グルタチオン高生産パン酵母の造成方法
【課題】新規なグルタチオン高生産パン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末及びその製造方法、及び、当該方法により得られた乾燥酵母粉末を用いたパン等の食品の製造方法を提供する。
【解決手段】パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から一次としてカドミウム耐性株、二次としてシクロヘキシミド耐性株をスクリーニングして得られた、グルタチオン高生産パン酵母。
【解決手段】パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から一次としてカドミウム耐性株、二次としてシクロヘキシミド耐性株をスクリーニングして得られた、グルタチオン高生産パン酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン高生産パン酵母の造成方法等に関する。詳細には、グルタチオンを高生産するパン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（以下、ＧＳＨという）はグルタミン酸、グリシン、システインからなるトリペプチドあり、生体内に広く分布する物質である。そして、その機能としては、抗酸化機能、美白効果、肝機能維持等が知られている。近年では、米粉パンの製パン性を高めるという報告などもされている。
【０００３】
このような背景、及び、昨今の消費者の健康志向から、機能性素材のひとつとしてＧＳＨを多く含有し食品として使用できる素材が求められている。そして、酵母を用いて、ＧＳＨを高発現させる試みやＧＳＨ高生産酵母を取得する試みが多く行われ、ＧＳＨ高含有イーストパウダー等が開発されている。
【０００４】
例えば、酵母のＧＳＨ発現を高める方法として、培地にアミノ酸を添加する方法（特許文献１）、亜鉛イオンを制限する方法（特許文献２）、通常よりも低い培養温度で培養する方法（特許文献３）など培養条件を工夫するものが開示されている。また、突然変異剤処理により、エチオニン・亜硫酸塩耐性株（特許文献４）、ポリエン系抗生物質耐性株（特許文献５）などからＧＳＨ高生産株を取得したことも報告されている。
【０００５】
しかし、これらの多くはキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）であり、食品への利用頻度・利用適性が高く且つ長年の食習慣があり安全性が担保されているパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での開発例は少ない。特許文献２はパン酵母の例ではあるが、ＧＳＨ生産量が充分とは言えない。このような背景の中、簡便で且つ効率的なＧＳＨ高生産パン酵母の培養方法や造成方法の更なる開発が望まれていた。
【０００６】
つまり、より簡便且つ効果的な（実用的な）ＧＳＨを高生産するパン酵母造成方法、当該方法により得られたパン酵母を用いたＧＳＨ高含有乾燥酵母粉末の製造技術等の開発が当業界において強く求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５３−０９４０８９号公報
【特許文献２】特開平０１−１４１５９１号公報
【特許文献３】特開昭６０−１５６３７９号公報
【特許文献４】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献５】特開２００３−２８４５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なグルタチオン高生産パン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末及びその製造方法、及び、当該方法により得られた乾燥酵母粉末を用いたパン等の食品の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から複数種の薬剤の耐性株を複数回のスクリーニング操作を行うことによりＧＳＨを高生産する菌株を簡便に取得できることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
（２）パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得し、三次スクリーニングとしてチオレドキシン高含有株を選択して取得したものを親株とすること、を特徴とする（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載の方法によって得られたグルタチオン高生産パン酵母の１倍体を取得し、これら（例えば、異なる親株由来の１倍体どうし）を交雑して２倍体を造成すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
（４）変異処理が、ＥＭＳ処理及び／又はＵＶ処理であること、を特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）グルタチオンが乾燥酵母粉末あたり４重量％以上（例えば、４〜５重量％）含有するグルタチオン高生産パン酵母を造成すること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法により造成したグルタチオン高生産パン酵母。
（７）グルタチオン高生産パン酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
（８）（６）又は（７）に記載のグルタチオン高生産パン酵母をグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地（例えば、各アミノ酸を０．７〜０．８重量％含有する培地）で培養したものを用いて製造すること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上（例えば、４〜５重量％）含有する乾燥酵母粉末の製造方法。
（９）（６）又は（７）に記載のグルタチオン高生産パン酵母を用いて製造してなること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末。
（１０）（９）に記載の乾燥酵母粉末（（８）に記載の製造方法により得られた乾燥酵母粉末）をパン生地に添加して製造すること、を特徴とするパンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、薬剤耐性株の複数回スクリーニング、あるいはそれらの１倍体の交雑等を行うだけで簡便且つ効率的にＧＳＨ高生産パン酵母を取得することができる。そして、当該方法により得られたパン酵母を用いてグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地で培養するだけで、簡便且つ効率的にＧＳＨを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末を製造でき、当該乾燥酵母粉末は製パン性向上目的等でパン製造などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法で得られたＧＳＨ高生産酵母の乾燥菌体あたりのＧＳＨ含量を示すグラフである。なお、ＯＹＣ−１０２は親株であり、丸印は交雑のための１倍体取得の候補株を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、本発明では、ＧＳＨ高生産パン酵母造成の親株として、市販のパン酵母を含むあらゆる公知のパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用することができる。また、その形態も、生酵母、乾燥酵母など酵母が死滅していない状態であれば特に限定されない。
【００１４】
そして、これをそのまま薬剤耐性株スクリーニングの親株として用いても良いが、これを突然変異処理したものを親株として用いても良い。突然変異処理は、物理的方法及び化学的方法のいずれもが使用可能である。物理的方法としては、一定時間の紫外線照射処理（ＵＶ処理）、放射線（例えばγ線）照射などがあり、化学的方法としては、例えば、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を一定時間懸濁させる処理方法などがあるが、ＥＭＳ処理又はＵＶ処理が特に好ましい。これらの方法は、適宜組み合わせて行うこともできる。また、突然変異処理した親株と変異処理を行っていないそのままの親株（自然株）を混合して用いることもできる。
【００１５】
なお、本発明においては、特定の遺伝子の付加・欠損等をさせた遺伝子組換え体パン酵母は親株として使用しない。よって、本発明では、遺伝子組換え体でない、つまり野生株が偶発的に変異した変異株又は上記突然変異処理により出現した変異株からＧＳＨ高生産パン酵母を取得することができ、食品に用いても安全性は問題ない。
【００１６】
次に、スクリーニングは、一次スクリーニングにカドミウム耐性株の選抜、二次スクリーニングにシクロヘキシミド耐性株の選抜を行う。この順番でスクリーニングを行うことにより、ＧＳＨ合成系酵素遺伝子の発現を活性化する転写因子Ｙａｐ１が活性化した菌株を取得することが可能となると推定され、効率良くＧＳＨを高含有する菌株を取得することができる。したがって、このスクリーニング順を逆にしたり、２薬剤のスクリーニングを同時に行う（同じ培地で行う）ことは好ましくない。スクリーニングの際の培地へのカドミウム添加量は、塩化カドミウム濃度として１００〜１０００μＭなどが例示され、シクロヘキシミド添加量としては３〜１０μｇ／ｍｌなどが例示される。
【００１７】
更に、三次スクリーニングとして、対数増殖期及び定常期の両方においてチオレドキシン（ＴＲＸ）高含有である株をウエスタンブロット法等によって選択して取得し、これを親株として再度カドミウム耐性株、シクロヘキシミド耐性株をスクリーニングすることで、より好適なＧＳＨ高生産パン酵母を取得することもできる。選抜基準としては、対数増殖期及び定常期の両方において親株の２倍以上のものを選抜することが例示される。
【００１８】
更には、上述の方法で取得したＧＳＨ高生産パン酵母の１倍体を取得して、異なる親株由来のものどうし又は同じ親株由来のものどうしを交雑することによって、更に好適なＧＳＨ高生産パン酵母を取得することもできる。交雑方法は、接合型の１倍体を用いた接合法が好適であるが、プロトプラスト融合等も可能である。また、マーカー遺伝子を用いて交雑株の選択を更に容易にすることもできる。
【００１９】
本発明では、上述のような手法により目的とするＧＳＨ高生産パン酵母を簡便且つ効率的に取得することができる。一例として挙げると、市販パン酵母を親株としてＧＳＨ高生産パン酵母を取得するのに成功し、ＨＧＹ９株と命名した。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２０１１年（平成２３年）３月３１日付けでＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１として受領された。
【００２０】
本発明により取得したサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株の主な菌学的性質を例示すると、以下の通りである。
（ａ）ＹＭ液体培地で生育させたときの菌の形態
（１）栄養細胞の大きさ：大きさ４〜１４μｍ、幅３〜７μｍ
（２）栄養細胞の形状：楕円形
（３）増殖の形式：出芽
（ｂ）胞子形成の有無
胞子形成する
（ｃ）生理学的・化学分類学的性質
（１）最適生育条件（ｐＨ）：４．５〜６．５
（２）生育の範囲（ｐＨ）：２．５〜８．０
（３）硝酸塩の資化：なし
（４）脂肪の分解：なし
（５）尿素の分解：なし
（６）カロチノイドの生成：なし
（７）顕著な有機酸の生成：なし
【００２１】
さらに、このＨＧＹ９株に代表されるような本発明によって取得されるＧＳＨ高生産パン酵母を使用して、ＧＳＨ高含有のイーストパウダー（乾燥酵母粉末）を製造することができる。製造方法としては、アミノ酸としてグリシン、システイン（Ｌ−システイン塩酸塩）、グルタミン酸を添加した培地（例えば糖蜜など）で培養し菌体洗浄、殺菌（不活性化）、乾燥粉末化（スプレードライなど）すること等により、例えば、４％以上のＧＳＨ含量である（乾燥菌体重量あたり４％以上のＧＳＨを含有する）イーストパウダーを得ることができる。
【００２２】
このようにして製造したＧＳＨ高含有のイーストパウダーは、各種食品、サプリメント、化粧品等に添加することができ、その機能性、安全性も高い。例えば、パン製造においてパン生地に０．０１〜０．０５％程度添加することで、生地の伸展性が向上しパン成形をしやすくする（つまり製パン性を向上させる）ことができる。
【００２３】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験Ｉ）
市販パン酵母よりＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００２５】
まず、オリエンタル酵母工業社製品のパン酵母（ＯＹＣ−１０２）に紫外線照射を３０秒間行った。このＵＶ処理したパン酵母を生理食塩水に懸濁し、ＹＭＰＤ寒天培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース１％、寒天２％）に塗布し、３０℃で２〜３日間培養した。さらに、その生育したコロニーを３０ｍＬのＹＰＤ培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）に植菌し、ＯＤ６１０＝１となるまで２８℃で振盪培養した。この培養液全量を滅菌水で遠心洗浄し、３ｍＬの滅菌水に懸濁した。
【００２６】
一次スクリーニングとして、上記菌体懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（１００μＭ）入りＳＤ培地（グルコース２％、寒天１．５％、イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）０．６７％）に塗布した。同様に、塩化カドミウム２００μＭ、３００μＭ入りＳＤ培地にも塗布した。２８℃で１週間培養し、出現した各コロニーをピックアップした。
【００２７】
二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで得たコロニーを上述と同様の方法で菌体懸濁液を作製し、この菌体懸濁液１００μＬをシクロヘキシミド４〜６μｇ／ｍｌ入りＳＤ培地に塗布した。そして、２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。
【００２８】
得られた株について、ＧＳＨ含量を以下の方法で測定した。
まず、ＹＰＤ培地５ｍＬが入った試験管にスクリーニングで取得した菌株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養したものを１００ｍＬのＹＭＰＤ培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース３％）が入ったフラスコに全量植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００２９】
上記培養液を定法で２回菌体洗浄し、洗浄培養菌体とした。これを、表１に示したＧＳＨ誘導培養条件で培養した。使用する糖は、糖蜜を用いて常に糖濃度が３５％となるように希釈して使用した。アミノ酸は、添加量をイオン交換水で溶解し、８時間目に溶解液を添加した。糖蜜及びアミノ酸の添加は、マルチホルダー付きシリンジポンプＰＨＤ２０００（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を用いた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
このＧＳＨ誘導培養液を１０ｍＬ回収し、定法で２回菌体洗浄後に滅菌水で５ｍＬにメスアップした。ここから５００μＬを１．５ｍＬチューブに取り、８５℃で１０分間の熱処理を行った。その後、１００００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行い、上清を回収した。これを超純水で適宜希釈し、分光光度計法によりＧＳＨ量を測定した。そして、５ｍＬにメスアップした懸濁液の乾燥重量を測定し、乾物あたりのＧＳＨ含量を算出した。
この測定の結果、４１株のＧＳＨ高生産パン酵母を取得できた（図１のＯＹＣ造成１〜５１）。
【実施例２】
【００３２】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験ＩＩ）
同様に、市販パン酵母よりＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００３３】
オリエンタル酵母工業社製品のパン酵母（ＯＹＣ−１０２、変異処理なし）を、試験管にてＹＰＤ培地を用い２８℃で９６時間振盪培養した。さらに、その培養液の一部を３０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、ＯＤ６１０＝１となるまで２８℃で振盪培養した。この培養液全量を滅菌水で遠心洗浄し、３ｍＬの滅菌水に懸濁した。
【００３４】
一次スクリーニングとして、上記懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（１００μＭ）入りＳＤ培地（グルコース２％、寒天１．５％、イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）０．６７％）に塗布した。同様に、塩化カドミウム２００μＭ、３００μＭ入りＳＤ培地にも塗布した。２８℃で１週間培養し、出現した各コロニーをピックアップした。
【００３５】
二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで得たコロニーを上述と同様の方法で懸濁液を作製し、この懸濁液１００μＬをシクロヘキシミド４〜６μｇ／ｍｌ入りＳＤ培地に塗布した。そして、２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。
【００３６】
三次スクリーニングとして、二次スクリーニングで得たコロニーをＹＰＤ培地を用い２８℃で振盪培養し、対数増殖期及び定常期のチオレドキシンタンパク（ＴＲＸ）をウエスタンブロット法で観察し、対数増殖期及び定常期の両方ともチオレドキシン量が親株であるＯＹＣ−１０２の２倍以上の菌株を選抜した。
得られた株について、実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定し、１株を選抜した（ＹＳＭ−３、図１）。
【００３７】
このＹＳＭ−３を親株とし、そのまま（変異処理を行わずに）及びＥＭＳ処理（ＥＭＳを３％含有する溶液に菌体を懸濁させ、２８℃で２０分間処理）したものについて実施例１と同様の方法で菌体懸濁液を作製した。そして、一次スクリーニングとして菌体懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（８００μＭ）入りＳＤ培地に塗布して２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。二次スクリーニングは、実施例１と同様の方法でシクロヘキシミド耐性株を選抜した。
得られた株について実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定し、２３株のＧＳＨ高生産パン酵母を取得できた。
【実施例３】
【００３８】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験ＩＩＩ）
実施例１及び２で得られたＧＳＨ高生産パン酵母の１倍体を交雑させてより好適なＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００３９】
実施例１で得られたＧＳＨ高生産パン酵母４１株と、実施例２で得られたＧＳＨ高生産パン酵母２３株からＧＳＨ含量が高い株を候補株として数株ずつ選び、さらにその他の適正などを考慮して各１株を選抜し、それぞれの１倍体（接合型）を定法により取得した。これら１倍体を接合法により交雑して、新たなＧＳＨ高生産パン酵母を造成し、これをサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株とした。
【００４０】
このサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株について、前培養後、アミノ酸（グリシン・Ｌ−システイン塩酸塩・グルタミン酸）を添加した糖蜜で３０℃２４時間ＧＳＨ合成培養を行い、菌体洗浄、１２１℃１５分間の殺菌処理を行った後にスプレードライ処理をしてＨＧＹ９株のイーストパウダーを製造した。これを、実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定した結果、４％以上のＧＳＨ含量であること（乾燥菌体重量あたり４％以上のＧＳＨを含有すること）が示された。
【実施例４】
【００４１】
（パン製造試験）
実施例３で製造したＨＧＹ９株のイーストパウダーを用いて、パン製造時の添加効果を確認するため以下の試験を行った。
【００４２】
強力粉２００ｇに塩、砂糖、イーストフード等を適量添加したものに、実施例３で製造したＨＧＹ９株のイーストパウダーを対粉０．０１６％添加した。これに１３６ｇ加水して混捏しパン生地を作製した後、市販パン酵母を用いて定法により食パンを製造した。対照区として、イーストパウダー無添加のもの（その他の配合はイーストパウダー添加区と同じ）も同様に作製した。
【００４３】
結果を表２に示した。対照区（無添加）と比較してイーストパウダー添加区は分割時の生地伸展性が良好であり、また、製品の食感（歯切れ）も良好であった。したがって、パン生地へのイーストパウダー添加により、製パン製向上及び食感改善効果が発揮されることが示された。
【００４４】
【表２】
【００４５】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００４６】
本発明は、新規なグルタチオン高生産パン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末及びその製造方法、及び、当該方法により得られた乾燥酵母粉末を用いたパンなどの食品の製造方法等を提供することを目的とする。
【００４７】
そして、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から一次としてカドミウム耐性株、二次としてシクロヘキシミド耐性株をスクリーニングすることで、グルタチオン高生産パン酵母を造成する。
【００４８】
本発明において寄託手続が進められている微生物の受領番号を下記に示す。
（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン高生産パン酵母の造成方法等に関する。詳細には、グルタチオンを高生産するパン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（以下、ＧＳＨという）はグルタミン酸、グリシン、システインからなるトリペプチドあり、生体内に広く分布する物質である。そして、その機能としては、抗酸化機能、美白効果、肝機能維持等が知られている。近年では、米粉パンの製パン性を高めるという報告などもされている。
【０００３】
このような背景、及び、昨今の消費者の健康志向から、機能性素材のひとつとしてＧＳＨを多く含有し食品として使用できる素材が求められている。そして、酵母を用いて、ＧＳＨを高発現させる試みやＧＳＨ高生産酵母を取得する試みが多く行われ、ＧＳＨ高含有イーストパウダー等が開発されている。
【０００４】
例えば、酵母のＧＳＨ発現を高める方法として、培地にアミノ酸を添加する方法（特許文献１）、亜鉛イオンを制限する方法（特許文献２）、通常よりも低い培養温度で培養する方法（特許文献３）など培養条件を工夫するものが開示されている。また、突然変異剤処理により、エチオニン・亜硫酸塩耐性株（特許文献４）、ポリエン系抗生物質耐性株（特許文献５）などからＧＳＨ高生産株を取得したことも報告されている。
【０００５】
しかし、これらの多くはキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）であり、食品への利用頻度・利用適性が高く且つ長年の食習慣があり安全性が担保されているパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での開発例は少ない。特許文献２はパン酵母の例ではあるが、ＧＳＨ生産量が充分とは言えない。このような背景の中、簡便で且つ効率的なＧＳＨ高生産パン酵母の培養方法や造成方法の更なる開発が望まれていた。
【０００６】
つまり、より簡便且つ効果的な（実用的な）ＧＳＨを高生産するパン酵母造成方法、当該方法により得られたパン酵母を用いたＧＳＨ高含有乾燥酵母粉末の製造技術等の開発が当業界において強く求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５３−０９４０８９号公報
【特許文献２】特開平０１−１４１５９１号公報
【特許文献３】特開昭６０−１５６３７９号公報
【特許文献４】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献５】特開２００３−２８４５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なグルタチオン高生産パン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末及びその製造方法、及び、当該方法により得られた乾燥酵母粉末を用いたパン等の食品の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から複数種の薬剤の耐性株を複数回のスクリーニング操作を行うことによりＧＳＨを高生産する菌株を簡便に取得できることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
（２）パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得し、三次スクリーニングとしてチオレドキシン高含有株を選択して取得したものを親株とすること、を特徴とする（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載の方法によって得られたグルタチオン高生産パン酵母の１倍体を取得し、これら（例えば、異なる親株由来の１倍体どうし）を交雑して２倍体を造成すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
（４）変異処理が、ＥＭＳ処理及び／又はＵＶ処理であること、を特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）グルタチオンが乾燥酵母粉末あたり４重量％以上（例えば、４〜５重量％）含有するグルタチオン高生産パン酵母を造成すること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法により造成したグルタチオン高生産パン酵母。
（７）グルタチオン高生産パン酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
（８）（６）又は（７）に記載のグルタチオン高生産パン酵母をグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地（例えば、各アミノ酸を０．７〜０．８重量％含有する培地）で培養したものを用いて製造すること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上（例えば、４〜５重量％）含有する乾燥酵母粉末の製造方法。
（９）（６）又は（７）に記載のグルタチオン高生産パン酵母を用いて製造してなること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末。
（１０）（９）に記載の乾燥酵母粉末（（８）に記載の製造方法により得られた乾燥酵母粉末）をパン生地に添加して製造すること、を特徴とするパンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、薬剤耐性株の複数回スクリーニング、あるいはそれらの１倍体の交雑等を行うだけで簡便且つ効率的にＧＳＨ高生産パン酵母を取得することができる。そして、当該方法により得られたパン酵母を用いてグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地で培養するだけで、簡便且つ効率的にＧＳＨを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末を製造でき、当該乾燥酵母粉末は製パン性向上目的等でパン製造などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法で得られたＧＳＨ高生産酵母の乾燥菌体あたりのＧＳＨ含量を示すグラフである。なお、ＯＹＣ−１０２は親株であり、丸印は交雑のための１倍体取得の候補株を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、本発明では、ＧＳＨ高生産パン酵母造成の親株として、市販のパン酵母を含むあらゆる公知のパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用することができる。また、その形態も、生酵母、乾燥酵母など酵母が死滅していない状態であれば特に限定されない。
【００１４】
そして、これをそのまま薬剤耐性株スクリーニングの親株として用いても良いが、これを突然変異処理したものを親株として用いても良い。突然変異処理は、物理的方法及び化学的方法のいずれもが使用可能である。物理的方法としては、一定時間の紫外線照射処理（ＵＶ処理）、放射線（例えばγ線）照射などがあり、化学的方法としては、例えば、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を一定時間懸濁させる処理方法などがあるが、ＥＭＳ処理又はＵＶ処理が特に好ましい。これらの方法は、適宜組み合わせて行うこともできる。また、突然変異処理した親株と変異処理を行っていないそのままの親株（自然株）を混合して用いることもできる。
【００１５】
なお、本発明においては、特定の遺伝子の付加・欠損等をさせた遺伝子組換え体パン酵母は親株として使用しない。よって、本発明では、遺伝子組換え体でない、つまり野生株が偶発的に変異した変異株又は上記突然変異処理により出現した変異株からＧＳＨ高生産パン酵母を取得することができ、食品に用いても安全性は問題ない。
【００１６】
次に、スクリーニングは、一次スクリーニングにカドミウム耐性株の選抜、二次スクリーニングにシクロヘキシミド耐性株の選抜を行う。この順番でスクリーニングを行うことにより、ＧＳＨ合成系酵素遺伝子の発現を活性化する転写因子Ｙａｐ１が活性化した菌株を取得することが可能となると推定され、効率良くＧＳＨを高含有する菌株を取得することができる。したがって、このスクリーニング順を逆にしたり、２薬剤のスクリーニングを同時に行う（同じ培地で行う）ことは好ましくない。スクリーニングの際の培地へのカドミウム添加量は、塩化カドミウム濃度として１００〜１０００μＭなどが例示され、シクロヘキシミド添加量としては３〜１０μｇ／ｍｌなどが例示される。
【００１７】
更に、三次スクリーニングとして、対数増殖期及び定常期の両方においてチオレドキシン（ＴＲＸ）高含有である株をウエスタンブロット法等によって選択して取得し、これを親株として再度カドミウム耐性株、シクロヘキシミド耐性株をスクリーニングすることで、より好適なＧＳＨ高生産パン酵母を取得することもできる。選抜基準としては、対数増殖期及び定常期の両方において親株の２倍以上のものを選抜することが例示される。
【００１８】
更には、上述の方法で取得したＧＳＨ高生産パン酵母の１倍体を取得して、異なる親株由来のものどうし又は同じ親株由来のものどうしを交雑することによって、更に好適なＧＳＨ高生産パン酵母を取得することもできる。交雑方法は、接合型の１倍体を用いた接合法が好適であるが、プロトプラスト融合等も可能である。また、マーカー遺伝子を用いて交雑株の選択を更に容易にすることもできる。
【００１９】
本発明では、上述のような手法により目的とするＧＳＨ高生産パン酵母を簡便且つ効率的に取得することができる。一例として挙げると、市販パン酵母を親株としてＧＳＨ高生産パン酵母を取得するのに成功し、ＨＧＹ９株と命名した。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２０１１年（平成２３年）３月３１日付けでＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１として受領された。
【００２０】
本発明により取得したサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株の主な菌学的性質を例示すると、以下の通りである。
（ａ）ＹＭ液体培地で生育させたときの菌の形態
（１）栄養細胞の大きさ：大きさ４〜１４μｍ、幅３〜７μｍ
（２）栄養細胞の形状：楕円形
（３）増殖の形式：出芽
（ｂ）胞子形成の有無
胞子形成する
（ｃ）生理学的・化学分類学的性質
（１）最適生育条件（ｐＨ）：４．５〜６．５
（２）生育の範囲（ｐＨ）：２．５〜８．０
（３）硝酸塩の資化：なし
（４）脂肪の分解：なし
（５）尿素の分解：なし
（６）カロチノイドの生成：なし
（７）顕著な有機酸の生成：なし
【００２１】
さらに、このＨＧＹ９株に代表されるような本発明によって取得されるＧＳＨ高生産パン酵母を使用して、ＧＳＨ高含有のイーストパウダー（乾燥酵母粉末）を製造することができる。製造方法としては、アミノ酸としてグリシン、システイン（Ｌ−システイン塩酸塩）、グルタミン酸を添加した培地（例えば糖蜜など）で培養し菌体洗浄、殺菌（不活性化）、乾燥粉末化（スプレードライなど）すること等により、例えば、４％以上のＧＳＨ含量である（乾燥菌体重量あたり４％以上のＧＳＨを含有する）イーストパウダーを得ることができる。
【００２２】
このようにして製造したＧＳＨ高含有のイーストパウダーは、各種食品、サプリメント、化粧品等に添加することができ、その機能性、安全性も高い。例えば、パン製造においてパン生地に０．０１〜０．０５％程度添加することで、生地の伸展性が向上しパン成形をしやすくする（つまり製パン性を向上させる）ことができる。
【００２３】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験Ｉ）
市販パン酵母よりＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００２５】
まず、オリエンタル酵母工業社製品のパン酵母（ＯＹＣ−１０２）に紫外線照射を３０秒間行った。このＵＶ処理したパン酵母を生理食塩水に懸濁し、ＹＭＰＤ寒天培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース１％、寒天２％）に塗布し、３０℃で２〜３日間培養した。さらに、その生育したコロニーを３０ｍＬのＹＰＤ培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）に植菌し、ＯＤ６１０＝１となるまで２８℃で振盪培養した。この培養液全量を滅菌水で遠心洗浄し、３ｍＬの滅菌水に懸濁した。
【００２６】
一次スクリーニングとして、上記菌体懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（１００μＭ）入りＳＤ培地（グルコース２％、寒天１．５％、イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）０．６７％）に塗布した。同様に、塩化カドミウム２００μＭ、３００μＭ入りＳＤ培地にも塗布した。２８℃で１週間培養し、出現した各コロニーをピックアップした。
【００２７】
二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで得たコロニーを上述と同様の方法で菌体懸濁液を作製し、この菌体懸濁液１００μＬをシクロヘキシミド４〜６μｇ／ｍｌ入りＳＤ培地に塗布した。そして、２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。
【００２８】
得られた株について、ＧＳＨ含量を以下の方法で測定した。
まず、ＹＰＤ培地５ｍＬが入った試験管にスクリーニングで取得した菌株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養したものを１００ｍＬのＹＭＰＤ培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース３％）が入ったフラスコに全量植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００２９】
上記培養液を定法で２回菌体洗浄し、洗浄培養菌体とした。これを、表１に示したＧＳＨ誘導培養条件で培養した。使用する糖は、糖蜜を用いて常に糖濃度が３５％となるように希釈して使用した。アミノ酸は、添加量をイオン交換水で溶解し、８時間目に溶解液を添加した。糖蜜及びアミノ酸の添加は、マルチホルダー付きシリンジポンプＰＨＤ２０００（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を用いた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
このＧＳＨ誘導培養液を１０ｍＬ回収し、定法で２回菌体洗浄後に滅菌水で５ｍＬにメスアップした。ここから５００μＬを１．５ｍＬチューブに取り、８５℃で１０分間の熱処理を行った。その後、１００００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行い、上清を回収した。これを超純水で適宜希釈し、分光光度計法によりＧＳＨ量を測定した。そして、５ｍＬにメスアップした懸濁液の乾燥重量を測定し、乾物あたりのＧＳＨ含量を算出した。
この測定の結果、４１株のＧＳＨ高生産パン酵母を取得できた（図１のＯＹＣ造成１〜５１）。
【実施例２】
【００３２】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験ＩＩ）
同様に、市販パン酵母よりＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００３３】
オリエンタル酵母工業社製品のパン酵母（ＯＹＣ−１０２、変異処理なし）を、試験管にてＹＰＤ培地を用い２８℃で９６時間振盪培養した。さらに、その培養液の一部を３０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、ＯＤ６１０＝１となるまで２８℃で振盪培養した。この培養液全量を滅菌水で遠心洗浄し、３ｍＬの滅菌水に懸濁した。
【００３４】
一次スクリーニングとして、上記懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（１００μＭ）入りＳＤ培地（グルコース２％、寒天１．５％、イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）０．６７％）に塗布した。同様に、塩化カドミウム２００μＭ、３００μＭ入りＳＤ培地にも塗布した。２８℃で１週間培養し、出現した各コロニーをピックアップした。
【００３５】
二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで得たコロニーを上述と同様の方法で懸濁液を作製し、この懸濁液１００μＬをシクロヘキシミド４〜６μｇ／ｍｌ入りＳＤ培地に塗布した。そして、２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。
【００３６】
三次スクリーニングとして、二次スクリーニングで得たコロニーをＹＰＤ培地を用い２８℃で振盪培養し、対数増殖期及び定常期のチオレドキシンタンパク（ＴＲＸ）をウエスタンブロット法で観察し、対数増殖期及び定常期の両方ともチオレドキシン量が親株であるＯＹＣ−１０２の２倍以上の菌株を選抜した。
得られた株について、実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定し、１株を選抜した（ＹＳＭ−３、図１）。
【００３７】
このＹＳＭ−３を親株とし、そのまま（変異処理を行わずに）及びＥＭＳ処理（ＥＭＳを３％含有する溶液に菌体を懸濁させ、２８℃で２０分間処理）したものについて実施例１と同様の方法で菌体懸濁液を作製した。そして、一次スクリーニングとして菌体懸濁液１００μＬを塩化カドミウム（８００μＭ）入りＳＤ培地に塗布して２８℃で１週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。二次スクリーニングは、実施例１と同様の方法でシクロヘキシミド耐性株を選抜した。
得られた株について実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定し、２３株のＧＳＨ高生産パン酵母を取得できた。
【実施例３】
【００３８】
（ＧＳＨ高生産パン酵母造成試験ＩＩＩ）
実施例１及び２で得られたＧＳＨ高生産パン酵母の１倍体を交雑させてより好適なＧＳＨ高生産パン酵母を造成するため、以下の試験を行った。
【００３９】
実施例１で得られたＧＳＨ高生産パン酵母４１株と、実施例２で得られたＧＳＨ高生産パン酵母２３株からＧＳＨ含量が高い株を候補株として数株ずつ選び、さらにその他の適正などを考慮して各１株を選抜し、それぞれの１倍体（接合型）を定法により取得した。これら１倍体を接合法により交雑して、新たなＧＳＨ高生産パン酵母を造成し、これをサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株とした。
【００４０】
このサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株について、前培養後、アミノ酸（グリシン・Ｌ−システイン塩酸塩・グルタミン酸）を添加した糖蜜で３０℃２４時間ＧＳＨ合成培養を行い、菌体洗浄、１２１℃１５分間の殺菌処理を行った後にスプレードライ処理をしてＨＧＹ９株のイーストパウダーを製造した。これを、実施例１と同様の方法でＧＳＨ含量を測定した結果、４％以上のＧＳＨ含量であること（乾燥菌体重量あたり４％以上のＧＳＨを含有すること）が示された。
【実施例４】
【００４１】
（パン製造試験）
実施例３で製造したＨＧＹ９株のイーストパウダーを用いて、パン製造時の添加効果を確認するため以下の試験を行った。
【００４２】
強力粉２００ｇに塩、砂糖、イーストフード等を適量添加したものに、実施例３で製造したＨＧＹ９株のイーストパウダーを対粉０．０１６％添加した。これに１３６ｇ加水して混捏しパン生地を作製した後、市販パン酵母を用いて定法により食パンを製造した。対照区として、イーストパウダー無添加のもの（その他の配合はイーストパウダー添加区と同じ）も同様に作製した。
【００４３】
結果を表２に示した。対照区（無添加）と比較してイーストパウダー添加区は分割時の生地伸展性が良好であり、また、製品の食感（歯切れ）も良好であった。したがって、パン生地へのイーストパウダー添加により、製パン製向上及び食感改善効果が発揮されることが示された。
【００４４】
【表２】
【００４５】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００４６】
本発明は、新規なグルタチオン高生産パン酵母の造成方法、及び、当該方法により得られたパン酵母を用いたグルタチオン高含有乾燥酵母粉末及びその製造方法、及び、当該方法により得られた乾燥酵母粉末を用いたパンなどの食品の製造方法等を提供することを目的とする。
【００４７】
そして、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又は変異処理した当該パン酵母から一次としてカドミウム耐性株、二次としてシクロヘキシミド耐性株をスクリーニングすることで、グルタチオン高生産パン酵母を造成する。
【００４８】
本発明において寄託手続が進められている微生物の受領番号を下記に示す。
（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
【請求項２】
パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得し、三次スクリーニングとしてチオレドキシン高含有株を選択して取得したものを親株とすること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法によって得られたグルタチオン高生産パン酵母の１倍体を取得し、これらを交雑して２倍体を造成すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
【請求項４】
変異処理が、ＥＭＳ処理及び／又はＵＶ処理であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グルタチオンが乾燥酵母粉末あたり４重量％以上含有するグルタチオン高生産パン酵母を造成すること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により造成したグルタチオン高生産パン酵母。
【請求項７】
グルタチオン高生産パン酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のグルタチオン高生産パン酵母をグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地で培養したものを用いて製造すること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末の製造方法。
【請求項９】
請求項６又は７に記載のグルタチオン高生産パン酵母を用いて製造してなること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末。
【請求項１０】
請求項９に記載の乾燥酵母粉末をパン生地に添加して製造すること、を特徴とするパンの製造方法。
【請求項１】
パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
【請求項２】
パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得し、三次スクリーニングとしてチオレドキシン高含有株を選択して取得したものを親株とすること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法によって得られたグルタチオン高生産パン酵母の１倍体を取得し、これらを交雑して２倍体を造成すること、を特徴とするグルタチオン高生産パン酵母の造成方法。
【請求項４】
変異処理が、ＥＭＳ処理及び／又はＵＶ処理であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グルタチオンが乾燥酵母粉末あたり４重量％以上含有するグルタチオン高生産パン酵母を造成すること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により造成したグルタチオン高生産パン酵母。
【請求項７】
グルタチオン高生産パン酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＧＹ９株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８１）。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のグルタチオン高生産パン酵母をグリシン、システイン塩酸塩及びグルタミン酸を含有する培地で培養したものを用いて製造すること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末の製造方法。
【請求項９】
請求項６又は７に記載のグルタチオン高生産パン酵母を用いて製造してなること、を特徴とするグルタチオンを４重量％以上含有する乾燥酵母粉末。
【請求項１０】
請求項９に記載の乾燥酵母粉末をパン生地に添加して製造すること、を特徴とするパンの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２１３３６１（Ｐ２０１２−２１３３６１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８１０８１（Ｐ２０１１−８１０８１）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第３項適用申請有り 食品開発展 Ｈｉ／Ｓ−ｔｅｃ Ｊａｐａｎ ２０１０，ＵＢＭメディア株式会社 主催，平成２２年１０月１３日から１５日 開催
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第３項適用申請有り 食品開発展 Ｈｉ／Ｓ−ｔｅｃ Ｊａｐａｎ ２０１０，ＵＢＭメディア株式会社 主催，平成２２年１０月１３日から１５日 開催
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【Ｆターム（参考）】
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