攪拌しながら反応を行った。反応中にｐＨを９．０付近に維持するために１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
【００４６】
ホスファターゼ反応１時間後、反応液を４℃まで冷却した。一晩放置後、遠心分離（１５，０００ｘｇ、１５分）により沈殿物を除去した。得られた上清を１Ｍ塩化水素溶液でｐＨ７．０に調整後、カーボン粉末２ｇ添加し、氷中で１時間攪拌した。０．４５μｍフィルターを用いてカーボン粉末を除去した後、得られたろ液２．０３Ｌをエバポレーターで約１００ｍＬまで濃縮した。
【００４７】
濃縮中に生成した沈殿をＧ３ガラスフィルターを用いて除去した後、得られたろ液１４０ｍＬに対してエタノールを６６０ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、さらに４℃で攪拌、一晩放置した。
【００４８】
Ｇ３ガラスフィルターで沈殿を回収した後、減圧乾燥を行い、これを蒸留水で１５０ｍＬに溶解し、エタノールを４５０ｍＬ添加、室温で攪拌後、さらに４℃で攪拌、一晩放置した。
【００４９】
Ｇ３ガラスフィルターで沈殿を回収後、減圧乾燥を行い、これを蒸留水で２５０ｍＬに溶解し、ナトリウムイオンで置換させたＰＫ２１６（Ｎａ）樹脂（三菱化学社製）カラム１００ｍＬに４００〜４５０ｍＬ／ｈの流速で通液させた。
【００５０】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含む画分３７０ｍＬを回収し、エバポレーターで５０ｍＬ位まで濃縮した後、１Ｍ 塩化水素溶液でｐＨを７．０に調整した。
【００５１】
これにカーボン粉末０．５ｇ添加、水中で約１時間攪拌した後、０．４５μｍフィルターを用いてカーボン粉末を除去した。得られたろ液７０ｍＬに対してエタノールを４００ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、さらに４℃で一晩攪拌した。沈殿をＧ３ガラスフィルターを用いて回収し、これを減圧乾燥することでＨＰＬＣ純度９８．８％のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ・２ナトリウム塩粉末（１８．４ｇ）を取得した。
このＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのＨＰＬＣの分析結果は以下の通りである。
＜分析条件＞
カラム：ＯＤＳ−ＨＳ３０２（ＹＭＣ社製）
溶離液：０．１Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）
＜分析結果＞
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ ９８．８％
５’−ＣＭＰ １．２％
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法であって、以下の工程（１）〜（４）の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
工程（１）：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程（２）：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程（３）：有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程、及び
工程（４）：沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程
【請求項２】
工程（１）、工程（２）、工程（３）、工程（４）の順に実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（２）、工程（１）、工程（３）、工程（４）の順に実施する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（１）と工程（２）を同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（３）と工程（４）を複数回実施する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
２価カチオンがカルシウムイオン又はマンガンイオンである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒が、炭素数５以下のアルコールである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（４）のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収後、さらに塩交換反応に付し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの塩を置換する、請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
イオン交換樹脂を用いる塩交換反応である、請求項９記載の製造法。
【請求項１】
高純度のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法であって、以下の工程（１）〜（４）の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法。
工程（１）：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程（２）：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程（３）：有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを沈殿させる工程、及び
工程（４）：沈殿したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを回収する工程
【請求項２】
工程（１）、工程（２）、工程（３）、工程（４）の順に実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（２）、工程（１）、工程（３）、工程（４）の順に実施する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（１）と工程（２）を同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（３）と工程（４）を複数回実施する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
２価カチオンがカルシウムイオン又はマンガンイオンである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒が、炭素数５以下のアルコールである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（４）のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの回収後、さらに塩交換反応に付し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの塩を置換する、請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
イオン交換樹脂を用いる塩交換反応である、請求項９記載の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９７４
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４１８６（Ｐ２００５−５１４１８６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３７６０
【国際出願日】平成１６年９月２１日（２００４．９．２１）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３７６０
【国際出願日】平成１６年９月２１日（２００４．９．２１）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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