コラーゲン合成促進剤およびコラーゲン代謝賦活剤
【構成】グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸、およびコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，コラーゲン合成促進物質がアスコルビン酸またはその誘導体である前記のコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンのモル含有率が３：２：１である前記のコラーゲン合成促進剤，前記のコラーゲン合成促進剤とコラゲナーゼ産生促進剤を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤。
【効果】線維芽細胞に作用して、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質のコラーゲン蛋白合成能を高めることができる。また、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【効果】線維芽細胞に作用して、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質のコラーゲン蛋白合成能を高めることができる。また、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は医薬，化粧品等に適用可能であり、また生化学の実験用試薬としても有用なコラーゲン合成促進剤およびコラーゲン代謝賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】通常の蛋白質の代謝回転（新陳代謝）に比べ、コラーゲンの代謝回転速度は非常に遅く、生理的条件に於いても、老化に伴ってコラーゲンの代謝回転速度がさらに低下していくことが知られている。コラーゲンの代謝回転速度はコラーゲンの分解速度と合成速度により決まるが、この様な老化に伴う代謝回転速度の低下はコラーゲンの架橋構造（老化架橋）の増加につながり、例えば、皮膚の硬化やしわの形成に関わっている。難分解・難抽出性の固いコラーゲンが増加することにより、細胞の足場として増殖・分化・移動に関与するコラーゲンの機能が損なわれ、細胞活性の低下を来し、さらにコラーゲンの代謝回転速度が低下するという悪循環に陥ると考えられている（現代化学、12月号、36頁、1990年参照）。
【０００３】この様な老化に伴うコラーゲン代謝回転速度の低下を食い止めるためには、コラーゲン代謝の鍵となる酵素コラゲナーゼの活性を賦活し分解を促すとともに、コラーゲンの合成速度を高めてやることにより、新しいコラーゲンを供給する必要がある。
【０００４】細胞のコラーゲン合成能を賦活するものとして、アスコルビン酸誘導体，エストラジオール，テストステロン等が知られている。これらはコラーゲン遺伝子を刺激するあるいは、蛋白合成後の律速過程を解除することによりコラーゲンの合成速度を上昇させるものである。
【０００５】しかし、前記のコラーゲン合成促進剤を用いても、実際には、コラーゲン合成量は不十分であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的とするところは、コラーゲン蛋白の合成を円滑に促すコラーゲン合成促進剤を提供するにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上述の目的は、グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸、およびコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，コラーゲン合成促進物質がアスコルビン酸またはその誘導体である前記のコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンのモル含有率が３：２：１である前記のコラーゲン合成促進剤，前記のコラーゲン合成促進剤とコラゲナーゼ産生促進剤を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤により達成される。
【０００８】本発明に用いられるグリシン、プロリン、アラニンの各アミノ酸モル比はアラニン１に対し、グリシンとプロリンは各々０．１〜１０の範囲で可能であるが、好ましくはコラーゲンのアミノ酸構成比に近く、合成促進の作用が最も強い３：２：１（グリシン：プロリン：アラニン）であることが望ましい（試験例２参照）。
【０００９】これらのアミノ酸でコラーゲン合成促進剤を調製し、コラーゲン合成促進物質を添加した細胞系に、補助剤として添加使用することができるが、予めコラーゲン合成促進物質とともにコラーゲン合成促進剤として調製して用いても良い。
【００１０】本発明に用いられるコラーゲン合成促進物質としては、コラーゲン合成促進物質として一般に知られているものを用いることができるが、老化予防化粧品として皮膚に適用するときは、皮膚線維芽細胞の存在する真皮層（結合組織）への作用が大きいので、アスコルビン酸およびその誘導体，エストロジェン，テストステロンなどの様な低分子物質が望ましい。
【００１１】本発明に用いられるコラゲナーゼ産生促進剤としては、絹ペプチド（特願平３−５９７５２号）、セリン，Ｎ−メチルセリン（特開平４−１１３０号）、硫酸塩，アンモニウム塩，硝酸塩（特願平４−３５５６５２号），エタノールアミン誘導体（特開平３−２９４２２２号）、ペントキシフィリンなどが挙げられる。これらのコラゲナーゼ産生促進剤とコラーゲン合成促進剤を含有するコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【００１２】本発明のコラーゲン合成促進剤およびコラーゲン代謝賦活剤を、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末、顆粒剤、錠剤等が挙げられる。
【００１３】その例として、本発明のコラーゲン合成促進剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、蝋、樹脂、水および要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤に混合することによって、化粧品や医薬品を製造することができる。
【００１４】その際のコラーゲン合成促進剤の含有量は剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として好ましくは０. ００１〜２重量％（アミノ酸固形物として）、更に好ましくは０. ０１１〜１重量％である。また、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質の含有量は、０．０１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．１〜３重量％である。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものはさらに添加量を増やすことができる。また、予めコラーゲン合成促進物質を含む細胞系に補助剤として用いる際には、１０5 コ／ｍｌの細胞系の場合、例えばアミノ酸として３０ｍＭ含有するコラーゲン合成促進剤溶液を、０．５〜２．０容量％程度添加すれば良い。
【００１５】
【発明の効果】本発明のコラーゲン合成促進剤は、線維芽細胞に作用して、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質のコラーゲン蛋白合成能を高めることができる。また、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、それに先立って、本発明のコラーゲン合成促進能の試験方法を記載する。
【００１７】（コラーゲン合成促進能測定試験法）正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ(ATCCCRL 1506) 〕の細胞密度を１０容量％ウシ胎仔血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０5 個／ｍｌに調整し、２４穴プレートにそれぞれ０. ４ｍｌずつ播種（４ｘ１０4 個／穴）して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
【００１８】尚、ＭＥＭ培地は、大日本製薬社製最少必須培地１０−１０１に、０. １２重量％炭酸水素ナトリウムを添加して調製した。
【００１９】２４時間後培養液を吸引除去し、終濃度０. ６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した後、４００μｌの、終濃度５００μg/mlのアスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムと０. ６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で置換した。
【００２０】コラーゲン合成促進剤溶液をポアーサイズが０. ２μｍのニトロセルロース膜（アドバンテック東洋製、DISMIC-25 ）で濾過滅菌後、各ウェルに終濃度０．５〜２容量％となるよう添加した。
【００２１】２４時間同様の条件で培養した後、β−アミノプロピオニトリルを終濃度５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを最終１μＣｉ／ｍｌ添加して、さらに２４時間培養した（培養検液）。
【００２２】コラーゲン産生量の定量：コラーゲンの産生量は上記の培養検液より、ペプシンに耐性かつ食塩濃度依存的溶解度によって分画されたコラーゲン画分に取り込まれた放射活性で測定した。ペプシン処理及び食塩濃度によるコラーゲンの分画法は、Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（Analytical Biochemistry ，２２０頁，１９７９年参照）に準じた。
【００２３】実施例１〜３グリシン、プロリン、アラニンの３アミノ酸を表１記載の様に混ぜ合わせ、モル比として１：１：１（実施例１）、１：２：３（実施例２）、３：２：１（実施例３）のコラーゲン合成促進剤を得た。
【００２４】
【表１】
混合時の各アミノ酸量をｇ数で表示
【００２５】尚、細胞添加実験においては、実施例１〜３記載のコラーゲン合成促進剤を各々２７９．２９ｍｇ、２８６．３１ｍｇ、２７２．２９ｍｇとり、それぞれの最終容量が１００ｍｌになるように水に溶かして、総アミノ酸濃度が３０ｍＭのコラーゲン合成促進剤溶液を作製した。
【００２６】（試験例１）実施例１記載のコラーゲン合成促進剤溶液を最終濃度０．５〜１．５容量％で、アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムを含有する細胞培養系に添加し、前述の試験をおこなった結果を表２に示した。なお、比較例１としてコラーゲン合成促進剤溶液を添加しない（アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのみ）群を設けた。
【００２７】
【表２】
平均値 ±標準偏差（ｎ＝４）
【００２８】表２からわかるように実施例１記載のコラーゲン合成促進剤は、用量依存的に強いコラーゲン合成促進活性を示した。
【００２９】（試験例２）実施例１〜３記載のコラーゲン合成促進剤を水に溶かして総アミノ酸濃度が３０ｍＭのコラーゲン合成促進剤溶液を調製し、最終濃度１容量％で、アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムを含有する細胞培養系に添加して試験例１と同様の試験をおこなった結果を表３に示した。なお、比較例２としてコラーゲン合成促進剤溶液を添加しない（アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのみ）群を設けた。
【００３０】
【表３】
平均値 ±標準偏差（ｎ＝３）
【００３１】表３からわかるように実施例１〜３コラーゲン合成促進剤はどれもアスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのコラーゲン合成促進能を増強したが、なかでも実施例３記載のコラーゲン合成促進剤が最も強いコラーゲン合成促進能をもっていた。
【００３２】以上の結果から、本発明で用いたコラーゲン合成促進剤が線維芽細胞に働いてコラーゲン合成促進物質であるアスコルビン酸誘導体の効果を増大させることがわかった。
【００３３】以下に本発明のコラーゲン合成促進剤またはコラーゲン代謝賦活剤を応用した組成物の処方例を示す。
【００３４】処方例１−軟膏実施例３のコラーゲン合成促進剤３ｍｇと下記親水性成分とを、湯浴で８０℃に加温して混合し、これを、８０℃に加温した下記の親油性成分混合物に攪拌しながら徐々に加えた。次に、ホモジナイザー（TOKUSYUKIKA KOGYO 製）で２分半激しく攪拌(2500rpm) して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却し、１００ｇ中に０．００３重量％のコラーゲン合成促進剤を含む軟膏を得た。
【００３５】
「親水性成分」 （ｇ）
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０３ パラオキシ安息香酸メチル ０.１ プロピレングリコール ６.７ 精製水 ４４.１
【００３６】
「親油性成分」
スクワラン ４.７ 白色ワセリン ２４.０ ステアリルアルコール ８.７ ミリスチン酸イソプロピル ６.０ モノステアリン酸ポリエチレングリコール（４５E.O.）
（商品名NIKKOL MYS-45 、日本サーファクタント工業（株）製） １.３ ジポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸（２E.O.）
（商品名NIKKOL DDP-2、日本サーファクタント工業（株）製） ２.３ モノステアリン酸グリセリン ２.０ パラオキシ安息香酸ブチル ０.１─────────────────────────────────── 計 １００
【００３７】処方例２−ローション（コラゲナーゼ産生促進剤の調製）塩化カルシウムの６０重量％水溶液４００ｍｌに、精錬絹原料５６ｇを加熱溶解した。この際、溶解を容易にするため、エチルアルコール１６０ｍｌを添加した。次いで、これを２４時間透析し濃縮後、１８重量％の可溶化フィブロイン水溶液３１２ｍｌを得た。
【００３８】このうち２３５ｍｌに濃硫酸１６５ｍｌをゆっくりと加え、６０℃で６時間加温した。次いでこれに水を加え総量１．８ｌとし、室温で一夜放置後氷冷しながら水酸化ナトリウムで中和、濾過することにより絹ペプチド溶液を得た（濃度２３５重量％）。
【００３９】（コラーゲン代謝賦活剤の調製）上記で得た絹ペプチド溶液と本発明のコラーゲン合成促進剤を下表に従って配合しローションを作製した（コラーゲン代謝賦活剤含有ローション）。
【００４０】
重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 １.０ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０３ コラゲナーゼ産生促進剤（絹ペプチド溶液） ０.１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４１】
処方例３−ローション 重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 ０．００１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４２】
処方例４−ローション 重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 ２.０ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０.０１ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン ２.０ Ｎ−メチルエタノールアミン ３.０ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４３】
処方例５−ローション 重量％ 実施例１のコラーゲン合成促進剤 ０．１ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０１ エタノール １３.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４４】
処方例６−ローション 重量％ 実施例２のコラーゲン合成促進剤 ０．５ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.１ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン １.０ Ｎ−メチルエタノールアミン １.０ エタノール １２.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.５ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４５】
処方例７−ローション 重量％ 実施例２のコラーゲン合成促進剤 ０．００１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４６】処方例８−入浴剤実施例３のコラーゲン合成促進剤３ｇと下記成分とを混合し、コラーゲン代謝賦活剤としての入浴剤１００ｇを得た。
【００４７】
香料 ０．１ｇ 有機色素 １０ｍｇ 炭酸水素ナトリウム １４．９ｇ 硫酸ナトリウム ５０．０ｇ 硫酸アンモニウム ３５．０ｇ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０．３ｇ
【００４８】尚、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００４９】処方例９−クリーム下表の成分（Ｃ）を約８０℃で均一に混合溶解し、約８０℃で均一に混合溶解しておいた成分（Ａ）中に加えて乳化したのち、約５０℃で均一に混合溶解しておいた成分（Ｂ）を添加し、約３０℃まで冷却して調製した。
【００５０】
（Ａ） 配合量（％）
スクワラン １０.０ オリーブ油 １０.０ 固形パラフィン ５.０ セタノール ４.０ ソルビタンモノステアレート ２.０ ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（20E.O.） ２.０（Ｂ）
実施例３記載のコラーゲン合成促進剤 ０.５ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ２.０ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン ２.０ 精製水 ２５.５（Ｃ）
グリセリン ５.０ メチルパラベン ０.１ 精製水 残量
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は医薬，化粧品等に適用可能であり、また生化学の実験用試薬としても有用なコラーゲン合成促進剤およびコラーゲン代謝賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】通常の蛋白質の代謝回転（新陳代謝）に比べ、コラーゲンの代謝回転速度は非常に遅く、生理的条件に於いても、老化に伴ってコラーゲンの代謝回転速度がさらに低下していくことが知られている。コラーゲンの代謝回転速度はコラーゲンの分解速度と合成速度により決まるが、この様な老化に伴う代謝回転速度の低下はコラーゲンの架橋構造（老化架橋）の増加につながり、例えば、皮膚の硬化やしわの形成に関わっている。難分解・難抽出性の固いコラーゲンが増加することにより、細胞の足場として増殖・分化・移動に関与するコラーゲンの機能が損なわれ、細胞活性の低下を来し、さらにコラーゲンの代謝回転速度が低下するという悪循環に陥ると考えられている（現代化学、12月号、36頁、1990年参照）。
【０００３】この様な老化に伴うコラーゲン代謝回転速度の低下を食い止めるためには、コラーゲン代謝の鍵となる酵素コラゲナーゼの活性を賦活し分解を促すとともに、コラーゲンの合成速度を高めてやることにより、新しいコラーゲンを供給する必要がある。
【０００４】細胞のコラーゲン合成能を賦活するものとして、アスコルビン酸誘導体，エストラジオール，テストステロン等が知られている。これらはコラーゲン遺伝子を刺激するあるいは、蛋白合成後の律速過程を解除することによりコラーゲンの合成速度を上昇させるものである。
【０００５】しかし、前記のコラーゲン合成促進剤を用いても、実際には、コラーゲン合成量は不十分であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的とするところは、コラーゲン蛋白の合成を円滑に促すコラーゲン合成促進剤を提供するにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上述の目的は、グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸、およびコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤，コラーゲン合成促進物質がアスコルビン酸またはその誘導体である前記のコラーゲン合成促進剤，グリシン、プロリン、アラニンのモル含有率が３：２：１である前記のコラーゲン合成促進剤，前記のコラーゲン合成促進剤とコラゲナーゼ産生促進剤を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤により達成される。
【０００８】本発明に用いられるグリシン、プロリン、アラニンの各アミノ酸モル比はアラニン１に対し、グリシンとプロリンは各々０．１〜１０の範囲で可能であるが、好ましくはコラーゲンのアミノ酸構成比に近く、合成促進の作用が最も強い３：２：１（グリシン：プロリン：アラニン）であることが望ましい（試験例２参照）。
【０００９】これらのアミノ酸でコラーゲン合成促進剤を調製し、コラーゲン合成促進物質を添加した細胞系に、補助剤として添加使用することができるが、予めコラーゲン合成促進物質とともにコラーゲン合成促進剤として調製して用いても良い。
【００１０】本発明に用いられるコラーゲン合成促進物質としては、コラーゲン合成促進物質として一般に知られているものを用いることができるが、老化予防化粧品として皮膚に適用するときは、皮膚線維芽細胞の存在する真皮層（結合組織）への作用が大きいので、アスコルビン酸およびその誘導体，エストロジェン，テストステロンなどの様な低分子物質が望ましい。
【００１１】本発明に用いられるコラゲナーゼ産生促進剤としては、絹ペプチド（特願平３−５９７５２号）、セリン，Ｎ−メチルセリン（特開平４−１１３０号）、硫酸塩，アンモニウム塩，硝酸塩（特願平４−３５５６５２号），エタノールアミン誘導体（特開平３−２９４２２２号）、ペントキシフィリンなどが挙げられる。これらのコラゲナーゼ産生促進剤とコラーゲン合成促進剤を含有するコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【００１２】本発明のコラーゲン合成促進剤およびコラーゲン代謝賦活剤を、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末、顆粒剤、錠剤等が挙げられる。
【００１３】その例として、本発明のコラーゲン合成促進剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、蝋、樹脂、水および要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤に混合することによって、化粧品や医薬品を製造することができる。
【００１４】その際のコラーゲン合成促進剤の含有量は剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として好ましくは０. ００１〜２重量％（アミノ酸固形物として）、更に好ましくは０. ０１１〜１重量％である。また、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質の含有量は、０．０１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．１〜３重量％である。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものはさらに添加量を増やすことができる。また、予めコラーゲン合成促進物質を含む細胞系に補助剤として用いる際には、１０5 コ／ｍｌの細胞系の場合、例えばアミノ酸として３０ｍＭ含有するコラーゲン合成促進剤溶液を、０．５〜２．０容量％程度添加すれば良い。
【００１５】
【発明の効果】本発明のコラーゲン合成促進剤は、線維芽細胞に作用して、アスコルビン酸誘導体等のコラーゲン合成促進物質のコラーゲン蛋白合成能を高めることができる。また、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、コラーゲンの合成と分解の両方を促進することができる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、それに先立って、本発明のコラーゲン合成促進能の試験方法を記載する。
【００１７】（コラーゲン合成促進能測定試験法）正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ(ATCCCRL 1506) 〕の細胞密度を１０容量％ウシ胎仔血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０5 個／ｍｌに調整し、２４穴プレートにそれぞれ０. ４ｍｌずつ播種（４ｘ１０4 個／穴）して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
【００１８】尚、ＭＥＭ培地は、大日本製薬社製最少必須培地１０−１０１に、０. １２重量％炭酸水素ナトリウムを添加して調製した。
【００１９】２４時間後培養液を吸引除去し、終濃度０. ６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した後、４００μｌの、終濃度５００μg/mlのアスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムと０. ６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で置換した。
【００２０】コラーゲン合成促進剤溶液をポアーサイズが０. ２μｍのニトロセルロース膜（アドバンテック東洋製、DISMIC-25 ）で濾過滅菌後、各ウェルに終濃度０．５〜２容量％となるよう添加した。
【００２１】２４時間同様の条件で培養した後、β−アミノプロピオニトリルを終濃度５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを最終１μＣｉ／ｍｌ添加して、さらに２４時間培養した（培養検液）。
【００２２】コラーゲン産生量の定量：コラーゲンの産生量は上記の培養検液より、ペプシンに耐性かつ食塩濃度依存的溶解度によって分画されたコラーゲン画分に取り込まれた放射活性で測定した。ペプシン処理及び食塩濃度によるコラーゲンの分画法は、Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（Analytical Biochemistry ，２２０頁，１９７９年参照）に準じた。
【００２３】実施例１〜３グリシン、プロリン、アラニンの３アミノ酸を表１記載の様に混ぜ合わせ、モル比として１：１：１（実施例１）、１：２：３（実施例２）、３：２：１（実施例３）のコラーゲン合成促進剤を得た。
【００２４】
【表１】
混合時の各アミノ酸量をｇ数で表示
【００２５】尚、細胞添加実験においては、実施例１〜３記載のコラーゲン合成促進剤を各々２７９．２９ｍｇ、２８６．３１ｍｇ、２７２．２９ｍｇとり、それぞれの最終容量が１００ｍｌになるように水に溶かして、総アミノ酸濃度が３０ｍＭのコラーゲン合成促進剤溶液を作製した。
【００２６】（試験例１）実施例１記載のコラーゲン合成促進剤溶液を最終濃度０．５〜１．５容量％で、アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムを含有する細胞培養系に添加し、前述の試験をおこなった結果を表２に示した。なお、比較例１としてコラーゲン合成促進剤溶液を添加しない（アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのみ）群を設けた。
【００２７】
【表２】
平均値 ±標準偏差（ｎ＝４）
【００２８】表２からわかるように実施例１記載のコラーゲン合成促進剤は、用量依存的に強いコラーゲン合成促進活性を示した。
【００２９】（試験例２）実施例１〜３記載のコラーゲン合成促進剤を水に溶かして総アミノ酸濃度が３０ｍＭのコラーゲン合成促進剤溶液を調製し、最終濃度１容量％で、アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムを含有する細胞培養系に添加して試験例１と同様の試験をおこなった結果を表３に示した。なお、比較例２としてコラーゲン合成促進剤溶液を添加しない（アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのみ）群を設けた。
【００３０】
【表３】
平均値 ±標準偏差（ｎ＝３）
【００３１】表３からわかるように実施例１〜３コラーゲン合成促進剤はどれもアスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウムのコラーゲン合成促進能を増強したが、なかでも実施例３記載のコラーゲン合成促進剤が最も強いコラーゲン合成促進能をもっていた。
【００３２】以上の結果から、本発明で用いたコラーゲン合成促進剤が線維芽細胞に働いてコラーゲン合成促進物質であるアスコルビン酸誘導体の効果を増大させることがわかった。
【００３３】以下に本発明のコラーゲン合成促進剤またはコラーゲン代謝賦活剤を応用した組成物の処方例を示す。
【００３４】処方例１−軟膏実施例３のコラーゲン合成促進剤３ｍｇと下記親水性成分とを、湯浴で８０℃に加温して混合し、これを、８０℃に加温した下記の親油性成分混合物に攪拌しながら徐々に加えた。次に、ホモジナイザー（TOKUSYUKIKA KOGYO 製）で２分半激しく攪拌(2500rpm) して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却し、１００ｇ中に０．００３重量％のコラーゲン合成促進剤を含む軟膏を得た。
【００３５】
「親水性成分」 （ｇ）
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０３ パラオキシ安息香酸メチル ０.１ プロピレングリコール ６.７ 精製水 ４４.１
【００３６】
「親油性成分」
スクワラン ４.７ 白色ワセリン ２４.０ ステアリルアルコール ８.７ ミリスチン酸イソプロピル ６.０ モノステアリン酸ポリエチレングリコール（４５E.O.）
（商品名NIKKOL MYS-45 、日本サーファクタント工業（株）製） １.３ ジポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸（２E.O.）
（商品名NIKKOL DDP-2、日本サーファクタント工業（株）製） ２.３ モノステアリン酸グリセリン ２.０ パラオキシ安息香酸ブチル ０.１─────────────────────────────────── 計 １００
【００３７】処方例２−ローション（コラゲナーゼ産生促進剤の調製）塩化カルシウムの６０重量％水溶液４００ｍｌに、精錬絹原料５６ｇを加熱溶解した。この際、溶解を容易にするため、エチルアルコール１６０ｍｌを添加した。次いで、これを２４時間透析し濃縮後、１８重量％の可溶化フィブロイン水溶液３１２ｍｌを得た。
【００３８】このうち２３５ｍｌに濃硫酸１６５ｍｌをゆっくりと加え、６０℃で６時間加温した。次いでこれに水を加え総量１．８ｌとし、室温で一夜放置後氷冷しながら水酸化ナトリウムで中和、濾過することにより絹ペプチド溶液を得た（濃度２３５重量％）。
【００３９】（コラーゲン代謝賦活剤の調製）上記で得た絹ペプチド溶液と本発明のコラーゲン合成促進剤を下表に従って配合しローションを作製した（コラーゲン代謝賦活剤含有ローション）。
【００４０】
重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 １.０ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０３ コラゲナーゼ産生促進剤（絹ペプチド溶液） ０.１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４１】
処方例３−ローション 重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 ０．００１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４２】
処方例４−ローション 重量％ 実施例３のコラーゲン合成促進剤 ２.０ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０.０１ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン ２.０ Ｎ−メチルエタノールアミン ３.０ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４３】
処方例５−ローション 重量％ 実施例１のコラーゲン合成促進剤 ０．１ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.０１ エタノール １３.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４４】
処方例６−ローション 重量％ 実施例２のコラーゲン合成促進剤 ０．５ アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 ０.１ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン １.０ Ｎ−メチルエタノールアミン １.０ エタノール １２.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ グリセリン ２.５ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４５】
処方例７−ローション 重量％ 実施例２のコラーゲン合成促進剤 ０．００１ エタノール １０.０ 乳酸 ０.３ クエン酸ナトリウム ０.１ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０.１ グリセリン ２.０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００重量％
【００４６】処方例８−入浴剤実施例３のコラーゲン合成促進剤３ｇと下記成分とを混合し、コラーゲン代謝賦活剤としての入浴剤１００ｇを得た。
【００４７】
香料 ０．１ｇ 有機色素 １０ｍｇ 炭酸水素ナトリウム １４．９ｇ 硫酸ナトリウム ５０．０ｇ 硫酸アンモニウム ３５．０ｇ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ０．３ｇ
【００４８】尚、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００４９】処方例９−クリーム下表の成分（Ｃ）を約８０℃で均一に混合溶解し、約８０℃で均一に混合溶解しておいた成分（Ａ）中に加えて乳化したのち、約５０℃で均一に混合溶解しておいた成分（Ｂ）を添加し、約３０℃まで冷却して調製した。
【００５０】
（Ａ） 配合量（％）
スクワラン １０.０ オリーブ油 １０.０ 固形パラフィン ５.０ セタノール ４.０ ソルビタンモノステアレート ２.０ ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（20E.O.） ２.０（Ｂ）
実施例３記載のコラーゲン合成促進剤 ０.５ アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩 ２.０ Ｎ−メチル−Ｌ−セリン ２.０ 精製水 ２５.５（Ｃ）
グリセリン ５.０ メチルパラベン ０.１ 精製水 残量
【特許請求の範囲】
【請求項１】 グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤。
【請求項２】 グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸、およびコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤。
【請求項３】 コラーゲン合成促進物質がアスコルビン酸またはその誘導体である請求項１または２記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項４】 グリシン、プロリン、アラニンのモル含有率が３：２：１である請求項１〜３いずれかに記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項５】 請求項１〜４いずれかに記載のコラーゲン合成促進剤とコラゲナーゼ産生促進剤を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤。
【請求項１】 グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤。
【請求項２】 グリシン、プロリン、アラニンの３種のアミノ酸、およびコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤。
【請求項３】 コラーゲン合成促進物質がアスコルビン酸またはその誘導体である請求項１または２記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項４】 グリシン、プロリン、アラニンのモル含有率が３：２：１である請求項１〜３いずれかに記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項５】 請求項１〜４いずれかに記載のコラーゲン合成促進剤とコラゲナーゼ産生促進剤を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤。
【公開番号】特開平７−１９４３７５
【公開日】平成７年（１９９５）８月１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−３５２６５４
【出願日】平成５年（１９９３）１２月２８日
【出願人】（００００００９５２）鐘紡株式会社 (120)
【公開日】平成７年（１９９５）８月１日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）１２月２８日
【出願人】（００００００９５２）鐘紡株式会社 (120)
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