ＭＭＰ発現抑制剤
細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）は、受精卵が細胞分裂を繰り返しながら組織を発生・分化する際に発現する酵素であるが、癌の浸潤、転移にも深く関わっており、癌の浸潤、転移にとって癌細胞周囲と血管基底膜の細胞外マトリックスの分解は必須のプロセスである。ＭＭＰの発現を抑制することによって、癌の浸潤、転移を抑制することができるが、ＭＭＰの発現を抑制する安全性の高い医薬はあまり開発されていなかった。本発明では、癌細胞によるＭＭＰの発現を抑制する剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、癌細胞による細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現を抑制することを特徴とする医薬に関する。
【背景技術】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘと呼ばれることもある）は、多細胞生物体を構成する各細胞を固定、接着させる不溶性成分の総称である。細胞外マトリックスは、細胞との接着を介してその増殖、分化に影響を与えることが知られており、その主なものとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどがある。細胞外マトリックスは、細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、以下「ＭＭＰ」と称する）という酵素によって分解されることが知られている。ＭＭＰは、受精卵が細胞分裂を繰り返しながら組織を発生・分化する際等に発現する酵素であるが、癌の浸潤、転移にも深く関わっており、癌の浸潤、転移にとって癌細胞周囲と血管基底膜の細胞外マトリックスの分解は必須のプロセスである。
【発明の開示】
従って、ＭＭＰの発現を抑制することによって、癌の浸潤、転移を抑制することができるが、ＭＭＰの発現を抑制する安全性の高い医薬はあまり開発されておらず、かかる医薬が要望されている。
本願の発明者らは、意外にも、メナテトレノン（ビタミンＫ−ＩＩ）が、ＭＭＰの発現を抑制するという知見を得た。本願発明の目的は、ＭＭＰの発現を抑制し、癌細胞の増殖を抑制する効果を有する安全性の高い医薬を提供することにある。
本願発明は、（１）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＭＭＰ発現抑制剤、（２）前記ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１４からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＭＰ発現抑制剤、（３）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ｕＰＡ発現抑制剤、（４）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌の転移、浸潤の抑制剤、（５）前記癌が肝癌である、請求項４に記載の癌の転移、浸潤の抑制剤、（６）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＡＰ−１の活性抑制剤、（７）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、Ｅｔｓ−１の発現抑制剤、（８）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌治療の予後改善剤、（９）ＭＭＰの発現を抑制するように、メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物の有効量を投与する工程を含む、癌細胞の転移抑制方法、（１０）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＣＤＫインヒビターｐ１６、ｐ２１又はｐ２７の発現促進剤を、提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、（ａ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞の増殖との関係を表わすグラフである。（ｂ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現との関係を示すＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を表わす図である。（ｃ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現との関係を示すＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を表わす図である。
図２は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の細胞周期を表わす図である。
図３は、肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の肝癌細胞の浸潤の抑制結果を示す図である。
図４は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の各種浸潤関連因子の発現について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を示す図である。
図５は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の各種浸潤関連因子の発現について、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を示す図である。
図６は、メナテトレノンを添加した際の転写因子の活性化についてゲルシフトアッセイによる実験結果を示す図である。
図７は、肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際における、各種ＭＭＰのプロモーター活性に及ぼす影響について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を示す図である。
図８は、ＴＰＡにより誘導される癌の浸潤・転移に関連する遺伝子の発現に対するメナテトレノンの影響について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を表わす図である。
図９は、ＴＰＡにより誘導される癌の浸潤・転移に関連するタンパクの発現に対するメナテトレノンの影響について、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
メナテトレノンとは、化学名２−メチル−３−テトラプレニル−１，４−ナフトキノン（２−ｍｅｔｈｌ−３−ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）である。構造式を、以下に示す。
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質で、におい及び味はなく、光により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。メナテトレノンは、ビタミンＫ−ＩＩとも称され、その薬理作用は、血液凝固因子（プロトロンビン、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のタンパク合成過程で、グルタミン酸残基が生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与するものであり、肝における正常プロトロンビン等の合成を促進し、生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用を発現するものである。
本発明における「薬理学的に許容できる塩」としては、たとえば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、酸性又は塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。酸、塩基は、当該化合物１分子に対し、０．１〜５分子の適宜な比で塩を形成する。
無機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などとの塩が挙げられ、有機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
無機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、有機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メグルミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられ、塩基性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンは、無水物であってもよいし、水和物を形成していてもよい。また、メナテトレノンには結晶多形が存在することもあるが限定されず、結晶形が単一であってもよいし、複数の混合物であってもよい。さらに、本発明に係るメナテトレノンが生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。
本発明において用いるメナテトレノンは、自体公知の方法で製造することができ、代表的な例として、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によれば容易に製造することができる他、合成メーカーから容易に入手することもできる。また、メナテトレノンはカプセル剤、注射剤等の製剤としても入手できる。本発明に係る医薬は、メナテトレノンをそのまま用いてもよいし、または、自体公知の薬学的に許容できる担体等（例：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤等）、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸、等の成分を配合してもよい。製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、パップ剤等があげられる。
また、本発明においては、メナテトレノンの投与形態は特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。メナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツーカプセル（エーザイ株式会社製）、グラケーカプセル（エーザイ株式会社製）として、またシロップ剤は商品名ケイツーシロップ（エーザイ株式会社製）として、注射剤は商品名ケイツーＮ注（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
メナテトレノンの好ましい投与量としては、１〜５００ｍｇ／日であり、好ましくは１０〜２００ｍｇ／日であり、更に好ましくは３０〜１３５ｍｇ／日である。
ＭＭＰとは、前述のとおりｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを指し、例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４等が知られているが、本願明細書中では、特にこれらに限定されることはなく、ＭＭＰ全般を指す意味で用いる。
また、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）とは、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）の一種であり、線溶反応に関与するほか、癌の浸潤・転移にも関与する酵素である。
【実施例】
以下に、本発明の有利な効果を示すため、実施例、参考例を示すが、これらは例示的なものであって、本発明はいかなる場合にも、以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に記載の条件を適宜変更して本発明を実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
発明者らは、メナテトレノンが、癌細胞の、（１）増殖及び（２）浸潤・転移にどのような影響を及ぼすのかを研究するべく以下に述べる試験を行った。
（メナテトレノンによる癌細胞の増殖抑制作用の検討）
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、４８時間経過後にＷＳＴアッセイにより細胞増殖の検討を行った。結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）から明らかなように、メナテトレノンを添加した細胞は、いずれの細胞でも添加していない対照肝癌細胞に比べてその増殖が濃度依存的に抑制されることが分かった。
（細胞周期調節遺伝子発現の検討）
細胞増殖抑制機序を検討するために、細胞周期の進行に関与する遺伝子の発現に着目し、細胞周期を進行させるＣｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）の阻害作用を有するＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるｐ２１、ｐ２７、ｐ１６の発現量がメナテトレノンの添加によってどう変化するのかを、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって解析した。
（ＲＴ−ＰＣＲ法）
本試験においては、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、４８時間経過後にＲＮＡを回収し、ｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇよりＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６の発現を調べた。コントロールとしてＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によるＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図１（ｂ）に示す。
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法）
本試験においては、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、それぞれの細胞からタンパク質を抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動後、ＰＶＰ膜にブロッティングし、抗ｐ２１、ｐ２７抗体とインキュベーションし、ＥＣＬ法にてｐ２１、ｐ２７のタンパク発現を調べた。結果を図１（ｃ）に示す。
図１（ｂ）、図１（ｃ）から明らかなように、ＨｅｐＧ２細胞ではｐ２７及びｐ２１ｍＲＮＡはメナテトレノンの添加濃度依存的に増加がみられた。Ｈｅｐ３Ｂ細胞ではｐ２１及びｐ１６の軽度増加がみられたが、ｐ２７の変化は観察されなかった。Ｈｕｈ７細胞ではこれらの発現には変化がみられなかった。
（細胞周期の検討）
メナテトレノンが癌細胞の細胞周期に与える影響について、メナテトレノンを添加した肝癌細胞のＤＮＡ量による分布をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析した。本試験においては、肝癌細胞ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で加え、４８時間経過後にＦＡＣＳによる細胞周期の変化を観察した。結果を図２に示す。図２より明らかなように、メナテトレノンの添加によりいずれの細胞においてもＧ１期の細胞の比率が濃度依存的に増加し、Ｇ２期の細胞の減少がみられた。これは、メナテトレノンが肝癌細胞の細胞周期においてＧ１期からＳ期への進行を抑制していることを示唆するものであり、メナテトレノンがＧ１ ａｒｒｅｓｔを誘導することにより肝癌細胞の増殖を抑制しているものと考えられる。
（癌細胞の浸潤・転移についての検討）
メナテトレノンの有する癌細胞の浸潤・転移を抑制する作用を検討するために、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）にメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で加えて癌細胞のマトリゲル内の浸潤能を測定した。本試験においては、タブルチャンバーの上室にマトリゲルをコートし、その上に癌細胞を撒き、メナテトレノンを添加した。下室にはフィーダーとしてＮＩＨ３Ｔ３細胞を撒いた。２４時間後にマトリゲルを通過して上室下面に移動した細胞数を顕微鏡下に観察した。結果を図３に示す。図３より明らかなように、メナテトレノンの添加濃度が大きいものほど上室下面に移動した細胞の数が減少していることが分かる。この結果により、メナテトレノンは濃度依存的に癌細胞のマトリゲル内浸潤能を抑制していることが分かる。
メナテトレノンの及ぼすＭＭＰの発現への影響を（１）ＲＴ−ＰＣＲ試験、（２）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ試験、（３）ゲルシフトアッセイ、（４）ＭＭＰ遺伝子プロモーター活性試験、及び（５）ＴＰＡによる誘導時の遺伝子の発現の試験により検討した。
（ＲＴ−ＰＣＲ法）
ＭＭＰの発現を検討するためにＲＴ−ＰＣＲ法による試験を行った。本試験においては各種肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）にメナテトレノンを添加した場合の各種ＭＭＰ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ））、ＭＭＰの発現に影響を与える転写因子Ｅｔｓ−１及び細胞外マトリックス受容体であるβ１インテグリンの発現を調査した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、肝癌細胞によって発現しているＭＭＰの種類は一部異なっていたが、メナテトレノンの添加によってＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７及びＭＭＰ−１４のｍＲＮＡの発現が濃度依存的に抑制されていることが分かる。また、転写因子Ｅｔｓ−１の発現も濃度依存的に抑制し、β１インテグリン及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現には変化はみられなかった。
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法）
ＭＭＰの発現を検討するためにＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による試験を行った。本試験においては各種肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）にメナテトレノンを添加した場合のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の蛋白発現を調べた。結果を図５に示す。図５より明らかなように、メナテトレノンの添加によってＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の蛋白の発現が抑制されていることが分かる。
（ゲルシフトアッセイ）
ＭＭＰは、そのプロモーター領域に共通して転写因子ＡＰ−１、Ｅｔｓ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆなどとの結合部位を有しており、ＭＭＰの発現を調節していることが知られている。ＭＭＰの発現を調節する転写因子ＡＰ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆの結合活性がメナテトレノンの添加により変化するかどうかをゲルシフトアッセイにより試験を行った。本試験ではメナテトレノンを肝癌細胞ＨｅｐＧ２に添加して２４時間後に核蛋白を抽出、３２ＰにてラベルしたＡＰ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆの結合部位を持つ二本鎖ＤＮＡと反応させた後、ゲルシフトアッセイを行った。結果を図６に示す。図６から明らかなように、メナテトレノンはＴｃｆ／Ｌｅｆの結合活性には変化を与えなかったが、ＡＰ−１の結合活性を濃度依存的に抑制していることが分かる。この結合はラベル化されていない過剰のＡＰ−１プローブでバンドが濃度依存的に減弱し（図中「１０Ｘ」、「１００Ｘ」）、変異ＡＰ−１プローブでは変化がなかった（図中「Ｍ」）。また、抗ｃ−ｆｏｓ抗体によりバンドの減弱、シフトが見られた（図中「Ｓ」）。以上の結果より、メナテトレノンが特異的にＡＰ−１の結合を抑制することが分かった。
（ＭＭＰ遺伝子プロモーター活性試験）
次に、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーターレポーター遺伝子を肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入し、メナテトレノンがこれらのＭＭＰプロモーター活性に与える影響を調べた。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーター−ルシフェラーゼポータープラスミッドは下記に示す文献１に報告されたＭＭＰプロモーター−ＣＡＴレポータープラスミッド（文献１）のレポーター遺伝子部分を置き換えることにより作成したものを用いた。各種ＭＭＰ−ルシフェラーゼプラスミッドをリポフェクタミンを用いて肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入した後、メナテトレノンを各種濃度で添加し４８時間後に細胞を回収、ルシフェラーゼ活性を測定しＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７遺伝子のプロモーター活性に与えるメナテトレノンの影響を検討した。
文献１：Ｏｚａｋｉ Ｉ，Ｍｉｚｕｔａ Ｔ，Ｚｈａｏ Ｇ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔ，Ｋａｗａｚｏｅ Ｓ，Ｅｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｙａｓｕｔａｋｅ Ｔ，Ｈｉｓａｔｏｍｉ Ａ，Ｓａｋａｉ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｖｉａ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｅｔｓ−１．Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ ２００３；２７：２８８−３００．
結果を図７に示す。図７より明らかなように、メナテトレノンの添加によりＨｕｈ７細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーター活性は濃度依存的に抑制された。特に、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７は５０％近くその活性が低下した。これにより、メナテトレノンによるＭＭＰの発現抑制はこれらの遺伝子プロモーター活性の抑制により起こっていることが示された。
（ＴＰＡによる誘導時の遺伝子の発現の試験）
メナテトレノンによりその発現が抑制されたＭＭＰやＥｔｓ−１は、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）等と共に１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）により誘導される遺伝子であることが知られている。メナテトレノンがＴＰＡによって活性化される遺伝子の発現を制御するかを探るため培養肝癌細胞ＨｅｐＧ２にＴＰＡを２０ｎＭの濃度で添加し、さらにこれにメナテトレノンを加えてＴＰＡによって発現誘導される上記の遺伝子の発現が影響されるかをＲＴ−ＰＣＲ法及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法にて検討した。結果を図８及び図９に示す。図８より明らかなように、肝癌細胞ＨｅｐＧ２にＴＰＡを２０ｎＭ添加するとＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７及びＥｔｓ−１、さらにはｕＰＡのｍＲＮＡの発現の増加がみられた。一方、ｕＰＡ受容体であるｕＰＡＲやｕＰＡのインヒビターであるＰＡＩは影響を受けなかった。これらにメナテトレノンを添加するとＴＰＡによって誘導されたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、Ｅｔｓ−１及びｕＰＡのｍＲＮＡの発現は濃度依存的に抑制された。また、図９より明らかなように、メナテトレノンは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３のタンパクレベルでの発現も濃度依存的に抑制した。この結果により、メナテトレノンは、肝癌細胞において、ＴＰＡによって誘導されたＭＭＰ、Ｅｔｓ−１およびｕＰＡなどの浸潤・転移に関与する遺伝子の発現を抑制することが示された。
【産業上の利用可能性】
本願発明によると、メナテトレノンが転写因子Ｅｔｓ−１の発現およびＡＰ−１の結合活性を抑制し、細胞外マトリックスを分解する酵素であるＭＭＰ及びＭＭＰとともに癌の浸潤・転移に関与している酵素であるｕＰＡの発現を抑制・防止することにより、癌細胞の浸潤、転移を抑えることができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、癌細胞による細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現を抑制することを特徴とする医薬に関する。
【背景技術】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘと呼ばれることもある）は、多細胞生物体を構成する各細胞を固定、接着させる不溶性成分の総称である。細胞外マトリックスは、細胞との接着を介してその増殖、分化に影響を与えることが知られており、その主なものとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどがある。細胞外マトリックスは、細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、以下「ＭＭＰ」と称する）という酵素によって分解されることが知られている。ＭＭＰは、受精卵が細胞分裂を繰り返しながら組織を発生・分化する際等に発現する酵素であるが、癌の浸潤、転移にも深く関わっており、癌の浸潤、転移にとって癌細胞周囲と血管基底膜の細胞外マトリックスの分解は必須のプロセスである。
【発明の開示】
従って、ＭＭＰの発現を抑制することによって、癌の浸潤、転移を抑制することができるが、ＭＭＰの発現を抑制する安全性の高い医薬はあまり開発されておらず、かかる医薬が要望されている。
本願の発明者らは、意外にも、メナテトレノン（ビタミンＫ−ＩＩ）が、ＭＭＰの発現を抑制するという知見を得た。本願発明の目的は、ＭＭＰの発現を抑制し、癌細胞の増殖を抑制する効果を有する安全性の高い医薬を提供することにある。
本願発明は、（１）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＭＭＰ発現抑制剤、（２）前記ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１４からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＭＰ発現抑制剤、（３）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ｕＰＡ発現抑制剤、（４）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌の転移、浸潤の抑制剤、（５）前記癌が肝癌である、請求項４に記載の癌の転移、浸潤の抑制剤、（６）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＡＰ−１の活性抑制剤、（７）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、Ｅｔｓ−１の発現抑制剤、（８）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌治療の予後改善剤、（９）ＭＭＰの発現を抑制するように、メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物の有効量を投与する工程を含む、癌細胞の転移抑制方法、（１０）メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＣＤＫインヒビターｐ１６、ｐ２１又はｐ２７の発現促進剤を、提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、（ａ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞の増殖との関係を表わすグラフである。（ｂ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現との関係を示すＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を表わす図である。（ｃ）はメナテトレノンの添加量と各種肝癌細胞におけるＣＤＫインヒビターの発現との関係を示すＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を表わす図である。
図２は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の細胞周期を表わす図である。
図３は、肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の肝癌細胞の浸潤の抑制結果を示す図である。
図４は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の各種浸潤関連因子の発現について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を示す図である。
図５は、各種肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際の各種浸潤関連因子の発現について、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を示す図である。
図６は、メナテトレノンを添加した際の転写因子の活性化についてゲルシフトアッセイによる実験結果を示す図である。
図７は、肝癌細胞にメナテトレノンを添加した際における、各種ＭＭＰのプロモーター活性に及ぼす影響について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を示す図である。
図８は、ＴＰＡにより誘導される癌の浸潤・転移に関連する遺伝子の発現に対するメナテトレノンの影響について、ＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果を表わす図である。
図９は、ＴＰＡにより誘導される癌の浸潤・転移に関連するタンパクの発現に対するメナテトレノンの影響について、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による実験結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
メナテトレノンとは、化学名２−メチル−３−テトラプレニル−１，４−ナフトキノン（２−ｍｅｔｈｌ−３−ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）である。構造式を、以下に示す。
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質で、におい及び味はなく、光により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。メナテトレノンは、ビタミンＫ−ＩＩとも称され、その薬理作用は、血液凝固因子（プロトロンビン、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のタンパク合成過程で、グルタミン酸残基が生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与するものであり、肝における正常プロトロンビン等の合成を促進し、生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用を発現するものである。
本発明における「薬理学的に許容できる塩」としては、たとえば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、酸性又は塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。酸、塩基は、当該化合物１分子に対し、０．１〜５分子の適宜な比で塩を形成する。
無機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などとの塩が挙げられ、有機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
無機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、有機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メグルミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられ、塩基性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンは、無水物であってもよいし、水和物を形成していてもよい。また、メナテトレノンには結晶多形が存在することもあるが限定されず、結晶形が単一であってもよいし、複数の混合物であってもよい。さらに、本発明に係るメナテトレノンが生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。
本発明において用いるメナテトレノンは、自体公知の方法で製造することができ、代表的な例として、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によれば容易に製造することができる他、合成メーカーから容易に入手することもできる。また、メナテトレノンはカプセル剤、注射剤等の製剤としても入手できる。本発明に係る医薬は、メナテトレノンをそのまま用いてもよいし、または、自体公知の薬学的に許容できる担体等（例：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤等）、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸、等の成分を配合してもよい。製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、パップ剤等があげられる。
また、本発明においては、メナテトレノンの投与形態は特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。メナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツーカプセル（エーザイ株式会社製）、グラケーカプセル（エーザイ株式会社製）として、またシロップ剤は商品名ケイツーシロップ（エーザイ株式会社製）として、注射剤は商品名ケイツーＮ注（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
メナテトレノンの好ましい投与量としては、１〜５００ｍｇ／日であり、好ましくは１０〜２００ｍｇ／日であり、更に好ましくは３０〜１３５ｍｇ／日である。
ＭＭＰとは、前述のとおりｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを指し、例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４等が知られているが、本願明細書中では、特にこれらに限定されることはなく、ＭＭＰ全般を指す意味で用いる。
また、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）とは、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）の一種であり、線溶反応に関与するほか、癌の浸潤・転移にも関与する酵素である。
【実施例】
以下に、本発明の有利な効果を示すため、実施例、参考例を示すが、これらは例示的なものであって、本発明はいかなる場合にも、以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に記載の条件を適宜変更して本発明を実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
発明者らは、メナテトレノンが、癌細胞の、（１）増殖及び（２）浸潤・転移にどのような影響を及ぼすのかを研究するべく以下に述べる試験を行った。
（メナテトレノンによる癌細胞の増殖抑制作用の検討）
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、４８時間経過後にＷＳＴアッセイにより細胞増殖の検討を行った。結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）から明らかなように、メナテトレノンを添加した細胞は、いずれの細胞でも添加していない対照肝癌細胞に比べてその増殖が濃度依存的に抑制されることが分かった。
（細胞周期調節遺伝子発現の検討）
細胞増殖抑制機序を検討するために、細胞周期の進行に関与する遺伝子の発現に着目し、細胞周期を進行させるＣｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）の阻害作用を有するＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるｐ２１、ｐ２７、ｐ１６の発現量がメナテトレノンの添加によってどう変化するのかを、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって解析した。
（ＲＴ−ＰＣＲ法）
本試験においては、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、４８時間経過後にＲＮＡを回収し、ｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇよりＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６の発現を調べた。コントロールとしてＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によるＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図１（ｂ）に示す。
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法）
本試験においては、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で添加した後、それぞれの細胞からタンパク質を抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動後、ＰＶＰ膜にブロッティングし、抗ｐ２１、ｐ２７抗体とインキュベーションし、ＥＣＬ法にてｐ２１、ｐ２７のタンパク発現を調べた。結果を図１（ｃ）に示す。
図１（ｂ）、図１（ｃ）から明らかなように、ＨｅｐＧ２細胞ではｐ２７及びｐ２１ｍＲＮＡはメナテトレノンの添加濃度依存的に増加がみられた。Ｈｅｐ３Ｂ細胞ではｐ２１及びｐ１６の軽度増加がみられたが、ｐ２７の変化は観察されなかった。Ｈｕｈ７細胞ではこれらの発現には変化がみられなかった。
（細胞周期の検討）
メナテトレノンが癌細胞の細胞周期に与える影響について、メナテトレノンを添加した肝癌細胞のＤＮＡ量による分布をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析した。本試験においては、肝癌細胞ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＬＥにメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で加え、４８時間経過後にＦＡＣＳによる細胞周期の変化を観察した。結果を図２に示す。図２より明らかなように、メナテトレノンの添加によりいずれの細胞においてもＧ１期の細胞の比率が濃度依存的に増加し、Ｇ２期の細胞の減少がみられた。これは、メナテトレノンが肝癌細胞の細胞周期においてＧ１期からＳ期への進行を抑制していることを示唆するものであり、メナテトレノンがＧ１ ａｒｒｅｓｔを誘導することにより肝癌細胞の増殖を抑制しているものと考えられる。
（癌細胞の浸潤・転移についての検討）
メナテトレノンの有する癌細胞の浸潤・転移を抑制する作用を検討するために、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）にメナテトレノンを０Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍの濃度で加えて癌細胞のマトリゲル内の浸潤能を測定した。本試験においては、タブルチャンバーの上室にマトリゲルをコートし、その上に癌細胞を撒き、メナテトレノンを添加した。下室にはフィーダーとしてＮＩＨ３Ｔ３細胞を撒いた。２４時間後にマトリゲルを通過して上室下面に移動した細胞数を顕微鏡下に観察した。結果を図３に示す。図３より明らかなように、メナテトレノンの添加濃度が大きいものほど上室下面に移動した細胞の数が減少していることが分かる。この結果により、メナテトレノンは濃度依存的に癌細胞のマトリゲル内浸潤能を抑制していることが分かる。
メナテトレノンの及ぼすＭＭＰの発現への影響を（１）ＲＴ−ＰＣＲ試験、（２）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ試験、（３）ゲルシフトアッセイ、（４）ＭＭＰ遺伝子プロモーター活性試験、及び（５）ＴＰＡによる誘導時の遺伝子の発現の試験により検討した。
（ＲＴ−ＰＣＲ法）
ＭＭＰの発現を検討するためにＲＴ−ＰＣＲ法による試験を行った。本試験においては各種肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）にメナテトレノンを添加した場合の各種ＭＭＰ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ））、ＭＭＰの発現に影響を与える転写因子Ｅｔｓ−１及び細胞外マトリックス受容体であるβ１インテグリンの発現を調査した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、肝癌細胞によって発現しているＭＭＰの種類は一部異なっていたが、メナテトレノンの添加によってＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７及びＭＭＰ−１４のｍＲＮＡの発現が濃度依存的に抑制されていることが分かる。また、転写因子Ｅｔｓ−１の発現も濃度依存的に抑制し、β１インテグリン及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現には変化はみられなかった。
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法）
ＭＭＰの発現を検討するためにＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による試験を行った。本試験においては各種肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）にメナテトレノンを添加した場合のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の蛋白発現を調べた。結果を図５に示す。図５より明らかなように、メナテトレノンの添加によってＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の蛋白の発現が抑制されていることが分かる。
（ゲルシフトアッセイ）
ＭＭＰは、そのプロモーター領域に共通して転写因子ＡＰ−１、Ｅｔｓ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆなどとの結合部位を有しており、ＭＭＰの発現を調節していることが知られている。ＭＭＰの発現を調節する転写因子ＡＰ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆの結合活性がメナテトレノンの添加により変化するかどうかをゲルシフトアッセイにより試験を行った。本試験ではメナテトレノンを肝癌細胞ＨｅｐＧ２に添加して２４時間後に核蛋白を抽出、３２ＰにてラベルしたＡＰ−１、Ｔｃｆ／Ｌｅｆの結合部位を持つ二本鎖ＤＮＡと反応させた後、ゲルシフトアッセイを行った。結果を図６に示す。図６から明らかなように、メナテトレノンはＴｃｆ／Ｌｅｆの結合活性には変化を与えなかったが、ＡＰ−１の結合活性を濃度依存的に抑制していることが分かる。この結合はラベル化されていない過剰のＡＰ−１プローブでバンドが濃度依存的に減弱し（図中「１０Ｘ」、「１００Ｘ」）、変異ＡＰ−１プローブでは変化がなかった（図中「Ｍ」）。また、抗ｃ−ｆｏｓ抗体によりバンドの減弱、シフトが見られた（図中「Ｓ」）。以上の結果より、メナテトレノンが特異的にＡＰ−１の結合を抑制することが分かった。
（ＭＭＰ遺伝子プロモーター活性試験）
次に、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーターレポーター遺伝子を肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入し、メナテトレノンがこれらのＭＭＰプロモーター活性に与える影響を調べた。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーター−ルシフェラーゼポータープラスミッドは下記に示す文献１に報告されたＭＭＰプロモーター−ＣＡＴレポータープラスミッド（文献１）のレポーター遺伝子部分を置き換えることにより作成したものを用いた。各種ＭＭＰ−ルシフェラーゼプラスミッドをリポフェクタミンを用いて肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入した後、メナテトレノンを各種濃度で添加し４８時間後に細胞を回収、ルシフェラーゼ活性を測定しＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７遺伝子のプロモーター活性に与えるメナテトレノンの影響を検討した。
文献１：Ｏｚａｋｉ Ｉ，Ｍｉｚｕｔａ Ｔ，Ｚｈａｏ Ｇ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔ，Ｋａｗａｚｏｅ Ｓ，Ｅｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｙａｓｕｔａｋｅ Ｔ，Ｈｉｓａｔｏｍｉ Ａ，Ｓａｋａｉ Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｖｉａ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｅｔｓ−１．Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ ２００３；２７：２８８−３００．
結果を図７に示す。図７より明らかなように、メナテトレノンの添加によりＨｕｈ７細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７のプロモーター活性は濃度依存的に抑制された。特に、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７は５０％近くその活性が低下した。これにより、メナテトレノンによるＭＭＰの発現抑制はこれらの遺伝子プロモーター活性の抑制により起こっていることが示された。
（ＴＰＡによる誘導時の遺伝子の発現の試験）
メナテトレノンによりその発現が抑制されたＭＭＰやＥｔｓ−１は、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）等と共に１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）により誘導される遺伝子であることが知られている。メナテトレノンがＴＰＡによって活性化される遺伝子の発現を制御するかを探るため培養肝癌細胞ＨｅｐＧ２にＴＰＡを２０ｎＭの濃度で添加し、さらにこれにメナテトレノンを加えてＴＰＡによって発現誘導される上記の遺伝子の発現が影響されるかをＲＴ−ＰＣＲ法及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法にて検討した。結果を図８及び図９に示す。図８より明らかなように、肝癌細胞ＨｅｐＧ２にＴＰＡを２０ｎＭ添加するとＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７及びＥｔｓ−１、さらにはｕＰＡのｍＲＮＡの発現の増加がみられた。一方、ｕＰＡ受容体であるｕＰＡＲやｕＰＡのインヒビターであるＰＡＩは影響を受けなかった。これらにメナテトレノンを添加するとＴＰＡによって誘導されたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、Ｅｔｓ−１及びｕＰＡのｍＲＮＡの発現は濃度依存的に抑制された。また、図９より明らかなように、メナテトレノンは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３のタンパクレベルでの発現も濃度依存的に抑制した。この結果により、メナテトレノンは、肝癌細胞において、ＴＰＡによって誘導されたＭＭＰ、Ｅｔｓ−１およびｕＰＡなどの浸潤・転移に関与する遺伝子の発現を抑制することが示された。
【産業上の利用可能性】
本願発明によると、メナテトレノンが転写因子Ｅｔｓ−１の発現およびＡＰ−１の結合活性を抑制し、細胞外マトリックスを分解する酵素であるＭＭＰ及びＭＭＰとともに癌の浸潤・転移に関与している酵素であるｕＰＡの発現を抑制・防止することにより、癌細胞の浸潤、転移を抑えることができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＭＭＰ発現抑制剤。
【請求項２】
前記ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１４からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＭＰ発現抑制剤。
【請求項３】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ｕＰＡ発現抑制剤。
【請求項４】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌の転移、浸潤の抑制剤。
【請求項５】
前記癌が肝癌である、請求項４に記載の癌の転移、浸潤の抑制剤。
【請求項６】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＡＰ−１の活性抑制剤。
【請求項７】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、Ｅｔｓ−１の発現抑制剤。
【請求項８】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌治療の予後改善剤。
【請求項９】
ＭＭＰの発現を抑制するように、メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物の有効量を投与する工程を含む、癌細胞の転移抑制方法。
【請求項１０】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＣＤＫインヒビターｐ１６、ｐ２１又はｐ２７の発現促進剤。
【請求項１】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＭＭＰ発現抑制剤。
【請求項２】
前記ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１４からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＭＰ発現抑制剤。
【請求項３】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ｕＰＡ発現抑制剤。
【請求項４】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌の転移、浸潤の抑制剤。
【請求項５】
前記癌が肝癌である、請求項４に記載の癌の転移、浸潤の抑制剤。
【請求項６】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＡＰ−１の活性抑制剤。
【請求項７】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、Ｅｔｓ−１の発現抑制剤。
【請求項８】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、癌治療の予後改善剤。
【請求項９】
ＭＭＰの発現を抑制するように、メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物の有効量を投与する工程を含む、癌細胞の転移抑制方法。
【請求項１０】
メナテトレノンもしくはその薬理学的に許容な塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、ＣＤＫインヒビターｐ１６、ｐ２１又はｐ２７の発現促進剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９３８５８
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５８１５（Ｐ２００５−５０５８１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６０３８
【国際出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【出願人】（００００００２１７）エーザイ株式会社 (102)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６０３８
【国際出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【出願人】（００００００２１７）エーザイ株式会社 (102)
【Ｆターム（参考）】
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