ブラシノステロイド生合成関連遺伝子
【課題】ブラシノステロイド生合成反応関連遺伝子を得ることを課題とする。
【解決手段】シロイヌナズナＢＰＲ２ ｃＤＮＡのクローニングを行い、ＢＰＲ１との同一性を調べ、４３.３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を得る。ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子であるブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【解決手段】シロイヌナズナＢＰＲ２ ｃＤＮＡのクローニングを行い、ＢＰＲ１との同一性を調べ、４３.３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を得る。ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子であるブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブラシノステロイド生合成関連遺伝子に関する。さらに詳しくは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ブラシノステロイドの生合成に関わる酵素遺伝子を過剰発現させることにより、ブラシノステロイドの生合成能が増強された有用植物が得られることが確認されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。しかし、過剰発現させる酵素遺伝子の違いによって、表現型や蓄積するブラシノステロイドの種類および量が異なるため、効率的に有用植物を得ることは難しかった。
【０００３】
そこで、本発明者らはシロイヌナズナにおいて、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する複数の生合成酵素遺伝子を制御する調節因子（ＢＰＲ１）を見出した。そして、本発明者らは、この発現量を制御することによって、ブラシノステロイドの生合成能を増強した有用植物や、形態形成が調節された植物が効率的に得られることについて先に出願している（特願２００６−２６６３３４）。
【０００４】
このような調節因子が、シロイヌナズナにおいて複数みつかれば、ブラシノステロイドの生合成能を増強した有用植物等をより効率的に得られると考えられる。また、シロイヌナズナ以外の他の植物においても、このような因子が存在すれば、同様に有用植物や、形態形成が調節された植物を効率的に得ることができると考えられる。
【０００５】
しかし、他の植物においては、例えば、イネのブラシノライドとオーキシンで発現が顕著に促進される遺伝子（例えば、特許文献１参照）や、ブラシノステロイド感受性を高め、イネの成長および発生過程で機能する遺伝子（例えば、特許文献２参照）等が見出されているものの、ブラシノステロイドの生合成酵素遺伝子の発現調節に関わる遺伝子については知られていない。
【非特許文献１】Ｃｈｏｅ， Ｓ． Ｆｕｊｉｏｋａ， Ｓ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｔ． Ｔａｋａｔｓｕｔｏ， Ｓ． Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ． ａｎｄ Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｋ．Ａ． （２００１） Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＷＡＲＦ４ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｅｅｄ ｙｉｅｌｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２６： ５７３−５８２．
【非特許文献２】Ｋｉｍ， Ｔ．Ｗ． Ｈｗａｎｇ， Ｊ．Ｙ． Ｋｉｍ， Ｙ．Ｓ． Ｊｏｏ， Ｓ．Ｈ． Ｃｈａｎｇ， Ｓ．Ｃ． Ｌｅｅ， Ｊ．Ｓ． Ｔａｋａｔｓｕｔｏ， Ｓ． ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｓ．Ｋ． （２００５） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＹＰ８５Ａ２， ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０， ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｔａｓｔｅｒｏｎｅ ｔｏ ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ ｉｎ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １７： ２３９７−２４１２．
【非特許文献３】Ｋｉｍ， Ｇ．Ｔ． Ｔｓｕｋａｙａ， Ｈ． Ｓａｉｔｏ， Ｙ． ａｎｄ Ｕｃｈｉｍｉｙａ， Ｈ． （１９９９） Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈａｐｅｓ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｕｐｏｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６： ９４３３−９４３７．
【特許文献１】特開２００３−３３４０８５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００１／０７３０３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はブラシノステロイド生合成関連遺伝子として、新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シロイヌナズナにおいて、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）と同様に、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する複数の酵素遺伝子を制御する新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）を見出した。そして、これが調節因子（ＢＰＲ１）と協調して働き、葉身、葉柄等の形態が変化した植物が得られることを確認した。また、本発明者らは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の遺伝子破壊変異を相補する因子をシロイヌナズナ以外の他の植物において見出し、本発明を完成するに至った。
これらのブラシノステロイド生合成関連遺伝子は、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、協調的に働くことで同様の機能を発揮するため有用である。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１７）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子等に関する。
（１）ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（２）配列表配列番号６または配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（３）配列表配列番号５または配列番号３７〜４１のいずれかに記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（４）ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（５）上記（４）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（６）ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）がブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する調節因子である上記（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）制御される酵素遺伝子がＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２である上記（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
（９）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより形質転換された植物。
（１０）形質転換によって、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した上記（９）に記載の植物。
（１１）上記（９）または（１０）に記載の植物とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された植物とを交配することによって得られる、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した植物。
（１２）マメ科またはアブラナ科の植物である上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の植物。
（１３）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該ポリヌクレオチドの発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御することにより、該植物の形態を変化させる方法。
（１４）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列表配列番号６のアミノ酸配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
（１５）（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表配列番号５の塩基配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（１６）上記（４）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子であって、ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のいずれかである相同因子。
（１７）ミヤコグサ、ダイズ、イネまたはトマトから選ばれる植物由来である上記（１６）に記載の相同因子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のブラシノステロイド生合成関連遺伝子である新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）と協調的に、またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を単独で働かせることで、シロイヌナズナや他の植物（特にイネ、ダイズ、トマトなどの重要作物）において有用な植物を効率的に得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」とは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むもののことをいう。この「４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列」には、例えば、配列表配列番号６または配列番号４２〜４６に記載のアミノ酸配列や、配列表配列番号５または配列番号３７〜４１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列等が挙げられる。これらのアミノ酸配列とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列との同一性は表１に示した。
【００１１】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」には、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子の相同因子等が含まれる。これらの「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」は、公知の「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子」と協調的に働くものであることが好ましい。
【００１２】
ここで、「協調的に働く」とは、公知の「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子」とともに、それぞれの機能がそのまままたは相乗的に作用することをいう。
例えば、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１、ＢＰＲ２）をともに働かせることで、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のブラシノステロイド生合成に関わる酵素であるＣＹＰ８５Ａ１、ＣＹＰ９０Ｃ１およびＣＹＰ９０Ｄ１をコードする遺伝子の転写を制御する機能と、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）の同様の酵素であるＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の転写を制御する機能とがともに作用すること等が挙げられる。
【００１３】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」のひとつである、「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）」は、ブラシノステロイド生合成反応経路において、該反応を触媒する酵素遺伝子の転写活性を調節する因子である。
「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）」は、シロイヌナズナのブラシノステロイド生合成反応経路において、酵素遺伝子ＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の発現を調節し、そのアミノ酸配列に、配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列表配列番号５にコードされるいずれかのアミノ酸配列を含むものであることが好ましい。
【００１４】
本発明の「ポリヌクレオチド」とは、植物から抽出、単離した天然のポリヌクレオチドであってもよく、また、その塩基配列に従って、ＰＣＲ等の公知の方法によって合成したものであってもよい。
【００１５】
本発明の「プラスミド」とは、プラスミドに組み込んだ遺伝子を増幅するために、大腸菌に形質転換するプラスミドと、組み込んだ遺伝子を発現するために、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ（旧名称Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））を通じて植物に形質転換するプラスミドのいずれも含まれる。形質転換する対象に応じて、公知のベクターを用いることができる。
【００１６】
本発明の「植物の形態を変化させる方法」とは、上記で作製したプラスミドをエレクトロポレーション法、パーティクルガン法等の公知の方法によってリゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株等に導入した後、得られたリゾビウム・ラジオバクターの形質転換体を花序浸し法等の公知の方法によって植物に取り込むことにより行うことができる。
また、このような方法によって形態が変化した植物と、他のポリヌクレオチドを導入することによって形態が変化した植物とを交配することによっても行うことができる。
【００１７】
本発明の「形態が変化した植物」とは、上記のような方法で形質転換された植物が、本発明のブラシノステロイド生合成反応の調節因子の発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する、例えば、当該酵素遺伝子の転写を活性化または抑制することにより、該植物の形態が変化した植物のことをいう。
【００１８】
本発明のタンパク質とは、植物から抽出、単離した天然のタンパク質であってもよく、また、そのアミノ酸配列や、それをコードする塩基配列に従って、公知の方法によって合成されたものであってもよい。
【００１９】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」のひとつである、「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子」は、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の欠失変異を補う作用を有する因子のことをいう。
このような「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子」は、そのアミノ酸配列に、配列表配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列または配列表配列番号３７〜４１にコードされるいずれかのアミノ酸配列を含むことが好ましい。例えば、ミヤコグサのＬｊＢＰＲ１、ダイズのＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、イネのＯｓＢＰＲ１、トマトのＬｅＢＰＲ１等が挙げられる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）の取得＞
１．シロイヌナズナＢＰＲ２ ｃＤＮＡのクローニング
日本ＤＮＡデータバンクのＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて多重配列整列および近接結合法による系統樹を作成し、ＮＪｐｌｏｔソフトウェアで表示することによってＢＰＲ１の系統樹解析を行った。その結果、アミノ酸レベルで４９％の同一性を示すＢＰＲ１のパラログ遺伝子であるＡｔ３ｇ１５０５０を見出し、ＢＰＲ２と命名した。
培養土で栽培したシロイヌナズナの長角果からＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン製）を用いてｃＤＮＡを得た。
これらのｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ｏｘ＿Ｕ１（配列表配列番号１）およびＡｔ３ｇ１５０５０ｏｘ＿Ｌ１（配列表配列番号２）のプライマーとＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて９４℃ ２分間の後、９４℃ １５秒間次いで６０℃ ３０秒間さらに６８℃ １分間の保温を１サイクルとして１０サイクルからなるＰＣＲ反応を行った。
【００２１】
さらに、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン製）を用いてクローニングするために、得られた反応物を鋳型にして、ａｔｔＢ１（配列表配列番号３）およびａｔｔＢ２（配列表配列番号４）のプライマーとＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いて９４℃ ２分間の後、９４℃ １５秒間次いで５５℃ ３０秒間さらに６８℃ １分間の保温を１サイクルとして２０サイクルからなるＰＣＲ反応を行い、ａｔｔＢアダプター配列を付加した。
【００２２】
ａｔｔＢアダプター配列を付加したＰＣＲ産物をＢＰクロナーゼ（インビトロジェン製）によって、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー対応のドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン製）にクローニングして、ＢＰＲ２ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２を得た。ｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてＤＮＡシーケンスを行った結果、ＢＰＲ２の塩基配列を配列番号５、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【００２３】
２．ＢＰＲ２の大腸菌発現ベクターの構築
上記実施例１、１．において調製したシロイヌナズナｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ｐＥＴ２１ａ＿Ｕ１（配列表配列番号７）および Ａｔ３ｇ１５０５０ｐＥＴ２１ａ＿Ｌ１（配列表配列番号８）のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いて、９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで６０℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲ反応を行った。
反応物を電気泳動し、約０．９ ｋｂの増幅断片を切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（キューバイオジーン製）を用いて精製した。そのｃＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ製）にクローニングした。得られたプラスミド（以下、ｐＧＥＭ−ＡｔＢＰＲ２とする）のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＤＮＡシーケンスを行い、塩基配列を確認した。
【００２４】
ｐＧＥＭ−ＡｔＢＰＲ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、約０．９ ｋｂの断片を切り出し、精製した。一方、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン製）も制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。これらをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２を得た。ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＤＮＡシーケンスを行い、配列を再度確認した。大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を、ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２で形質転換し、発現ベクターを得た。
【００２５】
３．ＢＰＲ２とＢＰＲ１の同一性の確認
ＢＰＲ２とＢＰＲ１のアミノ酸配列の同一性を、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製）を使用して調べ、結果を図１に示した。これらの同一性は４９％であった。
【実施例２】
【００２６】
＜カルモジュリン結合アッセイ＞
１ｍＭのＩＰＴＧを添加した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を２８℃で４時間培養することでＢＰＲ２のＴ７融合タンパクを発現誘導した。培養終了後、遠心分離により集菌し、氷冷したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で菌体を洗浄後、同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。氷上において超音波処理により菌体を破砕した後、遠心分離し上清を回収し、０．４５μｍのメンブランフィルター（アドバンテック製）でろ過した。リン酸緩衝液で平衡化した１００μｌのカルモジュリンアガロースビーズ（シグマ製）と１ｍＭのＣａＣｌ２または５ｍＭのＥＧＴＡを添加した ５００μｌの粗タンパク質抽出液を混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【００２７】
遠心分離してカルモジュリンアガロースビーズを回収後、５００μｌのリン酸緩衝液で４回、最後に１００μｌで洗浄した。洗浄後のカルモジュリンアガロースビーズは５０μｌの４×ＳＤＳサンプル処理液（ノバジェン製）に懸濁し、１００℃で３分間加熱して結合タンパクを溶出した。次にＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、粗タンパク質抽出液、カルモジュリンアガロースビーズ未結合画分、最終洗浄画分、結合画分を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【００２８】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転写緩衝液（１５．６ｍＭ Ｔｒｉｓ，１２０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ，０．１％ ＳＤＳ）中でセミドライ型の転写装置（バイオ・ラッド製）を用いて２０Ｖで３０分間の条件でＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド製）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をブロッティング溶液に浸し、室温で一晩振とうした。その後、ＴＢＳＴ緩衝液で１００００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識Ｔ７タグ抗体（Ｔ７・Ｔａｇ ＡＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｋｉｔ， ノバジェン製）の溶液に浸して室温で３０分間穏やかに振とうした。次いで転写膜をＴＢＳＴ溶液で２分間５回の洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるＣＤＰ−Ｓｔａｒで処理し、化学発光検出した。その結果、図２に示すように、Ｔ７タグ融合タンパク質として大腸菌で発現させたＢＰＲ２はｉｎ ｖｉｔｒｏでカルシウムイオンの存在下でカルモジュリンと結合することがわかった。
【実施例３】
【００２９】
＜ＢＰＲ２遺伝子の機能の解析＞
１．ＢＰＲ２の植物発現ベクターの構築
ＬＲクロナーゼ（インビトロジェン製）を用いて、上記実施例１、１．において作製したｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２のＡｔＢＰＲ２ ｃＤＮＡ部位をデスティネーションベクターｐＧＷＢ２に組み換え、ｐＧＷＢ２−ＡｔＢＰＲ２を得た。
【００３０】
２．ＢＰＲ２過剰発現体の作製
上記１．で作製したｐＧＷＢ２−ＡｔＢＰＲ２を、リゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株にエレクトロポレーション法で導入した。形質転換リゾビウム・ラジオバクター ＥＨＡ１０１株はハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーをハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ液体培地で２８℃一晩の前培養をした後、２８℃で一晩の本培養を行った。シロイヌナズナの形質転換は花序浸し法（参考文献１参照）によって行った。得られたＴ１種子を表面殺菌し、ハイグロマイシン（４０ｍｇ／ｌ）とカルベニシリン（４００ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地に播種した。Ｔ２種子を回収し、ホモ個体を選抜した。
［参考文献１］
Ｃｌｏｕｇｈ， Ｓ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｎｔ， Ａ．Ｆ． （１９９８） Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ： ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６： ７３５−７４３．
【００３１】
３．ＢＰＲ２遺伝子破壊変異体の単離
Ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＩＧｎＡＬ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔａｂｏｕｔ．ｈｔｍｌ）からＢＰＲ２遺伝子のエキソン領域にＴ−ＤＮＡが挿入したＳＡＬＫ＿１１１４０を見出した。Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）からその種子を取り寄せ、Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｕ１（配列表配列番号９）および Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｌ１（配列表配列番号１０）のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによってＢＰＲ２遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。
【００３２】
４．ＢＰＲ２過剰発現および破壊変異体の表現型解析
ＭＳ培地に野生型、ＧＵＳ遺伝子発現植物体、上記２．で作製したＢＰＲ２過剰発現体、上記３．で単離したＢＰＲ２破壊変異体を播種した。発芽２４日後の幼植物体を比較したところ、図３に示すようにＢＰＲ２過剰発現体はロゼット葉の上偏成長が見られた。
【００３３】
５．ブラシノライド処理した野生型シロイヌナズナのロゼット葉の表現型解析
発芽１４日目の野生型シロイヌナズナの葉柄の付け根を１μＭのブラシノライドで６日間処理した後、１３日間生育させた結果、図４で示すようにロゼット葉の上偏成長が見られた。これは図３で示したＢＰＲ２過剰発現体の表現型と類似しており、ＢＰＲ２過剰発現体はブラシノライドの内生量が増加していることが示唆された。
【００３４】
６．ＢＰＲ２過剰発現・破壊変異体のブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析
発芽２０日後の野生型、ＧＵＳ遺伝子発現植物体、上記２．で作製したＢＰＲ２過剰発現体、上記３．で単離したＢＰＲ２破壊変異体のロゼット葉から調製した上記実施例１、１．と同様の方法でｃＤＮＡを調整した。
ＲＴ−ＰＣＲにはＤＥＴ２，ＣＹＰ９０Ｂ１（ＤＷＦ４），ＣＹＰ９０Ａ１（ＣＰＤ），ＣＹＰ７２Ｂ１（ＢＡＳ１），ＣＹＰ９０Ｃ１（ＲＯＴ３），ＣＹＰ９０Ｄ１，ＣＹＰ８５Ａ１，ＣＹＰ８５Ａ２の各ブラシノステロイド生合成酵素遺伝子について、次の配列番号からなる特異的プライマーを使用した。
ＤＥＴ２：ＤＥＴ２＿Ｕ１（配列番号１１）およびＤＥＴ２＿Ｌ１（配列番号１２）
ＣＹＰ９０Ｂ１（ＤＷＦ４）：ＣＹＰ９０Ｂ１＿Ｕ１（配列番号１３）およびＣＹＰ９０Ｂ１＿Ｌ１（配列番号１４）
ＣＹＰ９０Ａ１（ＣＰＤ）：ＣＹＰ９０Ａ１＿Ｕ１（配列番号１５）およびＣＹＰ９０Ａ１＿Ｌ１（配列番号１６）
ＣＹＰ９０Ｃ１（ＲＯＴ３）：ＣＹＰ９０Ｃ１＿Ｕ１（配列番号１７）およびＣＹＰ９０Ｃ１＿Ｌ１（配列番号１８）
ＣＹＰ９０Ｄ１：ＣＹＰ９０Ｄ１＿Ｕ１（配列番号１９）およびＣＹＰ９０Ｄ１＿Ｌ１（配列番号２０）
ＣＹＰ８５Ａ１：ＣＹＰ８５Ａ１＿Ｕ１（配列番号２１）およびＣＹＰ８５Ａ１＿Ｌ１（配列番号２２）
ＣＹＰ８５Ａ２：ＣＹＰ８５Ａ２＿Ｕ１（配列番号２３）およびＣＹＰ８５Ａ２＿Ｌ１（配列番号２４）
ＣＹＰ７２Ｂ１（ＢＡＳ１）：ＣＹＰ７２Ｂ１＿Ｕ１（配列番号２５）およびＣＹＰ７２Ｂ１＿Ｌ１（配列番号２６）
【００３５】
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて、９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで５５−６２℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクルは各々の遺伝子によって最適化した。内部標準として、コントロールのプライマーＡｔＵＢＱ１０＿Ｕ１（配列表配列番号２７）およびＡｔＵＢＱ１０＿Ｌ１（配列表配列番号２８）を使用した。その結果、図５に示すように、ＢＰＲ２がブラシノステロイド生合成の後期反応に関わる酵素であるＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の転写を正に制御していることが明らかとなった。
【００３６】
７．ＢＰＲ２過剰発現・破壊変異体のブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析
シロイヌナズナのエコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ−０の花、長角果、茎、二次葉、ロゼット葉、根から上記実施例１、１．と同様の方法でｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｕ１（配列表配列番号９）およびＡｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｌ１（配列表配列番号１０）のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで６３℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとして２８サイクルからなるＰＣＲ反応を行い、ＢＰＲ２の発現解析を行った。その結果、図６に示すように、長角果、茎、根でＢＰＲ２遺伝子の転写物が高蓄積していた。
【実施例４】
【００３７】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１、ＢＰＲ２）の協調性の検討＞
ＢＰＲ１とＢＰＲ２の協調的な機能の有無を確認するために、Ａｔｂｐｒ１変異体とＡｔｂｐｒ２変異体を交配し、２重変異体を作製した。その結果、図７で示すように２重変異体は成長が遅延し、長角果が短縮した。したがって、ＢＰＲ１とＢＰＲ２がシロイヌナズナの形態形成に関して協調的に機能することがわかった。
【００３８】
実施例３より、新規の調節因子（ＢＰＲ２）は、ブラシノステロイド生合成の後期反応を触媒する酵素（ＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２）の遺伝子発現を特異的に制御するブラシノステロイド生合成の調節因子であることが確認された。従って、これとブラシノステロイド生合成の後期反応を触媒する酵素（ＣＹＰ９０Ｃ１およびＣＹＰ８５Ａ１）の遺伝子発現を特異的に制御するＢＰＲ１を組み合わせることによって、複数の酵素遺伝子を制御することで、より効率的に有効な植物を得られることが示唆された。
【実施例５】
【００３９】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子の取得＞
１．ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマトからのＢＰＲ１オルソログ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
培養土で栽培したミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマトの幼植物体から実施例１と同様の方法でｃＤＮＡを得た。
これらのｃＤＮＡを鋳型にして、実施例１と同様の方法で、次のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは各植物のＢＰＲ１の全長ｃＤＮＡ配列を基にプライマー設計プログラム（ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製））を使用して設計し、合成（インビトロジェン社）した。
ミヤコグサ：ＬｊＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号２９）およびＬｊＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３０）
ダイズ：ＧｍＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３１）およびＧｍＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ２（配列番号３２）
イネ：ＯｓＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３３）およびＯｓＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３４）
トマト：ＬｅＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３５）およびＬｅＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３６）
【００４０】
ａｔｔＢアダプター配列を付加したＰＣＲ産物をそれぞれＢＰクロナーゼ（インビトロジェン製）によって、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン製）にクローニングした。これによって得られたプラスミド（ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｊＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＤＯＮＲ２２１−ＯｓＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｅＢＰＲ１とする）のインサート部分について実施例１と同様の方法でＤＮＡシーケンスを行った。得られた配列を配列表配列番号３７（以下、ＬｊＢＰＲ１とする）、３８（以下、ＧｍＢＰＲ１−１とする）、３９（以下、ＧｍＢＰＲ１−２とする）、４０（以下、ＯｓＢＰＲ１とする）、４１（以下、ＬｅＢＰＲ１とする）に示した。また、これらの塩基配列から該当すると思われるアミノ酸配列を配列番号４２、４３、４４、４５、４６に示した。
【００４１】
２．ＢＰＲ１と各植物種のＢＰＲ１相同因子の同一性の確認
ＢＰＲ１とＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のぞれぞれのアミノ酸配列の同一性を、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製）を使用して調べ、ぞれぞれの同一性を図８および表１に示した。その結果、これらの植物において４３．３％以上の一定の配列同一性を有するブラシノステロイド生合成関連遺伝子が存在することが示唆された。
【００４２】
【表１】
【００４３】
３．ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１、ＬｅＢＰＲ１の植物発現ベクターの構築
ＬＲクロナーゼ（インビトロジェン製）を用いて、上記実施例５、１．で作製したｐＤＯＮＲ２２１−ＬｊＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−１、 ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＤＯＮＲ２２１−ＯｓＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｅＢＰＲ１の各々のｃＤＮＡ部位をデスティネーションベクターｐＧＷＢ２に組み換えた。得られたＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１、ＬｅＢＰＲ１の植物発現ベクターをｐＧＷＢ２−ＬｊＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＧＷＢ２−ＯｓＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＬｅＢＰＲ１とした。
【００４４】
４．シロイヌナズナＡｔｂｐｒ１破壊変異体の形質転換
上記３．で作製したｐＧＷＢ２−ＬｊＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＧＷＢ２−ＯｓＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＬｅＢＰＲ１をそれぞれリゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株にエレクトロポレーション法で導入した。形質転換リゾビウム・ラジオバクター ＥＨＡ１０１株はハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーをハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ液体培地で２８℃ 一晩の前培養をした後、２８℃で一晩の本培養を行った。ＡｔＢＰＲ１遺伝子のプロモーター領域にＴ−ＤＮＡが挿入したＳＡＬＫ＿０４１３４８ラインをＴｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）から取り寄せ、自殖後代からＡｔｂｐｒ１破壊変異体を取得した。シロイヌナズナＡｔｂｐｒ１破壊変異体の形質転換は花序浸し法（上記参考文献１参照）によって行った。得られたＴ１種子を表面殺菌し、ハイグロマイシン（４０ｍｇ／ｌ）とカルベニシリン（４００ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地に播種した。回収したＴ２種子をＭＳ培地に播種した結果、図９に示すようにすべての形質転換体でＡｔｂｐｒ１破壊変異体の葉身と葉柄の長さが回復した。
【００４５】
この結果より、ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマト等の植物由来の遺伝子が、シロイヌナズナのブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）の遺伝子破壊変異を相補することが確認された。これらの遺伝子はブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）と一定の配列同一性をもち、同等の機能を示すことから、ブラシノステロイド生合成関連遺伝子として有用であると示唆された。また、このようなブラシノステロイド生合成の調節因子が高等植物に普遍的に存在する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のブラシノステロイド生合成関連遺伝子である新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を利用することで、シロイヌナズナ、ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマト等において効率的に有用植物を得ることは、農業等の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＢＰＲ１とＢＰＲ２の同一性を示した図である（実施例１）。
【図２】ＢＰＲ２のカルモジュリン結合アッセイの結果を示した図である（実施例２）。
【図３】ＢＰＲ２過剰発現および破壊変異体の表現型解析の結果を示した図である（実施例３）。
【図４】ブラシノライド処理による野生型ロゼット葉の表現型解析の結果を示した図である（実施例３）。
【図５】ブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析の結果を示した図である（実施例２）。
【図６】ＢＰＲ２の器官別発現解析の結果を示した図である（実施例２）。
【図７】ＢＰＲ１とＢＰＲ２の２重変異体の表現型解析の結果を示した図である（実施例４）。
【図８】ＢＰＲ１とＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１とＢＰＲ２の同一性を示した図である（実施例５）。
【図９】ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１によるＡｔｂｐｒ１破壊変異体の相補の結果を示した図である（実施例５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明はブラシノステロイド生合成関連遺伝子に関する。さらに詳しくは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ブラシノステロイドの生合成に関わる酵素遺伝子を過剰発現させることにより、ブラシノステロイドの生合成能が増強された有用植物が得られることが確認されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。しかし、過剰発現させる酵素遺伝子の違いによって、表現型や蓄積するブラシノステロイドの種類および量が異なるため、効率的に有用植物を得ることは難しかった。
【０００３】
そこで、本発明者らはシロイヌナズナにおいて、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する複数の生合成酵素遺伝子を制御する調節因子（ＢＰＲ１）を見出した。そして、本発明者らは、この発現量を制御することによって、ブラシノステロイドの生合成能を増強した有用植物や、形態形成が調節された植物が効率的に得られることについて先に出願している（特願２００６−２６６３３４）。
【０００４】
このような調節因子が、シロイヌナズナにおいて複数みつかれば、ブラシノステロイドの生合成能を増強した有用植物等をより効率的に得られると考えられる。また、シロイヌナズナ以外の他の植物においても、このような因子が存在すれば、同様に有用植物や、形態形成が調節された植物を効率的に得ることができると考えられる。
【０００５】
しかし、他の植物においては、例えば、イネのブラシノライドとオーキシンで発現が顕著に促進される遺伝子（例えば、特許文献１参照）や、ブラシノステロイド感受性を高め、イネの成長および発生過程で機能する遺伝子（例えば、特許文献２参照）等が見出されているものの、ブラシノステロイドの生合成酵素遺伝子の発現調節に関わる遺伝子については知られていない。
【非特許文献１】Ｃｈｏｅ， Ｓ． Ｆｕｊｉｏｋａ， Ｓ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｔ． Ｔａｋａｔｓｕｔｏ， Ｓ． Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ． ａｎｄ Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｋ．Ａ． （２００１） Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＷＡＲＦ４ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｅｅｄ ｙｉｅｌｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２６： ５７３−５８２．
【非特許文献２】Ｋｉｍ， Ｔ．Ｗ． Ｈｗａｎｇ， Ｊ．Ｙ． Ｋｉｍ， Ｙ．Ｓ． Ｊｏｏ， Ｓ．Ｈ． Ｃｈａｎｇ， Ｓ．Ｃ． Ｌｅｅ， Ｊ．Ｓ． Ｔａｋａｔｓｕｔｏ， Ｓ． ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｓ．Ｋ． （２００５） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＹＰ８５Ａ２， ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０， ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｔａｓｔｅｒｏｎｅ ｔｏ ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ ｉｎ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １７： ２３９７−２４１２．
【非特許文献３】Ｋｉｍ， Ｇ．Ｔ． Ｔｓｕｋａｙａ， Ｈ． Ｓａｉｔｏ， Ｙ． ａｎｄ Ｕｃｈｉｍｉｙａ， Ｈ． （１９９９） Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈａｐｅｓ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｕｐｏｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６： ９４３３−９４３７．
【特許文献１】特開２００３−３３４０８５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００１／０７３０３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はブラシノステロイド生合成関連遺伝子として、新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シロイヌナズナにおいて、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）と同様に、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する複数の酵素遺伝子を制御する新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）を見出した。そして、これが調節因子（ＢＰＲ１）と協調して働き、葉身、葉柄等の形態が変化した植物が得られることを確認した。また、本発明者らは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の遺伝子破壊変異を相補する因子をシロイヌナズナ以外の他の植物において見出し、本発明を完成するに至った。
これらのブラシノステロイド生合成関連遺伝子は、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、協調的に働くことで同様の機能を発揮するため有用である。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１７）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子等に関する。
（１）ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（２）配列表配列番号６または配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（３）配列表配列番号５または配列番号３７〜４１のいずれかに記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（４）ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
（５）上記（４）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（６）ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）がブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する調節因子である上記（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）制御される酵素遺伝子がＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２である上記（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
（９）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより形質転換された植物。
（１０）形質転換によって、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した上記（９）に記載の植物。
（１１）上記（９）または（１０）に記載の植物とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された植物とを交配することによって得られる、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した植物。
（１２）マメ科またはアブラナ科の植物である上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の植物。
（１３）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該ポリヌクレオチドの発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御することにより、該植物の形態を変化させる方法。
（１４）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列表配列番号６のアミノ酸配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
（１５）（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表配列番号５の塩基配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（１６）上記（４）に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子であって、ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のいずれかである相同因子。
（１７）ミヤコグサ、ダイズ、イネまたはトマトから選ばれる植物由来である上記（１６）に記載の相同因子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のブラシノステロイド生合成関連遺伝子である新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）と協調的に、またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を単独で働かせることで、シロイヌナズナや他の植物（特にイネ、ダイズ、トマトなどの重要作物）において有用な植物を効率的に得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」とは、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むもののことをいう。この「４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列」には、例えば、配列表配列番号６または配列番号４２〜４６に記載のアミノ酸配列や、配列表配列番号５または配列番号３７〜４１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列等が挙げられる。これらのアミノ酸配列とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列との同一性は表１に示した。
【００１１】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」には、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子の相同因子等が含まれる。これらの「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」は、公知の「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子」と協調的に働くものであることが好ましい。
【００１２】
ここで、「協調的に働く」とは、公知の「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子」とともに、それぞれの機能がそのまままたは相乗的に作用することをいう。
例えば、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１、ＢＰＲ２）をともに働かせることで、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のブラシノステロイド生合成に関わる酵素であるＣＹＰ８５Ａ１、ＣＹＰ９０Ｃ１およびＣＹＰ９０Ｄ１をコードする遺伝子の転写を制御する機能と、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）の同様の酵素であるＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の転写を制御する機能とがともに作用すること等が挙げられる。
【００１３】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」のひとつである、「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）」は、ブラシノステロイド生合成反応経路において、該反応を触媒する酵素遺伝子の転写活性を調節する因子である。
「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）」は、シロイヌナズナのブラシノステロイド生合成反応経路において、酵素遺伝子ＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の発現を調節し、そのアミノ酸配列に、配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列表配列番号５にコードされるいずれかのアミノ酸配列を含むものであることが好ましい。
【００１４】
本発明の「ポリヌクレオチド」とは、植物から抽出、単離した天然のポリヌクレオチドであってもよく、また、その塩基配列に従って、ＰＣＲ等の公知の方法によって合成したものであってもよい。
【００１５】
本発明の「プラスミド」とは、プラスミドに組み込んだ遺伝子を増幅するために、大腸菌に形質転換するプラスミドと、組み込んだ遺伝子を発現するために、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ（旧名称Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））を通じて植物に形質転換するプラスミドのいずれも含まれる。形質転換する対象に応じて、公知のベクターを用いることができる。
【００１６】
本発明の「植物の形態を変化させる方法」とは、上記で作製したプラスミドをエレクトロポレーション法、パーティクルガン法等の公知の方法によってリゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株等に導入した後、得られたリゾビウム・ラジオバクターの形質転換体を花序浸し法等の公知の方法によって植物に取り込むことにより行うことができる。
また、このような方法によって形態が変化した植物と、他のポリヌクレオチドを導入することによって形態が変化した植物とを交配することによっても行うことができる。
【００１７】
本発明の「形態が変化した植物」とは、上記のような方法で形質転換された植物が、本発明のブラシノステロイド生合成反応の調節因子の発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する、例えば、当該酵素遺伝子の転写を活性化または抑制することにより、該植物の形態が変化した植物のことをいう。
【００１８】
本発明のタンパク質とは、植物から抽出、単離した天然のタンパク質であってもよく、また、そのアミノ酸配列や、それをコードする塩基配列に従って、公知の方法によって合成されたものであってもよい。
【００１９】
本発明の「ブラシノステロイド生合成関連遺伝子」のひとつである、「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子」は、ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の欠失変異を補う作用を有する因子のことをいう。
このような「ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子」は、そのアミノ酸配列に、配列表配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列または配列表配列番号３７〜４１にコードされるいずれかのアミノ酸配列を含むことが好ましい。例えば、ミヤコグサのＬｊＢＰＲ１、ダイズのＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、イネのＯｓＢＰＲ１、トマトのＬｅＢＰＲ１等が挙げられる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）の取得＞
１．シロイヌナズナＢＰＲ２ ｃＤＮＡのクローニング
日本ＤＮＡデータバンクのＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて多重配列整列および近接結合法による系統樹を作成し、ＮＪｐｌｏｔソフトウェアで表示することによってＢＰＲ１の系統樹解析を行った。その結果、アミノ酸レベルで４９％の同一性を示すＢＰＲ１のパラログ遺伝子であるＡｔ３ｇ１５０５０を見出し、ＢＰＲ２と命名した。
培養土で栽培したシロイヌナズナの長角果からＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン製）を用いてｃＤＮＡを得た。
これらのｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ｏｘ＿Ｕ１（配列表配列番号１）およびＡｔ３ｇ１５０５０ｏｘ＿Ｌ１（配列表配列番号２）のプライマーとＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて９４℃ ２分間の後、９４℃ １５秒間次いで６０℃ ３０秒間さらに６８℃ １分間の保温を１サイクルとして１０サイクルからなるＰＣＲ反応を行った。
【００２１】
さらに、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン製）を用いてクローニングするために、得られた反応物を鋳型にして、ａｔｔＢ１（配列表配列番号３）およびａｔｔＢ２（配列表配列番号４）のプライマーとＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いて９４℃ ２分間の後、９４℃ １５秒間次いで５５℃ ３０秒間さらに６８℃ １分間の保温を１サイクルとして２０サイクルからなるＰＣＲ反応を行い、ａｔｔＢアダプター配列を付加した。
【００２２】
ａｔｔＢアダプター配列を付加したＰＣＲ産物をＢＰクロナーゼ（インビトロジェン製）によって、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー対応のドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン製）にクローニングして、ＢＰＲ２ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２を得た。ｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてＤＮＡシーケンスを行った結果、ＢＰＲ２の塩基配列を配列番号５、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【００２３】
２．ＢＰＲ２の大腸菌発現ベクターの構築
上記実施例１、１．において調製したシロイヌナズナｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ｐＥＴ２１ａ＿Ｕ１（配列表配列番号７）および Ａｔ３ｇ１５０５０ｐＥＴ２１ａ＿Ｌ１（配列表配列番号８）のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いて、９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで６０℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲ反応を行った。
反応物を電気泳動し、約０．９ ｋｂの増幅断片を切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（キューバイオジーン製）を用いて精製した。そのｃＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ製）にクローニングした。得られたプラスミド（以下、ｐＧＥＭ−ＡｔＢＰＲ２とする）のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＤＮＡシーケンスを行い、塩基配列を確認した。
【００２４】
ｐＧＥＭ−ＡｔＢＰＲ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、約０．９ ｋｂの断片を切り出し、精製した。一方、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン製）も制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。これらをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２を得た。ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２のインサート部分についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＤＮＡシーケンスを行い、配列を再度確認した。大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を、ｐＥＴ２１−ＡｔＢＰＲ２で形質転換し、発現ベクターを得た。
【００２５】
３．ＢＰＲ２とＢＰＲ１の同一性の確認
ＢＰＲ２とＢＰＲ１のアミノ酸配列の同一性を、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製）を使用して調べ、結果を図１に示した。これらの同一性は４９％であった。
【実施例２】
【００２６】
＜カルモジュリン結合アッセイ＞
１ｍＭのＩＰＴＧを添加した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を２８℃で４時間培養することでＢＰＲ２のＴ７融合タンパクを発現誘導した。培養終了後、遠心分離により集菌し、氷冷したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で菌体を洗浄後、同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。氷上において超音波処理により菌体を破砕した後、遠心分離し上清を回収し、０．４５μｍのメンブランフィルター（アドバンテック製）でろ過した。リン酸緩衝液で平衡化した１００μｌのカルモジュリンアガロースビーズ（シグマ製）と１ｍＭのＣａＣｌ２または５ｍＭのＥＧＴＡを添加した ５００μｌの粗タンパク質抽出液を混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【００２７】
遠心分離してカルモジュリンアガロースビーズを回収後、５００μｌのリン酸緩衝液で４回、最後に１００μｌで洗浄した。洗浄後のカルモジュリンアガロースビーズは５０μｌの４×ＳＤＳサンプル処理液（ノバジェン製）に懸濁し、１００℃で３分間加熱して結合タンパクを溶出した。次にＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、粗タンパク質抽出液、カルモジュリンアガロースビーズ未結合画分、最終洗浄画分、結合画分を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【００２８】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転写緩衝液（１５．６ｍＭ Ｔｒｉｓ，１２０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ，０．１％ ＳＤＳ）中でセミドライ型の転写装置（バイオ・ラッド製）を用いて２０Ｖで３０分間の条件でＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド製）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をブロッティング溶液に浸し、室温で一晩振とうした。その後、ＴＢＳＴ緩衝液で１００００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識Ｔ７タグ抗体（Ｔ７・Ｔａｇ ＡＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｋｉｔ， ノバジェン製）の溶液に浸して室温で３０分間穏やかに振とうした。次いで転写膜をＴＢＳＴ溶液で２分間５回の洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるＣＤＰ−Ｓｔａｒで処理し、化学発光検出した。その結果、図２に示すように、Ｔ７タグ融合タンパク質として大腸菌で発現させたＢＰＲ２はｉｎ ｖｉｔｒｏでカルシウムイオンの存在下でカルモジュリンと結合することがわかった。
【実施例３】
【００２９】
＜ＢＰＲ２遺伝子の機能の解析＞
１．ＢＰＲ２の植物発現ベクターの構築
ＬＲクロナーゼ（インビトロジェン製）を用いて、上記実施例１、１．において作製したｐＤＯＮＲ２２１−ＡｔＢＰＲ２のＡｔＢＰＲ２ ｃＤＮＡ部位をデスティネーションベクターｐＧＷＢ２に組み換え、ｐＧＷＢ２−ＡｔＢＰＲ２を得た。
【００３０】
２．ＢＰＲ２過剰発現体の作製
上記１．で作製したｐＧＷＢ２−ＡｔＢＰＲ２を、リゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株にエレクトロポレーション法で導入した。形質転換リゾビウム・ラジオバクター ＥＨＡ１０１株はハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーをハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ液体培地で２８℃一晩の前培養をした後、２８℃で一晩の本培養を行った。シロイヌナズナの形質転換は花序浸し法（参考文献１参照）によって行った。得られたＴ１種子を表面殺菌し、ハイグロマイシン（４０ｍｇ／ｌ）とカルベニシリン（４００ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地に播種した。Ｔ２種子を回収し、ホモ個体を選抜した。
［参考文献１］
Ｃｌｏｕｇｈ， Ｓ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｎｔ， Ａ．Ｆ． （１９９８） Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ： ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６： ７３５−７４３．
【００３１】
３．ＢＰＲ２遺伝子破壊変異体の単離
Ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＩＧｎＡＬ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔａｂｏｕｔ．ｈｔｍｌ）からＢＰＲ２遺伝子のエキソン領域にＴ−ＤＮＡが挿入したＳＡＬＫ＿１１１４０を見出した。Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）からその種子を取り寄せ、Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｕ１（配列表配列番号９）および Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｌ１（配列表配列番号１０）のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによってＢＰＲ２遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。
【００３２】
４．ＢＰＲ２過剰発現および破壊変異体の表現型解析
ＭＳ培地に野生型、ＧＵＳ遺伝子発現植物体、上記２．で作製したＢＰＲ２過剰発現体、上記３．で単離したＢＰＲ２破壊変異体を播種した。発芽２４日後の幼植物体を比較したところ、図３に示すようにＢＰＲ２過剰発現体はロゼット葉の上偏成長が見られた。
【００３３】
５．ブラシノライド処理した野生型シロイヌナズナのロゼット葉の表現型解析
発芽１４日目の野生型シロイヌナズナの葉柄の付け根を１μＭのブラシノライドで６日間処理した後、１３日間生育させた結果、図４で示すようにロゼット葉の上偏成長が見られた。これは図３で示したＢＰＲ２過剰発現体の表現型と類似しており、ＢＰＲ２過剰発現体はブラシノライドの内生量が増加していることが示唆された。
【００３４】
６．ＢＰＲ２過剰発現・破壊変異体のブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析
発芽２０日後の野生型、ＧＵＳ遺伝子発現植物体、上記２．で作製したＢＰＲ２過剰発現体、上記３．で単離したＢＰＲ２破壊変異体のロゼット葉から調製した上記実施例１、１．と同様の方法でｃＤＮＡを調整した。
ＲＴ−ＰＣＲにはＤＥＴ２，ＣＹＰ９０Ｂ１（ＤＷＦ４），ＣＹＰ９０Ａ１（ＣＰＤ），ＣＹＰ７２Ｂ１（ＢＡＳ１），ＣＹＰ９０Ｃ１（ＲＯＴ３），ＣＹＰ９０Ｄ１，ＣＹＰ８５Ａ１，ＣＹＰ８５Ａ２の各ブラシノステロイド生合成酵素遺伝子について、次の配列番号からなる特異的プライマーを使用した。
ＤＥＴ２：ＤＥＴ２＿Ｕ１（配列番号１１）およびＤＥＴ２＿Ｌ１（配列番号１２）
ＣＹＰ９０Ｂ１（ＤＷＦ４）：ＣＹＰ９０Ｂ１＿Ｕ１（配列番号１３）およびＣＹＰ９０Ｂ１＿Ｌ１（配列番号１４）
ＣＹＰ９０Ａ１（ＣＰＤ）：ＣＹＰ９０Ａ１＿Ｕ１（配列番号１５）およびＣＹＰ９０Ａ１＿Ｌ１（配列番号１６）
ＣＹＰ９０Ｃ１（ＲＯＴ３）：ＣＹＰ９０Ｃ１＿Ｕ１（配列番号１７）およびＣＹＰ９０Ｃ１＿Ｌ１（配列番号１８）
ＣＹＰ９０Ｄ１：ＣＹＰ９０Ｄ１＿Ｕ１（配列番号１９）およびＣＹＰ９０Ｄ１＿Ｌ１（配列番号２０）
ＣＹＰ８５Ａ１：ＣＹＰ８５Ａ１＿Ｕ１（配列番号２１）およびＣＹＰ８５Ａ１＿Ｌ１（配列番号２２）
ＣＹＰ８５Ａ２：ＣＹＰ８５Ａ２＿Ｕ１（配列番号２３）およびＣＹＰ８５Ａ２＿Ｌ１（配列番号２４）
ＣＹＰ７２Ｂ１（ＢＡＳ１）：ＣＹＰ７２Ｂ１＿Ｕ１（配列番号２５）およびＣＹＰ７２Ｂ１＿Ｌ１（配列番号２６）
【００３５】
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて、９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで５５−６２℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクルは各々の遺伝子によって最適化した。内部標準として、コントロールのプライマーＡｔＵＢＱ１０＿Ｕ１（配列表配列番号２７）およびＡｔＵＢＱ１０＿Ｌ１（配列表配列番号２８）を使用した。その結果、図５に示すように、ＢＰＲ２がブラシノステロイド生合成の後期反応に関わる酵素であるＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２をコードする遺伝子の転写を正に制御していることが明らかとなった。
【００３６】
７．ＢＰＲ２過剰発現・破壊変異体のブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析
シロイヌナズナのエコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ−０の花、長角果、茎、二次葉、ロゼット葉、根から上記実施例１、１．と同様の方法でｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型にして、Ａｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｕ１（配列表配列番号９）およびＡｔ３ｇ１５０５０ＲＴ＿Ｌ１（配列表配列番号１０）のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて９４℃ ３分間の後、９４℃ ３０秒間次いで６３℃ ３０秒間さらに７２℃ １分間の保温を１サイクルとして２８サイクルからなるＰＣＲ反応を行い、ＢＰＲ２の発現解析を行った。その結果、図６に示すように、長角果、茎、根でＢＰＲ２遺伝子の転写物が高蓄積していた。
【実施例４】
【００３７】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１、ＢＰＲ２）の協調性の検討＞
ＢＰＲ１とＢＰＲ２の協調的な機能の有無を確認するために、Ａｔｂｐｒ１変異体とＡｔｂｐｒ２変異体を交配し、２重変異体を作製した。その結果、図７で示すように２重変異体は成長が遅延し、長角果が短縮した。したがって、ＢＰＲ１とＢＰＲ２がシロイヌナズナの形態形成に関して協調的に機能することがわかった。
【００３８】
実施例３より、新規の調節因子（ＢＰＲ２）は、ブラシノステロイド生合成の後期反応を触媒する酵素（ＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２）の遺伝子発現を特異的に制御するブラシノステロイド生合成の調節因子であることが確認された。従って、これとブラシノステロイド生合成の後期反応を触媒する酵素（ＣＹＰ９０Ｃ１およびＣＹＰ８５Ａ１）の遺伝子発現を特異的に制御するＢＰＲ１を組み合わせることによって、複数の酵素遺伝子を制御することで、より効率的に有効な植物を得られることが示唆された。
【実施例５】
【００３９】
＜ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子の取得＞
１．ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマトからのＢＰＲ１オルソログ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
培養土で栽培したミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマトの幼植物体から実施例１と同様の方法でｃＤＮＡを得た。
これらのｃＤＮＡを鋳型にして、実施例１と同様の方法で、次のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは各植物のＢＰＲ１の全長ｃＤＮＡ配列を基にプライマー設計プログラム（ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製））を使用して設計し、合成（インビトロジェン社）した。
ミヤコグサ：ＬｊＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号２９）およびＬｊＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３０）
ダイズ：ＧｍＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３１）およびＧｍＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ２（配列番号３２）
イネ：ＯｓＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３３）およびＯｓＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３４）
トマト：ＬｅＢＰＲ１ｏｘ＿Ｕ１（配列番号３５）およびＬｅＢＰＲ１ｏｘ＿Ｌ１（配列番号３６）
【００４０】
ａｔｔＢアダプター配列を付加したＰＣＲ産物をそれぞれＢＰクロナーゼ（インビトロジェン製）によって、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン製）にクローニングした。これによって得られたプラスミド（ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｊＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＤＯＮＲ２２１−ＯｓＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｅＢＰＲ１とする）のインサート部分について実施例１と同様の方法でＤＮＡシーケンスを行った。得られた配列を配列表配列番号３７（以下、ＬｊＢＰＲ１とする）、３８（以下、ＧｍＢＰＲ１−１とする）、３９（以下、ＧｍＢＰＲ１−２とする）、４０（以下、ＯｓＢＰＲ１とする）、４１（以下、ＬｅＢＰＲ１とする）に示した。また、これらの塩基配列から該当すると思われるアミノ酸配列を配列番号４２、４３、４４、４５、４６に示した。
【００４１】
２．ＢＰＲ１と各植物種のＢＰＲ１相同因子の同一性の確認
ＢＰＲ１とＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のぞれぞれのアミノ酸配列の同一性を、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製）を使用して調べ、ぞれぞれの同一性を図８および表１に示した。その結果、これらの植物において４３．３％以上の一定の配列同一性を有するブラシノステロイド生合成関連遺伝子が存在することが示唆された。
【００４２】
【表１】
【００４３】
３．ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１、ＬｅＢＰＲ１の植物発現ベクターの構築
ＬＲクロナーゼ（インビトロジェン製）を用いて、上記実施例５、１．で作製したｐＤＯＮＲ２２１−ＬｊＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−１、 ｐＤＯＮＲ２２１−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＤＯＮＲ２２１−ＯｓＢＰＲ１、ｐＤＯＮＲ２２１−ＬｅＢＰＲ１の各々のｃＤＮＡ部位をデスティネーションベクターｐＧＷＢ２に組み換えた。得られたＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１、ＬｅＢＰＲ１の植物発現ベクターをｐＧＷＢ２−ＬｊＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＧＷＢ２−ＯｓＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＬｅＢＰＲ１とした。
【００４４】
４．シロイヌナズナＡｔｂｐｒ１破壊変異体の形質転換
上記３．で作製したｐＧＷＢ２−ＬｊＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−１、ｐＧＷＢ２−ＧｍＢＰＲ１−２、ｐＧＷＢ２−ＯｓＢＰＲ１、ｐＧＷＢ２−ＬｅＢＰＲ１をそれぞれリゾビウム・ラジオバクターＥＨＡ１０１株にエレクトロポレーション法で導入した。形質転換リゾビウム・ラジオバクター ＥＨＡ１０１株はハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーをハイグロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ液体培地で２８℃ 一晩の前培養をした後、２８℃で一晩の本培養を行った。ＡｔＢＰＲ１遺伝子のプロモーター領域にＴ−ＤＮＡが挿入したＳＡＬＫ＿０４１３４８ラインをＴｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）から取り寄せ、自殖後代からＡｔｂｐｒ１破壊変異体を取得した。シロイヌナズナＡｔｂｐｒ１破壊変異体の形質転換は花序浸し法（上記参考文献１参照）によって行った。得られたＴ１種子を表面殺菌し、ハイグロマイシン（４０ｍｇ／ｌ）とカルベニシリン（４００ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地に播種した。回収したＴ２種子をＭＳ培地に播種した結果、図９に示すようにすべての形質転換体でＡｔｂｐｒ１破壊変異体の葉身と葉柄の長さが回復した。
【００４５】
この結果より、ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマト等の植物由来の遺伝子が、シロイヌナズナのブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）の遺伝子破壊変異を相補することが確認された。これらの遺伝子はブラシノステロイド生合成の調節因子（ＢＰＲ１）と一定の配列同一性をもち、同等の機能を示すことから、ブラシノステロイド生合成関連遺伝子として有用であると示唆された。また、このようなブラシノステロイド生合成の調節因子が高等植物に普遍的に存在する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のブラシノステロイド生合成関連遺伝子である新規のブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子を利用することで、シロイヌナズナ、ミヤコグサ、ダイズ、イネ、トマト等において効率的に有用植物を得ることは、農業等の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＢＰＲ１とＢＰＲ２の同一性を示した図である（実施例１）。
【図２】ＢＰＲ２のカルモジュリン結合アッセイの結果を示した図である（実施例２）。
【図３】ＢＰＲ２過剰発現および破壊変異体の表現型解析の結果を示した図である（実施例３）。
【図４】ブラシノライド処理による野生型ロゼット葉の表現型解析の結果を示した図である（実施例３）。
【図５】ブラシノステロイド生合成酵素遺伝子の発現解析の結果を示した図である（実施例２）。
【図６】ＢＰＲ２の器官別発現解析の結果を示した図である（実施例２）。
【図７】ＢＰＲ１とＢＰＲ２の２重変異体の表現型解析の結果を示した図である（実施例４）。
【図８】ＢＰＲ１とＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１とＢＰＲ２の同一性を示した図である（実施例５）。
【図９】ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１によるＡｔｂｐｒ１破壊変異体の相補の結果を示した図である（実施例５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項２】
配列表配列番号６または配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項３】
配列表配列番号５または配列番号３７〜４１のいずれかに記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項４】
ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子である請求項１〜３のいずれかに記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）がブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する調節因子である請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
制御される酵素遺伝子がＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２である請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより形質転換された植物。
【請求項１０】
形質転換によって、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の植物とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された植物とを交配することによって得られる、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した植物。
【請求項１２】
マメ科またはアブラナ科の植物である請求項９〜１１のいずれかに記載の植物。
【請求項１３】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該ポリヌクレオチドの発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御することにより、該植物の形態を変化させる方法。
【請求項１４】
（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列表配列番号６のアミノ酸配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１５】
（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表配列番号５の塩基配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項１６】
請求項４に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子であって、ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のいずれかである相同因子。
【請求項１７】
ミヤコグサ、ダイズ、イネまたはトマトから選ばれる植物由来である請求項１６に記載の相同因子。
【請求項１】
ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）のアミノ酸配列に４３．３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項２】
配列表配列番号６または配列番号４２〜４６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項３】
配列表配列番号５または配列番号３７〜４１のいずれかに記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項４】
ブラシノステロイド生合成関連遺伝子がブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）またはブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）因子である請求項１〜３のいずれかに記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
ブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ２）がブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御する調節因子である請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
制御される酵素遺伝子がＣＹＰ８５Ａ１およびＣＹＰ８５Ａ２である請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより形質転換された植物。
【請求項１０】
形質転換によって、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の植物とブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された植物とを交配することによって得られる、葉身、葉柄のいずれか１つ以上の形態が変化した植物。
【請求項１２】
マメ科またはアブラナ科の植物である請求項９〜１１のいずれかに記載の植物。
【請求項１３】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該ポリヌクレオチドの発現によって、ブラシノステロイド生合成反応を触媒する酵素遺伝子を制御することにより、該植物の形態を変化させる方法。
【請求項１４】
（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列表配列番号６のアミノ酸配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１５】
（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表配列番号５の塩基配列。
（ｂ）ブラシノステロイド生合成反応の調節をするタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、配列表配列番号６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項１６】
請求項４に記載のブラシノステロイド生合成関連遺伝子であるブラシノステロイド生合成反応の調節因子（ＢＰＲ１）の相同因子であって、ＬｊＢＰＲ１、ＧｍＢＰＲ１−１、ＧｍＢＰＲ１−２、ＯｓＢＰＲ１またはＬｅＢＰＲ１のいずれかである相同因子。
【請求項１７】
ミヤコグサ、ダイズ、イネまたはトマトから選ばれる植物由来である請求項１６に記載の相同因子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
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【図５】
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【図７】
【図８】
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【公開番号】特開２００８−３０１７８９（Ｐ２００８−３０１７８９Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５４１９４（Ｐ２００７−１５４１９４）
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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