アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解する新規微生物
【課題】アミノ−ｓ−トリアジン系化合物、特にメラミンやその水酸基置換体を完全分解する方法、及びこの分解方法に使用可能な新規な微生物の提供。
【解決手段】アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌、又は、当該細菌とベータプロテオバクテリアに属する細菌、ブラディリゾビウム属の細菌及びベータプロテオバクテリアに属する細菌を使用したメラミン、アンメリン、又はアンメリドであるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法、および、該細菌を有効成分として含有する微生物製剤。
【解決手段】アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌、又は、当該細菌とベータプロテオバクテリアに属する細菌、ブラディリゾビウム属の細菌及びベータプロテオバクテリアに属する細菌を使用したメラミン、アンメリン、又はアンメリドであるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法、および、該細菌を有効成分として含有する微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ−ｓ−トリアジン、特にメラミン、アンメリン及びアンメリドからなる群から選ばれる少なくとも1種の物質を分解する能力を有する新規なノカルディオイデス属に属する微生物及び当該微生物を含む複合微生物系に関し、さらに当該微生物又は当該複合微生物系を用いてアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓ−トリアジン系化合物は、炭素３、窒素３原子よりなる対称型のトリアジン環を基本骨格として持つ化合物の総称であり、樹脂、塗料、肥料、除草剤および殺菌剤等といった広範囲な用途に製造・利用されている。これらの物質は、環境中で比較的安定であり、使用に伴い環境中へ蓄積する。また、メラミン、アトラジン、およびシメトリン等のいくつかのｓ−トリアジン系化合物は環境省（旧環境庁）の「水環境保全に向けた取組のための要調査項目リスト（平成１０年６月５日報道発表）」にも挙げられている。
【０００３】
環境中に蓄積したｓ−トリアジン系化合物による被害例として、たとえば米国国内では、アトラジンの大量使用による飲料用地下水の汚染が報告されている。また、近年、メラミンが混入したペットフードを食べた犬や猫が腎不全を起こして死亡する事件、およびメラミンが混入したミルクを飲んだ乳幼児が腎臓結石を発症した事件等、人畜への健康被害例が多数報告されている。また、これらの健康被害はメラミン並びにその代謝物であるシアヌール酸との複合的な作用により生じるものと推定されている。このような点から、ｓ−トリアジン系化合物が肥料、飼料や食品に添加され、あるいは残存し、土壌や水域等の環境中に大量排出された場合、深刻な問題となる可能性がある。
【０００４】
ｓ−トリアジン系の化合物、特にメラミンおよびその水酸基置換体であるシアヌール酸は、他のｓ−トリアジン系化合物と比較して工業的に大量に製造されており、工業廃棄物に含まれ、また、難分解性であることから水域および土壌環境中に放出された場合、蓄積する可能性が高いといえる。
【０００５】
メラミンおよびその水酸基置換体を含むｓ−トリアジン化合物がいったん環境中に放出された場合には、これを回収して通常の化学反応によって分解するという方法は現実的ではない。そこで、環境中に放出されたこれらの化合物を微生物等により生分解する手段が試みられてきた。このような方法として、特許文献１には、メラミンの水溶液または懸濁液を嫌気条件下でメラミナーゼ活性を持つ微生物又は酵素剤に接触させることによってメラミンを生物学的に減成する方法が開示されている。また、特許文献２には、シュードモナス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることによってアンメリンまたはアンメリドをシアヌール酸に分解する方法が開示されている。特許文献３には、ロドコッカス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることにより塩素化トリアジンまたはヒドロキシトリアジンを対応するアンメリドへ生分解する方法が開示されている。さらに、特許文献４及び５には、トリアジン系農薬を好気条件下で分解する方法が開示されている。さらに、特許文献６にはアグロバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オクロバクトラム属、フィロバクテリウム属に属する菌株によりメラミンを分解する方法が示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの文献記載の細菌並びに方法は、メラミンをシアヌール酸に加水分解することができない、あるいはメラミンをシアヌール酸に分解するもののシアヌール酸を分解することができず、シアヌール酸が蓄積する、もしくは分解物の残存、残留が懸念される等の問題点がある。
【特許文献１】特開昭５４−１６３８９２
【特許文献２】特開昭５７−８６２９３
【特許文献３】特開昭６０−１１４１９１
【特許文献４】特開２００５−２７５３６
【特許文献５】特開２００７−６７１４
【特許文献６】特開２００７−２８２６３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、又は土壌中に含まれるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物、特にメラミンやその水酸基置換体を資化分解する方法、及びこの分解方法に使用可能な新規な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは水田土壌からアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌を単離して、本発明に到達した。この細菌は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析および菌学的性質から新規な細菌であった。この細菌は、単一の細菌でメラミンをアンメリン、アンメリドを経てシアヌール酸まで分解する能力があり、さらに、本菌株は、既知のシマジン分解細菌と共存培養した複合微生物系とすることにより、メラミンをシアヌール酸を経て完全に分解可能な能力を有していること、このような複合微生物系とすることでシアヌール酸分解速度の著しい向上が可能なことを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明は、次の［１］〜［１８］にある。
［１］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
［２］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである［１］記載の細菌。
［３］
ノカルディオイデス属の細菌が、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］又は［２］記載の細菌。
［４］
ノカルディオイデス属の細菌が、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株である［１］〜［３］の何れか１項に記載の細菌。
［５］
［１］〜［４］の何れか１項記載の細菌を有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための微生物製剤。
［６］
アミノ−ｓ−トリアジンン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである［５］記載の微生物製剤
［７］
［１］〜［４］の何れか１項記載の細菌と、１種類以上の共存菌とを、有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための複合微生物製剤。
［８］
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌を含む、［７］に記載の複合微生物製剤。
［９］
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌、
及び、次の（Ｅ）又は（Ｆ）：
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するブラディリゾビウム属の細菌を含む、［７］に記載の複合微生物製剤。
［１０］
ベータプロテオバクテリアに属する細菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株である、［８］又は［９］に記載の複合微生物製剤。
［１１］
ブラディリゾビウム属の細菌が、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株である、［９］又は［１０］に記載の複合微生物製剤。
［１２］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物がメラミン、アンメリン、又はアンメリドである［７］〜［１１］の何れか１項に記載の複合微生物製剤。
［１３］
［１］〜［４］の何れか１項に記載した細菌を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１４］
［５］〜［６］の何れか１項に記載した微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１５］
［７］〜［１２］の何れか１項に記載した複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１６］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［１］〜［４］の何れか１項に記載した細菌の使用。
［１７］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［５］〜［６］の何れか１項に記載した微生物製剤の使用。
［１８］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［７］〜［１２］の何れか１項に記載した複合微生物製剤の使用。
【００１０】
本発明は、上記細菌を含有する、微生物製剤、複合微生物製剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物製剤、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物製剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物触媒、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物触媒にも関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、及び土壌中に含まれるトリアジン系化合物、特にメラミン及びその水酸基置換体を速やかに分解することができる。さらに本発明の複合微生物を用いることにより広範囲な条件下で速やかに完全な分解が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を例示して、本発明を詳細に説明する。
本発明はアミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリドの分解能を有するノカルディオイデス属の細菌に関し、当該細菌を有効成分として含有するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物製剤にも関する。
【００１３】
好適な実施の態様において、本発明に係るノカルディオイデス属の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号１に記載する塩基配列、又はメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号１に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリド分解能を有するノカルディオイデス属の細菌とすることができる。
【００１４】
好適な実施の態様において、当該ノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌の具体例としては、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株が挙げられ、好ましくはノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）である。
【００１５】
また、本発明は、上述のノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌と、１種以上の共存菌とを含有してなる、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための複合微生物、及び複合微生物系にも関し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物製剤にも関する。このような複合微生物系又は複合微生物製剤とすることによって、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えて、その水酸基置換体化合物をも分解できるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００１６】
共存菌としては、シアヌール酸分解能を有する菌株やその生育を助ける菌株が挙げられる。好適な実施の一態様において、共存菌として、例えば、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌を含有させることができる。別な好適な実施の一態様において、共存菌として、例えば、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌に加えて、ブラディリゾビウム属細菌、ロドコッカス ロドクラウス、ノカルディオイデス ジェンセニ、ノカルディオイデス フルブス、ノカルディオイデス シンプレックス、シュードモナス エルギノーサ、及びスフィンゴモナス エスピーからなる群より選択された１種以上の細菌を含有させることができ、好ましくは、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌に加えて、ブラディリゾビウム属の細菌を含有させることができる。
【００１７】
好適な実施の態様において、本発明に係るベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号２に記載する塩基配列、又は複合微生物系のメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号２に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有するベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌とすることができる。ノカルディオイデス属に属する細菌に加えて、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌を含有してなる複合微生物系及び複合微生物製剤は、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えて、その水酸基置換体化合物をも分解できるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００１８】
好適な実施の態様において、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌として、ロドサイクラーレス科の細菌を挙げることができ、具体例としては、公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３年）６月１３日に寄託し、平成１７年（２００５年）８月２２日に国際寄託へ移管した； 国内寄託 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； 国際寄託 受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株が挙げられ、好ましくはベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）である。
【００１９】
好適な実施の態様において、本発明に係るブラディリゾビウム属の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号３に記載する塩基配列、又は複合微生物系のメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号３に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有するブラディリゾビウム属の細菌とすることができる。ブラディリゾビウム属の細菌を添加することによって、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌の生育を助けて、本発明に係る複合微生物系及び複合微生物製剤によるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００２０】
好適な実施の態様において、ブラディリゾビウム属に属する細菌の具体例としては、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３年）６月１３日に寄託し、平成１７年（２００５年）８月２２日に国際寄託へ移管した； 国内寄託 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 国際寄託 受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株が挙げられ、好ましくはブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）である。ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）は、シマジン分解菌として公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）の生育を助けて、本発明に係る複合微生物系及び複合微生物製剤によるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１の使用については、特開２００５−２７５３６号公報に記載されており、この記載を本明細書の一部として取り込む。
【００２１】
本発明において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物とは、次の式（Ｉ）：
【化１】
で表される化合物である。
式Ｉにおいて、Ｘ１は、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基であり、特に好ましくはアミノ基であり、
Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、水素原子、アルキル基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基である。
【００２２】
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロパン−１−イル基、プロパン−２−イル基（イソプロピル基）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはメチル基、エチル基、特に好ましくはメチル基を挙げることができる。
アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基を例示することができ、好ましくはメチルチオ基を挙げることができる。
アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロパン−１−イルアミノ基、プロパン−２−イルアミノ基（イソプロピルアミノ基）、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基を例示することができ、好ましくはエチルアミノ基を挙げることができる。
ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはジメチルアミノ基を挙げることができる。
アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロパン−１−イル基、アミノプロパン−２−イル（アミノイソプロピル基）、アミノイソブチル基、アミノｓｅｃ−ブチル基、アミノｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはアミノメチル基を挙げることができる。
ヒドロキシアルキルアミノ基としては、例えば、ヒドロキシメチルアミノ基、ヒドロキシエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはヒドロキシメチルアミノ基を挙げることができる。
ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、ビス（ヒドロキシメチル）アミノ基、ビス（ヒドロキシエチル）アミノ基を例示することができ、好ましくはビス（ヒドロキシメチル）アミノ基を挙げることができる。
ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子、好ましくは塩素原子を挙げることができる。
【００２３】
好適な実施の一態様において、Ｘ１はアミノ基とすることができ、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基、又は水素原子とすることができ、好ましくは、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、又は水素原子、さらに好ましくはアミノ基、水酸基、又は水素原子、さらに好ましくは、アミノ基又は水酸基とすることができる。
【００２４】
好適な実施の一態様において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物は、上記式Ｉにおいて、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がアミノ基である化合物（メラミン）、Ｘ１及びＸ２がアミノ基であり且つＸ３が水酸基である化合物（アンメリン）、Ｘ１がアミノ基であり且つＸ２及びＸ３が水酸基である化合物（アンメリド）とすることができる。
【００２５】
また、本発明は、アミノ−ｓ−トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及び当該細菌を有効成分として含有する微生物製剤を使用することによってアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解する方法にも関する。
【００２６】
また、本発明は、ノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌と、１種以上の共存菌とを有する複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法に関する。当該アミノ−ｓ−トリアジン系化合物としては、好ましくはメラミン、アンメリン、及びアンメリドを挙げることができる。このような複合微生物製剤は、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えてその水酸基置換体化合物をも分解することができるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の水素置換体化合物として、例えば、シアヌール酸が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の複合微生物製剤とは、アミノ−ｓ−トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の水酸基置換体の分解菌やその分解菌の生育を助ける菌を含んでいる製剤であればよく、当該複合微生物系の生育が許容される担体を含有していることが好ましい。当該担体としては、土壌、活性汚泥、培地、木炭、竹炭等が挙げられる。このような担体に、本発明に係る細菌類を添加、混合又は付着させて、飼料や肥料、土壌や水系に添加又は散布することによって、本発明に係る分解方法を、好適に実施することができる。
【００２８】
本発明のアミノ−ｓ−トリアジン、好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリド分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌には、下記の菌学的特徴を有するものが含まれる。
【００２９】
Ａ．形態学的性質（使用培地：Ｒ２Ａ寒天（ダイゴ、日本）、培養温度３０℃、培養時間４８時間）
（１） 細胞形態： 多形態桿菌
（２） 大きさ ： ０．８−１．０×２．０−４．０μｍ
（３） 胞子 ： −
（４） 運動性 ： −
【００３０】
Ｂ．コロニー形態（使用培地：Ｒ２Ａ寒天、培養温度３０℃、培養時間４８時間）
（１） コロニー直径：１．０ｍｍ以下
（２） 色調 ： クリーム色
（３） 形 ： 円形
（４） 隆起状態 ： 凸レンズ状
（５） 周縁 ： 全縁
（６） 表面の形状 ： スムーズ
（７） 透明度 ： 不透明
（８） 粘稠度 ： バター様
【００３１】
Ｃ．生理学的性質
（１） グラム染色 ： ＋（不定あり）
（２） ３７℃における生育 ： ＋
（３） ４５℃における生育 ： −
（４） カタラーゼ ： ＋
（５） オキシダーゼ ： −
（６） グルコースからの酸／ガス産生 ： −／−
（７） Ｏ／Ｆテスト ： −／−
（８） 嫌気条件下での生育 ： −
（９） 気菌糸の形成 ： −
（１０） 抗酸染色 ： −
【００３２】
Ｄ．生化学的性状試験（ビオメリュー製ＡＰＩ Ｃｏｒｙｎｅによる）
（１） 硝酸塩還元 ： −
（２） ピラジンアミダーゼ ： −
（３） ピロリドニルアリルアミダーゼ ： −
（４） アルカリフォスファターゼ ： −
（５） β−グルクロニダーゼ ： −
（６） β−ガラクトシダーゼ ： −
（７） α−グルコシダーゼ ： ＋
（８） Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ ： ＋
（９） エスクリン ： −
（１０） ウレアーゼ ： −
（１１） ゼラチン加水分解 ： −
（１２） グルコース資化性 ： −
（１３） リボース資化性 ： −
（１４） キシロース資化性 ： −
（１５） マンニトール資化性 ： −
（１６） マルトース資化性 ： −
（１７） 乳糖資化性 ： −
（１８） 白糖資化性 ： −
（１９） グリコーゲン資化性 ： −
【００３３】
対象とするアミノ−ｓ−トリアジン分解菌の具体的な例として新規分離菌株であるノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６がある。ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ． ＡＴＤ６」、受託番号「ＦERＭ Ｐ−２１７１０」として寄託されている
【００３４】
本発明者らは、後記する実施例１に記載の方法により、新規なアミノ−ｓ−トリアジン分解菌株ＡＴＤ６を見出した。この微生物が各アミノ−ｓ−トリアジンを分解するのに適した培地を実験的に検索したところ、次の表１に示した培地であることが判明した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
前記の表１中の微量元素溶液は、次の表２に示される組成からなるものである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
［実施例］
以下、本発明のメラミン分解菌の単離培養、分類同定、更に本発明分解菌及び本発明複合微生物系を用いたメラミンを始めとするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の実験例を示して、本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
実施例１メラミン分解菌の単離及び同定
発明者らは、以下の様にして、本発明に係わる新規メラミン分解菌ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６株を単離した。図１は、菌の集積に利用した還流装置の概略図である。土壌層タンク１に木質炭化素材を３ｇ、および日本国内の水田土壌を１ｇ入れ、さらにトリアジン系農薬分解関連菌として、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）、ロドコッカス ＳＰ． ＦＪ１１１７ＹＴ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５３５）等を接種した。５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、又は４０ｍｇ／Ｌのメラミンを炭素源及び窒素源として加えた滅菌済の表１に示す培地２００ｍｌを還流液として貯液タンク２から土壌層タンク１にポンプ３を用いて還流させた。
【００４０】
還流開始後の還流液中のメラミン濃度をＨＰＬＣで測定した。結果を図２に示す。図２は、菌の集積過程でのメラミン濃度の変遷を示す図である。図２の縦軸は還流液中のメラミン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示し、横軸は還流時間（日）を示す。図２の下向き矢印は還流液を全量、新鮮なものと交換した時点（還流液交換時期）を示す。図２で認められるように還流開始から２１日目以降、還流液中のメラミン濃度の減少が認められた。このメラミン濃度の速やかな減少は還流液の交換後も認められた。
【００４１】
そこで、表１に示す培地（メラミン濃度２０ｍｇ／Ｌ）が２０ｍｌ入った１００ｍｌ容三角フラスコに還流装置より取り出した還流液を１ｍｌ接種し、３０℃、２１０ｒｐｍで振とう培養を行ったところ、メラミン濃度の減少とアンメリン濃度の上昇が認められた。そこで培養液中のメラミン分解能を持つ細菌の構成比を上げることを目的として、培養液を限界希釈法により継代した。すなわち、培養液の１部を９倍量の培地で希釈し、さらにその希釈された培養液の１部を９倍量の培地で希釈するといった操作を繰り返し、１０の７乗倍まで段階希釈した各希釈系列から０．９ｍｌを新しい表１に示す培地２０ｍｌ（メラミン濃度１０ｍｇ／Ｌ、３９ｍｇ／Ｌ、又は５０ｍｇ／Ｌ）に接種し、２１０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。適宜ＨＰＬＣを用いて培養液中のメラミン濃度を測定し、メラミンの分解が認められた最も高い希釈系列を接種した培養液から培養液の一部を採取し同様の操作で希釈後植え継ぎを行った。上記操作を概ね１０日おきに３回繰り返した。
限界希釈法による継代培養操作を繰り返すことにより高次希釈の継代培養液においても速やかにメラミン濃度の減少が認められたことから、培養液中に存在するメラミン分解菌の構成比があがったと考えられたため、寒天培地を用いた単離作業に移行した。
【００４２】
すなわち、メラミンの分解が認められた培養液のうち、最も高い希釈系列を接種した培養液を前述の方法により１０の７乗倍まで段階希釈し、各希釈液をＲ２Ａ寒天培地（ＢＤ−Ｄｉｆｃｏ製）上にコンラージ棒を用いて１００μＬずつ塗布し３０℃で２日間静置培養した。寒天培地上に生じた単コロニーをニードルで釣菌し、表１に示す培地（メラミン濃度４０ｍｇ／Ｌ）１０ｍｌの入ったＬ字管に接種後、室温で振とう培養すると共に、新しいＲ２Ａ寒天培地に画線し、３０℃で静置培養した。ＨＰＬＣでＬ字管の培養液中のメラミン濃度を測定したところ、７日後にメラミン濃度の減少と共にアンメリン、アンメリド及びシアヌール酸濃度の上昇が認められた。しかし、まだ分解菌の単離が不十分であると考えられたため、Ｒ２Ａ寒天培地上に生じたメラミン分解能を持つコロニーを新しいＲ２Ａ寒天培地に塗布し培養後単コロニー分離を行った。この単コロニーの釣菌作業をさらに３回繰り返しコロニーを十分に純化した。純化した単コロニーについて、表１に示す培地（メラミン濃度２０ｍｇ／Ｌ）２０ｍｌの入った１００ｍｌ容三角フラスコに接種後、３０℃で旋回培養し、メラミンの分解が認められた株をメラミン分解菌の単離株とし、ＡＴＤ６株と名づけた。
【実施例２】
【００４３】
ＡＴＤ６株の菌学的検討
実施例１にて単離したＡＴＤ６株の菌学的位置づけを行うために、ＡＴＤ６株の形態学的性質、培地における生育の様相、生理学的性質、生化学的性状について分析を行った。その結果、次の菌学的性質が認められた。
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
【表５】
【００４７】
【表６】
【００４８】
結果を元にバージーのマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２（１９８４））に従って同定を行ったところ、本発明のＡＴＤ６株はｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ型細菌の一種であると推定された。ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ型細菌は多様な細菌群で、上記の菌学的性質の試験結果のみから本株を分類同定することは困難であった。そこで、以下の手順に則り、ＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を行った。
【００４９】
（１） ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてＡＴＤ６株の菌体からゲノムＤＮＡを調製した。
（２） 上記ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマー（Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ． ６３：２６１−２６８， ２００７）を用いてＰＣＲ法によりＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてＤＮＡを精製した。
（３） 上記精製ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして蛍光ラベルした公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析用プライマー（Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ． ６３：２６１−２６８， ２００７）を用いてサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサーＳＱ５５００Ｅ（日立製）により塩基配列を決定した。
以上の操作により決定されたＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列、１４７４塩基を配列番号１に示す。ジェネティクスＰＤＢ（ジェネティクス製）を用いて配列番号１に示したＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部分塩基配列と、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録された他の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列をＦＡＳＴＡ法により相同性比較を行った。その結果、ＡＴＤ６株はノカルディオイデス ニトロフェノリカス ＮＳＰ４１株と９６．４％、ノカルディオイデス シンプレックス ＡＴＣＣ１５７９９株と９６．１％の相同性を示した。しかし、ＡＴＤ６株は気菌糸を形成しないため、既知のノカルディオイデス属細菌の特徴と異なった。以上の結果より、発明者らは本菌株を新規なノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成２０年（２００８年）１０月２９日に受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０ として寄託した。
【実施例３】
【００５０】
ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、又はノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６を含む複合微生物系によるメラミンの分解
ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１をそれぞれ個別にＲ２Ａ寒天培地を用いて３０℃で平板培養し、表１に示す液体培地（メラミン濃度５ｍｇ／Ｌ）２０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃、２１０ｒｐｍ、暗所で旋回培養を行い、経時的にＨＰＬＣを用いてメラミン、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸の濃度を測定した。結果を図３に示す。図３は、実施例３におけるメラミン分解菌、複合微生物系によるメラミンの分解過程でのメラミン及びその代謝物の経時変化を示すグラフである。図３において、メラミン及び代謝物の濃度は標本数３の平均値を示し、ブランクは微生物を接種していないフラスコの結果を示す。ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６を単独で接種した培地ではメラミン濃度の減少と共にアンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸濃度の増加及び蓄積が認められた。一方、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６及びベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１を接種した培地ではメラミン濃度の減少に伴い、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸濃度が一旦上昇し、培養時間経過に伴い減少し、更には消失する様子が認められた。また、各物質が消失するまでの期間はブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１を共存させることにより短縮された。これらのことから、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１よりなる複合微生物系はメラミン、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸を完全分解する能力を持つことが判明した。ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１単独、又はベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１のみからなる複合微生物系はメラミンを分解しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、樹脂、塗料、肥料、除草剤および殺菌剤といった広範囲な用途に製造・利用されているメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解する新規な細菌、当該細菌を含む複合微生物系、当該細菌又は当該複合微生物系を用いたメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解する方法、を提供するものであり、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、土壌中に含まれるメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解して無害化し、資材や環境の浄化に寄与するものであり、混入物や残留物を除去して清浄な水や土壌を提供することを可能とするものであり、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は実施例１の新規メラミン分解菌の集積に利用した装置の概略図である。
【図２】図２は実施例１における新規メラミン分解菌の集積過程でのメラミン濃度の変動を示すグラフである。
【図３】図３は実施例３におけるメラミン分解菌、複合微生物系によるメラミンの分解過程でのメラミン及びその代謝物の経時変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５３】
１ 土壌層タンク
２ 還流液
３ ポンプ
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
［配列表の説明］
配列表の配列番号１は、本発明に係るノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（Nocardioides sp. ATD6）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４７４塩基である。
配列表の配列番号２は、本発明に係るベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（beta proteobacterium CDB21）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４８８塩基である。
配列表の配列番号３は、本発明に係るブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（Bradyrhizobium japonicum CSB1）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４６２塩基である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ−ｓ−トリアジン、特にメラミン、アンメリン及びアンメリドからなる群から選ばれる少なくとも1種の物質を分解する能力を有する新規なノカルディオイデス属に属する微生物及び当該微生物を含む複合微生物系に関し、さらに当該微生物又は当該複合微生物系を用いてアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓ−トリアジン系化合物は、炭素３、窒素３原子よりなる対称型のトリアジン環を基本骨格として持つ化合物の総称であり、樹脂、塗料、肥料、除草剤および殺菌剤等といった広範囲な用途に製造・利用されている。これらの物質は、環境中で比較的安定であり、使用に伴い環境中へ蓄積する。また、メラミン、アトラジン、およびシメトリン等のいくつかのｓ−トリアジン系化合物は環境省（旧環境庁）の「水環境保全に向けた取組のための要調査項目リスト（平成１０年６月５日報道発表）」にも挙げられている。
【０００３】
環境中に蓄積したｓ−トリアジン系化合物による被害例として、たとえば米国国内では、アトラジンの大量使用による飲料用地下水の汚染が報告されている。また、近年、メラミンが混入したペットフードを食べた犬や猫が腎不全を起こして死亡する事件、およびメラミンが混入したミルクを飲んだ乳幼児が腎臓結石を発症した事件等、人畜への健康被害例が多数報告されている。また、これらの健康被害はメラミン並びにその代謝物であるシアヌール酸との複合的な作用により生じるものと推定されている。このような点から、ｓ−トリアジン系化合物が肥料、飼料や食品に添加され、あるいは残存し、土壌や水域等の環境中に大量排出された場合、深刻な問題となる可能性がある。
【０００４】
ｓ−トリアジン系の化合物、特にメラミンおよびその水酸基置換体であるシアヌール酸は、他のｓ−トリアジン系化合物と比較して工業的に大量に製造されており、工業廃棄物に含まれ、また、難分解性であることから水域および土壌環境中に放出された場合、蓄積する可能性が高いといえる。
【０００５】
メラミンおよびその水酸基置換体を含むｓ−トリアジン化合物がいったん環境中に放出された場合には、これを回収して通常の化学反応によって分解するという方法は現実的ではない。そこで、環境中に放出されたこれらの化合物を微生物等により生分解する手段が試みられてきた。このような方法として、特許文献１には、メラミンの水溶液または懸濁液を嫌気条件下でメラミナーゼ活性を持つ微生物又は酵素剤に接触させることによってメラミンを生物学的に減成する方法が開示されている。また、特許文献２には、シュードモナス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることによってアンメリンまたはアンメリドをシアヌール酸に分解する方法が開示されている。特許文献３には、ロドコッカス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることにより塩素化トリアジンまたはヒドロキシトリアジンを対応するアンメリドへ生分解する方法が開示されている。さらに、特許文献４及び５には、トリアジン系農薬を好気条件下で分解する方法が開示されている。さらに、特許文献６にはアグロバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オクロバクトラム属、フィロバクテリウム属に属する菌株によりメラミンを分解する方法が示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの文献記載の細菌並びに方法は、メラミンをシアヌール酸に加水分解することができない、あるいはメラミンをシアヌール酸に分解するもののシアヌール酸を分解することができず、シアヌール酸が蓄積する、もしくは分解物の残存、残留が懸念される等の問題点がある。
【特許文献１】特開昭５４−１６３８９２
【特許文献２】特開昭５７−８６２９３
【特許文献３】特開昭６０−１１４１９１
【特許文献４】特開２００５−２７５３６
【特許文献５】特開２００７−６７１４
【特許文献６】特開２００７−２８２６３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、又は土壌中に含まれるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物、特にメラミンやその水酸基置換体を資化分解する方法、及びこの分解方法に使用可能な新規な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは水田土壌からアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌を単離して、本発明に到達した。この細菌は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析および菌学的性質から新規な細菌であった。この細菌は、単一の細菌でメラミンをアンメリン、アンメリドを経てシアヌール酸まで分解する能力があり、さらに、本菌株は、既知のシマジン分解細菌と共存培養した複合微生物系とすることにより、メラミンをシアヌール酸を経て完全に分解可能な能力を有していること、このような複合微生物系とすることでシアヌール酸分解速度の著しい向上が可能なことを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明は、次の［１］〜［１８］にある。
［１］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
［２］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである［１］記載の細菌。
［３］
ノカルディオイデス属の細菌が、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］又は［２］記載の細菌。
［４］
ノカルディオイデス属の細菌が、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株である［１］〜［３］の何れか１項に記載の細菌。
［５］
［１］〜［４］の何れか１項記載の細菌を有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための微生物製剤。
［６］
アミノ−ｓ−トリアジンン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである［５］記載の微生物製剤
［７］
［１］〜［４］の何れか１項記載の細菌と、１種類以上の共存菌とを、有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための複合微生物製剤。
［８］
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌を含む、［７］に記載の複合微生物製剤。
［９］
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌、
及び、次の（Ｅ）又は（Ｆ）：
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するブラディリゾビウム属の細菌を含む、［７］に記載の複合微生物製剤。
［１０］
ベータプロテオバクテリアに属する細菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株である、［８］又は［９］に記載の複合微生物製剤。
［１１］
ブラディリゾビウム属の細菌が、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株である、［９］又は［１０］に記載の複合微生物製剤。
［１２］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物がメラミン、アンメリン、又はアンメリドである［７］〜［１１］の何れか１項に記載の複合微生物製剤。
［１３］
［１］〜［４］の何れか１項に記載した細菌を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１４］
［５］〜［６］の何れか１項に記載した微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１５］
［７］〜［１２］の何れか１項に記載した複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
［１６］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［１］〜［４］の何れか１項に記載した細菌の使用。
［１７］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［５］〜［６］の何れか１項に記載した微生物製剤の使用。
［１８］
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための、［７］〜［１２］の何れか１項に記載した複合微生物製剤の使用。
【００１０】
本発明は、上記細菌を含有する、微生物製剤、複合微生物製剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物製剤、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物製剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解剤にも関し、さらに、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物触媒、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物触媒にも関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、及び土壌中に含まれるトリアジン系化合物、特にメラミン及びその水酸基置換体を速やかに分解することができる。さらに本発明の複合微生物を用いることにより広範囲な条件下で速やかに完全な分解が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を例示して、本発明を詳細に説明する。
本発明はアミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリドの分解能を有するノカルディオイデス属の細菌に関し、当該細菌を有効成分として含有するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用微生物製剤にも関する。
【００１３】
好適な実施の態様において、本発明に係るノカルディオイデス属の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号１に記載する塩基配列、又はメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号１に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリド分解能を有するノカルディオイデス属の細菌とすることができる。
【００１４】
好適な実施の態様において、当該ノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌の具体例としては、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株が挙げられ、好ましくはノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）である。
【００１５】
また、本発明は、上述のノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌と、１種以上の共存菌とを含有してなる、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための複合微生物、及び複合微生物系にも関し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物製剤にも関する。このような複合微生物系又は複合微生物製剤とすることによって、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えて、その水酸基置換体化合物をも分解できるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００１６】
共存菌としては、シアヌール酸分解能を有する菌株やその生育を助ける菌株が挙げられる。好適な実施の一態様において、共存菌として、例えば、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌を含有させることができる。別な好適な実施の一態様において、共存菌として、例えば、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌に加えて、ブラディリゾビウム属細菌、ロドコッカス ロドクラウス、ノカルディオイデス ジェンセニ、ノカルディオイデス フルブス、ノカルディオイデス シンプレックス、シュードモナス エルギノーサ、及びスフィンゴモナス エスピーからなる群より選択された１種以上の細菌を含有させることができ、好ましくは、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌に加えて、ブラディリゾビウム属の細菌を含有させることができる。
【００１７】
好適な実施の態様において、本発明に係るベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号２に記載する塩基配列、又は複合微生物系のメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号２に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有するベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌とすることができる。ノカルディオイデス属に属する細菌に加えて、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌を含有してなる複合微生物系及び複合微生物製剤は、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えて、その水酸基置換体化合物をも分解できるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００１８】
好適な実施の態様において、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌として、ロドサイクラーレス科の細菌を挙げることができ、具体例としては、公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３年）６月１３日に寄託し、平成１７年（２００５年）８月２２日に国際寄託へ移管した； 国内寄託 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； 国際寄託 受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株が挙げられ、好ましくはベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）である。
【００１９】
好適な実施の態様において、本発明に係るブラディリゾビウム属の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号３に記載する塩基配列、又は複合微生物系のメラミン、アンメリン、及びアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号３に記載された塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９６．５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を有するブラディリゾビウム属の細菌とすることができる。ブラディリゾビウム属の細菌を添加することによって、ベータプロテオバクテリアに属するシマジン分解細菌の生育を助けて、本発明に係る複合微生物系及び複合微生物製剤によるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。
【００２０】
好適な実施の態様において、ブラディリゾビウム属に属する細菌の具体例としては、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３年）６月１３日に寄託し、平成１７年（２００５年）８月２２日に国際寄託へ移管した； 国内寄託 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 国際寄託 受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株が挙げられ、好ましくはブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）である。ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）は、シマジン分解菌として公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）の生育を助けて、本発明に係る複合微生物系及び複合微生物製剤によるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１の使用については、特開２００５−２７５３６号公報に記載されており、この記載を本明細書の一部として取り込む。
【００２１】
本発明において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物とは、次の式（Ｉ）：
【化１】
で表される化合物である。
式Ｉにおいて、Ｘ１は、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基であり、特に好ましくはアミノ基であり、
Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、水素原子、アルキル基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基である。
【００２２】
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロパン−１−イル基、プロパン−２−イル基（イソプロピル基）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはメチル基、エチル基、特に好ましくはメチル基を挙げることができる。
アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基を例示することができ、好ましくはメチルチオ基を挙げることができる。
アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロパン−１−イルアミノ基、プロパン−２−イルアミノ基（イソプロピルアミノ基）、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基を例示することができ、好ましくはエチルアミノ基を挙げることができる。
ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはジメチルアミノ基を挙げることができる。
アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロパン−１−イル基、アミノプロパン−２−イル（アミノイソプロピル基）、アミノイソブチル基、アミノｓｅｃ−ブチル基、アミノｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはアミノメチル基を挙げることができる。
ヒドロキシアルキルアミノ基としては、例えば、ヒドロキシメチルアミノ基、ヒドロキシエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはヒドロキシメチルアミノ基を挙げることができる。
ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、ビス（ヒドロキシメチル）アミノ基、ビス（ヒドロキシエチル）アミノ基を例示することができ、好ましくはビス（ヒドロキシメチル）アミノ基を挙げることができる。
ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子、好ましくは塩素原子を挙げることができる。
【００２３】
好適な実施の一態様において、Ｘ１はアミノ基とすることができ、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基、又は水素原子とすることができ、好ましくは、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、又は水素原子、さらに好ましくはアミノ基、水酸基、又は水素原子、さらに好ましくは、アミノ基又は水酸基とすることができる。
【００２４】
好適な実施の一態様において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物は、上記式Ｉにおいて、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がアミノ基である化合物（メラミン）、Ｘ１及びＸ２がアミノ基であり且つＸ３が水酸基である化合物（アンメリン）、Ｘ１がアミノ基であり且つＸ２及びＸ３が水酸基である化合物（アンメリド）とすることができる。
【００２５】
また、本発明は、アミノ−ｓ−トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及び当該細菌を有効成分として含有する微生物製剤を使用することによってアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解する方法にも関する。
【００２６】
また、本発明は、ノカルディオイデス属に属するアミノ−ｓ−トリアジン分解菌と、１種以上の共存菌とを有する複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法に関する。当該アミノ−ｓ−トリアジン系化合物としては、好ましくはメラミン、アンメリン、及びアンメリドを挙げることができる。このような複合微生物製剤は、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えてその水酸基置換体化合物をも分解することができるために、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の完全な分解を促進することができる。アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の水素置換体化合物として、例えば、シアヌール酸が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の複合微生物製剤とは、アミノ−ｓ−トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及びアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の水酸基置換体の分解菌やその分解菌の生育を助ける菌を含んでいる製剤であればよく、当該複合微生物系の生育が許容される担体を含有していることが好ましい。当該担体としては、土壌、活性汚泥、培地、木炭、竹炭等が挙げられる。このような担体に、本発明に係る細菌類を添加、混合又は付着させて、飼料や肥料、土壌や水系に添加又は散布することによって、本発明に係る分解方法を、好適に実施することができる。
【００２８】
本発明のアミノ−ｓ−トリアジン、好ましくはメラミン、アンメリン、又はアンメリド分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌には、下記の菌学的特徴を有するものが含まれる。
【００２９】
Ａ．形態学的性質（使用培地：Ｒ２Ａ寒天（ダイゴ、日本）、培養温度３０℃、培養時間４８時間）
（１） 細胞形態： 多形態桿菌
（２） 大きさ ： ０．８−１．０×２．０−４．０μｍ
（３） 胞子 ： −
（４） 運動性 ： −
【００３０】
Ｂ．コロニー形態（使用培地：Ｒ２Ａ寒天、培養温度３０℃、培養時間４８時間）
（１） コロニー直径：１．０ｍｍ以下
（２） 色調 ： クリーム色
（３） 形 ： 円形
（４） 隆起状態 ： 凸レンズ状
（５） 周縁 ： 全縁
（６） 表面の形状 ： スムーズ
（７） 透明度 ： 不透明
（８） 粘稠度 ： バター様
【００３１】
Ｃ．生理学的性質
（１） グラム染色 ： ＋（不定あり）
（２） ３７℃における生育 ： ＋
（３） ４５℃における生育 ： −
（４） カタラーゼ ： ＋
（５） オキシダーゼ ： −
（６） グルコースからの酸／ガス産生 ： −／−
（７） Ｏ／Ｆテスト ： −／−
（８） 嫌気条件下での生育 ： −
（９） 気菌糸の形成 ： −
（１０） 抗酸染色 ： −
【００３２】
Ｄ．生化学的性状試験（ビオメリュー製ＡＰＩ Ｃｏｒｙｎｅによる）
（１） 硝酸塩還元 ： −
（２） ピラジンアミダーゼ ： −
（３） ピロリドニルアリルアミダーゼ ： −
（４） アルカリフォスファターゼ ： −
（５） β−グルクロニダーゼ ： −
（６） β−ガラクトシダーゼ ： −
（７） α−グルコシダーゼ ： ＋
（８） Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ ： ＋
（９） エスクリン ： −
（１０） ウレアーゼ ： −
（１１） ゼラチン加水分解 ： −
（１２） グルコース資化性 ： −
（１３） リボース資化性 ： −
（１４） キシロース資化性 ： −
（１５） マンニトール資化性 ： −
（１６） マルトース資化性 ： −
（１７） 乳糖資化性 ： −
（１８） 白糖資化性 ： −
（１９） グリコーゲン資化性 ： −
【００３３】
対象とするアミノ−ｓ−トリアジン分解菌の具体的な例として新規分離菌株であるノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６がある。ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ． ＡＴＤ６」、受託番号「ＦERＭ Ｐ−２１７１０」として寄託されている
【００３４】
本発明者らは、後記する実施例１に記載の方法により、新規なアミノ−ｓ−トリアジン分解菌株ＡＴＤ６を見出した。この微生物が各アミノ−ｓ−トリアジンを分解するのに適した培地を実験的に検索したところ、次の表１に示した培地であることが判明した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
前記の表１中の微量元素溶液は、次の表２に示される組成からなるものである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
［実施例］
以下、本発明のメラミン分解菌の単離培養、分類同定、更に本発明分解菌及び本発明複合微生物系を用いたメラミンを始めとするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の実験例を示して、本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
実施例１メラミン分解菌の単離及び同定
発明者らは、以下の様にして、本発明に係わる新規メラミン分解菌ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６株を単離した。図１は、菌の集積に利用した還流装置の概略図である。土壌層タンク１に木質炭化素材を３ｇ、および日本国内の水田土壌を１ｇ入れ、さらにトリアジン系農薬分解関連菌として、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９； ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）、ロドコッカス ＳＰ． ＦＪ１１１７ＹＴ（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５３５）等を接種した。５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、又は４０ｍｇ／Ｌのメラミンを炭素源及び窒素源として加えた滅菌済の表１に示す培地２００ｍｌを還流液として貯液タンク２から土壌層タンク１にポンプ３を用いて還流させた。
【００４０】
還流開始後の還流液中のメラミン濃度をＨＰＬＣで測定した。結果を図２に示す。図２は、菌の集積過程でのメラミン濃度の変遷を示す図である。図２の縦軸は還流液中のメラミン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示し、横軸は還流時間（日）を示す。図２の下向き矢印は還流液を全量、新鮮なものと交換した時点（還流液交換時期）を示す。図２で認められるように還流開始から２１日目以降、還流液中のメラミン濃度の減少が認められた。このメラミン濃度の速やかな減少は還流液の交換後も認められた。
【００４１】
そこで、表１に示す培地（メラミン濃度２０ｍｇ／Ｌ）が２０ｍｌ入った１００ｍｌ容三角フラスコに還流装置より取り出した還流液を１ｍｌ接種し、３０℃、２１０ｒｐｍで振とう培養を行ったところ、メラミン濃度の減少とアンメリン濃度の上昇が認められた。そこで培養液中のメラミン分解能を持つ細菌の構成比を上げることを目的として、培養液を限界希釈法により継代した。すなわち、培養液の１部を９倍量の培地で希釈し、さらにその希釈された培養液の１部を９倍量の培地で希釈するといった操作を繰り返し、１０の７乗倍まで段階希釈した各希釈系列から０．９ｍｌを新しい表１に示す培地２０ｍｌ（メラミン濃度１０ｍｇ／Ｌ、３９ｍｇ／Ｌ、又は５０ｍｇ／Ｌ）に接種し、２１０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。適宜ＨＰＬＣを用いて培養液中のメラミン濃度を測定し、メラミンの分解が認められた最も高い希釈系列を接種した培養液から培養液の一部を採取し同様の操作で希釈後植え継ぎを行った。上記操作を概ね１０日おきに３回繰り返した。
限界希釈法による継代培養操作を繰り返すことにより高次希釈の継代培養液においても速やかにメラミン濃度の減少が認められたことから、培養液中に存在するメラミン分解菌の構成比があがったと考えられたため、寒天培地を用いた単離作業に移行した。
【００４２】
すなわち、メラミンの分解が認められた培養液のうち、最も高い希釈系列を接種した培養液を前述の方法により１０の７乗倍まで段階希釈し、各希釈液をＲ２Ａ寒天培地（ＢＤ−Ｄｉｆｃｏ製）上にコンラージ棒を用いて１００μＬずつ塗布し３０℃で２日間静置培養した。寒天培地上に生じた単コロニーをニードルで釣菌し、表１に示す培地（メラミン濃度４０ｍｇ／Ｌ）１０ｍｌの入ったＬ字管に接種後、室温で振とう培養すると共に、新しいＲ２Ａ寒天培地に画線し、３０℃で静置培養した。ＨＰＬＣでＬ字管の培養液中のメラミン濃度を測定したところ、７日後にメラミン濃度の減少と共にアンメリン、アンメリド及びシアヌール酸濃度の上昇が認められた。しかし、まだ分解菌の単離が不十分であると考えられたため、Ｒ２Ａ寒天培地上に生じたメラミン分解能を持つコロニーを新しいＲ２Ａ寒天培地に塗布し培養後単コロニー分離を行った。この単コロニーの釣菌作業をさらに３回繰り返しコロニーを十分に純化した。純化した単コロニーについて、表１に示す培地（メラミン濃度２０ｍｇ／Ｌ）２０ｍｌの入った１００ｍｌ容三角フラスコに接種後、３０℃で旋回培養し、メラミンの分解が認められた株をメラミン分解菌の単離株とし、ＡＴＤ６株と名づけた。
【実施例２】
【００４３】
ＡＴＤ６株の菌学的検討
実施例１にて単離したＡＴＤ６株の菌学的位置づけを行うために、ＡＴＤ６株の形態学的性質、培地における生育の様相、生理学的性質、生化学的性状について分析を行った。その結果、次の菌学的性質が認められた。
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
【表５】
【００４７】
【表６】
【００４８】
結果を元にバージーのマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２（１９８４））に従って同定を行ったところ、本発明のＡＴＤ６株はｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ型細菌の一種であると推定された。ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ型細菌は多様な細菌群で、上記の菌学的性質の試験結果のみから本株を分類同定することは困難であった。そこで、以下の手順に則り、ＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を行った。
【００４９】
（１） ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてＡＴＤ６株の菌体からゲノムＤＮＡを調製した。
（２） 上記ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマー（Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ． ６３：２６１−２６８， ２００７）を用いてＰＣＲ法によりＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてＤＮＡを精製した。
（３） 上記精製ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして蛍光ラベルした公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析用プライマー（Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ． ６３：２６１−２６８， ２００７）を用いてサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサーＳＱ５５００Ｅ（日立製）により塩基配列を決定した。
以上の操作により決定されたＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列、１４７４塩基を配列番号１に示す。ジェネティクスＰＤＢ（ジェネティクス製）を用いて配列番号１に示したＡＴＤ６株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部分塩基配列と、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録された他の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列をＦＡＳＴＡ法により相同性比較を行った。その結果、ＡＴＤ６株はノカルディオイデス ニトロフェノリカス ＮＳＰ４１株と９６．４％、ノカルディオイデス シンプレックス ＡＴＣＣ１５７９９株と９６．１％の相同性を示した。しかし、ＡＴＤ６株は気菌糸を形成しないため、既知のノカルディオイデス属細菌の特徴と異なった。以上の結果より、発明者らは本菌株を新規なノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成２０年（２００８年）１０月２９日に受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０ として寄託した。
【実施例３】
【００５０】
ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、又はノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６を含む複合微生物系によるメラミンの分解
ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１をそれぞれ個別にＲ２Ａ寒天培地を用いて３０℃で平板培養し、表１に示す液体培地（メラミン濃度５ｍｇ／Ｌ）２０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃、２１０ｒｐｍ、暗所で旋回培養を行い、経時的にＨＰＬＣを用いてメラミン、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸の濃度を測定した。結果を図３に示す。図３は、実施例３におけるメラミン分解菌、複合微生物系によるメラミンの分解過程でのメラミン及びその代謝物の経時変化を示すグラフである。図３において、メラミン及び代謝物の濃度は標本数３の平均値を示し、ブランクは微生物を接種していないフラスコの結果を示す。ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６を単独で接種した培地ではメラミン濃度の減少と共にアンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸濃度の増加及び蓄積が認められた。一方、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６及びベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１を接種した培地ではメラミン濃度の減少に伴い、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸濃度が一旦上昇し、培養時間経過に伴い減少し、更には消失する様子が認められた。また、各物質が消失するまでの期間はブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１を共存させることにより短縮された。これらのことから、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１、及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１よりなる複合微生物系はメラミン、アンメリン、アンメリド、及びシアヌール酸を完全分解する能力を持つことが判明した。ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１単独、又はベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１及びブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１のみからなる複合微生物系はメラミンを分解しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、樹脂、塗料、肥料、除草剤および殺菌剤といった広範囲な用途に製造・利用されているメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解する新規な細菌、当該細菌を含む複合微生物系、当該細菌又は当該複合微生物系を用いたメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解する方法、を提供するものであり、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、土壌中に含まれるメラミンを主とするアミノトリアジン系化合物を分解して無害化し、資材や環境の浄化に寄与するものであり、混入物や残留物を除去して清浄な水や土壌を提供することを可能とするものであり、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は実施例１の新規メラミン分解菌の集積に利用した装置の概略図である。
【図２】図２は実施例１における新規メラミン分解菌の集積過程でのメラミン濃度の変動を示すグラフである。
【図３】図３は実施例３におけるメラミン分解菌、複合微生物系によるメラミンの分解過程でのメラミン及びその代謝物の経時変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５３】
１ 土壌層タンク
２ 還流液
３ ポンプ
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
［配列表の説明］
配列表の配列番号１は、本発明に係るノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（Nocardioides sp. ATD6）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４７４塩基である。
配列表の配列番号２は、本発明に係るベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（beta proteobacterium CDB21）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４８８塩基である。
配列表の配列番号３は、本発明に係るブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（Bradyrhizobium japonicum CSB1）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４６２塩基である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
【請求項２】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ノカルディオイデス属の細菌が、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】
ノカルディオイデス属の細菌が、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株である請求項１〜３の何れか１項に記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項記載の細菌を有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための微生物製剤。
【請求項６】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項５記載の微生物製剤
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項記載の細菌と、１種類以上の共存菌とを、有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための複合微生物製剤。
【請求項８】
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌を含む、請求項７に記載の複合微生物製剤。
【請求項９】
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌、
及び、次の（Ｅ）又は（Ｆ）：
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するブラディリゾビウム属の細菌を含む、請求項７に記載の複合微生物製剤。
【請求項１０】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株である、請求項８又は９に記載の複合微生物製剤。
【請求項１１】
ブラディリゾビウム属の細菌が、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株である、請求項９又は１０に記載の複合微生物製剤。
【請求項１２】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物がメラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項７〜１１の何れか１項に記載の複合微生物製剤。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１項に記載した細菌を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【請求項１４】
請求項５〜６の何れか１項に記載した微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【請求項１５】
請求項７〜１２の何れか１項に記載した複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【請求項１】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
【請求項２】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ノカルディオイデス属の細菌が、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】
ノカルディオイデス属の細菌が、ノカルディオイデス ｓｐ． ＡＴＤ６（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）又はその変異株である請求項１〜３の何れか１項に記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項記載の細菌を有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための微生物製剤。
【請求項６】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物が、メラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項５記載の微生物製剤
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項記載の細菌と、１種類以上の共存菌とを、有効成分として含有する、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解のための複合微生物製剤。
【請求項８】
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌を含む、請求項７に記載の複合微生物製剤。
【請求項９】
共存菌として、次の（Ｃ）又は（Ｄ）：
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するベータプロテオバクテリアに属する細菌、
及び、次の（Ｅ）又は（Ｆ）：
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるDNA
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するDNA、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するブラディリゾビウム属の細菌を含む、請求項７に記載の複合微生物製剤。
【請求項１０】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９５；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０３）又はその変異株である、請求項８又は９に記載の複合微生物製剤。
【請求項１１】
ブラディリゾビウム属の細菌が、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３９４； 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４０２）又はその変異株である、請求項９又は１０に記載の複合微生物製剤。
【請求項１２】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物がメラミン、アンメリン、又はアンメリドである請求項７〜１１の何れか１項に記載の複合微生物製剤。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１項に記載した細菌を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【請求項１４】
請求項５〜６の何れか１項に記載した微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【請求項１５】
請求項７〜１２の何れか１項に記載した複合微生物製剤を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１３０９６５（Ｐ２０１０−１３０９６５Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１１３１８（Ｐ２００８−３１１３１８）
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（５０１２４５４１４）独立行政法人農業環境技術研究所 (60)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（５０１２４５４１４）独立行政法人農業環境技術研究所 (60)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
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