L−アミノ酸の製造法

【課題】L−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を用いて、L−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】L−アミノ酸生産能を有し、かつ、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記L−アミノ酸を採取することにより、L−リジン等のL−アミノ酸を製造する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌を用いたL−アミノ酸の製造法に関し、脂肪酸、グリセロール、グルコース等を原料とするL−アミノ酸の製造法に関する。L−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【0002】
発酵法によるL−アミノ酸の工業生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。また、炭素源として脂肪酸(特許文献1)やグリセロール(特許文献2)を用いたL−アミノ酸の製造法が開示されている。
【0003】
UspAは、universal stress global stress response regulatorとして知られており、さまざまなストレスタンパク質の制御に関与している。UspAタンパク質をコードするuspA遺伝子はエシェリヒア・コリからクローニングされている(非特許文献1)。また、UspAタンパク質をコードするuspA遺伝子が破壊されたエシェリヒア・コリの特性について研究がなされている(非特許文献2)。しかしながら、UspA活性の低下とL−アミノ酸生産性との関連については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】WO2009/142286
【特許文献2】米国特許出願公開第2009093029号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Nystrom, T. and Neidhardt, F.C., Mol. Microbiol. 1992 Nov; 6(21): 3187-3198
【非特許文献2】Nystrom, T. and Neidhardt, F.C., J. Bacteriol. 1993 July; 175(13): 3949-3956
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、L−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてL−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、UspAタンパク質をコードするuspA遺伝子の発現を弱化させた微生物を用いることにより、L−リジンのようなL−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1) L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記L−アミノ酸を採取する、L−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
(2)前記UspAタンパク質がuspA遺伝子によってコードされ、当該遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することにより、UspAタンパク質の活性が低下した、前記の方法。
(3)前記UspAタンパク質が、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、前記方法。
(4)前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、または、パントエア属細菌である前記方法。
(5)前記細菌が、エシェリヒア・コリである前記方法。
(6)前記L−アミノ酸がL−リジンである、前記方法。
方法。
(7)前記培地が、グリセロールを炭素源として含む培地であることを特徴とする、前記方法。
(8)前記培地が、脂肪酸を炭素源として含む培地であることを特徴とする、前記方法。(9)前記脂肪酸がオレイン酸である、前記方法。
(10)前記脂肪酸が油脂由来の脂肪酸の混合物である、前記方法。
(11)前記培地が、油脂を加水分解することによって得られる脂肪酸とグリセロールの混合物を炭素源として含む培地である、前記方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、脂肪酸、グリセロール及びグルコース等の炭素源から効率よくL−アミノ酸を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
<1>本発明の細菌
本発明で使用される細菌は、L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であり、かつUspAタンパク質の活性が低下するように改変された細菌である。本発明の細菌は、L−アミノ酸生産能を有するL−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、UspAタンパク質の活性が低下するように改変することによって取得することができる。
以下に、UspAタンパク質の活性が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びL−アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。尚、本発明の細菌は、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌にL−アミノ酸生産能を付与するか、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌のL−アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。
【0011】
本発明において、L−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、L−アミノ酸を生産し、培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするL−アミノ酸を、好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量で培地に蓄積させることができる細菌をいう。
【0012】
本発明におけるL−アミノ酸とは、L−リジン、L−グルタミン酸、L−スレオニン、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−セリン、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−グルタミン、L−アルギニン、L−システイン(シスチン)、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−グリシン、L−アラニン、L−プロリン、L−オルニチン、L−シトルリン、L−ホモセリンが挙げられる。これらの中ではL−リジン、L−スレオニン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファンが好ましい。
【0013】
なお、本発明において、L−アミノ酸とは、フリー体のL−アミノ酸のみならず、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩も含む。
【0014】
<1−1>本発明の親株として使用される細菌
本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、L−アミノ酸生産能を有する細菌である。
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【0015】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ(E. coli)が挙げられるが、これに限定されない。
【0016】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書(Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 (ATCC 27325)、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【0017】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【0018】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【0019】
以下、前記のような細菌にL−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌L−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【0020】
L−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、L−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、L−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77〜100頁参照)。ここで、L−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、発現が増強されるL−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【0021】
L−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちX線や紫外線の照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、か
つL−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【0022】
また、L−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、L−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むDNA断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる(国際公開パンフレットWO95/34672号参照)。また、目的のL−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のL−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させてもよい。酵素活性の低下又は欠損は、後述のアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素の活性を低下させる改変と同様にして行うことができる。
【0023】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは腸内細菌科において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。腸内細菌科で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【0024】
以下、細菌にL−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びL−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【0025】
L−スレオニン生産菌
L−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、L−スレオニン生合成系酵素の1種又は2種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。L−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII(lysC)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、アスパルトキナーゼI(thrA)、ホモセリンキナーゼ(thrB)、スレオニンシンターゼ(thrC)、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ(アスパルテートトランスアミナーゼ)(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である(以下の記載においても同様)。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。L−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株(特開2001−346578号)等が挙げられる。
【0026】
L−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のL−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、L−スレオニン生産菌を構築するためには、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにL−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る(Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照)。
【0027】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし(WO98/04715号パンフレット参照)、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。(欧州特許第0593792号明細書参照)また、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid (AHV)に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【0028】
このようにL−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【0029】
L−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのL−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ(pntAB)遺伝子(欧州特許733712号明細書)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(pepC)(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子(pps)(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書)が挙げられる。
【0030】
また、L−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、L−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にL−スレオニン耐性、L−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子(欧州特許出願公開第0994190号明細書)、rhtC遺伝子(欧州特許出願公開第1013765号明細書)、yfiK、yeaS遺伝子(欧州特許出願公開第1016710号明細書)が挙げられる。また宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【0031】
L−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrABCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【0033】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、L−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【0034】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【0035】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【0036】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【0037】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【0038】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【0039】
L−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するL−リジン生産菌の例としては、L−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。L−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、L−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。L−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。L−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのL−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【0040】
L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L−リジン生合成系酵素の1種又は2種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、L−リジン排出遺伝子であるybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【0041】
L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L−リジンの生合成経路から分岐してL−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。L−リジンの生合成経路から分岐してL−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【0042】
好ましいL−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる(WO2006/078039)。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2(米国特許第6,040,160号)を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりL−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子(米国特許第5,661,012号)でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された(米国特許第5,827,698号)。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいL−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【0043】
pCABD2は、L−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素(DDPS)をコードする変異型dapA遺伝子と、L−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる(国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット)。
【0044】
L−メチオニン生産菌としては、L−メチオニン生合成系のリプレッサー(metJ)を欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性(metA)が増強され、又はS−アデノシルメチオニンシンテース活性(metK)が弱化したエシェリヒア属細菌を用いることが出来る(日本特許04110641号公報)。
【0045】
L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ(pheA)、3−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、5−エノール酸ピルビンシキミ酸3−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる(欧州出願公開763127号明細書)。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー(tyrR)によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい(欧州特許763127号明細書参照)。
【0046】
また、3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ(aroF、aroG)は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、aroFの場合、N末端より147位のL−アスパラギン酸または181位のL−セリンが他のアミノ酸残基に、aroGの場合、N末端より146位のL−アスパラギン酸、147位のL−メチオニン、150位のL−プロリンもしくは202位のL−アラニンの1アミノ酸残基、または157位のL−メチオニン及び219位のL−アラニンの2アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる(EP0488424)。また、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼも、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。
【0047】
芳香族アミノ酸はそれぞれ生合成系が共通しており、目的とするL−アミノ酸以外の芳香族アミノ酸に固有の生合成系を弱化した株を用いることが好ましい。例えば、目的アミノ酸がL−トリプトファンの場合、L−フェニルアラニン、L−チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がL−フェニルアラニンの場合、L−トリプトファン、L−チロシン固有の生合成系を弱化することによって、目的L−アミノ酸を効率よく生産する菌株を得ることができる。生合成系を弱化することは、その生合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を導入すること、また弱化したい生合成系により合成されるL−アミノ酸を要求する株を、同L−アミノ酸を含有する合成培地を用いて取得することにより達成できる。(US4,371,614)
【0048】
L−トリプトファン生産菌
L−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【0049】
L−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ(aroG)、3−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、5−エノール酸ピルビルシキミ酸3−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の1種又は2種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL−トリプトファン及びL−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164(trpE8)、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5をE. coli SV164に導入することにより得られたSV164 (pGH5)が挙げられる。
【0050】
前記E. coli SV164 (trpE8)は、L−トリプトファンによるフィードバック阻害が解除されたアントラニレートシンターゼをコードする変異型trpE遺伝子を、trpE欠失株であるE. coli KB862(DSM7196)に導入することによって得られた株である(WO94/08031、特表平7-507693号)。E. coli SV164 (pGH5)は、このSV164株に、セリンによるフィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA5遺伝子を含むプラスミドpGH5(WO94/08031)を導入することによって得られた株である。E. coli SV164 (pGH5)は、L−トリプトファンだけでなく、L−セリンも生産する(米国特許第7,045,320号)。
【0051】
上記E. coli KB862は、AJ13828と命名され、2000年12月21日に工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)にブダペスト条約に基づいて国際寄託され、受託番号FERM BP-7405が付与されている。
【0052】
また、L−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、3−フォスフォセリンフォスファターゼ(serB)活性を増大した株(US4,371,614)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(pckA)を増大した株(WO2004/090125)、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/フォスファターゼオペロン(aceオペロン)が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された株(WO2005/103275)が挙げられる。
【0053】
L−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入され
た株(特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりL−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりL−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【0054】
L−フェニルアラニン生産菌
L−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ12479(FERM BP-4796)(EP 1484410A)、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)、及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【0055】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、L−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB、mtrや、L−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくL−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる(EP1484410)。
【0056】
L−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌(欧州特許出願公開1616940号公報)が挙げられる。
【0057】
遺伝子組換えにより本発明に用いる細菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子の保存的バリアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【0058】
ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【0059】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
【0060】
保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。
【0061】
また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
【0062】
プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【0063】
上記した遺伝子の保存的バリアントに関する記載は、後述のuspA遺伝子及び本明細書に記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
【0064】
本発明に用いる細菌は、グルコースやスクロース等の通常アミノ酸発酵に使用される炭素源を資化できる細菌であればいずれでもよいが、特に好ましくはグリセロールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌であり、元来グリセロールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌、グリセロールまたは脂肪酸の資化性を付与された組換え株、又はグリセロールまたは脂肪酸の資化性が高まった変異株でもよい。
【0065】
本発明におけるL−アミノ酸生産菌は、グリセロールの資化能力を高めるように改変されていてもよい。グリセロールの資化能力は、グリセロール代謝に関与する遺伝子を改変することによって達成できる。
【0066】
グリセロール代謝に関与する遺伝子としては、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子(EP1715056)の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子(EP1715055A)の発現が強化されていてもよい。特にグリセロール資化性を高めるために、グリセロールデヒドロゲナーゼ(gldA)、ジハイドロキシアセトンキナーゼ(dhaKLM, dak)遺伝子、フルクトース−6−リン酸アルドラーゼ(fsaB)の発現が強化されていることが好ましい(WO2008/102861)。
また、グリセロールキナーゼ(glpK)においては、フルクトース-1,6-リン酸によるフィードバック阻害が解除された脱感作型glpK遺伝子を用いることが好ましい(WO2008/081959,WO2008/107277)。
【0067】
本発明におけるL−アミノ酸生産菌は、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高めるように改変されていても構わない。このような改変には、例えば、腸内細菌群に見出される脂肪酸代謝を調節するDNA結合能を有する転写因子FadRをコードする遺伝子の欠損などが挙げられる(DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322)。具体的には、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)のfadR遺伝子は、GenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号1,234,161〜1,234,880に位置し、GenBank accession No. AAC74271にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【0068】
油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高めるためには、fadA, fadB, fadI, fadJ, fadL、fadE、fadDから選択される1種または2種以上の遺伝子の発現量を強化してもよい。
本発明における「fadL遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸の取り込み能を有する外膜のトランスポーターをコードする遺伝子を意味する(Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg, F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419)。FadLをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadL遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号2459322〜2460668に位置する遺伝子を例示することができる。
【0069】
本発明における「fadD遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸からfatty acyl-CoA を生成するfatty acyl-CoA synthetase活性を触媒すると同時に、内膜を通して取り込む酵素をコードする遺伝子を意味する(Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170)。FadDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号1887770〜1886085(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。
【0070】
本発明における「fadE遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acyl-CoA を酸化するacyl-CoA dehydrogenase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する(O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3759-3764)。
【0071】
FadEをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadE遺伝子とし
て、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号243303〜240859(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。
【0072】
本発明における「fadB遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのα componentであり、enoyl-CoA hydratase、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-hydroxyacyl-CoA epimerase、Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomeraseの4つの活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する(Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785)。 FadBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号4028994〜4026805(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。
【0073】
本発明における「fadA遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのβ componentであり、3-ketoacyl-CoA thiolase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する(Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473)。FadAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号4026795〜4025632(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。
【0074】
腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexは、FadBとFadAが複合体を形成しており、遺伝子としてもfadBAオペロンを形成していることが知られている(Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429)。従って、fadBAオペロンとして、オペロン全体を増幅することも可能である。
【0075】
また、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力は、cyoオペロン(cyoABCDE)の増強によっても達成される。本発明における「cyoABCDE」とは、腸内細菌群に見出される末端酸化酵素の一つであるシトクロムbo型酸化酵素複合体(cytochrome bo terminal oxidase complex)の各サブユニットをコードする遺伝子群であり、cyoBがsubunit Iを、cyoAがsubunit IIを、cyoCがsubunit IIIを、cyoCがsubunit IVを、cyoEがheme O synthase活性を触媒する酵素をコードする(Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D.Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11185-11192)。
【0076】
cyoAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号450834〜449887(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。cyoBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号449865〜447874(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。cyoCをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoC遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号447884〜447270(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。cyoDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号447270〜446941(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。cyoE遺伝子をコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号446929〜446039(相補鎖)に位置する遺伝子を例示することができる。
【0077】
また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸:NADPオキ
シドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい(WO2009/031565号参照)。
【0078】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCOからピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素(EC 1.2.7.1)を意味する。ピルビン酸シンターゼは、PSと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【0079】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 + CoA
【0080】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法(Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279)に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性1ユニット(U)は1分間あたり1μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg(菌体タンパク質)以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い(Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49)。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【0081】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス(Hydrogenobacter thermophilus)等、還元的TCAサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis)、メタノカルドコッカス・ジャナスチ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス(Methanothermobacter thermautotrophicus)などの独立栄養性メタン生成古細菌(autotrophic methanogens)のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
【0082】
本発明における「ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCOからピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばNADPHあるいはNADH存在下で可逆的に触媒する酵素(EC 1.2.1.15)を意味する。ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼは、PNOと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)は、ピルビン酸:NADP+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸:NADP+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、NADPHあるいはNADHを用いることが出来る。
【0083】
NADPH + アセチル-CoA + CO → NADP + ピルビン酸 + CoA
【0084】
ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法(Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135)に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性1ユニット(U)は1分間あたり1μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg(菌体タンパク質)以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い(Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720)。
【0085】
ピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)のピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ遺伝子(Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479: 155-156)、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)のピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ遺伝子(Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720)の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ(Tharassiosira pseudonana)にも相同な遺伝子が存在することが知られている(Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231)。
【0086】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)のピルビン酸:NADPオキシドレダクターゼ遺伝子が利用できる。(GenBank Accession No. AB021127)。
【0087】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-NADPレダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、L−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【0088】
「フェレドキシン-NADPレダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素(EC 1.18.1.2)をいう。
【0089】
還元型フェレドキシン + NADP→ 酸化型フェレドキシン + NADPH + H
【0090】
本反応は、可逆反応であり、NADPHと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-NADPレダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-NADPレダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており(Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照)、フェレドキシン-NADPオキシドレダクターゼ、NADPH-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【0091】
フェレドキシン-NADPレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-NADPレダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-NADPレダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法(Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569)に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性1ユニット(U)は1分間あたり1μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン-NADPレダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【0092】
フェレドキシン-NADPレダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のL−アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-NADPレダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている(Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595)。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、NADPH-プチダレドキシンレダクターゼ(Putidaredoxin reductase)遺伝子とプチダレドキシン(Putidaredoxin)遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836)。
【0093】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-NADPレダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号4111749〜4112495(相補鎖)に位置する、fpr遺伝子を例示することができる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列(GenBank Accession No. BA00036)の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-NADPレダクターゼ遺伝子が見出されている(GenBank Accession No. BAB99777)。
【0094】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-NADPレダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【0095】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子(Fe)と、硫黄原子を含み、4F
e-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN(Flavin-mononucleotide)を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている(McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801)。
【0096】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、L−アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【0097】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【0098】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-NADPレダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている(Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138)。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-NADPレダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【0099】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し(Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125)、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子(Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737)とfldB遺伝子(Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793)の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列(GenBank Accession No. BA00036)においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx(GenBank Accession No. BAB97942)及び塩基番号1148953〜1149270番にfer(GenBank Accession No. BAB98495)が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンI及びフェレドキシンIIが同定されている(Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036)。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的TCAサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【0100】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号2654770〜2655105番(相補鎖)に位置するfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置するyfhL遺伝子を例示することができる。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列(GenBank Accession No. U00096)の塩基番号710688〜710158番(相補鎖)に位置するfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置するfldB遺伝子を例示することができる。
【0101】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列(GenBank Accession No. NC_002932)の塩基番号1184078〜1184266番に位置するフェレドキシンI遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置するフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス(Hydrogenobacter thermophilus)のフェレドキシン遺伝子(GenBank Accession No. BAE02673)やスルフォロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム(Chlorobium)属、デスルホバクター(Desulfobacter)属、アクイフェクス(Aquifex)属、ハイドロジェノバクター(Hydrogenobacter)属、サーモプロテウス(Thermoproteus)属、パイロバキュラム(Pyrobaculum)属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【0102】
<1−2>UspAタンパク質の活性の低下
次に、UspAタンパク質の活性を低下させる改変について説明する。
【0103】
UspAは、uspA遺伝子(Synonyms: ECK1742, b1744, ydjS)がコードしている。具体的には、エシェリヒア・コリのuspA遺伝子として、GenBankデータベースに登録された塩基配列(Accession X67639 S50575の塩基番号343〜777、配列番号1)を有する遺伝子を例示することができる。配列番号2には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【0104】
UspAタンパク質としては、例えばエシェリヒア・コリに関しては、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、タンパク質の機能が変わらない限り、同アミノ酸配列において、保存的変異を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。すなわち、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等を含む配列を有するタンパクであってもよい。
「1若しくは数個」、及び「保存的変異」については、前記と同様である。
【0105】
「UspAタンパク質の活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのUspAタンパク質の活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのUspAタンパク質の分子数が低下した場合や、分子あたりの活性が低下した場合等が該当する。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。
【0106】
UspAタンパク質の活性が低下するような改変は、具体的には、染色体上のuspA遺伝子の一部または全部を欠損させたり、同遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ(SD)配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。遺伝子の発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上の遺伝子のコードする領域にアミノ酸置換(ミスセンス変異)を導入すること、また終始コドンを導入すること
(ナンセンス変異)、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分を欠失させることによっても達成出来る。(Journal of biological Chemistry 272:8611-8617(1997) Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266,20833-20839(1991))
【0107】
uspA遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入すること、フレームシフト、ナンセンス変異、ミスセンス変異を導入することが挙げられる。
【0108】
発現調節配列の改変は、好ましくは1塩基以上、より好ましくは2塩基以上、特に好ましくは3塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、N末端領域、内部領域、C末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【0109】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やL−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【0110】
染色体上のuspA遺伝子を上記のように改変するには、例えば、uspA遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上のuspA遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上のuspA遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000))、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))とを組合わせた方法(WO2005/010175号参照)等の直鎖状DNAを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある(米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報)。
【0111】
UspAタンパク質の活性が低下したことの確認は、例えばuspA遺伝子の発現量を測定することによって行うことができる。例えば、uspA遺伝子の転写量が低下したことの確認は、uspA遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50%以下、25%以下、又は10%以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【0112】
uspA遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50%以下、25%以下、又は10%以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない(完全に活性が消失している)ことが特に好ましい。
【0113】
また、uspA遺伝子を変異処理して、低活性のUspAタンパク質をコードする遺伝子を取得することもできる。
【0114】
UspAタンパク質の活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、UspAタンパク質の活性又は発現量が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。
【0115】
<2>本発明のL−アミノ酸の製造法
本発明のL−アミノ酸の製造法においては、腸内細菌科に属し、L−アミノ酸生産能を有し、かつ、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された細菌を培養して、培養物中にL−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からL−アミノ酸を採取する。L−アミノ酸としては、L−リジン、L−スレオニン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン が好ましい。
【0116】
使用する培地は、細菌を用いたL−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロースを炭素源として用いることが好ましい。なお、シュクロース資化能を持たない株については、シュクロース資化遺伝子を導入することにより、シュクロースを炭素源として使用できるようになる(米国特許第5,175,107号)。
【0117】
さらに本発明においては、グリセロールまたは脂肪酸を炭素源として用いてもよい。グリセロールは、L−アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、好ましくは0.1w/v%〜50w/v%程度、より好ましくは0.5w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは1w/v%〜30w/v%程度培地に含有させる。グリセロールは、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、グリセロールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のグリセロールの比率は、10重量%以上、より好ましくは50重量%以上、より好ましくは70重量%以上であることが望ましい。他の炭素原として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。これらの中ではグルコースが好ましい。
【0118】
培養開始時のグリセロールの好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のグリセロールの消費に応じて、グリセロールを添加してもよい。
使用するグリセロールは、純粋なグリセロールであってもよいが、粗グリセロールであってもよい。粗グリセロールとは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃料生産のためのエステル化反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する(Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416を参照のこと)。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多く、中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度70〜95重量%程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒であるNaOH等のアルカリとその中和に用いられるKSO等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカーや製法により差はあるが、このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、2〜7%、好ましくは3〜6%、さらに好ましくは4〜5.8%含まれていることが好ましい。メタノールは、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。
【0119】
さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましく、例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で0.00001〜0.1%、好ましくは0.0005〜0.1%、より好ましくは0.004〜0.05%、さらに好ましくは0.007〜0.01%含まれていることが好ましい。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で0.000005〜0.01%、より好ましくは0.000007〜0.005%、さらに好ましくは0.00001〜0.001%含まれていることが好ましい。
【0120】
粗グリセロールのグリセロールの純度としては10%以上であればよく、好ましくは50%以上であり、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは80%以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は90%以上であってもよい。
粗グリセロールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。
【0121】
脂肪酸とは、一般式 CnHmCOOH(n+1、m+1は、それぞれ、脂肪酸に含まれる炭素数、水素数を表す)で表わすことができる長鎖炭化水素の1価のカルボン酸を指す。一般的に炭素数が12 以上のものを長鎖脂肪酸と呼ぶことが多い。脂肪酸は、その炭素数と不飽和度によって様々な種類が存在する。また、脂肪酸は、油脂の構成成分であり、油脂の種類によって脂肪酸の組成も異なることが知られている。ミリスチン酸(C13H27COOH)は炭素数14の飽和脂肪酸であり、ヤシ油、パーム油に含まれる。パルミチン酸(C15H31COOH)は炭素数16の飽和脂肪酸であり、植物油脂一般に多く含まれる。ステアリン酸(C17H35COOH)は、炭素数18の飽和脂肪酸であり、動物性脂肪・植物性油に多く含まれる。オレイン酸(C17H33COOH)は、炭素数18の一価の不飽和脂肪酸であり、動物性脂肪や植物油に多く含まれる。リノール酸(C17H31COOH)は炭素数18で9位と12位にシス型二重結合を2つ持っている多価不飽和脂肪酸である。脂肪酸としては、上記の長鎖脂肪酸の混合物を用いることも出来る。脂肪酸の混合物を炭素源として用いる場合、脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度比率であればいずれでもかまわない。油脂の加水分解物から、グリセロールを除いた脂肪酸の混合物を利
用することも可能である。
【0122】
本発明の方法においては、油脂の加水分解物を用いることもできる。
油脂は、脂肪酸とグリセロールのエステルであり、トリグリセリド(triglyceride)とも呼ばれる。油脂としては、加水分解反応が可能であれば、常温で液体のものを指す脂肪油(oil)、固体のものを指す脂肪(fat)など、どのようなものも使用することが出来る。また、動物由来(魚類を含む)油脂と植物由来油脂のすべてが使用可能であり、1種または2種以上を組み合わせて使用することも出来る。原料として用いる油脂は、純粋な油脂であってもよいし、油脂以外の物質を含む混合物であってもよい。例えば、油脂が植物由来のものである場合は、油脂を含む植物抽出物又はその分画物が挙げられる。
動物油脂として、バター、豚脂、牛脂、羊脂等、クジラ油、イワシ油、ニシン油等をあげることができる。植物油脂としては、パーム油、オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油、クルミ油、ゴマ油、ピーナッツ油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。パーム油はアブラヤシの果実からとれる油脂であり、近年バイオディーセル(biodiesel)燃料としての利用が盛んになり、生産量が高まっている。アブラヤシ(oil palm)は、ヤシ科アブラヤシ属(Elaeis)に分類される植物の総称である。粗パーム油(crude palm oil)は、一般的に搾油工場で生産される未精製のパーム油を指し、粗パーム油として取引が行われている。また、微細藻類にも油脂を蓄積するものが知られており(Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306)、藻体から抽出することも可能である。藻体内には油脂以外にも糖類、タンパク質、アミノ酸などの有機物が含まれているが、これらを含む混合物を加水分解して炭素源として用いても構わない。
油脂としては、加水分解により生じる脂肪酸種が、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できるものであり、それらの含量がより高い油脂が望ましい。L−アミノ酸生産能を有する細菌が資化できる長鎖の脂肪酸種としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。
【0123】
本発明における油脂の加水分解物とは、上記油脂を化学的あるいは酵素により加水分解したものを指し、脂肪酸とグリセロールの混合物を指す。工業的な加水分解法としては、高温(250-260℃)、高圧(5-6MPa)下で油脂と水を交流接触させる連続高温加水分解法が一般的に行われている。また、酵素を用いて低温(30℃前後)で反応を行うことも工業的に行われている(Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63)。前記酵素としては、油脂の加水分解反応を触媒する酵素リパーゼを用いることが出来る。リパーゼは工業的に重要な酵素であり、様々な産業的利用がなされている(Hasan, F. et
al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251)。油脂の加水分解物は、脂肪酸とグリセロールの混合物であり、パーム油等の一般的な油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸に対するグリセロールの重量比は10%程度であることが知られている。油脂の加水分解物としては、脂肪酸を含む限り特に制限されない。例えば、油脂の加水分解物をそのまま用いることも出来るが、脂肪酸、グリセロールの一部を除いて使うことも可能であるし、脂肪酸やグリセロールを加えて使用することも出来る。この時のグリセロールの脂肪酸に対する重量比は、好ましくは5〜20:100、より好ましくは7.5〜15:100である。
【0124】
本発明の方法で使用する培地に含まれる、脂肪酸、または、油脂の加水分解物の量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、10w/v%以下、好ましくは5w/v%以下、さらに好ましくは2w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合、0.2w/v%以上、好ましくは0.5w/v%以上、さらに好ましくは1.0w/v%以上含まれていることが望ましい。
【0125】
また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、
流加後の培地中の濃度が5w/v%以下、好ましくは2w/v%以下、さらに好ましくは1w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、0.01w/v%以上、好ましくは0.02w/v%以上、さらに好ましくは0.05w/v%以上の量にて制御することが好ましい。なお、脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィ(Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.Biotechnol. Biochem. 70:22-30)やHPLC(Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49)により測定することが可能である。
【0126】
培地に加える脂肪酸、または油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸は、水にミセル化するナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩として用いることが望ましい。しかしながら、脂肪酸のナトリウム塩やカリウム塩の溶解度も発酵原料として用いるのには十分ではない場合がある。そこで、L−アミノ酸生産能を有する細菌が炭素源として脂肪酸をより効率よく資化できるようにするために、乳化を行う等、均一化を促進する工程を加えることが好ましい。例えば乳化方法として、乳化促進剤や界面活性剤を加える等が考えられる。ここで乳化促進剤としては、リン脂質やステロールが挙げられる。また界面活性剤としては、非イオン界面活性剤では、ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノオレイン酸エステル(Tween 80)などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D-グルコシドなどのアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるN,N-ジメチル-N-ドデシルグリシンベタインなどが挙げられる。これ以外にも、トライトンX-100(Triton X-100)、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Brij-58)やノニルフェノールエトキシレート(Tergitol NP-40)等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
【0127】
さらに、脂肪酸の乳化や均一化を促進するための操作も有効である。この操作は、脂肪酸の乳化や均一化を促進する操作であれば、どのような操作でも構わない。具体的には、ホモジナイザー処理、ホモミキサー処理、超音波処理、高圧処理、高温処理などが挙げられるが、ホモジナイザー処理、超音波処理およびこれらの組合せがより好ましい。
上記界面活性剤による処理と、ホモジナイザー処理及び/または超音波処理を組み合わせることが特に好ましく、これらの処理は、脂肪酸がより安定なアルカリ条件下で行われることが望ましい。アルカリ条件としては、pH9以上が望ましく、より望ましくはpH10以上である。
【0128】
培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を1種のみ含まれていてもよいし、2種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【0129】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸2水素カリウム、リン酸水素2カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【0130】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄源の他に、増殖促進因子(増殖促進効果を持つ栄養素)が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【0131】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるL−リジン生産菌は、前述のようにL−リジン生合成経路が強化されており、L−リジン分解能が弱化されているものが多いので、L−スレオニン、L−ホモセリン、L−イソロイシン、L−メチオニンから選ばれる1種又は2種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【0132】
培養は、発酵温度20〜45℃、特に好ましくは33〜42℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、5〜50%に、望ましくは10%程度に調節して行う。また、pHを5〜9に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にpHが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量のL−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるL−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【0133】
本発明においては、L−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【0134】
目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のpHが6.5〜9.0、培養終了時の培地のpHが7.2〜9.0となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び/または炭酸イオンが少なくとも2g/L以上存在する培養期があるようにし、前期記重炭酸イオン及び/または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい(特開2002-065287号参照)。
【0135】
発酵液からのL−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法(Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710)、沈殿法、膜分離法(特開平9-164323号、特開平9-173792号)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にL−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、L−アミノ酸を回収することができる。
【0136】
尚、回収されるL−アミノ酸は、L−アミノ酸以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたL−アミノ酸の純度は、50%以上、好ましくは85%以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,
471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
【0137】
また、L−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したL−アミノ酸は、培地中に溶解しているL−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【0138】
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステル(「アスパルテーム」とも呼ばれる)の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、L−フェニルアラニンを原料として用いるα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造されたL−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【0139】
L−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にL−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる(米国特許第3,786,039号)。L−フェニルアラニンをL−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このL−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたL−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、N−ホルミル−、N−カルボベンゾキシ−、又はN−p−メトキシカルボベンゾキシ−L−アスパラギン酸無水物のようなN−アシル−L−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、N−アシル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンと、N−アシル−β−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10−4以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する(特開昭51-113841)。続いて、N−アシル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンを得る。
【実施例】
【0140】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
〔実施例1〕uspA遺伝子が破壊されたL−リジン生産菌の構築
まず、エシェリヒア・コリ野生型株MG1655株を用いて、uspA遺伝子破壊株の構築を行なった。
【0141】
pMW118(λattL-Km-λattR) プラスミド(国際公開第WO2006/093322号公報参照)を鋳型として、λファージのアタッチメントサイトの配列attLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、標的遺伝子であるuspA遺伝子の一部に対応する配列を5'末端に有する配列番号3及び4に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行った。配列番号3及び4の配列において、塩基番号1〜45がuspA遺伝子の一部に対応する配列である。PCR産物を用いて、米国特許出願公開第2006/0160191号公報に記載のλ-red法を用いてMG1655ΔuspA::att-Km株を構築した。λ-red法において、Km(カナマイシン)耐性組換え体は、37℃でKm(カナマイシン)(40mg/L)を含むL−寒天培地上で平板培養し、コロニーを形成する株を選択することにより取得した。MG1655ΔuspA::att-Km株においては、ゲノム上のuspA遺伝子のコード領域の一部が、Km耐性遺伝子で置換されている。
【0142】
MG1655ΔuspA::att-Km株から定法に従いP1ライセートを取得した。このP1ライセートを
用いて、米国特許出願公開第2006/0160191号公報に記載の方法で構築したL−リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株に対してP1形質導入法を用いて、カナマイシン耐性を指標に、WC196ΔcadAΔldcCΔuspA::att-Km株を構築した。さらに、その菌株にdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したL−リジン生産用プラスミドpCABD2(国際公開第WO01/53459号パンフレット)で常法に従い形質転換し、カナマイシン耐性およびストレプトマイシン耐性の組換え体として、WC196ΔcadAΔldcCΔuspA::att-Km/pCABD2株を構築した。WC196ΔcadAΔldcC株は、エシェリヒア・コリWC196のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子cadA及びldcCを、Red-driven integration法(Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645)とλファージ由来の切り出しシステム(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))とを組合わせた方法(WO2005/010175号参照)により、破壊した株である。この株に、pCABD2を導入したのがWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株である。得られた株を20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのカナマイシンを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【0143】
〔実施例2〕uspA発現を弱化したL−リジン生産菌のL−リジン生産能の評価
実施例1にて得られた株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し、分光光度計U-2000(日立社製)で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、500 mL容バッフル付三角フラスコの、20 mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地(下記に示す)の40 mLに、終OD600が0.2になる液量を接種し、ロータリー振とう培養装置InnOva 4430 (New Brunswick Scientific社製)で回転攪拌数200rpm、37℃において48時間培養した。
【0144】
本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウム(純正化学社製 一級品)を用い、乳化促進剤としてポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノオレイン酸エステル(Tween 80:ナカライテスク社製)を終濃度0.5%(w/v)となるように添加したものを用いた。培地中のオレイン酸量は10g/Lとした。エシェリヒア・コリがTween80を資化できないことは、M9最小培地(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.A. et al. John Wiley & Sons Inc. New York参照)を用いて別途確認した。
上記の条件で、48時間培養を行い、培地中に蓄積したリジンの量をバイオテックアナライザーAS310(サクラ精機社製)を用いて測定した。また、培地中に添加したオレイン酸を全て消費したことを、ガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadzu社製)を用いて別途確認した。さらに、培養終了直後にTween80を終濃度1.0%(w/v)となるように添加して希釈して分光光度計U-2000(日立社製)で波長600nmの濁度を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。
【0145】
この培養に用いたオレイン酸を炭素源とする発酵培地の組成を以下に示す(単位g/Lおよび%(volume/volume換算)全て終濃度を示す)。
【0146】
(1)オレイン酸ナトリウム品) 10 g/L
HClでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブを行なった。
その他の成分
(2)Tween 80 0.5 %
(Tween 80はNalgene 0.45μmフィルター(Nalgen社製)でフィルター滅菌を行なった。)
(3)MgSO・7HO 1 g/L
(MgSO・7HO は115℃で10分オートクレーブを行なった。)
(4)(NH)SO 16 g/L
KHPO 1 g/L
FeSO・7HO 0.01 g/L
MnSO・7HO 0.082 g/L
Yeast Extract(Difco社製) 2 g/L
((NH)SO 、KHPO 、FeSO・7HO 、MnSO・7HO、 Yeast Extractはこれらを混合した後 KOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブを行なった。)
(5)PIPES (pH7.5) 20g/L
(NaOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブを行なった。)
【0147】
上記(1)〜(5)の5つの区に分けて別殺菌して得られた溶液を混合し、オレイン酸ナトリウムを炭素源とする発酵培地を作製した。
【0148】
本培養の結果を表1に示す(L−リジン(g/L)は、培地に蓄積したリジン蓄積量を示す)。表1から分かるように、WC196ΔcadAΔldcCΔuspA::att-Km/pCABD2株は、uspA遺伝子を欠損していないWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株と比較して多量のL−リジンを蓄積した。
【0149】
【表1】

【0150】
〔実施例3〕uspA発現を弱化したL−リジン生産菌のグルコースまたはグリセロールを炭素源とする培養
実施例1で得られた株のグリセロールストックを融解し、100μLを、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し、分光光度計U-2000(日立)で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、500mL容坂口フラスコの、20mg/Lのストレプトマイシンを含むMS培地(組成は下記に示す)20mLに、終OD600が0.15になるような液量を接種し、往復振とう培養装置で攪拌速度114rpm、温度37℃において約48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したL−リジンの量、及び残存しているグルコースをバイオテックアナライザーAS210(サクラ精機)を用いて測定した。また、培地中に蓄積しているグリセロールをバイオテックアナライザーBF-5(王子計測機器)で測定した。
【0151】
〔MS培地組成〕
炭素源
グルコースまたはグリセロール 40g/L
MgSO・7HO 1 g/L
(NH)SO 16 g/L
KHPO 1 g/L
FeSO・7HO 0.01 g/L
MnSO・7HO 0.082 g/L
Yeast Extract(Difco社製) 2 g/L
【0152】
各成分を水に溶解し、KOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブ(但しグルコース又はグリセロール、及びMgSO・7HOは別殺菌)後、局方CaCO 30g/L(180℃で2時間乾熱滅菌したもの)を入れた。20mg/Lのストレプトマイシンを添加した。
【0153】
結果を表2に示す(ODは、26倍希釈して波長600nmの濁度を測定することにより得られた菌体量、Lys(g/L)は培地に蓄積したL−リジン蓄積量、Lys yield(%)は基質からのL−リジン収率を示す)。表2から分かるように、WC196ΔcadAΔldcCΔuspA::att-Km/pCABD2株は、uspA遺伝子を欠損していないWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株と比較して多量のL−リジンを蓄積した。
【0154】
【表2】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記L−アミノ酸を採取する、L−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、UspAタンパク質の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
【請求項2】
前記UspAタンパク質がuspA遺伝子によってコードされ、当該遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することにより、UspAタンパク質の活性が低下した、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記UspAタンパク質が、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、または、パントエア属細菌である請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記細菌が、エシェリヒア・コリである請求項4に記載の方法。
【請求項6】
前記L−アミノ酸がL−リジンである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
方法。
【請求項7】
前記培地が、グリセロールを炭素源として含む培地であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記培地が、脂肪酸を炭素源として含む培地であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記脂肪酸がオレイン酸である、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記脂肪酸が油脂由来の脂肪酸の混合物である、請求項8に記載の方法。
【請求項11】
前記培地が、油脂を加水分解することによって得られる脂肪酸とグリセロールの混合物を炭素源として含む培地である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

【公開番号】特開2013−74796(P2013−74796A)
【公開日】平成25年4月25日(2013.4.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−25009(P2010−25009)
【出願日】平成22年2月8日(2010.2.8)
【出願人】(000000066)味の素株式会社 (887)
【Fターム(参考)】