Ｔ細胞死誘導エピトープ
【課題】細胞死誘導エピトープおよびそれを含むポリペプチドである。活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導するための化合物、前記エピトープに対する抗体の製造方法、前記エピトープに結合する化合物の同定方法、活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導方法、および前記化合物を含む医薬組成物もまた、提供する。
【解決手段】Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；Ｘ２がＡｓｐであり；Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；Ｘ４が任意のアミノ酸であり；Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、エピトープの３次元構造。
【解決手段】Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；Ｘ２がＡｓｐであり；Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；Ｘ４が任意のアミノ酸であり；Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、エピトープの３次元構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その内容が全体として参照により引用される、２００４年５月１１日に出願された米国仮出願第６０／５７０，１６１号の優先権を主張する。
【０００２】
背景
自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌の治療においては、望ましくない免疫反応の制御が重要である。過度に攻撃的なＴ細胞の活性は、免疫抑制によって、または免疫寛容の誘導によって、抑えられうる。免疫系の機能の適切な維持や、過度に攻撃的なＴ細胞のような望ましくない細胞の除去には、アポトーシスが関与していると考えられている（Ｋａｂｅｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４， ３３８−３４０； ａｎｄ Ｒａｆｆ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５６， ３９７−３９９）。
【発明の概要】
【０００３】
要約
本願は、Ｔ細胞死誘導エピトープに関する。当該エピトープは特に、当該エピトープに結合する化合物を選択するために用いられうる。かような化合物は、過度に攻撃的なＴ細胞が関与する疾患の治療に有用である。かような疾患の例としては、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌が挙げられる。
【０００４】
一形態において、本発明は、単離されたエピトープの３次元構造を特徴とする。活性化Ｔ細胞上の当該エピトープにリガンドが結合すると、当該活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。かようなエピトープは、以下により表される。
【０００５】
（１）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）、ここで、
Ｘ１はＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２はＡｓｐであり；
Ｘ３はＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ５はＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである。
【０００６】
（２）Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号２）、ここで、
Ｘ６はＡｓｐであり；
Ｘ７はＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８はＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９はＰｒｏであり；
Ｘ１０はＧｌｕである。
【０００７】
（３）Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（配列番号３）、ここで、
Ｘ１１はＰｒｏであり；
Ｘ１２はＭｅｔであり；
Ｘ１３はＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４はＩｌｅである。
【０００８】
上述したこれらのエピトープはいずれも、例えばポリペプチド、２つのポリペプチドの相互作用領域、糖質部分、糖タンパク質、またはこれらの構造的、機能的な等価物でありうる。
【０００９】
他の形態において、本発明は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。活性化Ｔ細胞上の当該ポリペプチドにリガンドが結合すると、当該活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。一実施形態において、当該ポリペプチドは、４〜４００のアミノ酸を含む（例えば、４から４００の間の任意の整数、両端を含む）。例えば、当該ポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号２）、Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（配列番号３）、または配列番号４、６〜１８および２０〜２２のいずれかでありうる。
【００１０】
「単離されたエピトープ」または「単離されたポリペプチド」とは、天然に関連した分子を実質的に含まない、すなわち、乾燥重量で少なくとも７５％（例えば、７５％から１００％の間の任意の数、両端を含む）の純度を有することを意味する。純度は、適当な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定されうる。本発明の単離されたエピトープまたはポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学的手法により製造された自然源から精製されうる。
【００１１】
さらに他の形態において、本発明は、上述したエピトープの１つに結合する新規な化合物を特徴とする。当該化合物は、モノクローナル抗体などの抗体といった、任意の種類の分子でありうる。本発明の化合物は、本発明のエピトープを検出する目的、および活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で用いられうる。
【００１２】
抗体の製造方法もまた、本発明の技術的範囲に包含される。当該方法は、上述したエピトープ（例えば、ポリペプチド）の有効量を被験者に投与することを含む。当該抗体は、本発明のエピトープを検出する目的、または活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で用いられうる。
【００１３】
本発明はまた、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物（例えば、モノクローナル抗体）の同定方法をも特徴とする。当該方法は、試験化合物を本発明のエピトープと接触させること、および前記試験化合物が前記エピトープに結合するかどうかを決定することを含む。前記試験化合物が前記エピトープに結合したら、当該化合物は活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物である。
【００１４】
本発明はさらに、活性化Ｔ細胞を本発明の化合物と接触させることにより、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法を特徴とする。
【００１５】
さらに他の形態において、本発明は、製薬上許容できる担体、および、（１）ポリペプチドなどの本発明のエピトープ、または（２）前記エピトープに結合する化合物を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１６】
本発明は、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌といった、過度に攻撃的なＴ細胞が関与する疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の１つまたは２つ以上の実施形態の詳細を以下に記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘導が可能であり、新規なＴ細胞死誘導エピトープの使用により活性化Ｔ細胞が減少しうるという予期せぬ発見に基づいている。
【００１８】
活性化Ｔ細胞を減少させることは、過剰な、または望ましくない、Ｔ細胞が媒介する免疫応答またはＴ細胞の増殖に関連した症状を治療するのに特に有用である。例えば、活性化Ｔ細胞が減少すると、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌に関与する望ましくないＴ細胞の活性または増殖が低下または消失しうる。
【００１９】
そこで、本発明は、単離されたエピトープの３次元構造を特徴とする。活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により、前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。当該エピトープは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４で表される。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４の３次元構造は、例えば、Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ３８：３３３２−４１およびＴｏｏｇｏｏｄ （２００２） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ４５： １５４３−５７に記載されているようなコンピュータモデリングプログラムを用いて決定されうる。構造的、機能的に等価なエピトープは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４の３次元構造に従って設計され、本技術分野において公知の手法を用いて調製され、後述する実施例に記載の手法などの手法によって、活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導に関与する活性を試験されうる。例えば、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｐａｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｇｅｎｅ ７３， ３０５−３１８； Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００３００４９２５２ Ａｌ； ＷＯ ０３／０１３６０３ Ａｌ； Ｏｓｂｏｒｎｅ （１９９６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２４５−２４８； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８， ５９８−６０３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７７， ３４８−３５０； Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５， ３２４３−３２４８； Ｍｏｌｌｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６， ３１８４−３１９０； ａｎｄ Ｇｒｉｂｂｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２， ８１１−８１５を参照。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「活性化Ｔ細胞」とは、非活性化Ｔ細胞よりも増殖頻度が多く、増殖速度が速く、または増殖の程度が高いＴ細胞を意味する。細胞の「死」としては、プログラム細胞死、すなわち、アポトーシスが挙げられる。ある剤による「細胞死の誘導」とは、当該剤で処理された細胞の集団が、処理されていない細胞の集団と比較して、死滅速度が速いことを意味する。例えば、アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析（後述する実施例を参照）により測定すると、モノクローナル抗体であるｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７またはｍ１６６−４３Ｂ６で処理した場合にアポトーシスを起こすインビトロの活性化Ｔ細胞の百分率は、処理していない細胞と比較して約２倍である。
【００２１】
本発明はまた、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドをも特徴とする。当該ポリペプチドは、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する化合物を同定するのに用いられうる。かような化合物が活性化Ｔ細胞の表面上に発現したポリペプチドに結合すると、細胞死が誘導される。さらに、遊離ポリペプチド（すなわち、細胞表面上に発現していないポリペプチド）は、内因性の細胞死誘導リガンドを求めて細胞表面のポリペプチドと競合することにより、望ましくない細胞死を阻害しうる。ポリペプチドの配列の長さは、その用途に応じて変動しうる。本発明のポリペプチドは、例えば、単離されたＴ細胞表面タンパク質、合成ポリペプチド、または組換えポリペプチドとして得られる。組換えポリペプチドを調製するには、当該ポリペプチドをコードする核酸を、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグ、またはＭ１３遺伝子３タンパク質などの融合パートナーをコードする他の核酸に連結すればよい。得られた融合核酸は、適切な宿主細胞中で融合タンパク質を発現し、当該タンパク質は標準的な手法により単離されうる。単離された融合タンパク質は、融合パートナーを除去し、本発明の組換えポリペプチドを得る目的で、例えば酵素消化によりさらに処理されうる。
【００２２】
本発明のエピトープまたはポリペプチドは、動物（抗体製造の目的）またはヒト（疾患治療の目的）において抗体を産生させるのに用いられうる。動物においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれらの断片を作製する手法は、本技術分野において公知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。「抗体」との語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄ， ｅｔ． ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ， ３４１， ５４４）などの、無傷の分子およびその断片を含む。これらの抗体は、例えばエピトープに結合する化合物を同定する際に、エピトープを検出するのに用いられうる（以下を参照）。活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導しうる抗体はまた、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌などの疾患を治療するのにも有用である。一般に、本発明のエピトープ（例えば、ポリペプチド）は、ＫＬＨなどのキャリアタンパク質と結合され、アジュバントと混合され、宿主動物に注射されうる。当該動物において製造された抗体は、次いでペプチドアフィニティクロマトグラフィにより精製されうる。一般的に用いられている宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが挙げられる。免疫応答を増強するのに用いられうる種々のアジュバントは宿主の種類に依存し、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられる。有用なヒトアジュバントとしては、ＢＣＧ（バシル カルメット−グエリン（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｌｉｎ））およびコリネバクテリウム パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。
【００２３】
免疫された被験者の血清中には、ポリクローナル抗体、抗体分子の混成集団が存在する。特定の抗原に対するモノクローナル抗体、抗体の混成集団は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製されうる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ５１１； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ２９２； ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）。特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５および米国特許第４，３７６，１１０号に記載のような培養下の連続継代細胞系、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４， ７２； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０， ２０２６）、並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）による抗体分子の製造を提供する任意の技術により得られる。かような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇｇＤおよびこれらの任意のサブクラスのいずれの免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されうる。インビボでモノクローナル抗体を高力価で産生しうるハイブリドーマによれば、特に有用な製造方法となる。
【００２４】
さらに、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術も、用いられうる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１， ６８５１； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６０４；およびＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体のような、異なる部位が異なる動物種由来である分子である。あるいは、単鎖抗体の製造のために開示されている技術を採用して、単鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリを製造してもよい。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖断片および軽鎖断片をアミノ酸架橋を介して連結することにより形成される。さらに、抗体断片は、公知の技術により製造されうる。例えば、かような断片としては、以下に制限されないが、抗体分子のペプシン消化により製造されるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより得られるＦａｂ断片が挙げられる。抗体はまた、本技術分野において公知の方法によりヒト化されうる。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は、商業的にヒト化されうる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ； ａｎｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。トランスジェニック動物で発現している抗体のような完全ヒト化抗体もまた、本発明の特徴である（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７， １３；並びに米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号を参照）。
【００２５】
本発明はさらに、本発明のエピトープに結合して活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する新規な化合物を特徴とする。かような化合物は、エピトープの３次元構造に従って、例えばコンピュータモデリングプログラムを用いて設計され、本技術分野において公知の手法を用いて合成されうる。当該化合物はまた、後述するライブラリスクリーニングによって同定されうる。
【００２６】
試験化合物は、本技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における膨大なアプローチのいずれかを用いて得られる。かようなライブラリとしては、ペプチドライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に耐性の新規な非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリ）、空間アドレス可能な並行固相または液相ライブラリ、デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）またはアフィニティクロマトグラフィ選択により得られる合成ライブラリ、「１ビーズ１化合物」ライブラリ、および抗体ライブラリが挙げられる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７， ２６７８−８５； Ｌａｍ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２， １４５； Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８４； ａｎｄ Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２， ７６７を参照。
【００２７】
分子ライブラリを合成する方法の例は、本技術分野において例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０， ６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１， １１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７， ２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３， ２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３， ２０６１； ａｎｄ Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７，１２３３に記載されている。
【００２８】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３， ４１２−４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４， ５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９， １８６５−１８６９）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７，６３７８−６３８２； Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２，３０１−３１０；および米国特許第５，２２３，４０９号）として提供されうる。
【００２９】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物を同定するには、本発明のエピトープを試験化合物と接触させ、当該化合物の前記エピトープへの結合を評価する。前記化合物がエピトープに結合すれば、当該化合物は活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補である。
【００３０】
スクリーニングアッセイは、種々の方法で行われうる。例えば、ある方法ではエピトープ（もしくはエピトープ含有分子、例えば、ポリペプチドもしくは融合タンパク質）または試験化合物を固相上に固定し、反応の終了時に当該固相上に形成されたエピトープ−試験化合物複合体を検出する。実際には、固相としてマイクロタイタープレートが簡便に用いられうる。アンカー成分は、非共有結合または共有結合によって固定化されうる。非共有結合は、単にアンカー成分の溶液で固相表面をコーティングし、プレートを乾燥させることにより、達成されうる。あるいは、前記アンカー成分に特異的な、固定化された抗体（例えば、モノクローナル抗体）が、アンカー成分を固相表面に固定化するのに用いられうる。アンカー成分でコーティングされた固相表面には、非アンカー成分が添加される。反応が完結したら、形成された複合体が固相表面上に固定化されたままでいるような条件下で、（例えば洗浄によって）非アンカー成分の未結合画分を除去する。かような複合体の検出は、多種の方法で達成されうる。非アンカー成分がプレラベル化されている場合には、固相表面上に固定化されたラベルが検出されれば、複合体が形成されたことが示される。非アンカー成分がプレラベル化されていない場合には、間接的なラベルを用いて、例えば、非アンカー成分に特異的な抗体（当該抗体は直接ラベル化されていてもよいし、ラベル化された抗Ｉｇ抗体を用いて間接的にラベル化されていてもよい）を用いて、固相上に形成された複合体を検出しうる。
【００３１】
あるいは、反応は液相中で行われうる。複合体は、例えばエピトープ（もしくはエピトープ含有分子）または試験化合物に特異的な固定化された抗体を用いて、未結合成分と分離される。当該複合体は次いで、例えば他の成分に特異的なラベル化抗体を用いて検出される。
【００３２】
候補化合物は、後述する実施例に記載の方法または本技術分野において公知の任意の他の方法を用いて、活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導能を評価することにより有効性が確認されうる。確認された化合物は、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で、および自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌の治療などの疾患を治療する目的で、用いられうる。
【００３３】
本発明は、例えば活性化Ｔ細胞をインビトロで本発明の化合物に接触させることにより、または本発明の化合物の有効量をそれを必要とする被験者に投与することにより、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法を提供する。処置される被験者は、過剰なまたは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答により特徴づけられる症状を示している、または示す危険があると判定されうる。例えば、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌に罹患した患者である。この方法は、単独で行われてもよいし、他の薬剤または治療法と組み合わせて行われてもよい。
【００３４】
「治療」という語は、障害、障害の兆候、障害に続発する疾患状態または障害の素因を治癒させ、緩和させ、軽減させ、修復させ、予防し、または改善させる目的での、被験者への組成物の投与として定義される。「有効量」は、処置された患者において、例えば上述したような医学的に望ましい結果を生み出すことができる組成物の量である。
【００３５】
治療される疾患の例としては、以下に制限されないが、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、および乾癬性関節炎など）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎など）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸管疾患、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬剤性発疹、ハンセン病の逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主病、骨髄移植、肝移植または任意の器官もしくは組織の移植などの移植のケース（同種異系または異種の組織を用いた移植など）、アトピー性アレルギーなどのアレルギー、エイズ（ＡＩＤＳ）、および白血病またはリンパ腫などのＴ細胞新生物が挙げられる。
【００３６】
１種のインビボアプローチでは、治療用組成物（例えば、本発明のエピトープ、本発明のポリペプチドまたは本発明の化合物）を被験者に投与する。一般的に、前記エピトープ、前記ポリペプチドまたは前記化合物は、製薬上許容できる担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口で、または静脈内注射により投与され、または皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻内に、胃内に、気管内に、もしくは肺内に注射され、または埋め込まれる。
【００３７】
必要な投与量は、投与経路の選択；製剤の性質；被験者の病気の性質；被験者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；他に投与される薬剤；および主治医の判断に依存する。適切な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。必要量における広範な変動は、入手可能な組成物が多様であることや、種々の投与経路の有効性が異なることからすると予想されるところである。例えば、経口投与では、静脈内注射と比べてより多くの投与量が必要と予想される。このような投与量レベルにおける変動は、本技術分野においてよく了解されているように、最適化のための標準的・経験的な手順を用いて補正されうる。適切な送達媒体（例えば、ポリマー性マイクロ粒子または埋め込み型装置）中へ組成物を封入すると、送達（特に、経口送達）の効率が向上しうる。
【００３８】
製薬上許容できる担体と、有効量の本発明の化合物とを含有する医薬組成物もまた、本発明の技術的範囲に包含される。当該医薬組成物は、上述した疾患の治療に用いられうる。製薬上許容できる担体としては、溶媒、懸濁媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、および等張性吸収遅延剤が挙げられる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、従来の方法を用いた異なる投与経路のための剤形に製剤化されうる。例えば、前記医薬組成物は、カプセル剤、ゲルシール剤、または経口投与用の錠剤として製剤化されうる。カプセル剤は、ゼラチンまたはセルロースなどの標準的な製薬上許容できる物質を含有しうる。錠剤は、組成物を固体状の担体および滑沢剤との混合物を圧縮することにより、従来の手法に従って製剤化されうる。固体状の担体の例としては、デンプンおよび糖ベントナイトが挙げられる。前記医薬組成物はまた、結合剤（例えば、乳糖またはマンニトール）、従来の充填剤、および錠剤化剤を含有する硬殻錠剤またはカプセルの形態で投与されうる。前記医薬組成物は、非経口経路を介して投与されうる。非経口の剤形の例としては、活性剤の水性溶液、等張食塩水もしくは５％ブドウ糖、または他の周知の製薬上許容できる賦形剤が挙げられる。シクロデキストリンまたは本技術分野の当業者に周知の他の可溶化剤が、治療剤の送達のための医薬賦形剤として用いられうる。
【００４０】
本発明の組成物の有効性は、インビトロおよびインビボの双方で評価されうる。例えば、後述する実施例を参照。簡潔に言えば、前記組成物は、インビトロで活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導能を試験されうる。インビボ研究については、前記組成物は動物（例えば、マウスモデル）に注射され、次いでその治療効果が評価されうる。その結果に基づき、適切な投与量の範囲および投与経路が決定されうる。
【実施例】
【００４１】
下記の具体的な実施例は単に例示のためのものであって、開示の残部をいかようにも制限するものではないと解釈されるべきである。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、さらなる労力を必要とすることなく本発明を全ての範囲に亘って実施可能と考えられる。本明細書で引用した全ての文献は、その全体が参照により本明細書中に引用される。
【００４２】
マウス脾臓細胞懸濁液の調製
マウスの脾臓を８ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に浸漬させ、滅菌カバースリップを用いて優しく刻み、１５ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、２００×ｇで５分間スピンさせた。上清を捨て、壁を優しくタッピングして細胞ペレットを残ったバッファに再懸濁させた。１ｍＬの赤血球溶解バッファ（０．６Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．１７Ｍトリス塩基、ｐＨ７．６５）の添加により、混入した赤血球（ＲＢＣ）を溶解させ、次いで室温にて２分間インキュベートし、９ｍＬのＨＢＳＳを用いて高速クエンチした。２００×ｇで５分間細胞をペレット化し、２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。ヘモサイトメータ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）およびトリパンブルー色素排除法を用いて、混合液中の細胞の濃度および生存能力を測定した。
【００４３】
抗Ｔ細胞アポトーシス誘導モノクローナル抗体の調製
コンカナバリンＡ活性化ヒトＴ細胞でマウスを免疫することにより抗Ｔ細胞アポトーシス誘導モノクローナル抗体を産生させ、活性化ヒトＴ細胞に対するその結合能およびそれに続くＴ細胞のアポトーシスの誘導能をスクリーニングした。当該モノクローナル抗体の調製は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （（１９７６） Ｅｕｒｏ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ５１１−５１９）の周知の細胞融合方法に従って行い、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを製造した。かような方法に従って製造された３種のハイブリドーマはそれぞれ、ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、およびｍ１６６−４３Ｂ６と称され、インビトロでＴ細胞のアポトーシスを誘導可能なモノクローナル抗体を分泌した。
【００４４】
各ハイブリドーマの濃縮した培地の上清を２００００×ｇで１０分間スピンし、当該上清を結合バッファ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で１：１の比で希釈した。３〜５ｍＬの前記結合バッファでタンパク質Ｇカラム（体積倍量：約１ｍＬ）を３回洗浄した。透明な培地の上清を前記タンパク質Ｇカラムにロードし、フロースルーを回収して、カラムに再度ロードした。次いで、６〜１０ｍＬの結合バッファでカラムを洗浄し、５ｍＬの溶出バッファ（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８）を用いて、結合した抗体をカラムから溶出させた。各画分には溶出された抗体１ｍＬが含まれ、画分１ｍＬあたり５０ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と混合することで、溶出画分を中性のｐＨに調節した。抗体を含有する画分をプールし、２ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回、１回あたり４時間透析を行った。バイオラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄに記載の手法に従って、抗体サンプル中のタンパク質濃度を測定した。
【００４５】
モノクローナル抗体による活性化ヒトＴ細胞の細胞死の誘導
活性化Ｔ細胞（以下を参照）を、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ培地に５×１０５細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁させ、コントロールＩｇ、ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６で処理した。
【００４６】
Ｔ細胞死誘導抗体が、移植片拒絶反応、自己免疫疾患およびアレルギーなどのＴ細胞関連疾患を治療するための治療剤として用いられうることは周知である。ヒトＴ細胞に対する３種のモノクローナル抗体を作製し、この３種のモノクローナル抗体の、活性化ヒトＴ細胞のアポトーシスの誘導能を評価した。ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により分泌されたモノクローナル抗体を含む培地の上清を、非活性化ヒトＴ細胞（０日目）またはインビトロ活性化ヒトＴ細胞（７日目）のいずれかとともに６時間インキュベートした。インキュベーション後、アネキシンＶで細胞を染色し、ＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ３陽性細胞をゲートでコントロールし、インビトロ活性化ヒトＴ細胞または休眠ヒトＴ細胞の計数を可能とした。アポトーシスを起こしている細胞はアネキシンＶ陽性であった。スキャンされた全Ｔ細胞のうち、アポトーシスを起こしたＴ細胞の百分率を表１に示す。予期せぬことに、ハイブリドーマ細胞系ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により分泌されたモノクローナル抗体は、インビトロ活性化ヒトＴ細胞の細胞死を誘導したが、非活性化ヒトＴ細胞には影響を与えなかった。活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するが休眠Ｔ細胞には影響を与えないというこの能力は、アポトーシス経路の独特な特徴であり、Ｔ細胞が関与する疾患を標的とする治療薬の主な特徴である。
【００４７】
【表１】
【００４８】
Ｔ細胞死誘導エピトープの同定
モノクローナル抗体ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により認識される、細胞死誘導エピトープを同定する目的で、これらのモノクローナル抗体を用いてポリペプチドライブラリ（Ｐｈ． Ｄ．−１２ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）におけるコンセンサス結合配列をスクリーニングした。当該ライブラリは、１２個のアミノ酸からなり４０６ａａＭ１３遺伝子３タンパク質に連結された種々のペプチドを含んでいた。０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）コーティングバッファ中で１０μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの抗体を用いて、４℃にて一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングした。洗浄後、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３（１５０μＬ／ウェル）を含むブロッキングバッファを用いて、４℃にて少なくとも１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。次いで、上述したポリペプチドライブラリ由来の融合タンパク質を種々の濃度で用いて、室温にて１時間、プレートをインキュベートした。０．５％トゥイーン含有ＴＢＳで洗浄後、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ含有０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）バッファを用いて、結合した融合タンパク質を溶出させ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を用いて中和した。次いで、溶出した融合タンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【００４９】
モノクローナル抗体ｍ１２８−９Ｆ９が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５０】
【化１】
【００５１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ１＝Ｙ／Ｗ／Ｈ／Ｍであり、Ｘ２＝Ｄであり、Ｘ３＝Ｓ／Ｆ／Ｐ／Ｅ／Ｈであり、Ｘ４＝任意のアミノ酸であり、Ｘ５＝Ｐ／Ｙ／Ｈ／Ｗである。
【００５２】
モノクローナル抗体ｍ１６６−４３Ｂ６が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５３】
【化２】
【００５４】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ６＝Ｄであり、Ｘ７＝Ｙ／Ｍ／Ｎ／Ｗ／Ｆであり、Ｘ８＝ＦまたはＬであり、Ｘ９＝Ｐであり、Ｘ１０＝Ｅである。
【００５５】
モノクローナル抗体ｍ１５２−１５Ａ７が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５６】
【化３】
【００５７】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ１１＝Ｐ／Ａであり、Ｘ１２＝Ｍであり、Ｘ１３＝Ｅ／Ｓであり、Ｘ１４＝Ｉである。
【００５８】
モノクローナル抗体により認識されるＴ細胞死誘導エピトープのＥＬＩＳＡアッセイ
上述したモノクローナル抗体により認識される細胞死エピトープの特異性を同定する目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。エピトープを含むポリペプチドの段階希釈系（０．００１７ｆｍｏｌ〜１７ｆｍｏｌ）を、ＥＬＩＳＡプレート上に予めコーティングされたｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７またはｍ１６６−４３Ｂ６とともにインキュベートして、それらの結合親和性を測定した。
【００５９】
１μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの抗体を用いて、４℃にて一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングした。ＰＢＳ（１５０μＬ／ウェル）中の０．２５％ＢＳＡを用いて、３７℃にて１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。次いで、種々のポリペプチドを含む融合タンパク質を用いて、室温にて２時間、プレートをインキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄後、融合パートナーに特異的な抗体を２μｇ／ｍＬで用いて、室温にて１．５時間プレートをインキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗浄した。次いで、５０μＬの１〜３０００倍希釈されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が共役した特異的ヤギ抗融合パートナー抗体を各ウェルに添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。５０μＬのＡＰ基質溶液（１錠のＡＰ基質錠を５ｍＬの基質バッファに溶解させた）を添加することにより、酵素反応を行った。その結果によれば、全ての選択されたポリペプチドが、選択に用いた対応する抗体に特異的に結合することが確認された。
【００６０】
他の実施形態
本明細書中に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられうる。本明細書に開示された各特徴は、同一の、均等の、または類似の目的を達成可能な他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明記しない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の均等なまたは類似の特徴の単なる一例である。
【００６１】
上記記載から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を理解可能であり、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修飾を加え、本発明を種々の用途および条件に適応させることが可能である。よって、他の実施形態もまた、本発明の技術的範囲に包含される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その内容が全体として参照により引用される、２００４年５月１１日に出願された米国仮出願第６０／５７０，１６１号の優先権を主張する。
【０００２】
背景
自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌の治療においては、望ましくない免疫反応の制御が重要である。過度に攻撃的なＴ細胞の活性は、免疫抑制によって、または免疫寛容の誘導によって、抑えられうる。免疫系の機能の適切な維持や、過度に攻撃的なＴ細胞のような望ましくない細胞の除去には、アポトーシスが関与していると考えられている（Ｋａｂｅｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４， ３３８−３４０； ａｎｄ Ｒａｆｆ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５６， ３９７−３９９）。
【発明の概要】
【０００３】
要約
本願は、Ｔ細胞死誘導エピトープに関する。当該エピトープは特に、当該エピトープに結合する化合物を選択するために用いられうる。かような化合物は、過度に攻撃的なＴ細胞が関与する疾患の治療に有用である。かような疾患の例としては、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌が挙げられる。
【０００４】
一形態において、本発明は、単離されたエピトープの３次元構造を特徴とする。活性化Ｔ細胞上の当該エピトープにリガンドが結合すると、当該活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。かようなエピトープは、以下により表される。
【０００５】
（１）Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）、ここで、
Ｘ１はＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２はＡｓｐであり；
Ｘ３はＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ５はＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである。
【０００６】
（２）Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号２）、ここで、
Ｘ６はＡｓｐであり；
Ｘ７はＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８はＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９はＰｒｏであり；
Ｘ１０はＧｌｕである。
【０００７】
（３）Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（配列番号３）、ここで、
Ｘ１１はＰｒｏであり；
Ｘ１２はＭｅｔであり；
Ｘ１３はＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４はＩｌｅである。
【０００８】
上述したこれらのエピトープはいずれも、例えばポリペプチド、２つのポリペプチドの相互作用領域、糖質部分、糖タンパク質、またはこれらの構造的、機能的な等価物でありうる。
【０００９】
他の形態において、本発明は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。活性化Ｔ細胞上の当該ポリペプチドにリガンドが結合すると、当該活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。一実施形態において、当該ポリペプチドは、４〜４００のアミノ酸を含む（例えば、４から４００の間の任意の整数、両端を含む）。例えば、当該ポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号２）、Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（配列番号３）、または配列番号４、６〜１８および２０〜２２のいずれかでありうる。
【００１０】
「単離されたエピトープ」または「単離されたポリペプチド」とは、天然に関連した分子を実質的に含まない、すなわち、乾燥重量で少なくとも７５％（例えば、７５％から１００％の間の任意の数、両端を含む）の純度を有することを意味する。純度は、適当な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定されうる。本発明の単離されたエピトープまたはポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学的手法により製造された自然源から精製されうる。
【００１１】
さらに他の形態において、本発明は、上述したエピトープの１つに結合する新規な化合物を特徴とする。当該化合物は、モノクローナル抗体などの抗体といった、任意の種類の分子でありうる。本発明の化合物は、本発明のエピトープを検出する目的、および活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で用いられうる。
【００１２】
抗体の製造方法もまた、本発明の技術的範囲に包含される。当該方法は、上述したエピトープ（例えば、ポリペプチド）の有効量を被験者に投与することを含む。当該抗体は、本発明のエピトープを検出する目的、または活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で用いられうる。
【００１３】
本発明はまた、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物（例えば、モノクローナル抗体）の同定方法をも特徴とする。当該方法は、試験化合物を本発明のエピトープと接触させること、および前記試験化合物が前記エピトープに結合するかどうかを決定することを含む。前記試験化合物が前記エピトープに結合したら、当該化合物は活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物である。
【００１４】
本発明はさらに、活性化Ｔ細胞を本発明の化合物と接触させることにより、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法を特徴とする。
【００１５】
さらに他の形態において、本発明は、製薬上許容できる担体、および、（１）ポリペプチドなどの本発明のエピトープ、または（２）前記エピトープに結合する化合物を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１６】
本発明は、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌といった、過度に攻撃的なＴ細胞が関与する疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の１つまたは２つ以上の実施形態の詳細を以下に記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、活性化Ｔ細胞のアポトーシスの誘導が可能であり、新規なＴ細胞死誘導エピトープの使用により活性化Ｔ細胞が減少しうるという予期せぬ発見に基づいている。
【００１８】
活性化Ｔ細胞を減少させることは、過剰な、または望ましくない、Ｔ細胞が媒介する免疫応答またはＴ細胞の増殖に関連した症状を治療するのに特に有用である。例えば、活性化Ｔ細胞が減少すると、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌に関与する望ましくないＴ細胞の活性または増殖が低下または消失しうる。
【００１９】
そこで、本発明は、単離されたエピトープの３次元構造を特徴とする。活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により、前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導される。当該エピトープは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４で表される。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４の３次元構造は、例えば、Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ３８：３３３２−４１およびＴｏｏｇｏｏｄ （２００２） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ４５： １５４３−５７に記載されているようなコンピュータモデリングプログラムを用いて決定されうる。構造的、機能的に等価なエピトープは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４の３次元構造に従って設計され、本技術分野において公知の手法を用いて調製され、後述する実施例に記載の手法などの手法によって、活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導に関与する活性を試験されうる。例えば、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｐａｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｇｅｎｅ ７３， ３０５−３１８； Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００３００４９２５２ Ａｌ； ＷＯ ０３／０１３６０３ Ａｌ； Ｏｓｂｏｒｎｅ （１９９６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２４５−２４８； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８， ５９８−６０３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７７， ３４８−３５０； Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５， ３２４３−３２４８； Ｍｏｌｌｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６， ３１８４−３１９０； ａｎｄ Ｇｒｉｂｂｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２， ８１１−８１５を参照。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「活性化Ｔ細胞」とは、非活性化Ｔ細胞よりも増殖頻度が多く、増殖速度が速く、または増殖の程度が高いＴ細胞を意味する。細胞の「死」としては、プログラム細胞死、すなわち、アポトーシスが挙げられる。ある剤による「細胞死の誘導」とは、当該剤で処理された細胞の集団が、処理されていない細胞の集団と比較して、死滅速度が速いことを意味する。例えば、アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析（後述する実施例を参照）により測定すると、モノクローナル抗体であるｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７またはｍ１６６−４３Ｂ６で処理した場合にアポトーシスを起こすインビトロの活性化Ｔ細胞の百分率は、処理していない細胞と比較して約２倍である。
【００２１】
本発明はまた、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０、またはＸ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドをも特徴とする。当該ポリペプチドは、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する化合物を同定するのに用いられうる。かような化合物が活性化Ｔ細胞の表面上に発現したポリペプチドに結合すると、細胞死が誘導される。さらに、遊離ポリペプチド（すなわち、細胞表面上に発現していないポリペプチド）は、内因性の細胞死誘導リガンドを求めて細胞表面のポリペプチドと競合することにより、望ましくない細胞死を阻害しうる。ポリペプチドの配列の長さは、その用途に応じて変動しうる。本発明のポリペプチドは、例えば、単離されたＴ細胞表面タンパク質、合成ポリペプチド、または組換えポリペプチドとして得られる。組換えポリペプチドを調製するには、当該ポリペプチドをコードする核酸を、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグ、またはＭ１３遺伝子３タンパク質などの融合パートナーをコードする他の核酸に連結すればよい。得られた融合核酸は、適切な宿主細胞中で融合タンパク質を発現し、当該タンパク質は標準的な手法により単離されうる。単離された融合タンパク質は、融合パートナーを除去し、本発明の組換えポリペプチドを得る目的で、例えば酵素消化によりさらに処理されうる。
【００２２】
本発明のエピトープまたはポリペプチドは、動物（抗体製造の目的）またはヒト（疾患治療の目的）において抗体を産生させるのに用いられうる。動物においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれらの断片を作製する手法は、本技術分野において公知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。「抗体」との語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄ， ｅｔ． ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ， ３４１， ５４４）などの、無傷の分子およびその断片を含む。これらの抗体は、例えばエピトープに結合する化合物を同定する際に、エピトープを検出するのに用いられうる（以下を参照）。活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導しうる抗体はまた、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌などの疾患を治療するのにも有用である。一般に、本発明のエピトープ（例えば、ポリペプチド）は、ＫＬＨなどのキャリアタンパク質と結合され、アジュバントと混合され、宿主動物に注射されうる。当該動物において製造された抗体は、次いでペプチドアフィニティクロマトグラフィにより精製されうる。一般的に用いられている宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが挙げられる。免疫応答を増強するのに用いられうる種々のアジュバントは宿主の種類に依存し、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられる。有用なヒトアジュバントとしては、ＢＣＧ（バシル カルメット−グエリン（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｌｉｎ））およびコリネバクテリウム パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。
【００２３】
免疫された被験者の血清中には、ポリクローナル抗体、抗体分子の混成集団が存在する。特定の抗原に対するモノクローナル抗体、抗体の混成集団は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製されうる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ５１１； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ２９２； ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）。特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５および米国特許第４，３７６，１１０号に記載のような培養下の連続継代細胞系、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４， ７２； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０， ２０２６）、並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）による抗体分子の製造を提供する任意の技術により得られる。かような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇｇＤおよびこれらの任意のサブクラスのいずれの免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されうる。インビボでモノクローナル抗体を高力価で産生しうるハイブリドーマによれば、特に有用な製造方法となる。
【００２４】
さらに、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術も、用いられうる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１， ６８５１； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６０４；およびＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体のような、異なる部位が異なる動物種由来である分子である。あるいは、単鎖抗体の製造のために開示されている技術を採用して、単鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリを製造してもよい。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖断片および軽鎖断片をアミノ酸架橋を介して連結することにより形成される。さらに、抗体断片は、公知の技術により製造されうる。例えば、かような断片としては、以下に制限されないが、抗体分子のペプシン消化により製造されるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより得られるＦａｂ断片が挙げられる。抗体はまた、本技術分野において公知の方法によりヒト化されうる。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は、商業的にヒト化されうる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ； ａｎｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。トランスジェニック動物で発現している抗体のような完全ヒト化抗体もまた、本発明の特徴である（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７， １３；並びに米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号を参照）。
【００２５】
本発明はさらに、本発明のエピトープに結合して活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する新規な化合物を特徴とする。かような化合物は、エピトープの３次元構造に従って、例えばコンピュータモデリングプログラムを用いて設計され、本技術分野において公知の手法を用いて合成されうる。当該化合物はまた、後述するライブラリスクリーニングによって同定されうる。
【００２６】
試験化合物は、本技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における膨大なアプローチのいずれかを用いて得られる。かようなライブラリとしては、ペプチドライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に耐性の新規な非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリ）、空間アドレス可能な並行固相または液相ライブラリ、デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）またはアフィニティクロマトグラフィ選択により得られる合成ライブラリ、「１ビーズ１化合物」ライブラリ、および抗体ライブラリが挙げられる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７， ２６７８−８５； Ｌａｍ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２， １４５； Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８４； ａｎｄ Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２， ７６７を参照。
【００２７】
分子ライブラリを合成する方法の例は、本技術分野において例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０， ６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１， １１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７， ２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３， ２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３， ２０６１； ａｎｄ Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７，１２３３に記載されている。
【００２８】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３， ４１２−４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４， ５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９， １８６５−１８６９）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７，６３７８−６３８２； Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２，３０１−３１０；および米国特許第５，２２３，４０９号）として提供されうる。
【００２９】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物を同定するには、本発明のエピトープを試験化合物と接触させ、当該化合物の前記エピトープへの結合を評価する。前記化合物がエピトープに結合すれば、当該化合物は活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補である。
【００３０】
スクリーニングアッセイは、種々の方法で行われうる。例えば、ある方法ではエピトープ（もしくはエピトープ含有分子、例えば、ポリペプチドもしくは融合タンパク質）または試験化合物を固相上に固定し、反応の終了時に当該固相上に形成されたエピトープ−試験化合物複合体を検出する。実際には、固相としてマイクロタイタープレートが簡便に用いられうる。アンカー成分は、非共有結合または共有結合によって固定化されうる。非共有結合は、単にアンカー成分の溶液で固相表面をコーティングし、プレートを乾燥させることにより、達成されうる。あるいは、前記アンカー成分に特異的な、固定化された抗体（例えば、モノクローナル抗体）が、アンカー成分を固相表面に固定化するのに用いられうる。アンカー成分でコーティングされた固相表面には、非アンカー成分が添加される。反応が完結したら、形成された複合体が固相表面上に固定化されたままでいるような条件下で、（例えば洗浄によって）非アンカー成分の未結合画分を除去する。かような複合体の検出は、多種の方法で達成されうる。非アンカー成分がプレラベル化されている場合には、固相表面上に固定化されたラベルが検出されれば、複合体が形成されたことが示される。非アンカー成分がプレラベル化されていない場合には、間接的なラベルを用いて、例えば、非アンカー成分に特異的な抗体（当該抗体は直接ラベル化されていてもよいし、ラベル化された抗Ｉｇ抗体を用いて間接的にラベル化されていてもよい）を用いて、固相上に形成された複合体を検出しうる。
【００３１】
あるいは、反応は液相中で行われうる。複合体は、例えばエピトープ（もしくはエピトープ含有分子）または試験化合物に特異的な固定化された抗体を用いて、未結合成分と分離される。当該複合体は次いで、例えば他の成分に特異的なラベル化抗体を用いて検出される。
【００３２】
候補化合物は、後述する実施例に記載の方法または本技術分野において公知の任意の他の方法を用いて、活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導能を評価することにより有効性が確認されうる。確認された化合物は、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する目的で、および自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌の治療などの疾患を治療する目的で、用いられうる。
【００３３】
本発明は、例えば活性化Ｔ細胞をインビトロで本発明の化合物に接触させることにより、または本発明の化合物の有効量をそれを必要とする被験者に投与することにより、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法を提供する。処置される被験者は、過剰なまたは望ましくないＴ細胞が媒介する免疫応答により特徴づけられる症状を示している、または示す危険があると判定されうる。例えば、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、アレルギー疾患、およびＴ細胞由来の癌に罹患した患者である。この方法は、単独で行われてもよいし、他の薬剤または治療法と組み合わせて行われてもよい。
【００３４】
「治療」という語は、障害、障害の兆候、障害に続発する疾患状態または障害の素因を治癒させ、緩和させ、軽減させ、修復させ、予防し、または改善させる目的での、被験者への組成物の投与として定義される。「有効量」は、処置された患者において、例えば上述したような医学的に望ましい結果を生み出すことができる組成物の量である。
【００３５】
治療される疾患の例としては、以下に制限されないが、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、および乾癬性関節炎など）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎など）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸管疾患、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬剤性発疹、ハンセン病の逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主病、骨髄移植、肝移植または任意の器官もしくは組織の移植などの移植のケース（同種異系または異種の組織を用いた移植など）、アトピー性アレルギーなどのアレルギー、エイズ（ＡＩＤＳ）、および白血病またはリンパ腫などのＴ細胞新生物が挙げられる。
【００３６】
１種のインビボアプローチでは、治療用組成物（例えば、本発明のエピトープ、本発明のポリペプチドまたは本発明の化合物）を被験者に投与する。一般的に、前記エピトープ、前記ポリペプチドまたは前記化合物は、製薬上許容できる担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口で、または静脈内注射により投与され、または皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻内に、胃内に、気管内に、もしくは肺内に注射され、または埋め込まれる。
【００３７】
必要な投与量は、投与経路の選択；製剤の性質；被験者の病気の性質；被験者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；他に投与される薬剤；および主治医の判断に依存する。適切な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。必要量における広範な変動は、入手可能な組成物が多様であることや、種々の投与経路の有効性が異なることからすると予想されるところである。例えば、経口投与では、静脈内注射と比べてより多くの投与量が必要と予想される。このような投与量レベルにおける変動は、本技術分野においてよく了解されているように、最適化のための標準的・経験的な手順を用いて補正されうる。適切な送達媒体（例えば、ポリマー性マイクロ粒子または埋め込み型装置）中へ組成物を封入すると、送達（特に、経口送達）の効率が向上しうる。
【００３８】
製薬上許容できる担体と、有効量の本発明の化合物とを含有する医薬組成物もまた、本発明の技術的範囲に包含される。当該医薬組成物は、上述した疾患の治療に用いられうる。製薬上許容できる担体としては、溶媒、懸濁媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、および等張性吸収遅延剤が挙げられる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、従来の方法を用いた異なる投与経路のための剤形に製剤化されうる。例えば、前記医薬組成物は、カプセル剤、ゲルシール剤、または経口投与用の錠剤として製剤化されうる。カプセル剤は、ゼラチンまたはセルロースなどの標準的な製薬上許容できる物質を含有しうる。錠剤は、組成物を固体状の担体および滑沢剤との混合物を圧縮することにより、従来の手法に従って製剤化されうる。固体状の担体の例としては、デンプンおよび糖ベントナイトが挙げられる。前記医薬組成物はまた、結合剤（例えば、乳糖またはマンニトール）、従来の充填剤、および錠剤化剤を含有する硬殻錠剤またはカプセルの形態で投与されうる。前記医薬組成物は、非経口経路を介して投与されうる。非経口の剤形の例としては、活性剤の水性溶液、等張食塩水もしくは５％ブドウ糖、または他の周知の製薬上許容できる賦形剤が挙げられる。シクロデキストリンまたは本技術分野の当業者に周知の他の可溶化剤が、治療剤の送達のための医薬賦形剤として用いられうる。
【００４０】
本発明の組成物の有効性は、インビトロおよびインビボの双方で評価されうる。例えば、後述する実施例を参照。簡潔に言えば、前記組成物は、インビトロで活性化Ｔ細胞の細胞死の誘導能を試験されうる。インビボ研究については、前記組成物は動物（例えば、マウスモデル）に注射され、次いでその治療効果が評価されうる。その結果に基づき、適切な投与量の範囲および投与経路が決定されうる。
【実施例】
【００４１】
下記の具体的な実施例は単に例示のためのものであって、開示の残部をいかようにも制限するものではないと解釈されるべきである。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、さらなる労力を必要とすることなく本発明を全ての範囲に亘って実施可能と考えられる。本明細書で引用した全ての文献は、その全体が参照により本明細書中に引用される。
【００４２】
マウス脾臓細胞懸濁液の調製
マウスの脾臓を８ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に浸漬させ、滅菌カバースリップを用いて優しく刻み、１５ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、２００×ｇで５分間スピンさせた。上清を捨て、壁を優しくタッピングして細胞ペレットを残ったバッファに再懸濁させた。１ｍＬの赤血球溶解バッファ（０．６Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．１７Ｍトリス塩基、ｐＨ７．６５）の添加により、混入した赤血球（ＲＢＣ）を溶解させ、次いで室温にて２分間インキュベートし、９ｍＬのＨＢＳＳを用いて高速クエンチした。２００×ｇで５分間細胞をペレット化し、２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。ヘモサイトメータ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）およびトリパンブルー色素排除法を用いて、混合液中の細胞の濃度および生存能力を測定した。
【００４３】
抗Ｔ細胞アポトーシス誘導モノクローナル抗体の調製
コンカナバリンＡ活性化ヒトＴ細胞でマウスを免疫することにより抗Ｔ細胞アポトーシス誘導モノクローナル抗体を産生させ、活性化ヒトＴ細胞に対するその結合能およびそれに続くＴ細胞のアポトーシスの誘導能をスクリーニングした。当該モノクローナル抗体の調製は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （（１９７６） Ｅｕｒｏ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ５１１−５１９）の周知の細胞融合方法に従って行い、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを製造した。かような方法に従って製造された３種のハイブリドーマはそれぞれ、ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、およびｍ１６６−４３Ｂ６と称され、インビトロでＴ細胞のアポトーシスを誘導可能なモノクローナル抗体を分泌した。
【００４４】
各ハイブリドーマの濃縮した培地の上清を２００００×ｇで１０分間スピンし、当該上清を結合バッファ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で１：１の比で希釈した。３〜５ｍＬの前記結合バッファでタンパク質Ｇカラム（体積倍量：約１ｍＬ）を３回洗浄した。透明な培地の上清を前記タンパク質Ｇカラムにロードし、フロースルーを回収して、カラムに再度ロードした。次いで、６〜１０ｍＬの結合バッファでカラムを洗浄し、５ｍＬの溶出バッファ（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８）を用いて、結合した抗体をカラムから溶出させた。各画分には溶出された抗体１ｍＬが含まれ、画分１ｍＬあたり５０ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と混合することで、溶出画分を中性のｐＨに調節した。抗体を含有する画分をプールし、２ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回、１回あたり４時間透析を行った。バイオラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄに記載の手法に従って、抗体サンプル中のタンパク質濃度を測定した。
【００４５】
モノクローナル抗体による活性化ヒトＴ細胞の細胞死の誘導
活性化Ｔ細胞（以下を参照）を、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ培地に５×１０５細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁させ、コントロールＩｇ、ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６で処理した。
【００４６】
Ｔ細胞死誘導抗体が、移植片拒絶反応、自己免疫疾患およびアレルギーなどのＴ細胞関連疾患を治療するための治療剤として用いられうることは周知である。ヒトＴ細胞に対する３種のモノクローナル抗体を作製し、この３種のモノクローナル抗体の、活性化ヒトＴ細胞のアポトーシスの誘導能を評価した。ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により分泌されたモノクローナル抗体を含む培地の上清を、非活性化ヒトＴ細胞（０日目）またはインビトロ活性化ヒトＴ細胞（７日目）のいずれかとともに６時間インキュベートした。インキュベーション後、アネキシンＶで細胞を染色し、ＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ３陽性細胞をゲートでコントロールし、インビトロ活性化ヒトＴ細胞または休眠ヒトＴ細胞の計数を可能とした。アポトーシスを起こしている細胞はアネキシンＶ陽性であった。スキャンされた全Ｔ細胞のうち、アポトーシスを起こしたＴ細胞の百分率を表１に示す。予期せぬことに、ハイブリドーマ細胞系ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により分泌されたモノクローナル抗体は、インビトロ活性化ヒトＴ細胞の細胞死を誘導したが、非活性化ヒトＴ細胞には影響を与えなかった。活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するが休眠Ｔ細胞には影響を与えないというこの能力は、アポトーシス経路の独特な特徴であり、Ｔ細胞が関与する疾患を標的とする治療薬の主な特徴である。
【００４７】
【表１】
【００４８】
Ｔ細胞死誘導エピトープの同定
モノクローナル抗体ｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７、またはｍ１６６−４３Ｂ６により認識される、細胞死誘導エピトープを同定する目的で、これらのモノクローナル抗体を用いてポリペプチドライブラリ（Ｐｈ． Ｄ．−１２ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）におけるコンセンサス結合配列をスクリーニングした。当該ライブラリは、１２個のアミノ酸からなり４０６ａａＭ１３遺伝子３タンパク質に連結された種々のペプチドを含んでいた。０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）コーティングバッファ中で１０μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの抗体を用いて、４℃にて一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングした。洗浄後、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３（１５０μＬ／ウェル）を含むブロッキングバッファを用いて、４℃にて少なくとも１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。次いで、上述したポリペプチドライブラリ由来の融合タンパク質を種々の濃度で用いて、室温にて１時間、プレートをインキュベートした。０．５％トゥイーン含有ＴＢＳで洗浄後、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ含有０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）バッファを用いて、結合した融合タンパク質を溶出させ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を用いて中和した。次いで、溶出した融合タンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【００４９】
モノクローナル抗体ｍ１２８−９Ｆ９が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５０】
【化１】
【００５１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ１＝Ｙ／Ｗ／Ｈ／Ｍであり、Ｘ２＝Ｄであり、Ｘ３＝Ｓ／Ｆ／Ｐ／Ｅ／Ｈであり、Ｘ４＝任意のアミノ酸であり、Ｘ５＝Ｐ／Ｙ／Ｈ／Ｗである。
【００５２】
モノクローナル抗体ｍ１６６−４３Ｂ６が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５３】
【化２】
【００５４】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ６＝Ｄであり、Ｘ７＝Ｙ／Ｍ／Ｎ／Ｗ／Ｆであり、Ｘ８＝ＦまたはＬであり、Ｘ９＝Ｐであり、Ｘ１０＝Ｅである。
【００５５】
モノクローナル抗体ｍ１５２−１５Ａ７が結合したポリペプチドの配列は、以下の通りである：
【００５６】
【化３】
【００５７】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４のコンセンサスポリペプチド配列が得られ、ここでＸ１１＝Ｐ／Ａであり、Ｘ１２＝Ｍであり、Ｘ１３＝Ｅ／Ｓであり、Ｘ１４＝Ｉである。
【００５８】
モノクローナル抗体により認識されるＴ細胞死誘導エピトープのＥＬＩＳＡアッセイ
上述したモノクローナル抗体により認識される細胞死エピトープの特異性を同定する目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。エピトープを含むポリペプチドの段階希釈系（０．００１７ｆｍｏｌ〜１７ｆｍｏｌ）を、ＥＬＩＳＡプレート上に予めコーティングされたｍ１２８−９Ｆ９、ｍ１５２−１５Ａ７またはｍ１６６−４３Ｂ６とともにインキュベートして、それらの結合親和性を測定した。
【００５９】
１μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの抗体を用いて、４℃にて一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングした。ＰＢＳ（１５０μＬ／ウェル）中の０．２５％ＢＳＡを用いて、３７℃にて１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。次いで、種々のポリペプチドを含む融合タンパク質を用いて、室温にて２時間、プレートをインキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄後、融合パートナーに特異的な抗体を２μｇ／ｍＬで用いて、室温にて１．５時間プレートをインキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗浄した。次いで、５０μＬの１〜３０００倍希釈されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が共役した特異的ヤギ抗融合パートナー抗体を各ウェルに添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。５０μＬのＡＰ基質溶液（１錠のＡＰ基質錠を５ｍＬの基質バッファに溶解させた）を添加することにより、酵素反応を行った。その結果によれば、全ての選択されたポリペプチドが、選択に用いた対応する抗体に特異的に結合することが確認された。
【００６０】
他の実施形態
本明細書中に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられうる。本明細書に開示された各特徴は、同一の、均等の、または類似の目的を達成可能な他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明記しない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の均等なまたは類似の特徴の単なる一例である。
【００６１】
上記記載から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を理解可能であり、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修飾を加え、本発明を種々の用途および条件に適応させることが可能である。よって、他の実施形態もまた、本発明の技術的範囲に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２がＡｓｐであり；
Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４が任意のアミノ酸であり；
Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、エピトープの３次元構造。
【請求項２】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２がＡｓｐであり；
Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４が任意のアミノ酸であり；
Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、ポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸の長さが５〜１５００である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸の長さが５〜１５０である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸の長さが５〜１５である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４および６〜１３からなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項１１】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項１２】
前記化合物が抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化Ｔ細胞を請求項８に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項２に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項８に記載の化合物、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ６がＡｓｐであり；
Ｘ７がＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８がＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９がＰｒｏであり；
Ｘ１０がＧｌｕである、エピトープの３次元構造。
【請求項１９】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ６がＡｓｐであり；
Ｘ７がＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８がＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９がＰｒｏであり；
Ｘ１０がＧｌｕである、ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸の長さが５〜１５００である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸の長さが５〜１５０である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸の長さが５〜１５である、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１４〜１８からなる群から選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項２８】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項２９】
前記化合物が抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
活性化Ｔ細胞を請求項２５に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項３２】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１９に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２５に記載の抗体、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１１がＰｒｏであり；
Ｘ１２がＭｅｔであり；
Ｘ１３がＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４がＩｌｅである、エピトープの３次元構造。
【請求項３６】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１１がＰｒｏであり；
Ｘ１２がＭｅｔであり；
Ｘ１３がＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４がＩｌｅである、ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸の長さが４〜１５００である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸の長さが４〜１５０である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸の長さが４〜１５である、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号２０〜２２からなる群から選択される、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項４３】
モノクローナル抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項４５】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項４６】
前記化合物が抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
活性化Ｔ細胞を請求項４２に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項４９】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
請求項３６に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
請求項４２に記載の抗体、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２がＡｓｐであり；
Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４が任意のアミノ酸であり；
Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、エピトープの３次元構造。
【請求項２】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１がＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＭｅｔであり；
Ｘ２がＡｓｐであり；
Ｘ３がＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ４が任意のアミノ酸であり；
Ｘ５がＰｒｏ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＴｒｐである、ポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸の長さが５〜１５００である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸の長さが５〜１５０である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸の長さが５〜１５である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４および６〜１３からなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項１１】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項１２】
前記化合物が抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化Ｔ細胞を請求項８に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項２に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項８に記載の化合物、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ６がＡｓｐであり；
Ｘ７がＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８がＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９がＰｒｏであり；
Ｘ１０がＧｌｕである、エピトープの３次元構造。
【請求項１９】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ６がＡｓｐであり；
Ｘ７がＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
Ｘ８がＰｈｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ９がＰｒｏであり；
Ｘ１０がＧｌｕである、ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸の長さが５〜１５００である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸の長さが５〜１５０である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸の長さが５〜１５である、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１４〜１８からなる群から選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項２８】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項２９】
前記化合物が抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
活性化Ｔ細胞を請求項２５に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項３２】
請求項１８に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１９に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２５に記載の抗体、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４で表される単離されたエピトープの３次元構造であって、活性化Ｔ細胞上の前記エピトープへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１１がＰｒｏであり；
Ｘ１２がＭｅｔであり；
Ｘ１３がＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４がＩｌｅである、エピトープの３次元構造。
【請求項３６】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含む単離されたポリペプチドであって、
活性化Ｔ細胞上の前記ポリペプチドへのリガンドの結合により前記活性化Ｔ細胞の細胞死が誘導され、
Ｘ１１がＰｒｏであり；
Ｘ１２がＭｅｔであり；
Ｘ１３がＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ１４がＩｌｅである、ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸の長さが４〜１５００である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸の長さが４〜１５０である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸の長さが４〜１５である、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号２０〜２２からなる群から選択される、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープに結合し、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する、抗体。
【請求項４３】
モノクローナル抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープの有効量を被験者に投与することを含む、抗体の製造方法。
【請求項４５】
活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補化合物の同定方法であって、化合物を請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープと接触させることを含み、前記化合物が前記エピトープに結合したら前記化合物が活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する候補であることを示す、同定方法。
【請求項４６】
前記化合物が抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がモノクローナル抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
活性化Ｔ細胞を請求項４２に記載の抗体と接触させることを含む、活性化Ｔ細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項４９】
請求項３５に記載の３次元構造を有するエピトープ、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
請求項３６に記載のポリペプチド、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
請求項４２に記載の抗体、および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【公開番号】特開２０１３−４９６７９（Ｐ２０１３−４９６７９Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２３６２７（Ｐ２０１２−２２３６２７）
【出願日】平成２４年１０月５日（２０１２．１０．５）
【分割の表示】特願２００７−５１３３０３（Ｐ２００７−５１３３０３）の分割
【原出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（５０９２８７９３５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２３６２７（Ｐ２０１２−２２３６２７）
【出願日】平成２４年１０月５日（２０１２．１０．５）
【分割の表示】特願２００７−５１３３０３（Ｐ２００７−５１３３０３）の分割
【原出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（５０９２８７９３５）
【Ｆターム（参考）】
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