クチナシ赤色素およびその製造方法
【課題】赤味が強く鮮やかな色調の飲食品を製造できる新規なクチナシ赤色素を提供すること、さらにそのようなクチナシ赤色素をより高収率で製造する方法を提供すること。
【解決手段】イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（例えば、ゲニポシド酸など）、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０の範囲に含まれるタンパク質加水分解物（例えば、全窒素量当りのアミノ基量が４０．７の市販の小麦タンパク質加水分解物など）および有機酸（例えば、クエン酸など）を含有する水溶液を調製し、該水溶液にβ−グルコシダーゼを添加して酵素的加水分解反応する。これにより、分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上である新規なクチナシ赤色素が得られる。
【解決手段】イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（例えば、ゲニポシド酸など）、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０の範囲に含まれるタンパク質加水分解物（例えば、全窒素量当りのアミノ基量が４０．７の市販の小麦タンパク質加水分解物など）および有機酸（例えば、クエン酸など）を含有する水溶液を調製し、該水溶液にβ−グルコシダーゼを添加して酵素的加水分解反応する。これにより、分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上である新規なクチナシ赤色素が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クチナシ赤色素およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クチナシ赤色素は、中性域（ｐＨ６．０以上８．０以下）で赤色を呈し、熱や光に対して比較的安定であることから、中性域の液性を有する食品に対する赤色系着色料として主に利用されている。一般にクチナシ赤色素は、クチナシ果実抽出物等に含まれるイリドイド配糖体のエステル加水分解物をβ−グルコシダーゼにより酵素処理することにより製造される。
【０００３】
クチナシ赤色素の製造方法としては、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位に−ＣＯＯＨ基を持つ物質、または−ＣＯＯＣＨ３基を持つ物質からエステルの加水分解により得た物質、あるいはそれらを含有する物質と一級アミノ基含有物質とを酸性条件下で作用せしめて反応させることを特徴とする赤色系色素組成物の製造方法（特許文献１参照）、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（Ａ）を、物質（Ａ）に対して２モル当量以上のクエン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、アジピン酸、フマル酸、アスコルビン酸及びエリソルビン酸からなる群から選ばれる有機酸及び物質（Ａ）に対して０．７モル当量以上のアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はこれらの塩をpH３〜６の範囲で反応させることを特徴とする明色化した赤色色素の製造方法（特許文献２参照）、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質および第一級アミノ基含有物質とを五炭糖の存在下、酸性条件下で反応させることを特徴とするクチナシ赤色系色素の製造方法（特許文献３参照）などが知られている。また、実験室的製法として、イリドイド配糖体のエステル加水分解物のアグリコンとα−アラニンをクエン酸の存在下かつアルゴンガス雰囲気下で作用させる方法（非特許文献１参照）などが知られている。
【０００４】
しかし、近年、クチナシ赤色素のユーザーのニーズが多様化しており、より赤味が強く鮮やかな色調の飲食品を製造できるクチナシ赤色素が求められている。さらに、従来の製造方法では、色素の収率が十分に高いものであるとは必ずしも言えないため、クチナシ赤色素をより高収率で製造する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭５５−５７７８号公報
【特許文献２】特許第２８０２４５１号公報
【特許文献３】特許第２８７３５１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔｏｍｅ Ｎ，外３名，「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｄ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，ｖｏｌ．３９，ｎｏ．４，ｐ．３４５−３５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、赤味が強く鮮やかな色調の飲食品を製造できる新規なクチナシ赤色素を提供すること、さらにそのようなクチナシ赤色素をより高収率で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質を特定の性質を有するタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理を行うことによって、得られるクチナシ赤色素の色価が十分に高まることを見いだした。さらに、このようにして得られたクチナシ赤色素は、分子量に着目すれば従来の製造方法では得られない新規なものであり、かつ従来のクチナシ赤色素よりも色調的に鮮やかであることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上であることを特徴とするクチナシ赤色素、
（２）イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質をタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むクチナシ赤色素の製造方法であって、該タンパク質加水分解物が下記式（１）を満たすクチナシ赤色素の製造方法、
からなっている。
【０００９】
【数１】
【００１０】
なお、上記式中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のクチナシ赤色素により飲食品を着色すると、従来のクチナシ赤色素により着色する場合に比べて、赤味が強く、鮮やかな色調の飲食品が得られる。
本発明のクチナシ赤色素の製造方法は従来の製造方法に比べ収率が向上したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のクチナシ赤色素は、分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上である。
【００１３】
ここで、「分子量４４万以上の成分の含有量」は、下記の方法により測定される。
【００１４】
［分子量４４万以上の成分の含有量の測定法］
１）色価１００に換算して約０．２ｇの試料を精密に量り、これに水を加えて正確に１０ｍＬとする。
２）その液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した液を試験溶液とする。
３）試験溶液２０μＬをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に注入して、エンパワークロマトグラフィーマネージャーにより「全成分のピークの合計面積」および「保持時間１７．７分よりも早く溶出した成分のピークの合計面積」を測定し、下記（２）式により分子量４４万以上の成分の含有量を算出する。なお、前記保持時間は、分子量４４万のタンパク質であるＦｅｒｒｉｔｉｎ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に基づいて決定した。
【００１５】
【数２】
【００１６】
上記ＨＰＬＣの分析システムおよび分析条件を以下に示す。
【００１７】
＜ＨＰＬＣ分析システム＞
２６９５セパレーションモジュール（日本ウォーターズ社製）
２９９６フォトダイオードアレイ検出器（日本ウォーターズ社製）
エンパワークロマトグラフィーマネージャー（日本ウォーターズ社製）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００（内径４．６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）（ワイエムシィ社製）
移動相：０．２Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４−０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：５３０ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００１８】
本発明のクチナシ赤色素の製造に用いられるイリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（以下、「物質Ａ」ともいう）は、下記（３）式で表される化合物である。
【００１９】
【化１】
【００２０】
物質Ａとしては、ゲニポシド酸が好ましく用いられる。ゲニポシド酸は、通常、アカネ科クチナシ（Ｇａｒｄｅｎｉａ ａｕｇｕｓｔａ ＭＥＲＲＩＬ ｖａｒ． ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ ＨＯＲＴ．，Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ ＥＬＬＩＳ）の果実から抽出したゲニポシドを加水分解することにより調製される。
【００２１】
上記クチナシの果実からゲニポシドを抽出する方法に制限はなく、例えば、クチナシの乾燥果実を粉砕し、水、アルコールまたはそれらの混合液を用いて抽出するなどの公知の方法が用いられる。抽出条件は、例えば水・アルコール混合液（１：１）を用いる場合、室温（約０〜３０℃）〜５０℃で約１〜１８時間が好ましく、約３０〜４０℃で約２〜４時間がより好ましい。乾燥果実の粉砕物からのゲニポシドの抽出率をより高めるため、抽出操作は通常複数回繰り返される。ゲニポシドを含む抽出液は自体公知の方法により濃縮され、通常、濃縮液として冷蔵或いは冷凍保存される。
【００２２】
この濃縮液は、通常、黄色素成分であるクロシンその他のゲニポシド以外の成分を除去するため、吸着樹脂処理される。吸着樹脂処理は、例えば、下記の方法により行われる。
【００２３】
初めに、上記濃縮液を適当な濃度に希釈し、吸着樹脂を充填したカラムに希釈液を供給する。吸着樹脂としては、アンバーライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−７（製品名；オルガノ社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＨＰ−４０（製品名；三菱化学社製）等の多孔性樹脂が挙げられ、アンバーライトＸＡＤ−７が好ましく用いられる。
【００２４】
次に、水または低濃度のアルコール（例えば、エタノール等）と水の混合液をカラムに通液し、その非吸着及び溶出画分を回収することにより、ゲニポシドを含む画分が得られる。この画分は自体公知の方法により濃縮され、通常、濃縮液として冷蔵或いは冷凍保存される。
【００２５】
ゲニポシドの加水分解は、定法に従って行われてよく、通常、酸、アルカリまたは適当な加水分解酵素を用いて行われる。ここで酸としては、例えば塩酸、硫酸およびリン酸などが挙げられる。アルカリとしては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムなどが挙げられる。また加水分解酵素としては、エステラーゼなどが挙げられる。
【００２６】
工業的には、ゲニポシドの加水分解は通常アルカリを用いて行われる。一例を示すと、前記ゲニポシドを含む画分の濃縮液に過剰量の水酸化ナトリウム水溶液を加え、好ましくは攪拌下、室温（約０〜３０℃）〜７０℃で約１〜２４時間、好ましくは約４０〜６０℃で約３〜５時間反応する。
【００２７】
アルカリによる加水分解終了後、反応液に塩酸、硫酸またはリン酸などの無機酸もしくはクエン酸などの有機酸の水溶液を適量加え、液性をｐＨ約７．０以下、好ましくはｐＨ約４．０以下にすることによりゲニポシド酸を含むゲニポシド酸液が調製される。
【００２８】
ゲニポシド酸液のゲニポシド酸含有量（質量％）は、以下の方法により測定される。
【００２９】
［ゲニポシド酸含有量の測定方法］
１）試料約０．１ｇを精密に量り、水を加えて溶かし、更に水を加えて正確に１００ｍｌとする。必要により、濃度が１０〜４０μｇ／ｍｌとなるように水で正確に希釈する。
２）ゲニポシド酸標準品（和光純薬工業社製）５ｍｇを精密に量り、水を加えて正確に５０ｍｌとする。更に、水を用いて正確に２．５倍希釈（４０μｇ／ｍｌ）、５倍希釈（２０μｇ／ｍｌ）及び１０倍希釈（１０μｇ／ｍｌ）する。
３）１）の液及び２）の希釈液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した液を試験溶液とする。
４）試験溶液１０μｌをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に注入して、エンパワークロマトグラフィーマネージャーにより保持時間５分付近のピーク（ゲニポシド酸のもの）の面積を測定する。
５）ゲニポシド酸標準品の各希釈液の面積から検量線を作成し、この検量線を用いて、試料中のゲニポシド酸濃度を算出し、該濃度をゲニポシド酸含有量（質量％）に換算する。
ＨＰＬＣ分析システムおよび分析条件を以下に示す。
【００３０】
＜ＨＰＬＣ分析システム＞
２６９５セパレーションモジュール（日本ウォーターズ社製）
２９９６フォトダイオードアレイ検出器（日本ウォーターズ社製）
エンパワークロマトグラフィーマネージャー（日本ウォーターズ社製）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８（内径４．６ｍｍ；長さ１５０ｍｍ；ＹＭＣ社製）
移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）−メタノール（５：１）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３８ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００３１】
本発明に用いられるタンパク質加水分解物は、例えば大豆や小麦などの植物由来のタンパク質、カゼインやゼラチンなどの動物由来のタンパク質または酵母などの微生物に由来するタンパク質の加水分解物であって、下記式（４）を満たすものである。
【００３２】
【数３】
【００３３】
なお、上記式（４）中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。また、上記式（４）により算出される値を、以下「全窒素量当りのアミノ基量」という。全窒素量当りのアミノ基量が３０未満のタンパク質加水分解物は、該加水分解物を用いて製造されるクチナシ赤色素の色価が十分に高くならないため好ましくなく、全窒素量当りのアミノ基量が６０を超えるタンパク質加水分解物は、その製造の際に精製度を極めて高くする必要があり、実質的に製造・入手が不可能なため好ましくない。
【００３４】
上記式（４）を満たすタンパク質加水分解物（即ち、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物）としては、例えば、プロエキスＨＶＰ−Ｇ（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量４０．７）、プロエキスＧ２（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量５０．７）及びＥＰＳ−Ｃ（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量３１．７）などが商業的に生産・販売されており、本発明ではこれらを用いることができる。
【００３５】
上記アミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）は、以下の［アミノ基量測定法］に基づき測定される。
【００３６】
［アミノ基量測定法］
１）０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．５μｍｏｌ／ｍｌのグリシン水溶液を調製する。
２）１．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質加水分解物水溶液を調製する。
３）１ｍｌのＯＰＡ溶液（オルトフタルアルデヒド４０ｍｇ、０．１Ｍ四ほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）５０ｍｌ、２−（ジメチルアミノ）エタンチオール塩酸塩１００ｍｇ）と１０μｌのグリシン水溶液又はタンパク質加水分解物水溶液を混合し、２分間静置する。
４）ＯＰＡ溶液を対照として、液層の長さ１ｃｍで３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
５）グリシン水溶液から得られる検量線を基に、タンパク質加水分解物中のアミノ基をグリシン量に換算し、下記式（５）によりアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）を求める。
【００３７】
【数４】
【００３８】
上記全窒素量（％）は、『第８版 食品添加物公定書』に記載の「窒素定量法（セミミクロケルダール法）」に準じて測定することができる。
【００３９】
本発明に用いられるβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、アーモンド等に由来するものが挙げられる。β−グルコシダーゼとしては、スミチームＣ６０００、スミチームＡＣ、スミチームＣ、スミチームＸ、スミチームＢＧＴ、スミチームＢＧＡ（商品名；新日本化学工業社製）、セルロシンＡＣ４０、セルロシンＴ３、セルロシンＡＬ（商品名；エイチビイアイ社製）オノズカ３Ｓ、Ｙ−ＮＣ（商品名；ヤクルト薬品工業社製）、セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４（商品名；天野エンザイム社製）等が商業的に製造・販売されており、本発明ではこれらを用いることができる。
【００４０】
本発明のクチナシ赤色素の製造方法としては、物質Ａを、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むものであれば特に制限されない。工業的には、物質Ａ、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物および有機酸（例えば、クエン酸など）を含有する水溶液を調製し、該水溶液にβ−グルコシダーゼを添加して酵素的加水分解反応する方法が好ましく行われる。
【００４１】
なお、上記反応は、温度条件が通常約４０〜８０℃、好ましくは約５０〜６０℃であり、ｐＨ条件が通常ｐＨ３〜６、好ましくはｐＨ４〜５であり、反応時間が通常約２４〜９６時間、好ましくは約４８〜７２時間の範囲内で行うことができる。
【００４２】
また、上記反応におけるｐＨ条件の調整のため、物質Ａ等を含有する水溶液にβ−グルコシダーゼを添加する前に、該水溶液に適量のアルカリ剤（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムなど）を加えることが好ましく行われる。
【００４３】
上記反応は、窒素ガス、炭酸ガス、アルゴンガス等の不活性ガス下の嫌気条件で行うことが好ましい。嫌気条件は、例えば、物質Ａ等を含有する水溶液にβ−グルコシダーゼを添加する前に、該水溶液に不活性ガスを吹き込むことにより設定することができる。
【００４４】
β−グルコシダーゼの添加方法に特に制限はないが、β−グルコシダーゼの水溶液を調製し、該水溶液を添加する方法が好ましい。
【００４５】
上記反応の行われる溶液１００質量％中、物質Ａが約１〜２０質量％、好ましくは約４〜１５質量％、全窒素量当りのアミノ基量が約３０〜６０のタンパク質加水分解物が約１〜２５質量％、好ましくは約４〜１５質量％、有機酸が約１〜２０質量％、好ましくは約１〜１２質量％となるように調整するのが好ましい。β−グルコシダーゼの添加量は、物質Ａ１ｇに対し、０．００２８〜０．０７ｇとすることが好ましい。
【００４６】
上記反応により得られる反応液を約７０〜１００℃、好ましくは約８０〜９０℃で約０．５〜３時間、好ましくは約１〜２時間加熱して酵素を失活させた後、必要により吸着処理、膜処理、酸沈澱処理などの精製処理をすることにより、本発明に係るクチナシ赤色素が得られる。
【００４７】
本発明の製造方法の収率は、製造されたクチナシ赤色素についてゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を測定することにより評価できる。ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、１ｇのゲニポシド酸より得られた色素の１％溶液の光路長１ｃｍにおける吸光度を表す。即ち、ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、一定量のゲニポシド酸により得られる色素の色の強さを意味するため、この値が高いほど収率の高いクチナシ赤色素の製造方法であることを示す。ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、以下の方法に基づき測定できる。
【００４８】
［ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）の測定法］
１）測定する吸光度が０．３〜０．７の範囲になるように、試料を精密に量り、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶かして正確に１００ｍｌとする。
２）酢酸緩衝液を対照とし、液層の長さ１ｃｍで５３０ｎｍ付近の極大吸収部における吸光度Ａを測定し、下記式（６）によりＥ（１％１ｃｍ）を求める。
【００４９】
【数５】
３）２）で求めたＥ（１％１ｃｍ）と、クチナシ赤色素の製造においてβ−グルコシダーゼの添加による酵素的加水分解反応が全く起こらなかったと仮定した場合に得られる試料のゲニポシド酸含有量（質量％）から、下記式（７）によりゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を求める。
【００５０】
【数６】
【００５１】
本発明のクチナシ赤色素は、そのままの状態で色素製剤として提供することもできるし、希釈剤、担体またはその他の添加剤を配合し、製剤化して提供することもできる。製剤の形態としては、液体製剤、粉末製剤、顆粒製剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセル、ハードカプセル、Ｗ／Ｏ型乳化液などが挙げられる。
【００５２】
また、本発明のクチナシ赤色素は、飲食品の着色に用いることができ、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、シャーベット、氷菓などの冷菓類、乳飲料、乳酸菌飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、粉末飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、茶飲料などの飲料類、プリン、ゼリー、ヨーグルトなどのデザート類、チューインガム、チョコレート、ドロップ、キャンディ、クッキー、せんべい、グミなどの菓子類、ジャム類、スープ類、漬物類、ドレッシング、たれなどの調味料、ハム、ソーセージなどの畜肉加工品、魚肉ソーセージ、かまぼこなどの水産練り製品などの着色に用いることができる。
【００５３】
さらに、本発明のクチナシ赤色素を用いて上記飲食品を着色するにあたり、退色や変色の抑制のため、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、ルチン、ケルセチン、ローズマリー抽出物、セージ抽出物、モリン、カフェ酸、クロロゲン酸などの抗酸化剤を添加しても良い。特に、本発明のクチナシ赤色素を用いて魚肉ソーセージを着色する場合には、該魚肉ソーセージにアスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを添加することが好ましい。これにより、魚肉ソーセージの製造時の加熱殺菌による色調変化が顕著に抑制される。
【００５４】
また、本発明のクチナシ赤色素は、色調の調整のため他の食用色素と併用することができる。そのような食用色素としては、例えばモナスカス色素などのアザフィロン系色素、赤キャベツ色素や赤ダイコン色素などのアントシアニン系色素、ラック色素やコチニール色素などのアントラキノン系色素、ビートレッド色素などのベタシアニン系色素、トマト色素、パプリカ色素、クチナシ黄色素などのカロチノイド系色素、ベニバナ黄色素やカカオ色素などのフラボノイド色素などが挙げられる。本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素とを併用する方法に特に制限はなく、例えば本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素とを配合した色素製剤を調製する方法、或いは本発明のクチナシ赤色素を用いて飲食品を着色するにあたり、本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素をそれぞれ該飲食品に添加する方法などが挙げられる。
【００５５】
本発明のクチナシ赤色素を用いて着色した飲食品は、従来のクチナシ赤色素を用いて着色したものよりも色調的に鮮やかな優れたものである。鮮やかさの度合いは、例えばクチナシ赤色素により着色した飲食品について、常法によりマンセル表色系における彩度（Ｃ）を測定することにより確認することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明を製造例、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
[製造例]ゲニポシド酸液の調製
粉砕したクチナシの乾燥果実１８００ｇに４０ｖｏｌ％エタノール・水混合液７２００ｍｌを加え、室温で３時間攪拌した後吸引ろ過した。抽出残に４０ｖｏｌ％エタノール・水混合液３３００ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した後吸引ろ過する操作を２回繰り返し、ろ液として計１０５００ｍｌの抽出液を得た。この抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて６０℃、４ｋＰａの条件で濃縮し、ゲニポシドを含む濃縮液約５００ｍｌを得た。
得られた濃縮液に水を加えて１０００ｍｌとし、アンバーライトＸＡＤ−７（製品名；オルガノ社製）３０００ｍｌを充填したカラムに流速ＳＶ＝０．５で通液した。その後、カラムに流速ＳＶ＝０．５で２４０００ｍｌの水を通液し、排出液を回収した。回収した液を、ロータリーエバポレーターを用いて、６０℃、４ｋＰａの条件で濃縮し、ゲニポシドを４７．１％含む濃縮液９０ｇを得た。
得られた濃縮液９０ｇと、水３４．８ｇを混合した後、４８質量％水酸化ナトリウム水溶液を１１．８ｇ加え、６０℃で３時間加水分解処理した。処理後、５０質量％クエン酸水溶液を４８．９ｇ加え、ゲニポシド酸含有量が１９．２５質量％のゲニポシド酸液１８０ｇを得た。
【００５８】
[実施例１]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名；プロエキスＧ２；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量５０．７）０．９９ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品１）２６ｇを得た。
【００５９】
[実施例２]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名：ＥＰＳ−Ｃ；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量３１．７）１．５８ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品２）２６ｇを得た。
【００６０】
[実施例３]
製造例で得たゲニポシド酸液１６．８４ｇ、小麦タンパク質加水分解物（商品名；プロエキスＨＶＰ−Ｇ；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量４０．７）３．１９ｇおよびクエン酸０．４９ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２３．７４ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液２．２６ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品３）２６ｇを得た。
【００６１】
[比較例]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名：ＣＥＢ−５０１０；セムピオフーズ社製；全窒素量当りのアミノ基量１２．１）４．５９ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（比較例品）２６ｇを得た。
【００６２】
[参考例]
特許第２８０２４５１号公報の実施例１記載の方法に準じてクチナシ赤色素を製造した。即ち、製造例で得たゲニポシド酸液５．２０ｇ、グルタミン酸０．４９６ｇ、クエン酸１．５１ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量１２．０６ｇ（１０ｍｌ）の水溶液を調整した。得られた水溶液を２０ｍｌ容試験管に移し、セルラーゼＡＰ−３（天野製薬社製）１６７ｍｇを溶解し、アルゴンガスを管内に満たした。これを５５℃で１９時間維持した後、９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（参考例品）１２ｇを得た。
【００６３】
［試験例１］
実施例１〜３、比較例および参考例の製造方法で得られたクチナシ赤色素（実施例品１〜３、比較例品および参考例品）について「分子量４４万以上の成分の含有量」を測定した。また、得られたクチナシ赤色素についてゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を測定することにより、これら製造方法の収率を求めた。結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１の結果から、分子量に着目すれば、本発明のクチナシ赤色素（実施例品１〜３）は、参考例の方法により得られる公知のクチナシ赤色素とは異なる新規なものであると言える。さらに、本発明のクチナシ赤色素の製造方法は、比較例および参考例の製造方法に比べ収率の高い優れたものであることが明らかである。
【００６６】
［試験例２］
実施例１および３の製造方法で得られたクチナシ赤色素（実施例品１および３）並びに市販のクチナシ赤色素（製品名：ガーデニアンレッドＧ；三井製糖社製；分子量４４万以上の成分の含有量３９．７％）を用いてそれぞれ着色した魚肉ソーセージを作製し、該魚肉ソーセージの色調および彩度を測定して評価した。
【００６７】
（１）魚肉ソーセージの作製
冷凍調理すり身（大冷社製）７５ｇ、日食コーンスターチＹ（日本食品化工社製）１０ｇ、菜種サラダ油（岡村製油社製）７．５ｇ、冷水７．５ｇおよびＬ−アスコルビン酸ナトリウム（栄研商事社製）０．０５ｇに対して、クチナシ赤色素を加え、ゴムベラで均一になるまで混合した。クチナシ赤色素の添加量は、実施例品１（Ｅ（１％１ｃｍ）＝２．１０）が０．１８４ｇ、実施例品３（Ｅ（１％１ｃｍ）＝５．９５）が０．０６５ｇ、上記市販のクチナシ赤色素（市販品；Ｅ（１％１ｃｍ）＝２．９８）が０．１３ｇとした。得られた混合物をポリエチレン製の袋に入れて脱気し、着色すり身約１００ｇを得た。得られた着色すり身を袋から取り出して塩化ビニル製ケーシングに充填したものを１１５℃、２０分間加熱殺菌して、魚肉ソーセージを得た。
（２）色調および彩度の測定
上記（１）により得られた魚肉ソーセージを輪切りにし、その断面の色調（Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるＬ*ａ*ｂ*値）および彩度（マンセル表色系による彩度（Ｃ））を測定した。なお、色調および彩度の測定では、分光式色彩計（型式：ＳＥ−２０００；日本電色工業社製；測定径：直径１０ｍｍ）を用いた。結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
表２の結果から、本発明のクチナシ赤色素（実施例品１および３）により着色した魚肉ソーセージは、市販品のクチナシ赤色素により着色したものに比べてａ*値および彩度（Ｃ）が大きい。ここで、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるａ*値は赤方向の色度を表し、この値が大きいほど赤味が強いことを意味する。したがって、本発明のクチナシ赤色素により着色した魚肉ソーセージは市販品により着色したものに比べて、赤味が強く、鮮やかな色調を有している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クチナシ赤色素およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クチナシ赤色素は、中性域（ｐＨ６．０以上８．０以下）で赤色を呈し、熱や光に対して比較的安定であることから、中性域の液性を有する食品に対する赤色系着色料として主に利用されている。一般にクチナシ赤色素は、クチナシ果実抽出物等に含まれるイリドイド配糖体のエステル加水分解物をβ−グルコシダーゼにより酵素処理することにより製造される。
【０００３】
クチナシ赤色素の製造方法としては、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位に−ＣＯＯＨ基を持つ物質、または−ＣＯＯＣＨ３基を持つ物質からエステルの加水分解により得た物質、あるいはそれらを含有する物質と一級アミノ基含有物質とを酸性条件下で作用せしめて反応させることを特徴とする赤色系色素組成物の製造方法（特許文献１参照）、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（Ａ）を、物質（Ａ）に対して２モル当量以上のクエン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、アジピン酸、フマル酸、アスコルビン酸及びエリソルビン酸からなる群から選ばれる有機酸及び物質（Ａ）に対して０．７モル当量以上のアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はこれらの塩をpH３〜６の範囲で反応させることを特徴とする明色化した赤色色素の製造方法（特許文献２参照）、イリドイド化合物中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質および第一級アミノ基含有物質とを五炭糖の存在下、酸性条件下で反応させることを特徴とするクチナシ赤色系色素の製造方法（特許文献３参照）などが知られている。また、実験室的製法として、イリドイド配糖体のエステル加水分解物のアグリコンとα−アラニンをクエン酸の存在下かつアルゴンガス雰囲気下で作用させる方法（非特許文献１参照）などが知られている。
【０００４】
しかし、近年、クチナシ赤色素のユーザーのニーズが多様化しており、より赤味が強く鮮やかな色調の飲食品を製造できるクチナシ赤色素が求められている。さらに、従来の製造方法では、色素の収率が十分に高いものであるとは必ずしも言えないため、クチナシ赤色素をより高収率で製造する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭５５−５７７８号公報
【特許文献２】特許第２８０２４５１号公報
【特許文献３】特許第２８７３５１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔｏｍｅ Ｎ，外３名，「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｄ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，ｖｏｌ．３９，ｎｏ．４，ｐ．３４５−３５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、赤味が強く鮮やかな色調の飲食品を製造できる新規なクチナシ赤色素を提供すること、さらにそのようなクチナシ赤色素をより高収率で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質を特定の性質を有するタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理を行うことによって、得られるクチナシ赤色素の色価が十分に高まることを見いだした。さらに、このようにして得られたクチナシ赤色素は、分子量に着目すれば従来の製造方法では得られない新規なものであり、かつ従来のクチナシ赤色素よりも色調的に鮮やかであることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上であることを特徴とするクチナシ赤色素、
（２）イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質をタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むクチナシ赤色素の製造方法であって、該タンパク質加水分解物が下記式（１）を満たすクチナシ赤色素の製造方法、
からなっている。
【０００９】
【数１】
【００１０】
なお、上記式中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のクチナシ赤色素により飲食品を着色すると、従来のクチナシ赤色素により着色する場合に比べて、赤味が強く、鮮やかな色調の飲食品が得られる。
本発明のクチナシ赤色素の製造方法は従来の製造方法に比べ収率が向上したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のクチナシ赤色素は、分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上である。
【００１３】
ここで、「分子量４４万以上の成分の含有量」は、下記の方法により測定される。
【００１４】
［分子量４４万以上の成分の含有量の測定法］
１）色価１００に換算して約０．２ｇの試料を精密に量り、これに水を加えて正確に１０ｍＬとする。
２）その液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した液を試験溶液とする。
３）試験溶液２０μＬをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に注入して、エンパワークロマトグラフィーマネージャーにより「全成分のピークの合計面積」および「保持時間１７．７分よりも早く溶出した成分のピークの合計面積」を測定し、下記（２）式により分子量４４万以上の成分の含有量を算出する。なお、前記保持時間は、分子量４４万のタンパク質であるＦｅｒｒｉｔｉｎ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に基づいて決定した。
【００１５】
【数２】
【００１６】
上記ＨＰＬＣの分析システムおよび分析条件を以下に示す。
【００１７】
＜ＨＰＬＣ分析システム＞
２６９５セパレーションモジュール（日本ウォーターズ社製）
２９９６フォトダイオードアレイ検出器（日本ウォーターズ社製）
エンパワークロマトグラフィーマネージャー（日本ウォーターズ社製）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００（内径４．６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）（ワイエムシィ社製）
移動相：０．２Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４−０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：５３０ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００１８】
本発明のクチナシ赤色素の製造に用いられるイリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質（以下、「物質Ａ」ともいう）は、下記（３）式で表される化合物である。
【００１９】
【化１】
【００２０】
物質Ａとしては、ゲニポシド酸が好ましく用いられる。ゲニポシド酸は、通常、アカネ科クチナシ（Ｇａｒｄｅｎｉａ ａｕｇｕｓｔａ ＭＥＲＲＩＬ ｖａｒ． ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ ＨＯＲＴ．，Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ ＥＬＬＩＳ）の果実から抽出したゲニポシドを加水分解することにより調製される。
【００２１】
上記クチナシの果実からゲニポシドを抽出する方法に制限はなく、例えば、クチナシの乾燥果実を粉砕し、水、アルコールまたはそれらの混合液を用いて抽出するなどの公知の方法が用いられる。抽出条件は、例えば水・アルコール混合液（１：１）を用いる場合、室温（約０〜３０℃）〜５０℃で約１〜１８時間が好ましく、約３０〜４０℃で約２〜４時間がより好ましい。乾燥果実の粉砕物からのゲニポシドの抽出率をより高めるため、抽出操作は通常複数回繰り返される。ゲニポシドを含む抽出液は自体公知の方法により濃縮され、通常、濃縮液として冷蔵或いは冷凍保存される。
【００２２】
この濃縮液は、通常、黄色素成分であるクロシンその他のゲニポシド以外の成分を除去するため、吸着樹脂処理される。吸着樹脂処理は、例えば、下記の方法により行われる。
【００２３】
初めに、上記濃縮液を適当な濃度に希釈し、吸着樹脂を充填したカラムに希釈液を供給する。吸着樹脂としては、アンバーライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−７（製品名；オルガノ社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＨＰ−４０（製品名；三菱化学社製）等の多孔性樹脂が挙げられ、アンバーライトＸＡＤ−７が好ましく用いられる。
【００２４】
次に、水または低濃度のアルコール（例えば、エタノール等）と水の混合液をカラムに通液し、その非吸着及び溶出画分を回収することにより、ゲニポシドを含む画分が得られる。この画分は自体公知の方法により濃縮され、通常、濃縮液として冷蔵或いは冷凍保存される。
【００２５】
ゲニポシドの加水分解は、定法に従って行われてよく、通常、酸、アルカリまたは適当な加水分解酵素を用いて行われる。ここで酸としては、例えば塩酸、硫酸およびリン酸などが挙げられる。アルカリとしては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムなどが挙げられる。また加水分解酵素としては、エステラーゼなどが挙げられる。
【００２６】
工業的には、ゲニポシドの加水分解は通常アルカリを用いて行われる。一例を示すと、前記ゲニポシドを含む画分の濃縮液に過剰量の水酸化ナトリウム水溶液を加え、好ましくは攪拌下、室温（約０〜３０℃）〜７０℃で約１〜２４時間、好ましくは約４０〜６０℃で約３〜５時間反応する。
【００２７】
アルカリによる加水分解終了後、反応液に塩酸、硫酸またはリン酸などの無機酸もしくはクエン酸などの有機酸の水溶液を適量加え、液性をｐＨ約７．０以下、好ましくはｐＨ約４．０以下にすることによりゲニポシド酸を含むゲニポシド酸液が調製される。
【００２８】
ゲニポシド酸液のゲニポシド酸含有量（質量％）は、以下の方法により測定される。
【００２９】
［ゲニポシド酸含有量の測定方法］
１）試料約０．１ｇを精密に量り、水を加えて溶かし、更に水を加えて正確に１００ｍｌとする。必要により、濃度が１０〜４０μｇ／ｍｌとなるように水で正確に希釈する。
２）ゲニポシド酸標準品（和光純薬工業社製）５ｍｇを精密に量り、水を加えて正確に５０ｍｌとする。更に、水を用いて正確に２．５倍希釈（４０μｇ／ｍｌ）、５倍希釈（２０μｇ／ｍｌ）及び１０倍希釈（１０μｇ／ｍｌ）する。
３）１）の液及び２）の希釈液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した液を試験溶液とする。
４）試験溶液１０μｌをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に注入して、エンパワークロマトグラフィーマネージャーにより保持時間５分付近のピーク（ゲニポシド酸のもの）の面積を測定する。
５）ゲニポシド酸標準品の各希釈液の面積から検量線を作成し、この検量線を用いて、試料中のゲニポシド酸濃度を算出し、該濃度をゲニポシド酸含有量（質量％）に換算する。
ＨＰＬＣ分析システムおよび分析条件を以下に示す。
【００３０】
＜ＨＰＬＣ分析システム＞
２６９５セパレーションモジュール（日本ウォーターズ社製）
２９９６フォトダイオードアレイ検出器（日本ウォーターズ社製）
エンパワークロマトグラフィーマネージャー（日本ウォーターズ社製）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８（内径４．６ｍｍ；長さ１５０ｍｍ；ＹＭＣ社製）
移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）−メタノール（５：１）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３８ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００３１】
本発明に用いられるタンパク質加水分解物は、例えば大豆や小麦などの植物由来のタンパク質、カゼインやゼラチンなどの動物由来のタンパク質または酵母などの微生物に由来するタンパク質の加水分解物であって、下記式（４）を満たすものである。
【００３２】
【数３】
【００３３】
なお、上記式（４）中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。また、上記式（４）により算出される値を、以下「全窒素量当りのアミノ基量」という。全窒素量当りのアミノ基量が３０未満のタンパク質加水分解物は、該加水分解物を用いて製造されるクチナシ赤色素の色価が十分に高くならないため好ましくなく、全窒素量当りのアミノ基量が６０を超えるタンパク質加水分解物は、その製造の際に精製度を極めて高くする必要があり、実質的に製造・入手が不可能なため好ましくない。
【００３４】
上記式（４）を満たすタンパク質加水分解物（即ち、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物）としては、例えば、プロエキスＨＶＰ−Ｇ（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量４０．７）、プロエキスＧ２（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量５０．７）及びＥＰＳ−Ｃ（商品名；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量３１．７）などが商業的に生産・販売されており、本発明ではこれらを用いることができる。
【００３５】
上記アミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）は、以下の［アミノ基量測定法］に基づき測定される。
【００３６】
［アミノ基量測定法］
１）０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．５μｍｏｌ／ｍｌのグリシン水溶液を調製する。
２）１．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質加水分解物水溶液を調製する。
３）１ｍｌのＯＰＡ溶液（オルトフタルアルデヒド４０ｍｇ、０．１Ｍ四ほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）５０ｍｌ、２−（ジメチルアミノ）エタンチオール塩酸塩１００ｍｇ）と１０μｌのグリシン水溶液又はタンパク質加水分解物水溶液を混合し、２分間静置する。
４）ＯＰＡ溶液を対照として、液層の長さ１ｃｍで３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
５）グリシン水溶液から得られる検量線を基に、タンパク質加水分解物中のアミノ基をグリシン量に換算し、下記式（５）によりアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）を求める。
【００３７】
【数４】
【００３８】
上記全窒素量（％）は、『第８版 食品添加物公定書』に記載の「窒素定量法（セミミクロケルダール法）」に準じて測定することができる。
【００３９】
本発明に用いられるβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、アーモンド等に由来するものが挙げられる。β−グルコシダーゼとしては、スミチームＣ６０００、スミチームＡＣ、スミチームＣ、スミチームＸ、スミチームＢＧＴ、スミチームＢＧＡ（商品名；新日本化学工業社製）、セルロシンＡＣ４０、セルロシンＴ３、セルロシンＡＬ（商品名；エイチビイアイ社製）オノズカ３Ｓ、Ｙ−ＮＣ（商品名；ヤクルト薬品工業社製）、セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４（商品名；天野エンザイム社製）等が商業的に製造・販売されており、本発明ではこれらを用いることができる。
【００４０】
本発明のクチナシ赤色素の製造方法としては、物質Ａを、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むものであれば特に制限されない。工業的には、物質Ａ、全窒素量当りのアミノ基量が３０〜６０のタンパク質加水分解物および有機酸（例えば、クエン酸など）を含有する水溶液を調製し、該水溶液にβ−グルコシダーゼを添加して酵素的加水分解反応する方法が好ましく行われる。
【００４１】
なお、上記反応は、温度条件が通常約４０〜８０℃、好ましくは約５０〜６０℃であり、ｐＨ条件が通常ｐＨ３〜６、好ましくはｐＨ４〜５であり、反応時間が通常約２４〜９６時間、好ましくは約４８〜７２時間の範囲内で行うことができる。
【００４２】
また、上記反応におけるｐＨ条件の調整のため、物質Ａ等を含有する水溶液にβ−グルコシダーゼを添加する前に、該水溶液に適量のアルカリ剤（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムなど）を加えることが好ましく行われる。
【００４３】
上記反応は、窒素ガス、炭酸ガス、アルゴンガス等の不活性ガス下の嫌気条件で行うことが好ましい。嫌気条件は、例えば、物質Ａ等を含有する水溶液にβ−グルコシダーゼを添加する前に、該水溶液に不活性ガスを吹き込むことにより設定することができる。
【００４４】
β−グルコシダーゼの添加方法に特に制限はないが、β−グルコシダーゼの水溶液を調製し、該水溶液を添加する方法が好ましい。
【００４５】
上記反応の行われる溶液１００質量％中、物質Ａが約１〜２０質量％、好ましくは約４〜１５質量％、全窒素量当りのアミノ基量が約３０〜６０のタンパク質加水分解物が約１〜２５質量％、好ましくは約４〜１５質量％、有機酸が約１〜２０質量％、好ましくは約１〜１２質量％となるように調整するのが好ましい。β−グルコシダーゼの添加量は、物質Ａ１ｇに対し、０．００２８〜０．０７ｇとすることが好ましい。
【００４６】
上記反応により得られる反応液を約７０〜１００℃、好ましくは約８０〜９０℃で約０．５〜３時間、好ましくは約１〜２時間加熱して酵素を失活させた後、必要により吸着処理、膜処理、酸沈澱処理などの精製処理をすることにより、本発明に係るクチナシ赤色素が得られる。
【００４７】
本発明の製造方法の収率は、製造されたクチナシ赤色素についてゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を測定することにより評価できる。ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、１ｇのゲニポシド酸より得られた色素の１％溶液の光路長１ｃｍにおける吸光度を表す。即ち、ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、一定量のゲニポシド酸により得られる色素の色の強さを意味するため、この値が高いほど収率の高いクチナシ赤色素の製造方法であることを示す。ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）は、以下の方法に基づき測定できる。
【００４８】
［ゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）の測定法］
１）測定する吸光度が０．３〜０．７の範囲になるように、試料を精密に量り、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶かして正確に１００ｍｌとする。
２）酢酸緩衝液を対照とし、液層の長さ１ｃｍで５３０ｎｍ付近の極大吸収部における吸光度Ａを測定し、下記式（６）によりＥ（１％１ｃｍ）を求める。
【００４９】
【数５】
３）２）で求めたＥ（１％１ｃｍ）と、クチナシ赤色素の製造においてβ−グルコシダーゼの添加による酵素的加水分解反応が全く起こらなかったと仮定した場合に得られる試料のゲニポシド酸含有量（質量％）から、下記式（７）によりゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を求める。
【００５０】
【数６】
【００５１】
本発明のクチナシ赤色素は、そのままの状態で色素製剤として提供することもできるし、希釈剤、担体またはその他の添加剤を配合し、製剤化して提供することもできる。製剤の形態としては、液体製剤、粉末製剤、顆粒製剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセル、ハードカプセル、Ｗ／Ｏ型乳化液などが挙げられる。
【００５２】
また、本発明のクチナシ赤色素は、飲食品の着色に用いることができ、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、シャーベット、氷菓などの冷菓類、乳飲料、乳酸菌飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、粉末飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、茶飲料などの飲料類、プリン、ゼリー、ヨーグルトなどのデザート類、チューインガム、チョコレート、ドロップ、キャンディ、クッキー、せんべい、グミなどの菓子類、ジャム類、スープ類、漬物類、ドレッシング、たれなどの調味料、ハム、ソーセージなどの畜肉加工品、魚肉ソーセージ、かまぼこなどの水産練り製品などの着色に用いることができる。
【００５３】
さらに、本発明のクチナシ赤色素を用いて上記飲食品を着色するにあたり、退色や変色の抑制のため、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、ルチン、ケルセチン、ローズマリー抽出物、セージ抽出物、モリン、カフェ酸、クロロゲン酸などの抗酸化剤を添加しても良い。特に、本発明のクチナシ赤色素を用いて魚肉ソーセージを着色する場合には、該魚肉ソーセージにアスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを添加することが好ましい。これにより、魚肉ソーセージの製造時の加熱殺菌による色調変化が顕著に抑制される。
【００５４】
また、本発明のクチナシ赤色素は、色調の調整のため他の食用色素と併用することができる。そのような食用色素としては、例えばモナスカス色素などのアザフィロン系色素、赤キャベツ色素や赤ダイコン色素などのアントシアニン系色素、ラック色素やコチニール色素などのアントラキノン系色素、ビートレッド色素などのベタシアニン系色素、トマト色素、パプリカ色素、クチナシ黄色素などのカロチノイド系色素、ベニバナ黄色素やカカオ色素などのフラボノイド色素などが挙げられる。本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素とを併用する方法に特に制限はなく、例えば本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素とを配合した色素製剤を調製する方法、或いは本発明のクチナシ赤色素を用いて飲食品を着色するにあたり、本発明のクチナシ赤色素と他の食用色素をそれぞれ該飲食品に添加する方法などが挙げられる。
【００５５】
本発明のクチナシ赤色素を用いて着色した飲食品は、従来のクチナシ赤色素を用いて着色したものよりも色調的に鮮やかな優れたものである。鮮やかさの度合いは、例えばクチナシ赤色素により着色した飲食品について、常法によりマンセル表色系における彩度（Ｃ）を測定することにより確認することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明を製造例、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
[製造例]ゲニポシド酸液の調製
粉砕したクチナシの乾燥果実１８００ｇに４０ｖｏｌ％エタノール・水混合液７２００ｍｌを加え、室温で３時間攪拌した後吸引ろ過した。抽出残に４０ｖｏｌ％エタノール・水混合液３３００ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した後吸引ろ過する操作を２回繰り返し、ろ液として計１０５００ｍｌの抽出液を得た。この抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて６０℃、４ｋＰａの条件で濃縮し、ゲニポシドを含む濃縮液約５００ｍｌを得た。
得られた濃縮液に水を加えて１０００ｍｌとし、アンバーライトＸＡＤ−７（製品名；オルガノ社製）３０００ｍｌを充填したカラムに流速ＳＶ＝０．５で通液した。その後、カラムに流速ＳＶ＝０．５で２４０００ｍｌの水を通液し、排出液を回収した。回収した液を、ロータリーエバポレーターを用いて、６０℃、４ｋＰａの条件で濃縮し、ゲニポシドを４７．１％含む濃縮液９０ｇを得た。
得られた濃縮液９０ｇと、水３４．８ｇを混合した後、４８質量％水酸化ナトリウム水溶液を１１．８ｇ加え、６０℃で３時間加水分解処理した。処理後、５０質量％クエン酸水溶液を４８．９ｇ加え、ゲニポシド酸含有量が１９．２５質量％のゲニポシド酸液１８０ｇを得た。
【００５８】
[実施例１]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名；プロエキスＧ２；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量５０．７）０．９９ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品１）２６ｇを得た。
【００５９】
[実施例２]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名：ＥＰＳ−Ｃ；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量３１．７）１．５８ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品２）２６ｇを得た。
【００６０】
[実施例３]
製造例で得たゲニポシド酸液１６．８４ｇ、小麦タンパク質加水分解物（商品名；プロエキスＨＶＰ−Ｇ；播州調味料社製；全窒素量当りのアミノ基量４０．７）３．１９ｇおよびクエン酸０．４９ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２３．７４ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液２．２６ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（実施例品３）２６ｇを得た。
【００６１】
[比較例]
製造例で得たゲニポシド酸液６．４７ｇ、トウモロコシタンパク質加水分解物（商品名：ＣＥＢ−５０１０；セムピオフーズ社製；全窒素量当りのアミノ基量１２．１）４．５９ｇおよびクエン酸１．８７ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量２５．１３ｇの水溶液を調整した。得られた水溶液中に窒素ガスを導入し、液中の溶存酸素を低減させた後、６０℃に保温した。次いで、この水溶液にβ−グルコシダーゼ（商品名：スミチームＣ６０００；新日本化学社製）の２質量％水溶液０．８７ｇを加え、６０℃で酵素的加水分解反応を６０時間行った。反応後、得られた反応液を９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（比較例品）２６ｇを得た。
【００６２】
[参考例]
特許第２８０２４５１号公報の実施例１記載の方法に準じてクチナシ赤色素を製造した。即ち、製造例で得たゲニポシド酸液５．２０ｇ、グルタミン酸０．４９６ｇ、クエン酸１．５１ｇを混合・溶解した後、水酸化ナトリウムでｐHを４．５に調整し、さらに水を加え、総量１２．０６ｇ（１０ｍｌ）の水溶液を調整した。得られた水溶液を２０ｍｌ容試験管に移し、セルラーゼＡＰ−３（天野製薬社製）１６７ｍｇを溶解し、アルゴンガスを管内に満たした。これを５５℃で１９時間維持した後、９０℃で１時間加熱し、クチナシ赤色素（参考例品）１２ｇを得た。
【００６３】
［試験例１］
実施例１〜３、比較例および参考例の製造方法で得られたクチナシ赤色素（実施例品１〜３、比較例品および参考例品）について「分子量４４万以上の成分の含有量」を測定した。また、得られたクチナシ赤色素についてゲニポシド酸１ｇ当りのＥ（１％１ｃｍ）を測定することにより、これら製造方法の収率を求めた。結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１の結果から、分子量に着目すれば、本発明のクチナシ赤色素（実施例品１〜３）は、参考例の方法により得られる公知のクチナシ赤色素とは異なる新規なものであると言える。さらに、本発明のクチナシ赤色素の製造方法は、比較例および参考例の製造方法に比べ収率の高い優れたものであることが明らかである。
【００６６】
［試験例２］
実施例１および３の製造方法で得られたクチナシ赤色素（実施例品１および３）並びに市販のクチナシ赤色素（製品名：ガーデニアンレッドＧ；三井製糖社製；分子量４４万以上の成分の含有量３９．７％）を用いてそれぞれ着色した魚肉ソーセージを作製し、該魚肉ソーセージの色調および彩度を測定して評価した。
【００６７】
（１）魚肉ソーセージの作製
冷凍調理すり身（大冷社製）７５ｇ、日食コーンスターチＹ（日本食品化工社製）１０ｇ、菜種サラダ油（岡村製油社製）７．５ｇ、冷水７．５ｇおよびＬ−アスコルビン酸ナトリウム（栄研商事社製）０．０５ｇに対して、クチナシ赤色素を加え、ゴムベラで均一になるまで混合した。クチナシ赤色素の添加量は、実施例品１（Ｅ（１％１ｃｍ）＝２．１０）が０．１８４ｇ、実施例品３（Ｅ（１％１ｃｍ）＝５．９５）が０．０６５ｇ、上記市販のクチナシ赤色素（市販品；Ｅ（１％１ｃｍ）＝２．９８）が０．１３ｇとした。得られた混合物をポリエチレン製の袋に入れて脱気し、着色すり身約１００ｇを得た。得られた着色すり身を袋から取り出して塩化ビニル製ケーシングに充填したものを１１５℃、２０分間加熱殺菌して、魚肉ソーセージを得た。
（２）色調および彩度の測定
上記（１）により得られた魚肉ソーセージを輪切りにし、その断面の色調（Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるＬ*ａ*ｂ*値）および彩度（マンセル表色系による彩度（Ｃ））を測定した。なお、色調および彩度の測定では、分光式色彩計（型式：ＳＥ−２０００；日本電色工業社製；測定径：直径１０ｍｍ）を用いた。結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
表２の結果から、本発明のクチナシ赤色素（実施例品１および３）により着色した魚肉ソーセージは、市販品のクチナシ赤色素により着色したものに比べてａ*値および彩度（Ｃ）が大きい。ここで、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるａ*値は赤方向の色度を表し、この値が大きいほど赤味が強いことを意味する。したがって、本発明のクチナシ赤色素により着色した魚肉ソーセージは市販品により着色したものに比べて、赤味が強く、鮮やかな色調を有している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上であることを特徴とするクチナシ赤色素。
【請求項２】
イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質をタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むクチナシ赤色素の製造方法であって、該タンパク質加水分解物が下記式（１）を満たすクチナシ赤色素の製造方法。
【数１】
〔式中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。〕
【請求項１】
分子量４４万以上の成分の含有量が５０％以上であることを特徴とするクチナシ赤色素。
【請求項２】
イリドイド配糖体中イリドイド骨格の４位にカルボキシル基を有する物質をタンパク質加水分解物の存在下でβ−グルコシダーゼ処理する工程を含むクチナシ赤色素の製造方法であって、該タンパク質加水分解物が下記式（１）を満たすクチナシ赤色素の製造方法。
【数１】
〔式中、Ａ、Ｎは、それぞれアミノ基量（μｍｏｌ／ｍｇ）、全窒素量（％）を示す。〕
【公開番号】特開２０１１−２１７７２８（Ｐ２０１１−２１７７２８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０１０９０（Ｐ２０１０−２０１０９０）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（３９００１０６７４）理研ビタミン株式会社 (236)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（３９００１０６７４）理研ビタミン株式会社 (236)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]