アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法
【課題】 副生物の毒性が低く、コスト的に有利な、Ｓ体又はＲ体のβアミノ酸の選択的に製造する方法を提供すること。
【解決手段】Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とするバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とするバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）、及び、これらを利用してＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【解決手段】Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とするバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とするバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）、及び、これらを利用してＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｓ体又はＲ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法、及び、該方法に使用することの出来る、新規な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
βアミノ酸は、動物の蛋白質中に含まれていない非天然アミノ酸である。他の非天然アミノ酸と同じく、βアミノ酸についても医薬中間体としての需要が高まっており、種々の医薬品の一部に用いられつつある（Chimica OGGI/Chemistry today10, 15 (2002)）。
【０００３】
アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法としては、下記の３つの方法がすでに知られている。
（１）ペニシリンGアシラーゼ (Penicillin G acylase) を用いる方法
この方法は、最も一般的でV.A.Soloshonok et al., Tetrahedron, 6, 1601 (1995)など数多くある。３アミノ３フェニルプロピオン酸（以下βフェニルアラニンと称す）のラセミ体のアミノ基をフェニルアセチル化してから、ペニシリンGアシラーゼを用いて分割する方法で、R体が選択的に生成する。
この方法では、S体を選択的に生成させることはできないこと、光学純度が低いこと、フェニルアセチル基は分子量が大きいこと、副生するフェニル酢酸は毒性が高い物質の原料となる物質であること、アミノ基をフェニルアセチル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になることなどの問題があった。
【０００４】
【化１】
【０００５】
（２）ブタ腎臓由来アシラーゼ (Porcine kidney acylase I ) を用いる方法
WO2003080854A2（2003.10.2.公開、デグッサ社）又はGrayson & K. Drauz CHIMICA OGGI/chemistry today 10, 15 (2002)によれば、βフェニルアラニンのラセミ体のアミノ基をクロロアセチル化した後に、ブタ腎臓由来のアシラーゼを用いてNクロロアセチルβフェニルアラニンを酵素分割している。本方法では、S体が選択的に生成する。明細書の記載によれば、Nアセチルβフェニルアラニンを用いた場合は実質的に反応は起こっていない。
この方法では、R体を選択的に生成させることはできないこと、モノクロロ酢酸は環境的視点から好ましくないこと、アミノ基をクロロアセチル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になること、医薬原料製造のためには好ましからざる動物由来の酵素を用いる必要があることなどの問題があった。
【０００６】
【化２】
【０００７】
（３）グルタリル７−アミノセファロスポラン酸アシラーゼ (Glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase) を用いる方法
WO 03/020943 A2 (2003.3.13.公開、Aventis Pharma社)によれば、βフェニルアラニンのラセミ体のアミノ基をグルタリル化した後に、Glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylaseを用いてNグルタリルβフェニルアラニンを酵素分割している。本方法では、Ｒ体が選択的に生成する。
本方法では、Ｓ体を生成させることができないこと、グルタリル基の分子量が大きいこと、アミノ基をグルタリル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になること、などの問題点があった。
【０００８】
【化３】
【特許文献１】WO2003080854A2
【特許文献２】WO 03/020943 A2
【非特許文献１】V.A.Soloshonok et al., Tetrahedron, 6, 1601 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上、アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法について述べたが、通常のαアミノ酸については、S体、R体の分割を行うためにはアミノ基をアセチル化しておいてから、S選択的、または、R選択的のアシラーゼを用いて分割することが広く行われている。しかし、N-アセチルβアミノ酸については、αアミノ酸用のアシラーゼも含めて加水分解酵素は知られていなかった。
【００１０】
アセチル基は、アミノ酸を無水酢酸と反応させることだけで生成することができるので、アシル化には最も一般的に使用されているにもかかわらず、前述のように、βアミノ酸のアシル化に、フェニルアセチル化、クロロアセチル化、グルタリル化などが用いられてきたのは、N-アセチルを加水分解するアシラーゼが知られていなかったことによる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決することを目的として、鋭意研究の結果、N-アセチル基をS体特異的、または、R体特異的に加水分解することができる酵素を産生する新規な微生物を見出し、更に、これら微生物を利用して、S体又はR体のβアミノ酸を自由に製造することを確認し、これらに基づき本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
１．Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
２．Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、上記１記載のバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
３．受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９寄託されている菌株１１９Ｌ。
４．Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
５．Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、上記４および４−１記載のバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
６．受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８で寄託されている菌株１３０Ｆ。
７．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
８．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項１ないし３のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
９．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に上記４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約２５℃〜３０℃の範囲で作用させて、Ｓ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
１０．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に上記４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約７５℃〜８０℃の範囲で作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
１１．菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、上記８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、上記８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、N−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解し、Ｓ体又はＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生する菌体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に一態様に係るバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）は、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする。
本発明の別の態様に係るバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）は、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする。以下の実施例に示されるように、Ｓ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼの至適反応温度は約２５℃〜３０℃の範囲、好ましくは約３０℃付近であり、一方、Ｒ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼの至適反応温度は約７５℃〜８０℃の範囲、好ましくは約７５℃付近である、と考えられる。
【００１５】
ここで、Ｎ−アセチルβアミノ酸の種類に特に制限がなく、以下に示す構造式のものを用いることができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
式中、R1はそれぞれ置換基を有していてもよい炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数６〜１０のアリール基、炭素原子数７〜１１のアラルキル基、又はこれらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基を示す。R2は水素原子または水酸基を示す。中でも、Ｎ−アセチルβフェニルアラニンおよびその誘導体が好ましい。
【００１８】
本発明のバリオボラックス・スピーシーズの一例として、平成１６年７月２２日付けで、特許生物寄託センターに寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９が付与されている菌株１１９Ｌ（AJ 110348）を挙げることが出来る。
同様に、本発明のバークホルデリア・スピーシーズの一例として、平成１６年７月２２日付けで、特許生物寄託センターに寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８が付与されている菌株１３０Ｆ（AJ 110349）を挙げることが出来る。
これら菌株の菌学的性質は、本明細書中の実施例に詳細に記載されている。
【００１９】
本発明のバリオボラックス・スピーシーズを利用して、N−アセチルβアミノ酸のR体のみを選択的に加水分解し、（R）-βアミノ酸を生成させ、N−アセチル（S）βアミノ酸を残すことができる。また、本発明のバークホルデリア・スピーシーズを利用して、例えば、反応温度３０℃で反応させるとN−アセチルβアミノ酸のS体のみが加水分解し、（S）βアミノ酸が生成し、N−アセチル（R）βアミノ酸を残すことができる。一方、例えば、反応温度７５℃で反応させるとN−アセチルβアミノ酸のR体のみが加水分解し、（R）βアミノ酸が生成し、N−アセチル（S）βアミノ酸を残すことができる。尚、副生物としては酢酸が生じる。
N−アセチルβアミノ酸として、N−アセチルβフェニルアラニンを出発物質として使用した場合の反応を以下に示す。
【００２０】
【化５】
【００２１】
従って、本発明は、Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法にも係る。
該アシラーゼが本発明の所望の活性を有している限り、その由来及び調製方法等に特に制限はない。例えば、上記本発明の菌体により産生されるものであり、これは、該菌体から当業者に公知の任意の方法に調製することが可能である。又、該アシラーゼをコードする遺伝子（組み換え遺伝子を含む）により形質転換した適当な宿主細胞が産生するものを使用することも出来る。
【００２２】
本発明の製造方法において、各アシラーゼを作用させる様式、方法、及び条件等は、Ｎ−アセチルβアミノ酸の種類及び量、各アシラーゼの種類、製造規模等の諸要件に応じて、当業者に公知の任意のものを適宜選択することが出来る。
【００２３】
例えば、本発明の菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加したり、又は、該菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることが出来る。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００２５】
Ｎ−アセチル−ＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（Ac-β-Phe）の化学合成
Aldrich製β-Phe45.3gに水182mlを加え、氷冷下25%水酸化ナトリウム水溶液32mlを加えて溶解し、pH11.4に調整した。無水酢酸58mlを25%水酸化ナトリウム水溶液(約115ml)でpH11〜12に調整しながら滴下した。滴下後、反応液を40℃にしてpHを11〜12に調整しながら3.5時間撹拌した。反応終了後、不溶物をろ過により除きろ液を再度氷冷した。濃塩酸105mlを加えてpH2に調整し、2時間晶析した。析出した結晶を分離し、水100mlで洗浄した。40℃で減圧乾燥し、白色結晶のAc-β-Phe53.4g得た。収率94%
【００２６】
尚、以下の実施例において、TLC分析は、（MERCK製シリカゲル６０F２５４上で展開し（展開溶媒：ブタノール／酢酸／水＝４／１／２）、ニンヒドリンによる発色、または２５４ｎｍでの吸収により反応物を検出した。標準物質としては、上記記載の方法で調製したNアセチル-DL-β-Phe、Nアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-βPhe、渡辺化学工業製L-β-Phe（（R）-βPhe ）より上記と同様の方法で調製 ）、Nアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-β-Phe、渡辺化学工業製D-β-Phe（（S）-βPhe ）より上記と同様の方法で調製）、DL-β-Phe（Aldrich製）、L-β-Phe（（R）-βPhe、渡辺化学工業製）、D-β-Phe（（S）-β-Phe、渡辺化学工業製）を用いた。
【００２７】
実施例１：β‐Pheアミノアシラーゼの探索
Ac-β-Pheのアセチル基を光学特異的に加水分解できる酵素を産生する微生物のスクリーニングを以下の手順で行った。
【００２８】
β-Pheアミノアシラーゼ活性を有する微生物のスクリーニング：
化学合成したDL-β-PheのN-Acetyl誘導体を含む合成培地（硫酸アンモニユーム10.0g/l、KH2PO4 1.0 g/l、MgSO4・７H2O 0.4 g/l、FeSO4・７H2O 10 mg/l、MnSO4・5H2O 10 mg/l、ビタミンB1・HCl 0.2 mg/l、酵母エキス0.5 g/l、N-Acetyl- DL-β-Phe 5.0 g/l, pH8.0 ）に関東各地で採取した土壌サンプル200点を接種し、振とう培養を行い、微生物の生育が認められた培養液について酵素反応を行った。
【００２９】
酵素反応は、ｐH６．５の０．２Mリン酸バッファーに、Nアセチル-DL-β-Pheを１．０％溶解した液１部に対して、菌体懸濁液１部または菌体破砕液上清を１部混合し、３１．５℃で３時間反応させた。反応後に９０℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。反応液の分析は下記のようにTLC分析により行った。
【００３０】
その結果、４点の土壌からDL-β-PheのN-Acetyl誘導体からβ-Pheを生成する活性が認められた。この培養液から微生物を分離し、得られた微生物についてDL-β-Phe誘導体加水分解能を調べたところ、そのうちの２株（119L、130F）からβ-Pheアミノアシラーゼ活性を有する微生物を分離することに成功した。
【００３１】
これら２つの菌株の菌学上の分類は、NCIB Japan に委託して実施した、１６ＳｒＤＮＡ全塩基配列解析、並びに、それに基づく相同性検索及び近隣結合法による分子系統樹（MicroSeq Microbial Identification Systgeneem Software V.1.4.1 を使用し、相同性検索のデータベースとしてMicroSeq Microbial Full Library v.0001 (Applied Biosystems, CA, USA) を用いた）、更に、相同率１００％で一致する菌株が検索されない場合には、BLAST を用いたDNA塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL) に対する相同性検索により決定した。ここで、菌株119L及び130Fの１６ＳｒＤＮＡ全塩基配列を夫々、以下の表１（配列番号１）及び表２（配列番号２）に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
更に、NCIB Japan に委託して試験した結果得られた菌学的性質（形態学的性質及び生理性状学的性質）を以下の表３及び表４（菌株119L）、並びに、表５及び表６（菌株130F）に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】
【表６】
【００３９】
実施例２：β‐Pheアミノアシラーゼ活性の測定
バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）または、バークホルデリア・スピーシーズ（FERMＡＰ−２０１２８）を５００ｍｌ容量の坂口フラスコに張り込んだ２０ｍｌの培地（１％（NH4）２SO4、０．１％KH2PO4、０．０４％MgSO4・７H2O、１０ｐｐｍFeSO4・７H2O、１０ｐｐｍMnSO4・７H2O、０．２ｐｐｍビタミンB１塩酸塩、１％グルコース、０．１％NaCl、０．１％MES、０．２％カザミノ酸、０．５％Nアセチル-DL-β-Phe、ｐH７．０）に接種し、培養温度３１．５℃、１３５ｒｐｍ、２４時間または４８時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離（条件８０００ｐｐｍ×15分）により集菌した。菌体の一部をｐH６．５の０．２Mリン酸バッファーに懸濁し、超音波処理（出力３００W、３．５分、４℃）で細胞を破砕した。次に、遠心分離（条件８０００ｐｐｍ×15分）により、沈殿物を除去し、菌体破砕液上清とした。
【００４０】
このようにして得られた、菌体または菌体破砕液上清を用いて上記のように酵素反応及びＴＬＣ分析を行った。その結果、菌体及び菌体破砕後の上澄み液で酵素活性が確認された。これより、本酵素は菌体内酵素であると推定された。また、活性を示した酵素は生育培地にDL-β-Phe- N-Acetylの基質を含む培地にて培養を行った時にのみ生成が認められることから、本酵素は誘導酵素であると考えられる。以上の結果を図１に示す。
【００４１】
実施例３：β‐Pheアミノアシラーゼ活性の基質特異性の検討
Nアセチル-DL-β-Pheの代わりにNアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-βPhe ）またはNアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-β-Phe）を添加した系でも同様に酵素反応及びＴＬＣ分析を行った（図２）。
【００４２】
その結果、バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）は、Nアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-β-Phe）を選択的に加水分解し、L-β-Phe（（R）-β-Phe）を生成することがわかった。以上の結果を表７に示す。なお以下の表７以降に示すデータは全てＨＰＬＣで測定した。
【００４３】
【表７】
【００４４】
表７に示す如く、S-β-Pheについては、検出されずR-β-Pheのみが検出された。次に、至適ｐHについて調べた。結果を表８に示す。
【００４５】
【表８】
【００４６】
至適pHは７．５〜８．０であることがわかった。次に、至適反応温度について調べた。反応時間10分の結果を表９に示す。
【００４７】
【表９】
【００４８】
また、バークホルデリア・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８）は、３０℃で反応させるとNアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-βPhe ）を選択的に加水分解し、D-β-Phe（（S）-β-Phe）を生成することがわかった。結果を表１０に示す。
【００４９】
【表１０】
【００５０】
次に反応温度を変えて実験（反応時間１５分間）を行った。結果を表１１に示す。
【００５１】
【表１１】
【００５２】
反応温度３０℃以下では、S-β-Pheが選択的に生成するのに対して、反応温度７５℃以上ではR-β-Pheが選択的に生成した。
【００５３】
実施例４： βフェニルアラニンの誘導体に対する反応
βフェニルアラニンの誘導体についても実験を行った。以下のようにして、βフェニルアラニンの誘導体を、さらに対応するNアセチル体を調製した。
【００５４】
p-ブロモ-β-フェニルアラニンの合成
p-ブロモ-ベンズアルデヒド10.0g(54mmol)にエタノール/水（=95/5）100ml、酢酸アンモニウム8.3g(108mmol)、マロン酸11.2g(108mmol)を加えて80℃で加熱還流し17時間攪拌した。その後熱時ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥してp-ブロモ-β-フェニルアラニン8.3gを得た。（収率62.8%）
【００５５】
アセチル-p-ブロモ-β-フェニルアラニンの合成
p-ブロモ-β-フェニルアラニン10.0g(41mmol)に水40mlを加え、25%水酸化ナトリウム水溶液でpH14に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸8.5ml(90mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、室温で3時間攪拌した。濃塩酸でpH2に調整して1時間攪拌後、析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-p-ブロモ-β-フェニルアラニンを定量的に12.0g得た。
【００５６】
p-ニトロ-β-フェニルアラニンの合成
酢酸110mlに酢酸アンモニウム20.4g(264mmol)を加えて85℃に加熱した。酢酸アンモニウムが溶解したらp-ニトロ-ベンズアルデヒド20.0g(132mmol)、マロン酸27.8g(264mmol)を加えて90℃で加熱し5時間攪拌した。その後室温に戻してろ過し、母液に2-プロパノール300mlを加えた。析出した結晶をろ過した後、結晶をエタノール100mlでスラリー洗浄した。ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥してp-ニトロ-β-フェニルアラニン14.4gを得た。（収率52.0%)
【００５７】
アセチル-p-ニトロ-β-フェニルアラニンの合成
p-ニトロ-β-フェニルアラニン10.0g(48mmol)に水40mlを加え、25%水酸化ナトリウム水溶液でpH14に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸10.7ml(105mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、室温で1.5時間攪拌した。濃塩酸でpH2に調整して1時間攪拌後、析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-p-ニトロ-β-フェニルアラニン11.6gを得た。(収率96.9%)
【００５８】
3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニンの合成
ピペロナール7.5g(50mmol)にエタノール75ml、酢酸アンモニウム8.0g(100mmol)を加え40℃で攪拌して溶解させた。マロン酸10.5g(100mmol)を加え5時間加熱還流した。エタノールを減圧濃縮した後、水75ml、濃塩酸を加えpH2に調整して1時間攪拌した。析出した結晶を濾去した後、母液を25%水酸化ナトリウム水溶液でpH6に調整した。メタノール75mlを加えて一晩攪拌した。析出した結晶をろ過した後、結晶を2-プロパノール25mlでスラリー洗浄した。ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥して3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン4.6gを得た。（収率43.5%)
【００５９】
アセチル-3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン
3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン1.4g(7mmol)に水28mlを加え25%水酸化ナトリウム水溶液でpH12に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸1.6ml(17mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、40℃に加熱して2.5時間攪拌した。反応液をろ過後、母液を濃塩酸でpH2に調整して一晩攪拌した。析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン1.6gを得た。(収率94.0%)
【００６０】
これらの化合物のうち、Nアセチル体について実施例２記載と同様の方法で、バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）及びバークホルデリア・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８）と反応させたところ、β-フェニルアラニンの場合と同様な選択的な分解が起こることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法においては、出発物質として原料であるβアミノ酸をＮ−アセチル化した化合物を使用することができるので、従来の方法で使用したものと比べてコスト的に有利であり、更に、副生物として得られる酢酸は安全な物質であるので、環境的視点からも非常に好ましいものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】酵素反応によるN-Acetyl- DL-β-Pheからβ-Pheの生成（左：119L、右：130F）を示す電気泳動の写真である。1：DL-β-Phe 0.5 %溶液、2：N-Acetyl -DL-β-Phe 0.5 %溶液、3：反応液（酵素なし）、4：0時間、5：3時間
【図２】β‐Pheアミノアシラーゼの基質特異性（左：119L、右：130F）の結果を示す電気泳動の写真である。1：DL-β-Phe 0.5 %溶液、2： N-Acetyl -DL-β-Phe 0.5 %溶液、3： 反応前、4： D体反応液、5：D体0時間、6： D体3時間、7： L体反応液、8： L体0時間、9： L体3時間。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｓ体又はＲ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法、及び、該方法に使用することの出来る、新規な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
βアミノ酸は、動物の蛋白質中に含まれていない非天然アミノ酸である。他の非天然アミノ酸と同じく、βアミノ酸についても医薬中間体としての需要が高まっており、種々の医薬品の一部に用いられつつある（Chimica OGGI/Chemistry today10, 15 (2002)）。
【０００３】
アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法としては、下記の３つの方法がすでに知られている。
（１）ペニシリンGアシラーゼ (Penicillin G acylase) を用いる方法
この方法は、最も一般的でV.A.Soloshonok et al., Tetrahedron, 6, 1601 (1995)など数多くある。３アミノ３フェニルプロピオン酸（以下βフェニルアラニンと称す）のラセミ体のアミノ基をフェニルアセチル化してから、ペニシリンGアシラーゼを用いて分割する方法で、R体が選択的に生成する。
この方法では、S体を選択的に生成させることはできないこと、光学純度が低いこと、フェニルアセチル基は分子量が大きいこと、副生するフェニル酢酸は毒性が高い物質の原料となる物質であること、アミノ基をフェニルアセチル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になることなどの問題があった。
【０００４】
【化１】
【０００５】
（２）ブタ腎臓由来アシラーゼ (Porcine kidney acylase I ) を用いる方法
WO2003080854A2（2003.10.2.公開、デグッサ社）又はGrayson & K. Drauz CHIMICA OGGI/chemistry today 10, 15 (2002)によれば、βフェニルアラニンのラセミ体のアミノ基をクロロアセチル化した後に、ブタ腎臓由来のアシラーゼを用いてNクロロアセチルβフェニルアラニンを酵素分割している。本方法では、S体が選択的に生成する。明細書の記載によれば、Nアセチルβフェニルアラニンを用いた場合は実質的に反応は起こっていない。
この方法では、R体を選択的に生成させることはできないこと、モノクロロ酢酸は環境的視点から好ましくないこと、アミノ基をクロロアセチル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になること、医薬原料製造のためには好ましからざる動物由来の酵素を用いる必要があることなどの問題があった。
【０００６】
【化２】
【０００７】
（３）グルタリル７−アミノセファロスポラン酸アシラーゼ (Glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase) を用いる方法
WO 03/020943 A2 (2003.3.13.公開、Aventis Pharma社)によれば、βフェニルアラニンのラセミ体のアミノ基をグルタリル化した後に、Glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylaseを用いてNグルタリルβフェニルアラニンを酵素分割している。本方法では、Ｒ体が選択的に生成する。
本方法では、Ｓ体を生成させることができないこと、グルタリル基の分子量が大きいこと、アミノ基をグルタリル化することは単なるアセチル化よりもコスト高になること、などの問題点があった。
【０００８】
【化３】
【特許文献１】WO2003080854A2
【特許文献２】WO 03/020943 A2
【非特許文献１】V.A.Soloshonok et al., Tetrahedron, 6, 1601 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上、アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法について述べたが、通常のαアミノ酸については、S体、R体の分割を行うためにはアミノ基をアセチル化しておいてから、S選択的、または、R選択的のアシラーゼを用いて分割することが広く行われている。しかし、N-アセチルβアミノ酸については、αアミノ酸用のアシラーゼも含めて加水分解酵素は知られていなかった。
【００１０】
アセチル基は、アミノ酸を無水酢酸と反応させることだけで生成することができるので、アシル化には最も一般的に使用されているにもかかわらず、前述のように、βアミノ酸のアシル化に、フェニルアセチル化、クロロアセチル化、グルタリル化などが用いられてきたのは、N-アセチルを加水分解するアシラーゼが知られていなかったことによる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決することを目的として、鋭意研究の結果、N-アセチル基をS体特異的、または、R体特異的に加水分解することができる酵素を産生する新規な微生物を見出し、更に、これら微生物を利用して、S体又はR体のβアミノ酸を自由に製造することを確認し、これらに基づき本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
１．Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
２．Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、上記１記載のバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
３．受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９寄託されている菌株１１９Ｌ。
４．Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
５．Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、上記４および４−１記載のバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
６．受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８で寄託されている菌株１３０Ｆ。
７．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
８．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項１ないし３のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
９．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に上記４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約２５℃〜３０℃の範囲で作用させて、Ｓ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
１０．Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に上記４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約７５℃〜８０℃の範囲で作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
１１．菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、上記８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、上記８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、N−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解し、Ｓ体又はＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生する菌体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に一態様に係るバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）は、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする。
本発明の別の態様に係るバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）は、Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする。以下の実施例に示されるように、Ｓ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼの至適反応温度は約２５℃〜３０℃の範囲、好ましくは約３０℃付近であり、一方、Ｒ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼの至適反応温度は約７５℃〜８０℃の範囲、好ましくは約７５℃付近である、と考えられる。
【００１５】
ここで、Ｎ−アセチルβアミノ酸の種類に特に制限がなく、以下に示す構造式のものを用いることができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
式中、R1はそれぞれ置換基を有していてもよい炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数６〜１０のアリール基、炭素原子数７〜１１のアラルキル基、又はこれらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基を示す。R2は水素原子または水酸基を示す。中でも、Ｎ−アセチルβフェニルアラニンおよびその誘導体が好ましい。
【００１８】
本発明のバリオボラックス・スピーシーズの一例として、平成１６年７月２２日付けで、特許生物寄託センターに寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９が付与されている菌株１１９Ｌ（AJ 110348）を挙げることが出来る。
同様に、本発明のバークホルデリア・スピーシーズの一例として、平成１６年７月２２日付けで、特許生物寄託センターに寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８が付与されている菌株１３０Ｆ（AJ 110349）を挙げることが出来る。
これら菌株の菌学的性質は、本明細書中の実施例に詳細に記載されている。
【００１９】
本発明のバリオボラックス・スピーシーズを利用して、N−アセチルβアミノ酸のR体のみを選択的に加水分解し、（R）-βアミノ酸を生成させ、N−アセチル（S）βアミノ酸を残すことができる。また、本発明のバークホルデリア・スピーシーズを利用して、例えば、反応温度３０℃で反応させるとN−アセチルβアミノ酸のS体のみが加水分解し、（S）βアミノ酸が生成し、N−アセチル（R）βアミノ酸を残すことができる。一方、例えば、反応温度７５℃で反応させるとN−アセチルβアミノ酸のR体のみが加水分解し、（R）βアミノ酸が生成し、N−アセチル（S）βアミノ酸を残すことができる。尚、副生物としては酢酸が生じる。
N−アセチルβアミノ酸として、N−アセチルβフェニルアラニンを出発物質として使用した場合の反応を以下に示す。
【００２０】
【化５】
【００２１】
従って、本発明は、Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法にも係る。
該アシラーゼが本発明の所望の活性を有している限り、その由来及び調製方法等に特に制限はない。例えば、上記本発明の菌体により産生されるものであり、これは、該菌体から当業者に公知の任意の方法に調製することが可能である。又、該アシラーゼをコードする遺伝子（組み換え遺伝子を含む）により形質転換した適当な宿主細胞が産生するものを使用することも出来る。
【００２２】
本発明の製造方法において、各アシラーゼを作用させる様式、方法、及び条件等は、Ｎ−アセチルβアミノ酸の種類及び量、各アシラーゼの種類、製造規模等の諸要件に応じて、当業者に公知の任意のものを適宜選択することが出来る。
【００２３】
例えば、本発明の菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加したり、又は、該菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることが出来る。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００２５】
Ｎ−アセチル−ＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（Ac-β-Phe）の化学合成
Aldrich製β-Phe45.3gに水182mlを加え、氷冷下25%水酸化ナトリウム水溶液32mlを加えて溶解し、pH11.4に調整した。無水酢酸58mlを25%水酸化ナトリウム水溶液(約115ml)でpH11〜12に調整しながら滴下した。滴下後、反応液を40℃にしてpHを11〜12に調整しながら3.5時間撹拌した。反応終了後、不溶物をろ過により除きろ液を再度氷冷した。濃塩酸105mlを加えてpH2に調整し、2時間晶析した。析出した結晶を分離し、水100mlで洗浄した。40℃で減圧乾燥し、白色結晶のAc-β-Phe53.4g得た。収率94%
【００２６】
尚、以下の実施例において、TLC分析は、（MERCK製シリカゲル６０F２５４上で展開し（展開溶媒：ブタノール／酢酸／水＝４／１／２）、ニンヒドリンによる発色、または２５４ｎｍでの吸収により反応物を検出した。標準物質としては、上記記載の方法で調製したNアセチル-DL-β-Phe、Nアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-βPhe、渡辺化学工業製L-β-Phe（（R）-βPhe ）より上記と同様の方法で調製 ）、Nアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-β-Phe、渡辺化学工業製D-β-Phe（（S）-βPhe ）より上記と同様の方法で調製）、DL-β-Phe（Aldrich製）、L-β-Phe（（R）-βPhe、渡辺化学工業製）、D-β-Phe（（S）-β-Phe、渡辺化学工業製）を用いた。
【００２７】
実施例１：β‐Pheアミノアシラーゼの探索
Ac-β-Pheのアセチル基を光学特異的に加水分解できる酵素を産生する微生物のスクリーニングを以下の手順で行った。
【００２８】
β-Pheアミノアシラーゼ活性を有する微生物のスクリーニング：
化学合成したDL-β-PheのN-Acetyl誘導体を含む合成培地（硫酸アンモニユーム10.0g/l、KH2PO4 1.0 g/l、MgSO4・７H2O 0.4 g/l、FeSO4・７H2O 10 mg/l、MnSO4・5H2O 10 mg/l、ビタミンB1・HCl 0.2 mg/l、酵母エキス0.5 g/l、N-Acetyl- DL-β-Phe 5.0 g/l, pH8.0 ）に関東各地で採取した土壌サンプル200点を接種し、振とう培養を行い、微生物の生育が認められた培養液について酵素反応を行った。
【００２９】
酵素反応は、ｐH６．５の０．２Mリン酸バッファーに、Nアセチル-DL-β-Pheを１．０％溶解した液１部に対して、菌体懸濁液１部または菌体破砕液上清を１部混合し、３１．５℃で３時間反応させた。反応後に９０℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。反応液の分析は下記のようにTLC分析により行った。
【００３０】
その結果、４点の土壌からDL-β-PheのN-Acetyl誘導体からβ-Pheを生成する活性が認められた。この培養液から微生物を分離し、得られた微生物についてDL-β-Phe誘導体加水分解能を調べたところ、そのうちの２株（119L、130F）からβ-Pheアミノアシラーゼ活性を有する微生物を分離することに成功した。
【００３１】
これら２つの菌株の菌学上の分類は、NCIB Japan に委託して実施した、１６ＳｒＤＮＡ全塩基配列解析、並びに、それに基づく相同性検索及び近隣結合法による分子系統樹（MicroSeq Microbial Identification Systgeneem Software V.1.4.1 を使用し、相同性検索のデータベースとしてMicroSeq Microbial Full Library v.0001 (Applied Biosystems, CA, USA) を用いた）、更に、相同率１００％で一致する菌株が検索されない場合には、BLAST を用いたDNA塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL) に対する相同性検索により決定した。ここで、菌株119L及び130Fの１６ＳｒＤＮＡ全塩基配列を夫々、以下の表１（配列番号１）及び表２（配列番号２）に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
更に、NCIB Japan に委託して試験した結果得られた菌学的性質（形態学的性質及び生理性状学的性質）を以下の表３及び表４（菌株119L）、並びに、表５及び表６（菌株130F）に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】
【表６】
【００３９】
実施例２：β‐Pheアミノアシラーゼ活性の測定
バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）または、バークホルデリア・スピーシーズ（FERMＡＰ−２０１２８）を５００ｍｌ容量の坂口フラスコに張り込んだ２０ｍｌの培地（１％（NH4）２SO4、０．１％KH2PO4、０．０４％MgSO4・７H2O、１０ｐｐｍFeSO4・７H2O、１０ｐｐｍMnSO4・７H2O、０．２ｐｐｍビタミンB１塩酸塩、１％グルコース、０．１％NaCl、０．１％MES、０．２％カザミノ酸、０．５％Nアセチル-DL-β-Phe、ｐH７．０）に接種し、培養温度３１．５℃、１３５ｒｐｍ、２４時間または４８時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離（条件８０００ｐｐｍ×15分）により集菌した。菌体の一部をｐH６．５の０．２Mリン酸バッファーに懸濁し、超音波処理（出力３００W、３．５分、４℃）で細胞を破砕した。次に、遠心分離（条件８０００ｐｐｍ×15分）により、沈殿物を除去し、菌体破砕液上清とした。
【００４０】
このようにして得られた、菌体または菌体破砕液上清を用いて上記のように酵素反応及びＴＬＣ分析を行った。その結果、菌体及び菌体破砕後の上澄み液で酵素活性が確認された。これより、本酵素は菌体内酵素であると推定された。また、活性を示した酵素は生育培地にDL-β-Phe- N-Acetylの基質を含む培地にて培養を行った時にのみ生成が認められることから、本酵素は誘導酵素であると考えられる。以上の結果を図１に示す。
【００４１】
実施例３：β‐Pheアミノアシラーゼ活性の基質特異性の検討
Nアセチル-DL-β-Pheの代わりにNアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-βPhe ）またはNアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-β-Phe）を添加した系でも同様に酵素反応及びＴＬＣ分析を行った（図２）。
【００４２】
その結果、バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）は、Nアセチル-L-β-Phe（Nアセチル-（R）-β-Phe）を選択的に加水分解し、L-β-Phe（（R）-β-Phe）を生成することがわかった。以上の結果を表７に示す。なお以下の表７以降に示すデータは全てＨＰＬＣで測定した。
【００４３】
【表７】
【００４４】
表７に示す如く、S-β-Pheについては、検出されずR-β-Pheのみが検出された。次に、至適ｐHについて調べた。結果を表８に示す。
【００４５】
【表８】
【００４６】
至適pHは７．５〜８．０であることがわかった。次に、至適反応温度について調べた。反応時間10分の結果を表９に示す。
【００４７】
【表９】
【００４８】
また、バークホルデリア・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８）は、３０℃で反応させるとNアセチル-D-β-Phe（Nアセチル-（S）-βPhe ）を選択的に加水分解し、D-β-Phe（（S）-β-Phe）を生成することがわかった。結果を表１０に示す。
【００４９】
【表１０】
【００５０】
次に反応温度を変えて実験（反応時間１５分間）を行った。結果を表１１に示す。
【００５１】
【表１１】
【００５２】
反応温度３０℃以下では、S-β-Pheが選択的に生成するのに対して、反応温度７５℃以上ではR-β-Pheが選択的に生成した。
【００５３】
実施例４： βフェニルアラニンの誘導体に対する反応
βフェニルアラニンの誘導体についても実験を行った。以下のようにして、βフェニルアラニンの誘導体を、さらに対応するNアセチル体を調製した。
【００５４】
p-ブロモ-β-フェニルアラニンの合成
p-ブロモ-ベンズアルデヒド10.0g(54mmol)にエタノール/水（=95/5）100ml、酢酸アンモニウム8.3g(108mmol)、マロン酸11.2g(108mmol)を加えて80℃で加熱還流し17時間攪拌した。その後熱時ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥してp-ブロモ-β-フェニルアラニン8.3gを得た。（収率62.8%）
【００５５】
アセチル-p-ブロモ-β-フェニルアラニンの合成
p-ブロモ-β-フェニルアラニン10.0g(41mmol)に水40mlを加え、25%水酸化ナトリウム水溶液でpH14に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸8.5ml(90mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、室温で3時間攪拌した。濃塩酸でpH2に調整して1時間攪拌後、析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-p-ブロモ-β-フェニルアラニンを定量的に12.0g得た。
【００５６】
p-ニトロ-β-フェニルアラニンの合成
酢酸110mlに酢酸アンモニウム20.4g(264mmol)を加えて85℃に加熱した。酢酸アンモニウムが溶解したらp-ニトロ-ベンズアルデヒド20.0g(132mmol)、マロン酸27.8g(264mmol)を加えて90℃で加熱し5時間攪拌した。その後室温に戻してろ過し、母液に2-プロパノール300mlを加えた。析出した結晶をろ過した後、結晶をエタノール100mlでスラリー洗浄した。ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥してp-ニトロ-β-フェニルアラニン14.4gを得た。（収率52.0%)
【００５７】
アセチル-p-ニトロ-β-フェニルアラニンの合成
p-ニトロ-β-フェニルアラニン10.0g(48mmol)に水40mlを加え、25%水酸化ナトリウム水溶液でpH14に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸10.7ml(105mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、室温で1.5時間攪拌した。濃塩酸でpH2に調整して1時間攪拌後、析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-p-ニトロ-β-フェニルアラニン11.6gを得た。(収率96.9%)
【００５８】
3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニンの合成
ピペロナール7.5g(50mmol)にエタノール75ml、酢酸アンモニウム8.0g(100mmol)を加え40℃で攪拌して溶解させた。マロン酸10.5g(100mmol)を加え5時間加熱還流した。エタノールを減圧濃縮した後、水75ml、濃塩酸を加えpH2に調整して1時間攪拌した。析出した結晶を濾去した後、母液を25%水酸化ナトリウム水溶液でpH6に調整した。メタノール75mlを加えて一晩攪拌した。析出した結晶をろ過した後、結晶を2-プロパノール25mlでスラリー洗浄した。ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥して3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン4.6gを得た。（収率43.5%)
【００５９】
アセチル-3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン
3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン1.4g(7mmol)に水28mlを加え25%水酸化ナトリウム水溶液でpH12に調整した。5℃に冷却し、無水酢酸1.6ml(17mmol)と25％水酸化ナトリウム水溶液をpH11.5〜12の間に保つように同時滴下した後、40℃に加熱して2.5時間攪拌した。反応液をろ過後、母液を濃塩酸でpH2に調整して一晩攪拌した。析出した結晶をろ過、減圧乾燥してアセチル-3,4-(-O-CH2-O-)-β-フェニルアラニン1.6gを得た。(収率94.0%)
【００６０】
これらの化合物のうち、Nアセチル体について実施例２記載と同様の方法で、バリオボラックス・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９）及びバークホルデリア・スピーシーズ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８）と反応させたところ、β-フェニルアラニンの場合と同様な選択的な分解が起こることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法においては、出発物質として原料であるβアミノ酸をＮ−アセチル化した化合物を使用することができるので、従来の方法で使用したものと比べてコスト的に有利であり、更に、副生物として得られる酢酸は安全な物質であるので、環境的視点からも非常に好ましいものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】酵素反応によるN-Acetyl- DL-β-Pheからβ-Pheの生成（左：119L、右：130F）を示す電気泳動の写真である。1：DL-β-Phe 0.5 %溶液、2：N-Acetyl -DL-β-Phe 0.5 %溶液、3：反応液（酵素なし）、4：0時間、5：3時間
【図２】β‐Pheアミノアシラーゼの基質特異性（左：119L、右：130F）の結果を示す電気泳動の写真である。1：DL-β-Phe 0.5 %溶液、2： N-Acetyl -DL-β-Phe 0.5 %溶液、3： 反応前、4： D体反応液、5：D体0時間、6： D体3時間、7： L体反応液、8： L体0時間、9： L体3時間。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
【請求項２】
Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、請求項１記載のバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
【請求項３】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９で寄託されている菌株１１９Ｌ。
【請求項４】
Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
【請求項５】
Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、請求項４、請求項４−１記載のバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
【請求項６】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８で寄託されている菌株１３０Ｆ。
【請求項７】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項８】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項１ないし３のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項９】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約２５℃〜３０℃の範囲で作用させて、Ｓ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項１０】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約７５℃〜８０℃の範囲で作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項１１】
菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＲ体のβアミノ酸を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
【請求項２】
Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、請求項１記載のバリオボラックス・スピーシーズ（Variovorax sp.）。
【請求項３】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２９で寄託されている菌株１１９Ｌ。
【請求項４】
Ｎ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解することによりＳ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼ及びＲ体を選択的に生成する活性を有するアシラーゼを産生することを特徴とする、バークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
【請求項５】
Ｎ−アセチルβアミノ酸がＮ−アセチルβフェニルアラニンである、請求項４、請求項４−１記載のバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）。
【請求項６】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２８で寄託されている菌株１３０Ｆ。
【請求項７】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体にＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項８】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項１ないし３のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項９】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約２５℃〜３０℃の範囲で作用させて、Ｓ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項１０】
Ｎ−アセチルβアミノ酸のラセミ体に請求項４ないし６のいずれか一項に記載の菌体により産生されるＮ−アセチルβアミノ酸を不斉加水分解する活性を有するアシラーゼを約７５℃〜８０℃の範囲で作用させて、Ｒ体のβアミノ酸を選択的に製造する方法。
【請求項１１】
菌体の懸濁液中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
菌体の破砕液上清中にＮ−アセチルβアミノ酸のラセミ体を添加することにより該アシラーゼを作用させることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−４２７２２（Ｐ２００６−４２７２２Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３１３０６（Ｐ２００４−２３１３０６）
【出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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