Ｌ−乳酸の製造方法及び新規微生物
【課題】
グリセリン、特にバイオディーゼル廃液から微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供する。
【解決手段】
炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させる。このときエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株を用いることが好適である。
グリセリン、特にバイオディーゼル廃液から微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供する。
【解決手段】
炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させる。このときエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株を用いることが好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法に関する。また、Ｌ−乳酸の製造に適した新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬品用などの用途以外に、バイオプラスチックのモノマー原料として工業的用途にも広く適用され、需要が増加している。バイオプラスチックとは、微生物の働きによって分解される生分解性プラスチックと、再生可能な有機性資源を原料にして作られるバイオマスプラスチックの総称である。乳酸から合成されるポリ乳酸は、使用後に堆肥の製造やメタン発酵に用いることができ、自然環境の中でも分解される。さらに、ポリ乳酸は、バイオマスプラスチックとしてカーボンニュートラルの観点からも注目されている。最近では、フィルム、シート及び繊維等にポリ乳酸が使用され、生産量も徐々に増加している。しかし、乳酸にはＬ体とＤ体が存在し、ポリ乳酸を製造する際には、光学純度の高い乳酸を得ることが必要である。
【０００３】
一方、グリセリンは、廃グリセリンと呼ばれるバイオディーゼル燃料製造時の副生成物の処理が問題になっている。バイオディーゼル燃料とは、生物由来の油から得られる軽油代替燃料の一つであり、エネルギー資源枯渇、地球温暖化及び大気汚染などの環境問題の解決に貢献する燃料として近年注目を集めている。しかし、廃グリセリンは強アリカリ性であり、純度も低いために、有効な用途がない。現在、廃グリセリンの大部分が産業廃棄物として処分されているため、再使用する方法が強く必要とされている。
【０００４】
そこで上記問題を解決する方策として、特許文献１には、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属、およびプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属からなる細菌属群から選ばれる細菌を用い、グリセリンから乳酸を製造する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アクロモバクタ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属、パエニバチラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ラオウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属及びセラッティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属からなる細菌属群から選ばれる細菌を用いて、グリセリンからＤ−乳酸を製造する方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び２に記載された発明では、光学純度の高いＬ−乳酸を製造することはできない。また、例示された細菌属にエンテロコッカス属は含まれていない。
【０００７】
特許文献３には、乳酸菌を用いて、グルコース等からＬ−乳酸を生産させる方法が記載されている。また、乳酸を産生する乳酸菌の例として、多数の例示の中にエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属が記載されている。しかしながら、実施例ではラクトコッカス（Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌が使用されており、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属は使用されていない。また、培地の炭素源として、多数の例示の中にグリセリンが記載されている。しかしながら、グリセリンは多数の炭素源の例示の中で述べられているに過ぎず、グリセリンを炭素源として、Ｌ−乳酸を生産する方法は記載されていない。
【０００８】
特許文献４には、細菌にグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入することにより、細菌にグリセリン資化能を付与する方法、及び該組換え細菌を用いて、グリセリンから乳酸を含む発酵生成物を製造する方法が記載されている。また、細菌に導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子として、多数の例示の中で、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のものが示されている。しかしながら、グリセリンを取り込ませる細菌の例示として、エンテロコッカス フェカリスが示されているわけではない。さらに、特許文献４に記載された方法では収率良く乳酸を生産することができない。また、実施例では、エンテロコッカス フェカリス由来の遺伝子は使用されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−５０２５１号公報
【特許文献２】特開２００９−１４２２５６号公報
【特許文献３】特開２００８−１３１９３１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／０１３６９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、グリセリン、特にバイオディーゼル廃液由来のグリセリンから微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法を提供することによって解決される。
【００１２】
このとき、エンテロコッカス フェカリスが以下に示す菌学的性質を有することが好適である
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００１３】
エンテロコッカス フェカリスがエンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）であることも好適である。炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンであることも好適である。グリセリンがバイオディーゼル廃液由来であることも好適である。原料のＮａＣｌ濃度が０．１質量％〜飽和濃度であることも好適である。原料のｐＨが７．５以上であることも好適である。
【００１４】
また、上記課題は、エンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）菌株を提供することによって解決される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、グリセリン、特にバイオディーゼル廃液由来のグリセリンから微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法である。
【００１７】
エンテロコッカス フェカリスは、下記の菌学的性質を有するものであることが好ましい。下記の記載において、＋は陽性を、−は陰性を意味する。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 １０〜４５℃ 至適温度３０℃
初発ｐＨ及び至適ｐＨ ｐＨ５〜１１ 至適ｐＨ１１
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００１８】
本発明に用いられる、エンテロコッカス フェカリスの耐塩性は、８％以上であることが好適である。１０％以上であることがより好適である。
【００１９】
本発明の方法に最も好適に用いられる微生物は、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株（以下「Ｗ１１菌株」と略称することがある）であり、当該菌株は岩手県産のワカメから分離された。エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株は、平成２２年３月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３が付与された。
【００２０】
本発明の方法に用いられる原料に含まれる炭素源としてのグリセリンは、純粋なグリセリンであってもよく、グリセリン含有混合物であってもよい。グリセリン含有混合物中の他の成分及びそれらの量は、本発明で用いるエンテロコッカス フェカリスに対して悪影響を及ぼさないものであることが好ましい。グリセリン含有混合物の由来は特に限定されないが、資源の再使用の観点から、バイオディーゼル廃液を使用することが好ましい。
【００２１】
バイオディーゼル燃料の製造方法の１つは、アルカリ触媒を用いたトリグリセリドのアルコリシスにより、脂肪酸メチルエステルを生成させる方法である。この方法では、副生成物としてグリセリンを含有するバイオディーゼル廃液が発生する。この廃液には、通常、メタノール、アルカリ触媒、副生物の脂肪酸などが混入している。本発明において、バイオディーゼル廃液は未処理のまま用いることもできるし、メタノールを除去したものを用いることもできる。
【００２２】
本発明の方法に用いられる原料に含まれる炭素源として、バイオディーゼル廃液を添加した場合であっても、純粋なグリセリンを添加した場合と同等又はそれ以上の収量及び変換効率で、Ｌ−乳酸を生成することが可能である。
【００２３】
本発明の方法に用いられる原料は、細菌類の培養に通常用いられる成分を含有する原料であればよく、特定の原料に限定されない。本発明の方法では、炭素源、窒素源及び無機塩類を含有する、単純な組成の原料からなる培地を用いても、高い光学純度でＬ−乳酸を得ることが可能である。
【００２４】
本発明の方法に用いられる原料は、グリセリン以外の物質を炭素源として含んでもよい。他の炭素源は、グリセリンからのＬ−乳酸の生成を妨げない範囲で含有されることが好ましい。本発明で用いられる他の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、アラビノース、デキストリン、糖蜜、麦芽エキスなどが挙げられるが、それらに限定されない。炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンであることが好適である。
【００２５】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物及び尿素等を用いることができる。さらに、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、及びカザミノ酸などの有機窒素源を用いてもよい。炭素源および窒素源は組み合わせて使用すると有利である。
【００２６】
本発明の方法に用いられる原料が、無機塩類として塩化ナトリウムを含有することが好ましい。塩化ナトリウムを含有することにより、Ｄ−乳酸の生成を抑制しやすくなり、Ｌ−乳酸の光学純度が向上する。塩化ナトリウム以外にも、塩化カリウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸三カルシウム、リン酸一水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム等を含有することができる。
【００２７】
さらに、各種ビタミン類、ＴＷＥＥＮ８０等の界面活性剤、消泡剤等を培地に添加してもよい。
【００２８】
培養条件は、エンテロコッカス フェカリスの培養に適したものであればよい。原料のｐＨは７．５以上であることが好適である。原料のｐＨが７．５以下の場合、Ｄ−乳酸を副生しやすくなる。エンテロコッカス フェカリスはｐＨが８以上、９以上、あるいは１０以上であってもグリセリンからＬ−乳酸を生成することができる。したがって触媒残渣の水酸化ナトリウムが含まれるバイオディーゼル廃液を原料として用いることもできる。
【００２９】
原料のＮａＣｌ濃度は０．１質量％〜飽和濃度であることが好適である。０．１質量％未満の場合、Ｄ−乳酸の生成量が増加することがある。原料のＮａＣｌ濃度は１質量％以上であることがより好適であり、２．５％以上であることがさらに好適である。
【００３０】
培養温度は２０℃〜５０℃であることが好適である。温度が低い場合、Ｄ−乳酸が生成されやすくなる。２５℃以上であることがより好適である。
【００３１】
培養は、好気的条件下で行ってもよいが、好ましくは嫌気的条件下で行われる。好気的条件下で培養する場合、乳酸の生成量が少なくなることがある。嫌気的条件下で培養する場合は、炭酸ガスや不活性ガス（窒素、アルゴン等）を通気するか、あるいは無通気により培養することができる。
【００３２】
培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれを用いることもできるが、振とう培養であることが好ましく、撹拌培養であることがより好ましい。
【００３３】
培養方法としては、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、及び連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）等の培養方法を用いることができる。
【００３４】
エンテロコッカス フェカリスの菌体や該菌体の固定化物を用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法の例としては以下の方法が挙げられる。
【００３５】
エンテロコッカス フェカリスの菌体は、菌株を培養した後、遠心分離等を行うことにより得ることができる。菌体の固定化物は、前記方法により得た菌体を、ゲルにより包括固定化したり、イオン交換体を担持させて固定化したりすることより得ることができる。
【００３６】
エンテロコッカス フェカリスを用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法としては、得られた菌体を、グリセリンを含有した原料に懸濁し、反応させる方法を例示することができる。このとき、得られた菌体の固定化物を使用してもよい。Ｌ−乳酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下する場合があるので、必要に応じて、培養中に培地のｐＨを調整してもよい。さらに、上記に示したような増殖に必要な栄養素を添加し、増殖が連続的に行われるようにしてもよい。また、得られた菌体の固定化物をカラムに充填し、グリセリンを含む原料を流通させる方法を例示することもできる。
【００３７】
本発明のＬ−乳酸の製造に使用する装置は、撹拌型リアクター、エアリフト型リアクター、気泡塔型リアクター及び充填型リアクター等のバイオリアクターとしての各種装置を使用することができる。
【００３８】
こうして得られたＬ−乳酸の分離および精製は、従来公知の方法に従って実施することができる。例えば、培養物を酸性化した後に直接蒸留する方法、乳酸のラクチドを形成させて蒸留する方法、再結晶により精製する方法、乳酸をエステル化した後に蒸留する方法、有機溶媒で乳酸を抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させた後に溶出させてイオン交換カラムで乳酸を分離する方法、カルシウムイオン等との金属塩をつくり単離する方法、電気透析により乳酸を濃縮分離する方法などの方法により分離、精製される。
【００３９】
こうして得られたＬ−乳酸は、光学純度が高いので、物性の良好なポリＬ−乳酸を製造するのに好適に用いることができる。
【実施例】
【００４０】
［乳酸菌の分離］
岩手県産のワカメを分離源として、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）を分離した。
【００４１】
［乳酸菌培養培地］
乳酸菌の培養培地として、表１に示される組成のＧＹＰ白亜寒天培地を用いた。組成１を調整後、組成２を加え、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）を行った。液体培地として用いる場合、組成２を除いたものをＧＹＰ液体培地として用いた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
［コロニー形成］
ＮａＣｌ濃度を７％に調整したＧＹＰ白亜寒天培地で、２０〜２５℃で１週間培養した場合に形成されるコロニーを観察した。エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株を培養した場合に形成されるコロニーは、直径：１〜２ｍｍ、色調：白、形：円系、隆起状態：半レンズ状、周縁：全縁、表面の形状等：スムーズ、透明度：不透明、粘稠度：バター様、というものであった。
【００４４】
［菌学的性質］
Ｗ１１菌株のグラム染色、カタラーゼ試験、運動性試験、生育温度試験、初発ｐＨ試験、耐塩性・好塩性試験及び糖類発酵性試験を行った。以下の記載において、＋は陽性を、−は陰性を意味する。糖類発酵性試験の結果は表２にまとめて示す。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 １０〜４５℃ 至適温度３０℃
初発ｐＨ及び至適ｐＨ ｐＨ５〜１１ 至適ｐＨ１１
耐塩性 １１％
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００４５】
［同定試験］
Ｗ１１菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全長（１４４４ｂｐ）の解析を行い、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた細菌基準株データベース及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対する相同性検索を行った。その結果、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）と本菌株の相同性は１００％であった。さらに、Ｗ１１菌株の表現形質による分類学的性質も考慮して、本菌株は、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）であると判断された。
【００４６】
［前培養］
ＧＹＰ液体培地を用いて、Ｗ１１菌株の前培養を行った。前培養は、３０℃、一晩の条件下で行った。
【００４７】
［静置培養及び振とう培養の検討］
実施例１
ＧＹＰ液体培地のグルコースをグリセリンに変えてグリセリン１％（ｗ／ｖ）としたものをＧＹＰ改変液体培地（Ａ）とした。この液体培地（５ｍｌ）に、得られた前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表２にまとめて示す。
【００４８】
実施例２
培養条件を振とう培養（約１１５ｒｐｍ）にした以外は実施例１と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表２にまとめて示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
［耐塩性・好塩性試験］
実施例３
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）５ｍｌに、得られた前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表３にまとめて示す。
【００５１】
実施例４
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）のＮａＣｌ濃度を３％に調整した以外は実施例３と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表３にまとめて示す。
【００５２】
実施例５
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）のＮａＣｌ濃度を６％に調整した以外は実施例３と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表３にまとめて示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
実施例６
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）５ｍｌに、得られた前培養液を１％植菌し、２５℃で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表４にまとめて示す。
【００５５】
実施例７
培養温度を３０℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５６】
実施例８
培養温度を３７℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５７】
実施例９
培養温度を４５℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
［培地の初発ｐＨの検討］
実施例１０
ＧＹＰ液体培地から無機塩類を除き、さらにグルコースをグリセリンに変えてグリセリン１％（ｗ／ｖ）としたものをＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）とした。このＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）に塩酸を用いて、ｐＨ６に調整し、フィルターろ過によって滅菌した。それぞれの液体培地（５ｍｌ）に前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表５にまとめて示す。
【００６０】
実施例１１
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ７に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６１】
実施例１２
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ８に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６２】
実施例１３
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ９に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６３】
実施例１４
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ１０に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６４】
実施例１５
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ１１に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６５】
実施例１６
培養条件を振とう培養（約１１５ｒｐｍ）にした以外は実施例１５と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６６】
【表５】
【００６７】
［アルカリ条件下での培養検討］
実施例１７
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）にＮａＯＨを加えて、ｐＨ１１に調整した。この液体培地（５０ｍｌ）に、前培養液を１％植菌した。坂口フラスコを用いて、３０℃の条件下で３日間、振とう培養（約１１５ｒｐｍ）を行った。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表６にまとめて示す。
【００６８】
実施例１８
培養条件を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコを用い、無通気の条件下で、液体培地（１００ｍｌ）が撹拌される程度の緩やかな振とう培養（約７０ｒｐｍ）を行った以外は実施例１７と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表６にまとめて示す。
【００６９】
実施例１９
培養条件を、２００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ及び撹拌子を用い、無通気の条件下で、液体培地（１００ｍｌ）を撹拌培養（約１２０ｒｐｍ）した以外は実施例１７と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表６にまとめて示す。
【００７０】
【表６】
【００７１】
［バイオディーゼル廃液を用いた乳酸発酵の検討］
実施例２０
ＧＹＰ液体培地から無機塩類及び炭素源（グルコース）を除き、炭素源としてバイオディーゼル廃液（株式会社 総社技術コンサルタント提供）を１％（ｗ／ｖ）加え、オートクレーブ滅菌した。用いたバイオディーゼル廃液の組成は、グリセリンが約３９質量％、メタノールが約３０質量％であった。培地のｐＨは７．８であった。このＧＹＰ改変液体培地に（１００ｍｌ）に、前培養液を１％植菌した。３０℃の条件下で３日間、スターラーを用いた撹拌培養を行った。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表７にまとめて示す。
【００７２】
実施例２１
バイオディーゼル廃液を２％（ｗ／ｖ）加え、培地のｐＨが８．３であった以外は実施例２０と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表７にまとめて示す。
【００７３】
実施例２２
バイオディーゼル廃液を３％（ｗ／ｖ）加え、培地のｐＨが８．６であった以外は実施例２０と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表７にまとめて示す。
【００７４】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法に関する。また、Ｌ−乳酸の製造に適した新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬品用などの用途以外に、バイオプラスチックのモノマー原料として工業的用途にも広く適用され、需要が増加している。バイオプラスチックとは、微生物の働きによって分解される生分解性プラスチックと、再生可能な有機性資源を原料にして作られるバイオマスプラスチックの総称である。乳酸から合成されるポリ乳酸は、使用後に堆肥の製造やメタン発酵に用いることができ、自然環境の中でも分解される。さらに、ポリ乳酸は、バイオマスプラスチックとしてカーボンニュートラルの観点からも注目されている。最近では、フィルム、シート及び繊維等にポリ乳酸が使用され、生産量も徐々に増加している。しかし、乳酸にはＬ体とＤ体が存在し、ポリ乳酸を製造する際には、光学純度の高い乳酸を得ることが必要である。
【０００３】
一方、グリセリンは、廃グリセリンと呼ばれるバイオディーゼル燃料製造時の副生成物の処理が問題になっている。バイオディーゼル燃料とは、生物由来の油から得られる軽油代替燃料の一つであり、エネルギー資源枯渇、地球温暖化及び大気汚染などの環境問題の解決に貢献する燃料として近年注目を集めている。しかし、廃グリセリンは強アリカリ性であり、純度も低いために、有効な用途がない。現在、廃グリセリンの大部分が産業廃棄物として処分されているため、再使用する方法が強く必要とされている。
【０００４】
そこで上記問題を解決する方策として、特許文献１には、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属、およびプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属からなる細菌属群から選ばれる細菌を用い、グリセリンから乳酸を製造する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アクロモバクタ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、フラテウリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ）属、パエニバチラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ラオウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属及びセラッティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属からなる細菌属群から選ばれる細菌を用いて、グリセリンからＤ−乳酸を製造する方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び２に記載された発明では、光学純度の高いＬ−乳酸を製造することはできない。また、例示された細菌属にエンテロコッカス属は含まれていない。
【０００７】
特許文献３には、乳酸菌を用いて、グルコース等からＬ−乳酸を生産させる方法が記載されている。また、乳酸を産生する乳酸菌の例として、多数の例示の中にエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属が記載されている。しかしながら、実施例ではラクトコッカス（Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌が使用されており、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属は使用されていない。また、培地の炭素源として、多数の例示の中にグリセリンが記載されている。しかしながら、グリセリンは多数の炭素源の例示の中で述べられているに過ぎず、グリセリンを炭素源として、Ｌ−乳酸を生産する方法は記載されていない。
【０００８】
特許文献４には、細菌にグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入することにより、細菌にグリセリン資化能を付与する方法、及び該組換え細菌を用いて、グリセリンから乳酸を含む発酵生成物を製造する方法が記載されている。また、細菌に導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子として、多数の例示の中で、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のものが示されている。しかしながら、グリセリンを取り込ませる細菌の例示として、エンテロコッカス フェカリスが示されているわけではない。さらに、特許文献４に記載された方法では収率良く乳酸を生産することができない。また、実施例では、エンテロコッカス フェカリス由来の遺伝子は使用されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−５０２５１号公報
【特許文献２】特開２００９−１４２２５６号公報
【特許文献３】特開２００８−１３１９３１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／０１３６９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、グリセリン、特にバイオディーゼル廃液由来のグリセリンから微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法を提供することによって解決される。
【００１２】
このとき、エンテロコッカス フェカリスが以下に示す菌学的性質を有することが好適である
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００１３】
エンテロコッカス フェカリスがエンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）であることも好適である。炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンであることも好適である。グリセリンがバイオディーゼル廃液由来であることも好適である。原料のＮａＣｌ濃度が０．１質量％〜飽和濃度であることも好適である。原料のｐＨが７．５以上であることも好適である。
【００１４】
また、上記課題は、エンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）菌株を提供することによって解決される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、グリセリン、特にバイオディーゼル廃液由来のグリセリンから微生物を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法である。
【００１７】
エンテロコッカス フェカリスは、下記の菌学的性質を有するものであることが好ましい。下記の記載において、＋は陽性を、−は陰性を意味する。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 １０〜４５℃ 至適温度３０℃
初発ｐＨ及び至適ｐＨ ｐＨ５〜１１ 至適ｐＨ１１
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００１８】
本発明に用いられる、エンテロコッカス フェカリスの耐塩性は、８％以上であることが好適である。１０％以上であることがより好適である。
【００１９】
本発明の方法に最も好適に用いられる微生物は、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株（以下「Ｗ１１菌株」と略称することがある）であり、当該菌株は岩手県産のワカメから分離された。エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株は、平成２２年３月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３が付与された。
【００２０】
本発明の方法に用いられる原料に含まれる炭素源としてのグリセリンは、純粋なグリセリンであってもよく、グリセリン含有混合物であってもよい。グリセリン含有混合物中の他の成分及びそれらの量は、本発明で用いるエンテロコッカス フェカリスに対して悪影響を及ぼさないものであることが好ましい。グリセリン含有混合物の由来は特に限定されないが、資源の再使用の観点から、バイオディーゼル廃液を使用することが好ましい。
【００２１】
バイオディーゼル燃料の製造方法の１つは、アルカリ触媒を用いたトリグリセリドのアルコリシスにより、脂肪酸メチルエステルを生成させる方法である。この方法では、副生成物としてグリセリンを含有するバイオディーゼル廃液が発生する。この廃液には、通常、メタノール、アルカリ触媒、副生物の脂肪酸などが混入している。本発明において、バイオディーゼル廃液は未処理のまま用いることもできるし、メタノールを除去したものを用いることもできる。
【００２２】
本発明の方法に用いられる原料に含まれる炭素源として、バイオディーゼル廃液を添加した場合であっても、純粋なグリセリンを添加した場合と同等又はそれ以上の収量及び変換効率で、Ｌ−乳酸を生成することが可能である。
【００２３】
本発明の方法に用いられる原料は、細菌類の培養に通常用いられる成分を含有する原料であればよく、特定の原料に限定されない。本発明の方法では、炭素源、窒素源及び無機塩類を含有する、単純な組成の原料からなる培地を用いても、高い光学純度でＬ−乳酸を得ることが可能である。
【００２４】
本発明の方法に用いられる原料は、グリセリン以外の物質を炭素源として含んでもよい。他の炭素源は、グリセリンからのＬ−乳酸の生成を妨げない範囲で含有されることが好ましい。本発明で用いられる他の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、アラビノース、デキストリン、糖蜜、麦芽エキスなどが挙げられるが、それらに限定されない。炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンであることが好適である。
【００２５】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物及び尿素等を用いることができる。さらに、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、及びカザミノ酸などの有機窒素源を用いてもよい。炭素源および窒素源は組み合わせて使用すると有利である。
【００２６】
本発明の方法に用いられる原料が、無機塩類として塩化ナトリウムを含有することが好ましい。塩化ナトリウムを含有することにより、Ｄ−乳酸の生成を抑制しやすくなり、Ｌ−乳酸の光学純度が向上する。塩化ナトリウム以外にも、塩化カリウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸三カルシウム、リン酸一水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム等を含有することができる。
【００２７】
さらに、各種ビタミン類、ＴＷＥＥＮ８０等の界面活性剤、消泡剤等を培地に添加してもよい。
【００２８】
培養条件は、エンテロコッカス フェカリスの培養に適したものであればよい。原料のｐＨは７．５以上であることが好適である。原料のｐＨが７．５以下の場合、Ｄ−乳酸を副生しやすくなる。エンテロコッカス フェカリスはｐＨが８以上、９以上、あるいは１０以上であってもグリセリンからＬ−乳酸を生成することができる。したがって触媒残渣の水酸化ナトリウムが含まれるバイオディーゼル廃液を原料として用いることもできる。
【００２９】
原料のＮａＣｌ濃度は０．１質量％〜飽和濃度であることが好適である。０．１質量％未満の場合、Ｄ−乳酸の生成量が増加することがある。原料のＮａＣｌ濃度は１質量％以上であることがより好適であり、２．５％以上であることがさらに好適である。
【００３０】
培養温度は２０℃〜５０℃であることが好適である。温度が低い場合、Ｄ−乳酸が生成されやすくなる。２５℃以上であることがより好適である。
【００３１】
培養は、好気的条件下で行ってもよいが、好ましくは嫌気的条件下で行われる。好気的条件下で培養する場合、乳酸の生成量が少なくなることがある。嫌気的条件下で培養する場合は、炭酸ガスや不活性ガス（窒素、アルゴン等）を通気するか、あるいは無通気により培養することができる。
【００３２】
培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれを用いることもできるが、振とう培養であることが好ましく、撹拌培養であることがより好ましい。
【００３３】
培養方法としては、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、及び連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）等の培養方法を用いることができる。
【００３４】
エンテロコッカス フェカリスの菌体や該菌体の固定化物を用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法の例としては以下の方法が挙げられる。
【００３５】
エンテロコッカス フェカリスの菌体は、菌株を培養した後、遠心分離等を行うことにより得ることができる。菌体の固定化物は、前記方法により得た菌体を、ゲルにより包括固定化したり、イオン交換体を担持させて固定化したりすることより得ることができる。
【００３６】
エンテロコッカス フェカリスを用いてグリセリンからＬ−乳酸を製造する方法としては、得られた菌体を、グリセリンを含有した原料に懸濁し、反応させる方法を例示することができる。このとき、得られた菌体の固定化物を使用してもよい。Ｌ−乳酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下する場合があるので、必要に応じて、培養中に培地のｐＨを調整してもよい。さらに、上記に示したような増殖に必要な栄養素を添加し、増殖が連続的に行われるようにしてもよい。また、得られた菌体の固定化物をカラムに充填し、グリセリンを含む原料を流通させる方法を例示することもできる。
【００３７】
本発明のＬ−乳酸の製造に使用する装置は、撹拌型リアクター、エアリフト型リアクター、気泡塔型リアクター及び充填型リアクター等のバイオリアクターとしての各種装置を使用することができる。
【００３８】
こうして得られたＬ−乳酸の分離および精製は、従来公知の方法に従って実施することができる。例えば、培養物を酸性化した後に直接蒸留する方法、乳酸のラクチドを形成させて蒸留する方法、再結晶により精製する方法、乳酸をエステル化した後に蒸留する方法、有機溶媒で乳酸を抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させた後に溶出させてイオン交換カラムで乳酸を分離する方法、カルシウムイオン等との金属塩をつくり単離する方法、電気透析により乳酸を濃縮分離する方法などの方法により分離、精製される。
【００３９】
こうして得られたＬ−乳酸は、光学純度が高いので、物性の良好なポリＬ−乳酸を製造するのに好適に用いることができる。
【実施例】
【００４０】
［乳酸菌の分離］
岩手県産のワカメを分離源として、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）を分離した。
【００４１】
［乳酸菌培養培地］
乳酸菌の培養培地として、表１に示される組成のＧＹＰ白亜寒天培地を用いた。組成１を調整後、組成２を加え、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）を行った。液体培地として用いる場合、組成２を除いたものをＧＹＰ液体培地として用いた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
［コロニー形成］
ＮａＣｌ濃度を７％に調整したＧＹＰ白亜寒天培地で、２０〜２５℃で１週間培養した場合に形成されるコロニーを観察した。エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｗ１１菌株を培養した場合に形成されるコロニーは、直径：１〜２ｍｍ、色調：白、形：円系、隆起状態：半レンズ状、周縁：全縁、表面の形状等：スムーズ、透明度：不透明、粘稠度：バター様、というものであった。
【００４４】
［菌学的性質］
Ｗ１１菌株のグラム染色、カタラーゼ試験、運動性試験、生育温度試験、初発ｐＨ試験、耐塩性・好塩性試験及び糖類発酵性試験を行った。以下の記載において、＋は陽性を、−は陰性を意味する。糖類発酵性試験の結果は表２にまとめて示す。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 １０〜４５℃ 至適温度３０℃
初発ｐＨ及び至適ｐＨ ｐＨ５〜１１ 至適ｐＨ１１
耐塩性 １１％
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【００４５】
［同定試験］
Ｗ１１菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全長（１４４４ｂｐ）の解析を行い、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた細菌基準株データベース及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対する相同性検索を行った。その結果、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）と本菌株の相同性は１００％であった。さらに、Ｗ１１菌株の表現形質による分類学的性質も考慮して、本菌株は、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）であると判断された。
【００４６】
［前培養］
ＧＹＰ液体培地を用いて、Ｗ１１菌株の前培養を行った。前培養は、３０℃、一晩の条件下で行った。
【００４７】
［静置培養及び振とう培養の検討］
実施例１
ＧＹＰ液体培地のグルコースをグリセリンに変えてグリセリン１％（ｗ／ｖ）としたものをＧＹＰ改変液体培地（Ａ）とした。この液体培地（５ｍｌ）に、得られた前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表２にまとめて示す。
【００４８】
実施例２
培養条件を振とう培養（約１１５ｒｐｍ）にした以外は実施例１と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表２にまとめて示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
［耐塩性・好塩性試験］
実施例３
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）５ｍｌに、得られた前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表３にまとめて示す。
【００５１】
実施例４
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）のＮａＣｌ濃度を３％に調整した以外は実施例３と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表３にまとめて示す。
【００５２】
実施例５
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）のＮａＣｌ濃度を６％に調整した以外は実施例３と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表３にまとめて示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
実施例６
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）５ｍｌに、得られた前培養液を１％植菌し、２５℃で３日間、静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表４にまとめて示す。
【００５５】
実施例７
培養温度を３０℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５６】
実施例８
培養温度を３７℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５７】
実施例９
培養温度を４５℃にした以外は実施例６と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表４にまとめて示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
［培地の初発ｐＨの検討］
実施例１０
ＧＹＰ液体培地から無機塩類を除き、さらにグルコースをグリセリンに変えてグリセリン１％（ｗ／ｖ）としたものをＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）とした。このＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）に塩酸を用いて、ｐＨ６に調整し、フィルターろ過によって滅菌した。それぞれの液体培地（５ｍｌ）に前培養液を１％植菌し、３０℃の条件下で３日間静置培養した。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表５にまとめて示す。
【００６０】
実施例１１
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ７に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６１】
実施例１２
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ８に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６２】
実施例１３
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ９に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６３】
実施例１４
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ１０に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６４】
実施例１５
ＧＹＰ改変液体培地（Ｂ）にＮａＯＨを用いて、ｐＨ１１に調整した以外は実施例１０と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６５】
実施例１６
培養条件を振とう培養（約１１５ｒｐｍ）にした以外は実施例１５と同様に培養し、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表５にまとめて示す。
【００６６】
【表５】
【００６７】
［アルカリ条件下での培養検討］
実施例１７
ＧＹＰ改変液体培地（Ａ）にＮａＯＨを加えて、ｐＨ１１に調整した。この液体培地（５０ｍｌ）に、前培養液を１％植菌した。坂口フラスコを用いて、３０℃の条件下で３日間、振とう培養（約１１５ｒｐｍ）を行った。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表６にまとめて示す。
【００６８】
実施例１８
培養条件を、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコを用い、無通気の条件下で、液体培地（１００ｍｌ）が撹拌される程度の緩やかな振とう培養（約７０ｒｐｍ）を行った以外は実施例１７と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表６にまとめて示す。
【００６９】
実施例１９
培養条件を、２００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ及び撹拌子を用い、無通気の条件下で、液体培地（１００ｍｌ）を撹拌培養（約１２０ｒｐｍ）した以外は実施例１７と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表６にまとめて示す。
【００７０】
【表６】
【００７１】
［バイオディーゼル廃液を用いた乳酸発酵の検討］
実施例２０
ＧＹＰ液体培地から無機塩類及び炭素源（グルコース）を除き、炭素源としてバイオディーゼル廃液（株式会社 総社技術コンサルタント提供）を１％（ｗ／ｖ）加え、オートクレーブ滅菌した。用いたバイオディーゼル廃液の組成は、グリセリンが約３９質量％、メタノールが約３０質量％であった。培地のｐＨは７．８であった。このＧＹＰ改変液体培地に（１００ｍｌ）に、前培養液を１％植菌した。３０℃の条件下で３日間、スターラーを用いた撹拌培養を行った。培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）した後、上清を熱失活（８０℃、１５ｍｉｎ）させた。さらに遠心分離（８０００×ｇ、１５ｍｉｎ、室温）を行い、得られた上清をサンプルとし、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはＦ−キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。結果を表７にまとめて示す。
【００７２】
実施例２１
バイオディーゼル廃液を２％（ｗ／ｖ）加え、培地のｐＨが８．３であった以外は実施例２０と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表７にまとめて示す。
【００７３】
実施例２２
バイオディーゼル廃液を３％（ｗ／ｖ）加え、培地のｐＨが８．６であった以外は実施例２０と同様に培養し、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表７にまとめて示す。
【００７４】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
エンテロコッカス フェカリスが以下に示す菌学的性質を有することを特徴とする請求項１記載のＬ−乳酸の製造方法。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【請求項３】
エンテロコッカス フェカリスがエンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）である請求項１又は２記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンである請求項１〜３いずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項５】
グリセリンがバイオディーゼル廃液由来である、請求項１〜４のいずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項６】
原料のＮａＣｌ濃度が０．１質量％〜飽和濃度である請求項１〜５のいずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項７】
原料のｐＨが７．５以上である請求項１〜６いずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項８】
エンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）菌株。
【請求項１】
炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）にＬ−乳酸を生産させることを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
エンテロコッカス フェカリスが以下に示す菌学的性質を有することを特徴とする請求項１記載のＬ−乳酸の製造方法。
グラム染色 ＋
カタラーゼ −
運動性 −
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
グリセリン ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
ラムノース ＋
デンプン −
スクロース ＋
Ｄ−キシロース −
【請求項３】
エンテロコッカス フェカリスがエンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）である請求項１又は２記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
炭素源のうち５０質量％以上がグリセリンである請求項１〜３いずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項５】
グリセリンがバイオディーゼル廃液由来である、請求項１〜４のいずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項６】
原料のＮａＣｌ濃度が０．１質量％〜飽和濃度である請求項１〜５のいずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項７】
原料のｐＨが７．５以上である請求項１〜６いずれか記載のＬ−乳酸の製造方法。
【請求項８】
エンテロコッカス フェカリス Ｗ１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４３）菌株。
【公開番号】特開２０１１−２２９４７６（Ｐ２０１１−２２９４７６Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０４０３０（Ｐ２０１０−１０４０３０）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５９９０３５６２７）学校法人加計学園 (43)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５９９０３５６２７）学校法人加計学園 (43)
【Ｆターム（参考）】
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