免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を最適化するための方法
本発明は、Ｉｇスーパーファミリーの分子及び派生物の生物物理学的特性を最適化するための方法に関する。この方法は、構造的、安定性、及びフォールディングの役割が未知である未認識のヘリカル構造エレメントが、抗体ドメインの正確で効率的な構造化の重要な決定基として同定されることを特徴とする。抗体特性及びＩｇフォールディングパターンを有する他のタンパク質の特性にポジティブな影響を与えるための新規方法は、本明細書において、短いヘリカルエレメントの特性の最適化、及び、Ｉｇドメイン間のこれらのエレメントの移植からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質の生物物理学的特性を最適化するための方法に関する。よってそれは、格別に抗体での使用に適する。しかし、それは単にこれらに制限されず、しかし、理論的には、免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバー、また、その派生物（例えばＦｃ融合タンパク質など）に拡大できる。よって本発明は、また、この種類のタンパク質の調製方法及びそれらの医学的使用に関する。
【０００２】
背景
生体分子（例えばタンパク質、ポリヌクレオチド、多糖類など）が、医薬として、診断用薬剤として、食品添加物、界面活性剤などとして、研究用試薬として、多くの他の適応のための商業的重要性をますます得ている。そのような生体分子の必要性は、通常、例えばタンパク質の場合、天然供給源から分子を単離することによっては、もはや満たすことができず、生物工学的な産生方法の使用が必要となる。
【０００３】
タンパク質の生物工学的調製は、典型的には、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの単離、及び適した発現ベクター中へのそのクローニングで開始される。適した原核又は真核発現細胞中への組換え発現ベクターのトランスフェクション及びトランスフェクトされた組換え細胞の続く選択後、後者をバイオリアクター中で培養させ、所望のタンパク質を発現させる。次に、細胞又は培養上清を回収し、その中に含まれるタンパク質を処理し、精製する。
【０００４】
抗体、特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスは、生物薬剤学的に産生される最も重要なタンパク質の１つである。それらは、基礎研究から、診断を通じ、一連の治療（例、腫瘍の処置）までの広範囲な適用を有する。抗体は複雑なグリコシル化されたタンパク質分子であり、ＩｇＧの場合、２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成されている（図１を参照のこと）。抗原の認識及び結合は、２つの同一の抗原結合部位、いわゆるパラトープを介して起こる（図１を参照のこと）。抗体の標的構造、抗原は、後者により高度に特異的に認識されるだけでなく、その結合は、また、Ｆｃフラグメントにより媒介される複数のいわゆるエフェクター機能と共役する（図１を参照のこと）。最も重要なエフェクター機能は、とりわけ、補体系（補体依存性細胞傷害：ＣＤＣ）及び抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を含む。
【０００５】
一連の適用にもかかわらず、抗体は望まれうるようには未だに広く使用されておらず、主に非常に高い生産コストのためである。従って、種々の戦略が、分子及び生産方法を改善するために採用されてきた。抗体の生物学的特性を改善するための付着点は、例えば、親和性及び抗原特異性に対する改変ならびにＦｃエフェクター機能の調節である。他のアプローチは、分子の異質性を低下させることに向けられており、例えば、前駆体、加水分解産物、タンパク質のＣ末端アミノ基の酵素的切断、脱アミノ化、様々なグリコシル化パターンもしくは誤って連結されたジスルフィド架橋、又は抗体の物理化学的特性（例えば安定性及び溶解性など）の改善により起こる。抗体の特性を最適化することは、このように、潜在的に極めて広範囲の適用を有する。
【０００６】
すべてのタンパク質が、定義された最終構造に固有のその機能を実行できるように、構造化方法（タンパク質フォールディング（folding）として公知）を受けなければならない。しばしばフォールディング中間体を介して導くこの多段階構造化方法において、ミスフォールディング及び凝集が存在しうる。タンパク質のミスフォールディングに起因しうる、又は、それらに関連する非常に多くの疾患が存在する。なぜなら、タンパク質は、それらの天然のフォールドされた状態を達成しない、又は、この天然の状態のままではないからである。これらは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び種々のアミロイドーシスを含む。この種類のタンパク質のミスフォールディングが生物工学的な産生方法において起こる場合、これは産物の力価、収率、品質及び／又は安定性を犠牲にしている。
【０００７】
多数の科学的研究において抗体の構造化方法（抗体フォールディングとして公知）の明確化が既に扱われてきた（Goto, Y. and Hamaguchi, K., Journal of Molecular Biology 156, 891-910, 1982;Thies, M. J. W. et al., Journal of Molecular Biology 293, 67-79, 1999;Feige, M. J. et al., Journal of Molecular Biology 365, 1232-1244, 2007;Feige, M. J. et al., Journal of Molecular Biology 344, 107-118, 2004）。抗体は、天然において非常に広範囲に及ぶいわゆるＩｇスーパーファミリーに属する。抗体及びそのフラグメントに関するフォールディング研究の他、このＩｇスーパーファミリーの他のメンバーもそれらのフォールディング方法について徹底的に研究されてきた（Cota, E. et al., Journal of Molecular Biology 305, 1185-1194, 2001;Hamill, S. J. et al., Journal of Molecular Biology 297, 165- 178, 2000;Paci, E. at al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 394-399, 2003）。研究の現状について以下の絵が浮かび上がっている：Ｉｇスーパーファミリーのタンパク質の構造化は、プリーツシート（pleated sheet）構造のコアにおける数個の疎水性アミノ酸の周囲から開始し（特に、鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦ）、次に、このフォールディングコアから開始する完全な構造化に終結する。図２は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバー、ベータ２ミクログロブリンの典型的なトポロジーを示す。鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦに印を付けており、それらは既に言及した通り、一般的にＩｇタンパク質のフォールディング方法のコアになると仮定される。
【０００８】
発明の概要
本発明は、天然ヘリカルエレメント（helical elements）が最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この最適化は、ヘリックス内部に追加の塩橋を導入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤又はヘリックス不安定化基（プロリン及び／又はグリシン）を除去することにより行われる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントが移植されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。この移植は、好ましくは、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン中で行われる。特に好ましい実施態様において、１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）中へ移される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックス、好ましくはαヘリックスの形成の可能性を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための方法に関する。
【００１１】
形成の確率は、好ましくは、アルゴリズム、特にＡＧＡＤＩＲアルゴリズムを使用して算出される。好ましくは、置換されたアミノ酸は、特にＡ型とＢ型及び／又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられる。置換されたアミノ酸は、ヘリカル構造を既に有する領域中に位置付けられうる。既存のヘリカルエレメントにおけるこの種類のアミノ酸交換の目的は、このエレメントでのヘリックス形成の確率を増加させることである。ヘリックス形成は、例えば、Ｉｇドメインにおいて置換すべきアミノ酸がプロリン又はグリシンである場合、好ましくは、それが先行するβプリーツシート鎖の後の少なくとも第２の位置（ｉ→ｉ＋２）に、又は、次のβプリーツシーツ鎖の前の最大で最後から２番目の位置（ｉ→ｉ−２）に位置付けられる場合に増加しうる。プロリン及びグリシンは、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により、好ましくは、アラニンにより置換される。別の可能性は、荷電側鎖を有するアミノ酸を挿入することによる塩橋の導入であり、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるようにする。反対荷電を伴う側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、場合により、この目的のために挿入され、置換されたアミノ酸の間の間隔によって、側鎖が塩橋を形成できるようにする。好ましい実施態様において、交換されたアミノ酸は、２（ｉ→ｉ＋３）、３（ｉ→ｉ＋４）、又はそれ以上のアミノ酸（ｉ→ｉ＋５）により互いに分離される。生理学的条件下で負荷電している側鎖を伴うアミノ酸は、グルタミン酸又はアスパラギン酸でよく、アルギニン、リジン、又はヒスチジンは、これらの条件下で正荷電している側鎖を有しうる。好ましい実施態様において、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが挿入される又は恐らくは既に存在している位置は、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近い。このように、二重塩橋を挿入でき、それにおいて配列は生成され、ここで３つのアミノ酸が位置ｉ、及びｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、ならびにｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に位置付けられ、ここで位置ｉ、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸は同じ荷電の側鎖を有するのに対し、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸は反対荷電を有する。この目的のために、３つの対応するアミノ酸を突然変異により挿入でき、恐らく対応するアミノ酸が開始配列中に既に存在する場合には、さらに少ないアミノ酸を挿入できる。この種類の二重塩橋において、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンは、好ましくは、中央の位置ｉ＋３、ｉ＋４、又はｉ＋５に存在する。好ましい実施態様は、交換後に、タンパク質が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、及び／又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。
【００１２】
別の局面において、本発明は、最適なヘリカルエレメントを有さない又はほとんど有さないドメイン（例えば、ベータ２ミクログロブリンのＩｇドメイン（配列番号３）、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ）、又は免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ１など）中への適したヘリカルエレメントの移植に関する。移植エレメントは、例えば、免疫グロブリンの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、もしくはＣＨ３に起因しうる、又は、本発明の方法により最適化されたそのようなエレメントのバリアントでありうる。移植は、好ましくは、４〜１２の連続アミノ酸（好ましくは約１０のアミノ酸）が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換される方法を使用して行われ、挿入アミノ酸配列は、置換される配列よりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、挿入配列は、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間の領域からのヘリカルエレメントである。適したヘリカルエレメントは、例えば、ヒトＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ配列（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からのＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトＣＬドメイン（配列番号１３）からのＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からのＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法に関し、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための先に記載した方法を、この種類のタンパク質に適用し、このようにして得られた改変タンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする。
【００１４】
別の局面において、本発明は、先に記載した本発明の方法により産生される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関する。好ましくは、それは、抗体、特に、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む完全な免疫グロブリンである。
【００１５】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）を有するタンパク質に関し、それは、この可変ドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましくは、このヘリカルエレメントは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。本発明の好ましい局面において、可変ドメインは、抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ２ドメインを含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ１ドメインを含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は改変β２ミクログロブリンに関し、それは、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメント、好ましくは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを有する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、それは、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含み、それは、配列 配列番号１、配列番号１２、もしくは配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４、もしくは配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つに含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を有するヘリカルエレメントを含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、医学的使用のための先に記載されるタンパク質に関する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、天然ヘリカルエレメントの最適化が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が、最適なヘリカルエレメントを有さない又はほとんど有さないドメインにおいて行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００２３】
本発明の利点は、本発明のタンパク質の、より大きなフォールディング効率及び安定性、より少ないミスフォールディング、及び、それによる、最終分析における、より高い価値のタンパク質の質を伴うより高い産物収率、精製方法におけるより大きな柔軟性、より遅いアンフォールディング速度、特にストレス条件下での、溶解性の改善及び凝集のより低い傾向にある。製造方法のより大きな頑強性のおかげで、この新たな方法は先行技術よりも明らかに優れている。本発明は、従って、好ましくは、組換え抗体及びＦｃ融合タンパク質を調製するための方法に適用することができる。本発明は、しかし、免疫グロブリンドメインとの相同性を伴うドメインを含むフラグメント及びその派生物又は融合タンパク質を含む免疫グロブリンスーパーファミリーの他の分子に適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＩＧＧサブクラスの抗体：２つの軽鎖を明色にしており、重鎖を暗く示す。抗原結合に関与する領域（パラトープ）、ＣＨ２ドメインのグリコシル化、及びエフェクター機能を媒介するＦｃ部分に標識する。
【図２】Ｉｇスーパーファミリーの代表としてのベータ２ミクログロブリン：ヒトベータ２ミクログロブリン（配列番号３）のβプリーツシート鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦに標識する。
【図３】免疫グロブリンＧのトポロジー：βプリーツシーツが互いに結合するＩｇＧ分子に関連するＩｇトポロジーにおける短いヘリカルエレメントを暗く示す。
【図４】ＩＧＧ１ ＣＬドメインにおけるヘリカルエレメントの位置：図中、抗体の定常ドメインにおけるヘリカルエレメントの位置を、ヒトＩｇＧ１ ＣＬドメインの例を使用して示す。βプリーツシート鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧならびにヘリカルエレメント、Ｈｅｌｉｘ１及びＨｅｌｉｘ２に標識する。
【図５】ＮＭＲスペクトロスコピーによるＣＬフォールディング中間体の特性付け：この図は、リフォールディングが完成した後の天然ピーク振幅との比較による、各関連群についてのリフォールディング中の最初のＮＭＲスペクトルにおいて得られたピーク振幅を示す。マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）の構造エレメントを、ピーク振幅の上に図式的に示す。
【図６】ＩＧＧ ＣＬドメインの構造化：マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）のフォールディング中間体における構造化の程度をＮＭＲスペクトロスコピーにより決定する。天然構造化領域を暗く示す。
【図７】ＣＤ分光学的検査：マウスカッパＣＬドメイン（破線）（ＣＬ ＷＴ；配列番号１）、ヒトベータ２ミクログロブリンループを伴うＣＬドメイン（破線＆点線）（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）ならびにヒトベータ２ミクログロブリン（直線）（β２ｍ ＷＴ；配列番号３）及びＣＬヘリックスを伴うベータ２ミクログロブリン（点線）（β２ｍからＣＬ；配列番号４）のＣＤ分光学的検査を２０℃のＰＢＳ中で行う。ベータ２ミクログロブリンヘリックスを伴うＣＬ（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）は、アンフォールドされたタンパク質のスペクトルを示し、全ての他のタンパク質は、ベータプリーツシートタンパク質の特徴を有する。
【図８】ベータ２ミクログロブリンアミロイド形成に対するヘリカルエレメントの影響：ＡＦＭ測定は、ＣＬヘリックス（β２ｍからＣＬ；配列番号４）の移植による、全ての条件下でのベータ２ミクログロブリン（β２ｍ ＷＴ；配列番号３）とのアミロイド形成における低下を例示する。測定は、ｐＨ １．５、３．０で、ならびにＰＢＳ中で、シード（＝超音波処理により断片化された原線維）の存在及び非存在において行う。
【図９】ＩＧＧ１分子のＣＨ２ドメイン：ヒトＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメイン（Ａ）内に最適化されたＨｅｌｉｘ１を位置付けること（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）、及び、追加の塩橋を挿入すること、及び、ヘリックス破壊剤プロリン（Ｂ）を除去することによるＨｅｌｉｘ１の最適化（突然変異：ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）からＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９））。
【図１０】Ｈｅｌｉｘ１最適化された突然変異体を伴う野生型ＣＨ２ドメインの構造比較：ＦＵＶ−ＣＤスペクトル（Ａ）及びＮＵＶ−ＣＤスペクトル（Ｂ）は、結果的に二次構造及び三次構造であり、実質的に、ＩｇＧ１ ＣＨ２野生型ドメイン（破線）（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（実線）（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）について同一である。
【図１１】熱安定性研究：野生型ＣＨ２ドメイン（破線）（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（実線）（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）の熱安定性を、ＦＵＶ−ＣＤスペクトロスコピーにより２１８nmで測定する。加熱速度は２０℃／時である。野生型の融点は５６．０℃に決定され、突然変異体の融点は６０．４℃である。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明のこの説明の範囲内で使用される用語及びサインは、以下で定義される以下の意味を有する。一般用語「含む」は、より具体的な用語「からなる」を含む。さらに、用語「単数」及び「複数」は制限的に使用されない。
【００２６】
本発明は、生物物理学的特性を改善させるため、特に、安定性、フォールディング効率を増加させるため、及び、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質ならびにこのようにして改変された実際のタンパク質の凝集を低下させるための方法に関する。免疫グロブリンスーパーファミリーは、現在、７６０を上回る異なるタンパク質を含む。経済的に最も重要なグループは、免疫グロブリン（抗体）からなる。種々のカテゴリーの免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷ。他のメンバーは、細胞表面上の抗原受容体（例、Ｔ細胞受容体）、免疫系の共受容体及び共刺激分子、抗原提示に関与するタンパク質（例、ＭＨＣ分子）、及び特定のサイトカイン受容体及び細胞内筋肉タンパク質である。免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、共通の構造エレメント、いわゆる免疫グロブリンドメイン（Ｉｇドメイン）により特徴付けられる。Ｉｇドメインは共通の基本構造を有する。それらは、典型的には、約７０〜１１０のアミノ酸からなり（しかし、２００を上回るアミノ酸を伴う例も存在する）、しばしば、分子内ジスルフィド架橋を含む。クラスＩｇＧの抗体は、例えば、４つのサブユニット、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖で構成され、各場合において、それらは、共有結合ジスルフィド架橋により一緒に連結され、ｙ形状構造を形成する。各軽鎖は、２つのＩｇドメイン、いわゆる可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）Ｉｇドメインを含み、各重鎖が４つのそのようなＩｇドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む。クラスＩｇＭ及びＩｇＥの抗体は、追加の定常ドメイン（ＣＨ４）を含む。Ｉｇドメインは、特徴的な二次構造、免疫グロブリンのフォールディングパターン（英語で、「Ｉｇフォールド」）、逆平行βプリーツシート鎖の２つのシートにより形成される疎水性コアを伴うサンドイッチ様構造を有する（図４を参照のこと）。三次元表示は、折り畳みシートを連想させる。ペプチド基はシート中に位置付けられ、介在するＣ原子は複数の折り畳みシートの端に位置付けられる。複数の鎖のペプチド結合が互いに相互作用する。安定化のために必要とされる水素架橋結合が、ポリペプチド骨格に沿って形成され、約７．０Åの距離の対で生じる。折り畳みシートにおいて、隣接アミノ酸間の間隔は、有意によりコンパクトなαヘリックスにおいてよりもずっと大きい。間隔は、ヘリックス中の０．１５nmと比較し、０．３５nmである。
しかし、側基が一緒に近接しているため、大きなプリーツシート領域は、一般的に、側基残基が比較的小さく、全てが等しく荷電していない場合にだけ形成される。
【００２７】
βプリーツシートを同定するために、ＣＤ（「円二色性」）スペクトロスコピー及びＮＭＲ（「核磁気共鳴」）スペクトロスコピーを使用してよく、頻度を統計的に評価するために、ラマチャンドランプロットを使用してよい（Ramachandran, G. N. et al., J. Mol. Biol. 7, 95-99, 1963）。個々のβ鎖を、それらが配列中で現れる順番に従い、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、又はＣ’、Ｃ’’と呼ぶ。Ｉｇフォールドの安定化は、サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸の相互作用、鎖間の水素架橋、及び存在する場合、Ｂ鎖及びＦ鎖のシステイン基間での高度に保存されたジスルフィド結合により補助される。２つのシステイン間に位置付けられるアミノ酸の数は変動しうるが、一般的に、５５〜７５の間のアミノ酸である。免疫グロブリンの可変ドメインは、典型的には、９つのβ鎖を含み、定常ドメインは、典型的には、７つのβ鎖を含む。
【００２８】
β鎖間の配列領域が、高い配列可変性を伴う非構造化ループにより、又は、特に免疫グロブリンの定常ドメインにおいて、短いヘリカルエレメントにより形成される。ヘリックスは、タンパク質中の右手又は左手スパイラル二次構造であり、それにおいて、主鎖の各ＮＨ基が、主鎖のカルボニル基を伴う水素架橋結合に入る。右手αヘリックスにおいて、水素架橋結合により及ぶ距離は、４つのアミノ酸である（ｉ＋４→ｉ水素架橋結合）。αヘリックスにおいて、１ターンは、１．５Å（０．１５nm）のレベルでの３．６のアミノ酸基に対応する；各アミノ酸は、このように、１００°によるオフセットである。さらなるヘリックス形状は、３１０ヘリックス（ｉ＋３→ｉ水素架橋結合）及びπヘリックス（ｉ＋５→ｉ水素架橋結合）である。アミノ酸の側鎖は、ヘリックスの外側に位置付けられる。タンパク質中の典型的なヘリックスは、約１０のアミノ酸（３ターン又はコイル）で構成されるが、しかし、わずか４つのアミノ酸で構成されるヘリカルエレメント又は４０までのアミノ酸で構成されるヘリックスも公知である。タンパク質中のヘリカル二次構造は、それ自体が公知の方法、例えば、ｘ線構造解析又は核磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲスペクトロスコピー）を使用して実験的に決定できる。ヘリックス形成の確率は、また、しかし、アミノ酸配列に基づき適したアルゴリズムを使用して決定してよい（Munoz, V. & Serrano, L. (1997). Development of the Multiple Sequence Approximation within the Agadir Model of α-helix Formation. Comparison with Zimm-Bragg and Lifson-Roig Formalisms. Biopolymers 41, 495-509; Lacroix, E., Viguera AR & Serrano, L.(1998). Elucidating the folding problem of a-helices: Local motifs, long-range electrostatics, ionic strength dependence and prediction of NMR parameters.J. Mol. Biol. 284, 173-191）。上記の参考文献において記載されるＡＧＡＤＩＲアルゴリズムが、本発明の範囲内で好ましい。免疫グロブリンの定常ドメインの場合において、ヘリカルエレメントは、βプリーツシート鎖ＡとＢならびにＥとＦの間に位置付けられる。
【００２９】
本発明は、ヘリカル構造が、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性に重要であるとの知見に基づく。この種類のヘリカルエレメントを最適化することにより、特にアミノ酸配列を変化させることにより（それによってヘリックス形成、好ましくはαヘリックスの可能性の増加をもたらす）、生物物理学的特性を改善することが可能であり、特に安定性（例、熱安定性、ｐＨ安定性）、フォールディング効率、及び溶解性をこのように増加させることができ、アンフォールディング速度ならびにミスフォールディングの傾向、凝集、又はアミロイド形成をこのように低下させることができる。
【００３０】
以下でアミノ酸配列中の「先行する」又は「続く」位置を参照する場合、用語「先行する」は配列のＮ末端に近いことを意味し、用語「続く」は配列のＣ末端に近いことを意味する。
【００３１】
高分解能ＮＭＲスペクトロスコピーを使用して、抗体ドメインのフォールディング経路が、実質的な原子分解を用いて明らかにされている（図５及び６を参照のこと）。これは、このドメイン、ＣＬドメインのフォールディングが、天然のシス状態へのＴｙｒ３４−Ｐｒｏ３５結合の異性化により限定されるとの事実により可能になる。低温では、この方法は極めて遅く、故に、フォールディング経路はＮＭＲスペクトロスコピーに直接的に受け入れられる。天然構造への途中で、部分的折り畳み構造、いわゆるフォールディング中間体が形成されることが見出された。フォールディング中間体において、ドメインの短いヘリカルエレメントが既に十分に構造化されており、タンパク質の全ての他の領域がわずかに部分的に構造化されていることが高度に有意である。図５及び６はこの状態を例示しており、特に、抗体ドメインの短いヘリカルエレメントが高度に構造化されているのに対し、フォールディング核と仮定される鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦがそれほど構造化されていないことが明白である。ヘリカルエレメントの特性を最適化することにより、抗体の生物物理学的特性（例、安定性、溶解性、フォールディング効率）は、ポジティブな影響を受けることができ、また、ドメイン間、例えば、可変ドメイン（ヘリカルエレメントに接近できない）中へのヘリカルエレメントの移植によってもポジティブな影響を受けることができる。本発明の別の利点は、本質的にプリーツシート構造を有するタンパク質を最適化することは、その特性が実質的により良く理解されている短いヘリカルエレメントを介して行われ、結果的に、プリーツシート構造よりも容易に改変されるという事実である。
【００３２】
本発明は、天然ヘリカルエレメントが最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を産生するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この最適化は、ヘリックス内部に追加の塩橋を挿入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤（プロリン及び／又はグリシン）を除去することにより行われる。免疫グロブリンのフォールディングパターンを含むタンパク質とは、本発明の範囲内で、先に記載する構造の少なくとも１つのＩｇドメインを有するタンパク質を意味する。特に、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、及び、従って好ましくは、免疫グロブリンである。しかし、本発明は、また、天然においてこの形態で存在しないが、しかし、Ｉｇドメインを有する人工タンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質（例えば抗リウマチ活性物質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）であるエタネルセプトなど）に関する。抗体とは、本発明に関連して、天然において存在し、例えば、哺乳動物を抗原で免疫することにより得ることができる種類の免疫グロブリンだけでなく、パラトープを有し、それ自体で、又は、別のＩｇドメインと一緒に、抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＩｇドメインを有する場合の、人工タンパク質も意味する。そのようなＩｇドメインは、例えば、免疫グロブリンの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）である。
【００３３】
従来、２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる免疫グロブリンの内、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４の重鎖を伴うクラスＩｇＧの免疫グロブリンが好ましい。これらの免疫グロブリンは、天然でモノクローナル又はポリクローナルでありうる、それらは霊長類（特にヒト）、げっ歯類、又は他の哺乳動物の配列を含みうる、及び、キメラ又はヒト化配列でありうる。ヒト又はヒト化免疫グロブリンが好ましい。免疫グロブリンは、また、それらのドメイン中に、本発明の方法の最適化に加えて、分子の特性を変化させることが可能であるアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含みうる。このように、例えば、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、アポトーシス誘導、又はＦｃＲｎ媒介性ホメオスタシスなどが調節されうる。潜在的な脱アミド部位、酸化部位、及びグリコシル化部位を除去する、又は、重鎖のＣ末端リジンを欠失させることにより、例えば、分子の異質性を低下させることができる。
【００３４】
完全な免疫グロブリンの他、当業者は、Ｉｇドメインを含む、それが由来する多数のタンパク質に精通している。このように、当業者には、例えば、免疫グロブリンのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｃフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ−Ｆｃ融合タンパク質、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの融合体からなる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖又は軽鎖の可変ドメインだけからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばＶＨ ＶＨＨ又はＶＬ ｄＡｂ（ラクダ由来のドメイン抗体ならびにこれらのコンストラクトのミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、及び融合タンパク質を含む）が公知である。
【００３５】
Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原結合＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域により一緒に保持される両鎖の可変領域からなる。それらは、例えば、パパインなどのプロテアーゼでの処理により、又は、ＤＮＡクローニングにより従来の抗体から産生されうる。他の抗体フラグメントは、ペプシンでのタンパク質消化により産生できるＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００３６】
遺伝子クローニング又はデノボ遺伝子合成により、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけからなる短くなった抗体フラグメントを調製することも可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（フラグメント可変＝可変部分のフラグメント）として公知である。定常鎖のシステイン基を介した共有結合が、これらのＦｖフラグメントにおいて可能ではないため、これらのＦｖフラグメントは、しばしば、特定の他の方法により安定化される。この目的のために、重鎖及び軽鎖の可変領域は、しばしば、約１０〜３０のアミノ酸、特に好ましくは１５のアミノ酸の短いフラグメントを用いて一緒に連結される。これによって、ＶＨとＶＬがペプチドリンカーにより一緒に連結される単一のポリペプチド鎖が産生される。そのような抗体フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる。ｓｃＦｖ抗体の例が公知であり、記載されている。
【００３７】
過去数年において、種々の戦略が、多量体ｓｃＦｖ派生物を産生するために開発されている。その意図は、薬物動態学的特性が改善され、結合力が増加した組換え抗体を産生することである。ｓｃＦｖフラグメントの多量体化を達成するために、それらを、多量体ドメインを伴う融合タンパク質として産生する。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ又はヘリックス構造（「コイルドコイル構造」）のＣＨ３領域（例えば、ロイシンジッパードメインなど）でありうる。他の戦略において、ｓｃＦｖフラグメントのＶＨ領域とＶＬ領域間の相互作用を、多量体化のために使用する（例、ジア、トリ、及びペンタボディ）。
用語「ジアボディ」を当技術分野において使用し、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を示す。ｓｃＦｖ分子中のペプチドリンカーを５〜１０のアミノ酸に短くすることによって、ＶＨ／ＶＬ鎖を重ね合わせることによるホモ二量体の形成がもたらされる。ジアボディは、加えて、挿入されたジスルフィド架橋により安定化されうる。ジアボディの例を文献中に見出すことができる。
【００３８】
用語「ミニボディ」を当技術分野において使用し、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を示す。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、二量体化領域として含む融合タンパク質からなる。これは、ヒンジ領域、またＩｇＧ及びリンカー領域を用いて、ｓｃＦｖフラグメントを連結する。
【００３９】
用語「トリアボディ」を当技術分野において使用し、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ派生物を示す。リンカー配列を使用しないＶＨ−ＶＬの直接融合によって、三量体の形成が導かれる。
【００４０】
二価、三価、又は四価構造を有する、当技術分野においてミニ抗体として公知のフラグメントも、ｓｃＦｖフラグメントの派生物である。多量体化は、二量体、三量体、又は四量体のコイルドコイル構造を用いて達成される。
【００４１】
当業者は、また、ＩｇＮＡＲ（「新たな抗原受容体」）として公知であるサメ及びエイからの免疫グロブリンを知っている。これらは、１つの可変領域及び５つの定常領域からなる鎖の二量体を形成する（Flajnik, M. F., Nature Reviews, Immunology 2, 688-698, 2002）。
【００４２】
また、当業者は、わずか２つの短くなった重鎖（各々が１つの可変ドメイン及び２つの定常ドメインを有する）からなる、ラマ又はラクダ科の他の動物からの抗体も知っている（Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363, 446-448, 1993）。当業者には、これらの短くなった重鎖の１つ又は複数の可変ドメインだけからなるこれらのラクダ抗体の派生物及びバリアントも公知である。そのような分子は、ドメイン抗体としても公知である。単一ドメイン抗体も、他の種からの、例えば、マウス及びヒトからの、又はヒト化形態での配列に基づき公知である（Holt et al., Trends in Biotechnology 21(11)、484 - 490, 2003）。これらのドメイン抗体のバリアントは、複数の可変ドメインからなる分子を含み、ペプチドリンカーにより互いに共有結合される。血清中での半減期を延長するために、ドメイン抗体を他のポリペプチド単位、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分と、又は、血清中に生じるタンパク質、例えばアルブミンなどと融合させてもよい。
【００４３】
用語「ヘリカルエレメント」及び「ヘリックス」を、本発明に関連して、同義語として使用する。それらは、４〜１２のアミノ酸、好ましくは６〜１２の、最も好ましくは８、９、又は１０のアミノ酸のアミノ酸配列に関連し、ヘリックスを形成できる。
【００４４】
本発明に関連する「最適化」により、タンパク質の一次構造における変化を意味し、それにより、このタンパク質中でヘリカルエレメントを形成する可能性が増加し、又は、それにより、ヘリカルエレメントがこのタンパク質中に作製され、このタンパク質の生物物理学的特性、特にそのフォールディング効率、安定性、溶解性、及び凝集傾向（最適化により低下する）を改善することを目的とする。タンパク質の一次構造を変化させる好ましい方法は、そのアミノ酸配列を突然変異させること、即ち、少なくとも１つのアミノ酸の交換（置換）、除去（欠失）、又は導入（挿入）である。これは、通常、このアミノ酸配列をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を対応して変化させ、続いて、この（組換え）ＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより行う。当業者は、これを行うために当業者に利用可能な標準的方法を有する。
【００４５】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この移植は、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン中に行われる。移植とは、これに関連し、４〜１２のアミノ酸のアミノ酸配列の、同じ長さの別のアミノ酸配列による置換を意味する。特に好ましい実施態様において、１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）に移される。
【００４６】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックスの形成の確率を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善する方法に関する。形成の確率は、好ましくは、アルゴリズム、特にＡＧＡＤＩＲアルゴリズムを使用して算出される。好ましくは、交換されるアミノ酸は、特にＡ型とＢ型又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中にある。置換されるアミノ酸は、ヘリカル構造を既に有する領域中にありうる。既存のヘリカルエレメントにおけるアミノ酸交換の目的は、このエレメントのヘリックス形成の確率を増加させることである。ヘリックス形成は、例えば、Ｉｇドメインにおいて置換されるべきアミノ酸がプロリン又はグリシンである場合、好ましくは、それが先行するβプリーツシート鎖の後の少なくとも第２の位置（ｉ→ｉ＋２）に、又は、次のβプリーツシーツ鎖の前の最大で最後から２番目の位置（ｉ→ｉ−２）に位置付けられる場合に増加しうる。プロリン又はグリシンは、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により、好ましくは、アラニンにより置換される。別の可能性は、荷電側鎖を有するアミノ酸を導入することによる塩橋の導入であり、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるようにする。所望の場合、反対荷電の側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が挿入され、置換されたアミノ酸の間の間隔を選択し、側鎖が塩橋を形成できるようにする。好ましい実施態様において、交換されるアミノ酸は、２（ｉ→ｉ＋３）、３（ｉ→ｉ＋４）、又はそれ以上のアミノ酸により互いに分離される。生理学的条件下で負荷電している側鎖を伴う、使用されうるアミノ酸の例は、グルタミン酸又はアスパラギン酸を含み、一方、アルギニン、リジン、又はヒスチジンは、これらの条件下で正荷電している側鎖を有する。好ましい実施態様において、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが挿入される又は場合により既に存在している位置は、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近い。また、二重塩橋を挿入でき、それにおいて配列は生成され、ここで３つのアミノ酸が位置ｉ及び、ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、ならびにｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に位置付けられ、ここで位置ｉ及び、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸は同じ荷電の側鎖を有するが、しかし、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸は反対荷電を有する。この目的のために、３つの対応するアミノ酸を突然変異により挿入でき、恐らくは、対応するアミノ酸が開始配列中に既に存在する場合にはさらに少ないアミノ酸を挿入してよい。この種類の二重塩橋において、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンは、好ましくは、中央の位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５中に存在する。好ましい実施態様は、交換後、タンパク質が、ヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたヘリックス配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からの配列ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトラムダＣＬドメイン（配列番号１３）からの配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からの配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。
【００４７】
別の局面において、本発明は、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン（例えば、ベータ２ミクログロブリンのＩｇドメイン（配列番号３）、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ）、又は免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ１など）中への適したヘリカルエレメントの移植に関する。移植されるエレメントは、例えば、免疫グロブリンの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、もしくはＣＨ３に起因しうる、又は、本発明の方法により最適化されたそのようなエレメントのバリアントでありうる。移植は、好ましくは、４〜１２の連続アミノ酸（好ましくは約１０のアミノ酸）が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換され、挿入アミノ酸配列が、置換配列よりも高いヘリックス形成の確率を有する方法を使用して行われる。好ましい実施態様において、挿入配列は、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間の領域からのヘリカルエレメントである。適したヘリカルエレメントは、例えば、ヒトＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ配列（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からの配列ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトＣＬドメイン（配列番号１３）からの配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からの配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法に関し、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための先に記載した方法を、この種類のタンパク質に適用し、このようにして得られた改変タンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする。宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によるタンパク質の調製方法、及び、所望の発現タンパク質（目的のタンパク質）の続く精製の方法は、当業者に十分に周知である。特に、当業者は、真核生物の宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスターの卵巣からの細胞株（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、ＣＨＯ細胞）又はマウスミエローマ細胞からの細胞株（例、ＮＳ０細胞）において免疫グロブリンを発現させる方法に精通しているであろう。特定の抗体フォーマット、例えばドメイン抗体などを、有利に、原核生物の宿主細胞（例、Ｅ． ｃｏｌｉ）又は酵母細胞において産生してもよい。
【００４９】
別の局面において、本発明は、先に記載される本発明の方法により産生される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関する。好ましくは、それは抗体、特に、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む完全免疫グロブリンである。
【００５０】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメイン（ＶＬ又はＶＨ）を有するタンパク質に関し、それはこの可変ドメインにおいてヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。天然の可変ドメインは、この種類のヘリカルエレメントを含まず、そのようなエレメントの導入によりそれらの生物物理学的特性を改善することができる。一実施態様において、この種類の可変ドメインは、免疫グロブリンの可変ドメインにおいて天然に存在する同じ長さの任意のアミノ酸配列よりも高いヘリックス形成の確率を伴うヘリカルエレメントを含む。この種類の天然の可変ドメインについてのレファレンスは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋのデータベース中に受入番号ＡＡＫ１９９３６（ＩｇＧ１ ＶＨ）及びＡＡＫ６２６７２（ＩｇＧ１ ＶＬ）の下で寄託されている可変ドメインでありうる。好ましい実施態様において、本発明の可変ドメインは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含む。特に好ましくは、ヘリカルエレメントは、プリーツシート鎖ＥとＦの間に位置付けられる。
【００５１】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。配列番号５は、そのようなドメインのためのレファレンスとして役立ちうる。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、ヘリカルエレメントは、ＣＨ２ドメインのプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間に位置付けられる。
【００５２】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメント又は同じ長さの任意のアミノ酸配列よりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ１ドメインを含む。好ましくは、ヘリカルエレメントは、ＣＨ１ドメインのプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間に位置付けられる。
【００５３】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメント、好ましくは配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを有する改変されたβ２ミクログロブリンに関する。
【００５４】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、それがＩｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含み、それは、配列 配列番号１、配列番号１２、もしくは配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４、もしくは配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つにおいて含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を有するヘリカルエレメントを含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、配列 配列番号４、配列番号６、及び／又は配列番号９を含む。
【００５６】
別の局面において、本発明は、先に記載される、治療又は診断法における医学的使用のためのタンパク質に関する。Ｉｇフォールディングパターンを有する抗体及び他のタンパク質の医学的使用が、当業者に公知であり、多くのそのような物質が薬物として認可されている（例、リツキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト）。特に、当業者は、そのような物質の製剤を調製し（例えば、生理学的緩衝水溶液）、適応される場合にはこの種類の薬物を投与する（例えば、静脈内注射又は注入）ための方法に精通している。
【００５７】
別の局面において、本発明は、天然ヘリカルエレメントが最適化されていることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００５８】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植を、好ましくは、ヘリカルエレメントを有さない又はそれほど適さないヘリカルエレメントを有するドメインにおいて行うことを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変する生物工学的方法に関する。
【００５９】
以下は、本発明に関連して重要であるさらなる定義及び説明である：
【００６０】
本発明のタンパク質は、好ましくは、宿主細胞における組換え発現により産生される。宿主細胞中に導入される発現ベクターを使用する。発現ベクターは「目的の遺伝子」を含み、それは、目的の産物をコードする任意の長さのヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物又は「目的の産物」は、一般的に、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はそのフラグメントもしくは派生物である。しかし、それはＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡでもよい。目的の遺伝子は、その全長で、短くなった形態で、融合遺伝子として又は標識された遺伝子として存在しうる。それは、ゲノムＤＮＡ又は好ましくはｃＤＮＡもしくは対応するフラグメントもしくは融合物でありうる。目的の遺伝子は天然遺伝子配列でありうる、又は、それは突然変異もしくは別の方法で改変されうる。そのような改変は、特定の宿主細胞に適応するためのコドン最適化及びヒト化を含む。目的の遺伝子は、例えば、分泌型、細胞質内型、核局在型、膜結合型、又は細胞表面結合型ポリペプチドをコードしうる。
【００６１】
用語「核酸」、「ヌクレオチド配列」、又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びそのフラグメントならびに単鎖又は二重鎖として生じ、遺伝子のコード鎖又は非コード鎖を表わすことができるゲノム又は合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを示す。核酸配列は、標準的技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性の突然変異誘発、又はオリゴヌクレオチド配列からのデノボ合成などを使用して改変してよい。
【００６２】
本発明に関連する生物薬剤学的な意義を伴うタンパク質／ポリペプチドは、例えば、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又は免疫グロブリン及び他のタンパク質（例、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、及びその派生物又はフラグメント）を含む。一般的に、これらは、アゴニストもしくはアンタゴニスト及び／又は治療的用途もしくは診断的用途を有する物質である。
【００６３】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」をアミノ酸配列又はタンパク質について使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語は、また、反応、例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、又はタンパク質プロセシングなどにより翻訳後改変されたタンパク質を含む。ポリペプチドの構造を、例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入及び他のタンパク質（例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分など）との融合により、その生物学的活性を保持しながら改変してよい。また、ポリペプチドは多量体化し、ホモマー及びヘテロマーを形成しうる。
【００６４】
発現ベクターは、理論的には、当技術分野において公知の従来方法により調製してよい。また、ベクターの機能的成分（例、適したプロモーター、エンハンサー、ターミネーションシグナル及びポリアデニル化シグナル、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー、複製開始点、及びスプライシングシグナル）に関する記載がある。従来のクローニングベクターを使用してそれらを産生してよい（例、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、又はウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単純ヘルペスウイルス、ならびに合成もしくは人工染色体又はミニ染色体など）。真核生物の発現ベクターは、典型的には、原核生物の配列、例えば、細菌中でのベクターの複製及び選択を可能にする複製起点及び抗生物質耐性遺伝子なども含む。ポリヌクレオチド配列の導入のための複数のクローニング部位を含む、多くの真核生物の発現ベクターが公知であり、一部を、種々の企業、例えば、Stratagene, La Jolla（CA, USA）；Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）；Promega（Madison, WI, USA）又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto, CA, USA）などから商業的に入手してよい。
【００６５】
真核生物又は原核生物の宿主細胞を、適した発現ベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換する。酵母細胞及び哺乳動物細胞は、好ましくは、真核生物の宿主細胞として使用される。前者は、特に、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）であり、後者は、特に、げっ歯類細胞、例えば、マウス、ラット、及びハムスター細胞株などである。細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｐ．エルギノーサ（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が、好ましくは、原核生物の宿主細胞として使用され、その内、大腸菌が特に好ましい。本発明の発現ベクターを用いた対応する細胞のトランスフェクション又は形質転換の成功は、形質転換細胞、遺伝子改変細胞、組換え細胞、又はトランスジェニック細胞をもたらし、それらも本発明の対象である。
【００６６】
本発明の目的のための好ましい真核生物の宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はこれらの細胞株の派生体／子孫などである。特に好ましくは、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＢＨＫ２１細胞、特にＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。また、適しているのは、マウスからのミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞ならびにこれらの細胞株の派生体／子孫である。しかし、これらの細胞株の派生体及び子孫、他の哺乳動物細胞（制限はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯類の細胞株を含む）、真核細胞（制限はされないが、酵母、昆虫、トリ、及び植物の細胞を含む）も宿主細胞として生物薬剤学的タンパク質の産生のために使用してよい。
【００６７】
ポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターの１つを用いた真核生物の宿主細胞のトランスフェクションを、従来の方法により行う。トランスフェクションの適した方法は、例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例、ＤＥＡＥデキストラン）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、及びウイルス感染を含む。
【００６８】
ポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターの１つを用いた原核生物の宿主細胞の形質転換を、従来の方法を使用して行う。適した方法は、例えば、エレクトロポレーション、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、ポリエチレングリコール、又はジメチルスルホキシドを用いた細胞の化学処理、バクテリオファージ形質導入を含む。
【００６９】
本発明に従い、安定なトランスフェクションが好ましくは行われ、それにおいて、コンストラクトが、宿主細胞のゲノム中又は人工染色体／ミニ染色体中のいずれかに組込まれる、又は、エピソームとして宿主細胞中に安定に含まれる。問題になっている宿主細胞において異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度及び発現を与えるトランスフェクション方法が好ましい。
【００７０】
宿主細胞が、好ましくは、樹立され、順応され、無血清条件下で、場合により、動物タンパク質／ペプチドを含まない培地中で培養される。商業的に入手可能な培地の例は、ハムＦ１２（Sigma, Deisenhofen, DE）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）、ＹＭ（Sigma）、ＹＰＤ（Invitrogen）、及び合成「ドロップアウト」酵母培地（Sigma）を含む。これらの培地の各々には、場合により、種々の化合物、例えば、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例、インスリン、トランスフェリン、表皮増殖因子、インスリン様増殖因子）、塩（例、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸）、バッファー（例、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例、アデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコース又は他の等価の栄養分、抗生物質、及び／又は微量元素を添加してよい。無血清培地が本発明に従って好ましいが、宿主細胞は、適量の血清を混合した培地を使用して培養してもよい。
【００７１】
原核生物の宿主細胞の培養のために、商業的にも利用可能な多数の公知の培地が存在する。例は、ＬＢ、ＴＢ、Ｍ９、ＳＯＣ、ＹＴ、及びＮＺ培地（Sigma）を含む。
【００７２】
１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の選択のために、１つ又は複数の適した選択薬剤を培地に加える、又は、増殖に必須の添加剤（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を欠く適した「ドロップアウト（drop-out）」培地を使用する。
【００７３】
遺伝子発現及び高産生宿主細胞の選択：
用語「遺伝子発現」又は「発現」は、宿主細胞における異種遺伝子配列の転写及び／又は翻訳に関する。発現率は、一般的に、宿主細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づき、又は、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の産生量に基づき決定することができる。選択されたヌクレオチド配列の転写により産生されるｍＲＮＡの量は、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、又はＰＣＲ法（例、定量的ＰＣＲ）により決定することができる。選択されたヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、プロテインＡ ＨＰＬＣ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性の検出、タンパク質の免疫染色、それに続くＦＡＣＳ分析又は蛍光顕微鏡法、ＦＡＣＳ分析又は蛍光顕微鏡による蛍光タンパク質の直接検出により決定することもできる。
【００７４】
別の局面において、本発明のタンパク質は、産生細胞が増殖し、目的のコード遺伝子産物を産生するために使用される方法において産生される。このために、選択された高産生細胞を、好ましくは無血清培養液において、好ましくは浮遊培養において、目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で培養する。目的のタンパク質／産物は、好ましくは、分泌された遺伝子産物として、細胞培養液から得られる。タンパク質が分泌シグナルなしで発現される場合、しかし、遺伝子産物は細胞ライセートから単離することもできる。他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質を実質的に含まない純粋で均質な産物を得るために、従来の精製手順を行う。最初に、細胞及び細胞残屑を培養液又はライセートから除去する。所望の遺伝子産物を、次に、混入する可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば、免疫親和性及びイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ又はセファデックスでのクロマトグラフィー、シリカ又は陽イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥなど）により除くことができる。組換え宿主細胞により発現される異種タンパク質の精製をもたらす方法は、当業者に公知であり、文献において記載されている。
【００７５】
本発明を、本明細書において、例として一部の実施態様を参照することにより記載する。
【００７６】
実施例
略語
ＡＦＭ：原子間力顕微鏡法
β２ｍ：β２ミクログロブリン
ｂｐ：塩基対
ＣＤ：円二色性
ＣＨ２：重鎖Ｉｇの第２定常ドメイン
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬ：軽鎖Ｉｇの定常ドメイン
ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸還元酵素
Ｅ． ｃｏｌｉ：大腸菌
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法
ＦＵＶ：遠紫外線
ＧｄｍＣｌ：塩酸グアニジン
ＧＳＨ：グルタチオン
ＧＳＳＧ：グルタチオンジスルフィド
ＨＳＱＣ：異核種単一量子コヒーレンス法
ＨＣ：重鎖
ＨＴ：ヒポキサンチン／チミジン
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ｋｂ：キロベース
ＬＣ：軽鎖
ｍＡｋ：モノクローナル抗体
ＭＤ：分子動力学
ＭＴＸ：メトトレキサート
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＮＰＴ：ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ
ＮＵＶ：近紫外線
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＥＡＰ：分泌型アルカリホスファターゼ
ＷＴ：野生型
【００７７】
方法
細菌中でのタンパク質産生及び精製
タンパク質の発現のために、組換えＥ． ｃｏｌｉ細菌ＢＬ２１ ＤＥ３（Stratagene, CA, USA）を３７℃のＬＢ選択培地中で振盪フラスコにおいて３００rpmで一晩培養する。ＮＭＲ測定のためのアイソトープ標識タンパク質を産生するために、組換え細菌を、単一窒素源として１５Ｎ塩化アンモニウムを、又は、場合により、追加で単一炭素源として１３Ｃグルコースを伴うＭ９最少培地（Sigma）中で培養する。
【００７８】
次に、「封入体」を単離する。このために、細菌を遠心により除去し、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビター中に再懸濁させる。細胞をフレンチプレス中で溶解させ、２% ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と混合し、４℃で３０分間撹拌する。遠心（２０，０００rpm、３０分間）により、「封入体」をペレットとして単離し、次に、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビター中で２回再懸濁させ、再び遠心（２０，０００rpm、３０分間）して捨てた。タンパク質β２ｍ ＷＴ（配列番号３）、β２ｍからＣＬ（配列番号４）、ＣＨ２ ＷＴ（配列番号５）、及びＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体（配列番号６）については、封入体のペレットを次に１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０mM ＥＤＴＡ、８M尿素に再懸濁し、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０mM ＥＤＴＡ、５M尿素中で平衡化させたＱセファロースカラムに加えた。全てのタンパク質がフロースルー中にあり、４℃の２５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１００mMアルギニン、１０mM ＥＤＴＡ、１mM ＧＳＳＧ、０．５mM ＧＳＨ中での透析により一晩リフォールディングさせる。次に、タンパク質を濃縮させ、最終的に、ＰＢＳ中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ ゲルろ過カラムを通して精製する。
【００７９】
Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むタンパク質ＣＬ ＷＴ（配列番号１）、ＣＬ Ｐ３５Ａ（配列番号７）、及びＣＬからβ２ｍ（配列番号２）を精製するために、封入体を１００mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、６M ＧｄｍＣｌ、２０mM β-メルカプトエタノール中で２時間、２０℃で可溶化させる。不溶性成分を次に遠心（４８０００g、２５分間、２０℃）により除く。上清を、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、４M ＧｄｍＣｌ中で５倍希釈し、ニッケルキレートカラム（Ni-NTA、Qiagen）に加える。５カラム容積での洗浄後、溶出を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ４）、４M ＧｄｍＣｌで行う。透折によるリフォールディングを、４℃の２５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５mM ＥＤＴＡ、１mM酸化グルタチオン中で一晩行う。凝集物を遠心（４８０００g、２５分間、４℃）により除く。Ｎ末端Ｈｉｓタグを除去するために、０．２５単位のトロンビン（Novagen）を、４℃で１６時間、タンパク質１ミリグラム当たりに加える。さらなる遠心後、タンパク質を、最終的に、２０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、１００mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲルろ過カラムを通して精製する。
【００８０】
ＣＤスペクトロスコピー
ＣＤ測定をＪａｓｃｏＪ−７１５分光偏光計で行う。測定を２０℃のＰＢＳ中で行う。
【００８１】
遠ＵＶ ＣＤスペクトルを、０．２mmの石英ディッシュ中で、タンパク質濃度５０μMで１９５〜２５０nmから測定し、近ＵＶ ＣＤスペクトルを、５mmの石英ディッシュ中で、タンパク質濃度５０〜１００μMで２５０〜３２０nmから測定する。測定を２０℃のＰＢＳ中で行う。スペクトルを各場合において１６倍に蓄積し、平均し、バッファー補正する。温度遷移をそれぞれ２１８nm（ＣＨ２ ＷＴ／突然変異体）又は２０５nm（ＣＬ、β２ｍ ＷＴ／突然変異体）で、１０μMのタンパク質濃度のＰＢＳ中で、１mm石英ディッシュにおいて２０℃／時の加熱速度で測定する。
【００８２】
ＡＦＭ測定
原線維化実験のために、ＰＢＳ（１：１）中の１００μMタンパク質溶液を、バッファーＡ（２５mM酢酸ナトリウム、２５mMリン酸ナトリウム、ｐＨ １．５又は２．５）と混合する。最終ｐＨ値は、このように、それぞれｐＨ １．５又はｐＨ ３．０である。溶液を、７日間、穏やかに傾けながら３７℃でインキュベートし、次に２０μLの溶液を新しい雲母表面に加えて、滅菌ろ過水で３回洗浄し、次にＡＦＭ中で分析する。スキャン速度１．５μm/分のＡＦＭ接触モードを使用する。測定を、Digital Instruments Multimode Scanning Probe顕微鏡及びＤＮＰ−Ｓ２０チップを使用して行う。「シード（Seeds）」を、１０分間、超音波槽中でインキュベートすることによりベータ２ミクログロブリン原線維（ｐＨ １．５）から生成する。「シーディング（Seeding）」実験のために、２μlの「シード」を１００μlの混合物に加える。
【００８３】
ＮＭＲ測定
特記なき場合、全てのスペクトルを２５℃で、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ６００、ＤＭＸ７５０、及びＡＶＡＮＣＥ９００分光計において測定する。割当を、標準的な三重共鳴スペクトルを使用して試みる。リフォールディング実験及びリアルタイムＨＳＱＣ測定のために、ＣＬを、２Ｍ塩化グアニジウム中でアンフォールドさせ、次に、氷冷ＰＢＳで１：１０希釈する。フォールディングプロセス中でのＨＳＱＣ測定を２℃で１４分毎に行い、ＳＰＡＲＫＹを使用して分析する。
【００８４】
遺伝子合成
野生型ＣＨ２ドメイン及びＣＬドメインについての配列領域を、ＰＣＲにより、ヒトＩｇＧ１抗体遺伝子又はマウス抗体ＭＡＫ３３のカッパ鎖から増幅させる（Augustine, J. G. et al., J. Biol. Chem. 276 (5), 3287-3294, 2001）。Ｐ３５Ａ突然変異を、ＣＬドメイン中に、変異プラマーを使用したＰＣＲ突然変異誘発により挿入する。Ｅ． ｃｏｌｉ中での発現のために、ヘリックス最適化したＣＨ２突然変異体、β２ｍ−ＷＴ、及びＣＬヘリックスを移植したβ２ｍ突然変異体のＣＨ２ドメインについての配列領域をデノボで合成する（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中での完全抗体の発現のために、ヘリックス突然変異を、変異プライマーを使用したＰＣＲ突然変異誘発により、ＩｇＧ１抗体遺伝子の野生型ＣＨ２ドメイン中に挿入する。
【００８５】
真核細胞の培養及びトランスフェクション
細胞ＣＨＯ−ＤＧ４４／ｄｈｆｒ-/-を、細胞培養フラスコにおいて、ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE）を添加した無血清ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中で浮遊細胞として、３７℃で、加湿空気及び５% ＣＯ２中で持続的に培養する。細胞数及び生存を、Cedex（Innovatis）を用いて決定し、細胞を次に濃度１〜３×１０５個/mLで播種し、２〜３日毎に継代する。
【００８６】
ＣＨＯ−ＤＧ４４のトランスフェクションのために、Lipofectamine Plus Reagent（Invitrogen）を使用する。各トランスフェクションバッチについて、合計１．０〜１．１μgのプラスミドＤＮＡ、４μLのLipofectamine、及び６μLのPlus試薬を製造者の指示に従って混合し、容積２００μL中で、０．８mlのＨＴ添加ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中の６×１０５個の細胞に加える。細胞インキュベーター中での３７℃で３時間のインキュベーション後、２mLのＨＴ添加ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加える。４８時間の培養期間後、トランスフェクション混合物を回収するか（一過性トランスフェクション）、又は、選択に供する。１つの発現ベクターがＤＨＦＲ選択マーカーを含み、他のベクターがＮＰＴ選択マーカーを含むため、トランスフェクションから２日後、コトランスフェクトした細胞を、ＤＨＦＲ及びＮＰＴベースの選択のためにヒポキサンチン及びチミジンを加えていないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中に移し、Ｇ４１８（Invitrogen）も培地中に濃度４００μg/mLで加える。
【００８７】
組込まれた異種遺伝子のＤＨＦＲベースの遺伝子増幅を、ＨＴ不含ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地への濃度５〜２０００nMでの選択薬剤ＭＴＸ（Sigma）の添加により行う。
【００８８】
発現ベクター
ＣＨＯ−ＤＧ４４中での発現のために、ｐＡＤ−ＣＭＶベクターに基づく真核生物の発現ベクターを使用し（Werner, R. G. et al., Arzneimittel-Forschung/Drug Research 48, 870-880, 1998）、ＣＭＶエンハンサー／ＣＭＶプロモーターの組み合わせを介した異種遺伝子の発現を媒介する。第１ベクターｐＢＩ−２６は、増幅可能な選択マーカーとして作用するｄｈｆｒミニ遺伝子を含む。第２ベクターｐＢＩ−４９において、ｄｈｆｒミニ遺伝子をＮＰＴ遺伝子により置換する。この目的のために、ＮＰＴ選択マーカー（ＳＶ４０初期プロモーター及びＴＫポリアデニル化シグナルを含む）を、市販のプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）から１６４０bpのＢｓｕ３６Ｉフラグメントとして単離した。Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いたフラグメントの平滑化（ｔｏｐｐｉｎｇ ｕｐ）反応後、フラグメントを第１ベクターの３７５０bpのＢｓｕ３６Ｉ／ＳｔｕＩフラグメント（同様にＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理した）と連結した。次に、ＮＰＴ遺伝子を改変した。それはＮＰＴバリアントＦ２４０Ｉ（Ｐｈｅ２４０Ｉｌｅ）であり、そのクローニングはＷＯ２００４／０５０８８４において記載されている。
【００８９】
大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３（Stratagene, CA, USA）中での発現のために、ベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）を使用する。
【００９０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の上清における発現抗体の定量化を、標準的手順に従ってＥＬＩＳＡを使用し、一方ではヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Dianova, Hamburg, DE）を、他方ではＡＰ抱合ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Sigma）を使用して行う。使用したスタンダードは、各場合における発現抗体と同じアイソタイプの精製抗体である。
【００９１】
ＳＥＡＰアッセイ
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からの培養上清中のＳＥＡＰ力価を、製造者（Roche Diagnostics GmbH）の操作指示に従ってSEAP Reporter Gene Assaysを使用して定量化する。
【００９２】
ThermoFluor（登録商標）方法
最適化されたタンパク質／免疫グロブリンの熱安定性を分析するために、ThermoFluor（登録商標）方法に基づくｑＰＣＲシステム（Ｍｘ３００５ＰＴＭ； Stratagene）を使用する。ソルバトクロミック／環境感受性の蛍光色素が、タンパク質の熱安定性におけるわずかな変化の指標として使用される。この蛍光色素は、水溶液中で小さな量子収率を有し、温度上昇の結果としてアンフォールドするタンパク質の疎水性の非天然構造と相互作用する。既にアンフォールドしたタンパク質ドメインと色素の相互作用は、検出された蛍光における有意な増加をもたらす（Cummings M. D. et al., Journal of Biomolecular Screening 854 - 863, 2006）。
【００９３】
２５〜９５℃の温度範囲における１分当たり１℃の間隔でのタンパク質プローブの測定が容積２０μL中で起こり、２μMタンパク質及び４ｘＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ（５０００ｘＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ原液から調製；Invitrogen）を、各場合において試験すべきバッファー中で使用する。
【００９４】
実施例１：免疫グロブリンドメインの生物物理学的特性を改善するための手法
第一工程は、最適化の標的として選択された免疫グロブリンドメイン中にヘリックスが存在しない場合、ヘリカルエレメント又は対応するループを同定することである。抗体の定常ドメインの場合、ヘリックスは、例えば、βプリーツシート鎖ＡとＢ及びＥとＦの間に常に位置付けられる（図４）。これらの領域の同定後、最適化を以下の計画に従って行う：
【００９５】
１．全てのプロリン基及び／又はグリシン基を、別のアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換する（優先すべきポイント２との不一致が存在しない場合）。置換すべき基が、先行するβプリーツシート鎖の後の最初の基又は続くβプリーツシート鎖の前の最後の基ではない場合にだけ置換を行う。
２．次に、ヘリックスを追加の塩橋の挿入により安定化する。これは、既存のアミノ酸を、異なる荷電の荷電側鎖を有するアミノ酸で置換することにより行う。アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の任意の組み合わせを使用してよい。置換すべき基を、２、３、又は４個のアミノ酸により分離させ、ヘリックス中での塩橋の形成を確実にしなければならず、挿入された荷電基が、例えば、ナンバリングｉ及びｉ＋３、ｉ及びｉ＋４、又はｉ及びｉ＋５を有するようにする。上記の基の全ての順列が可能である。好ましくは、しかし、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが、アスパラギン酸又はグルタミン酸よりもＣ末端により近く挿入される。二重塩橋も、それらがヘリックス長と一致し、指定された全ての他の点例えば、基ｉ、及びｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９が、先に記載した通りに置換される場合、理論的に可能である。基ｉ、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９は、各々が同じ荷電を有し、一方、基ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５は反対荷電を有する。位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５では、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンを好ましくは使用すべきである。この工程において、タンパク質の表面上に位置付けられる溶媒暴露基だけを置換すべきである。
３．ポイント１及び／又は２に記載される最適化を受けない全ての残りの基を、αヘリックスの形成の確率の増加をもたらすアミノ酸により置換する。コンピューターアルゴリズムＡｇａｄｉｒ（Internet ad-dress: http://www.embl.de/Services/serrano/agadir/ agadir-start.html）又はαヘリックスの形成の確率を予測するための任意の他のアルゴリズムが、基礎を形成する。この工程において、タンパク質の表面上に位置付けられる溶媒暴露基だけを置換すべきである。
一般的に、見出されるべきヘリカルエレメントが存在しない抗体の可変ドメイン及び／又は他の抗体のドメイン及び／又は他の免疫グロブリンドメインについて、対応するループを、最初に、抗体の定常ドメイン、好ましくは最適化すべき分子が起因する同じ生物のＩｇＧ１サブクラスのＣＬドメインからのヘリックスにより置換すべきである。次に、最適化を上の手順に従って行う。
【００９６】
実施例２：ＣＬドメインのタンパク質フォールディングの研究
抗体ドメインのフォールディング経路の重要な決定基を確かめるために、高分解能構造研究を、マウスＭＡＫ３３ ＣＬドメイン及びスポット突然変異体（ＣＬ−Ｐ３５Ａ）について行う。タンパク質ＣＬ ＷＴ（配列番号１）及びＣＬ−Ｐ１３５Ａ（配列番号７）をＥ． ｃｏｌｉ中で組換え産生させる。ＣＬ ＷＴ中の最初の４つのＮ末端アミノ酸の各々は、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に由来し、ＣＬドメインにおいて天然に存在しない。ＮＭＲスペクトロスコピーを、変性剤ＧｄｍＣｌ中でのアンフォールディング後、リアルタイムに低温でＣＬドメインのフォールディングをモニターするために使用できる（図５及び６）。鎖ＡとＢの間及び鎖ＥとＦの間の２つの短いヘリカルエレメントが、主なフォールディング中間体において既に完全に構造化されていることが見出される（図５及び６）。このように、それらが、これら及び他の抗体ドメインのフォールディングプロセスにおいて重要な役割を果たすことを仮定することができる。ＣＬドメインをフォールドする速度決定工程は、その前にフォールディング中間体が集合され、プロリン基３５のトランスからシスへの異性化である。従って、この基はアラニンについて交換され、それは常にトランスで存在するはずである。この方法では、フォールディング中間体を平衡状態で安定化させることができる。それに関するＮＭＲ研究によって、ＷＴ−ＣＬドメインに関する動態学的研究が確認される：２つの短いヘリックスは、ＣＬドメイン中の完全に構造化されたエレメントだけである。
【００９７】
実施例３：ヘリカルエレメントの移植
ＣＨ１ドメイン（わずかに顕著なヘリックスだけを有する）及び可変ドメイン（ヘリックスを有さない）中への、特に、抗体の定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及びＣＨ３からのヘリカルエレメントの移入が、１つの可能なアプローチである。ヘリックスの追加の又は代わりの最適化のために、例えば、ヘリックス内に追加の塩橋を用い、ヘリックス破壊剤（プロリン基又はグリシン基）を除くことが可能である。このアプローチでの生存を、マウスＩｇＧ及びベータ２ミクログロブリンのカッパ軽鎖のＣＬドメインに関する試験により実証することができる。遺伝子改変により、βプリーツシート鎖ＡとＢ又はＥとＦを連結するＣＬ中の２つのヘリカルエレメント（図５）を、ベータ２ミクログロブリンからの対応する非構造化領域（図２）（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）と交換する。逆に、ベータ２ミクログロブリン中の非構造化領域を、ＣＬからの対応するヘリカルエレメント（β２ｍからＣＬ；配列番号４）により置換する。タンパク質ＣＬからβ２ｍ及びβ２ｍからＣＬならびに、コントロールとして、野生型配列β２ｍ（配列番号３）及びＣＬ（配列番号１）をＥ． ｃｏｌｉ中で組換え産生させる。ＣＬ ＷＴ中の最初の４つのＮ末端アミノ酸又はＣＬからβ２ｍ中の最初のＮ末端アミノ酸は、各場合において、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に起因し、ＣＬドメインにおいて天然で存在しない。ＣＬは、そのヘリックス（＝ＣＬからβ２ｍ）の非存在において、その天然構造にもはやフォールドできないのに対し、ベータ２ミクログロブリンは、ＣＬヘリックスがベータ２ミクログロブリン配列（β２ｍからＣＬ）（図７及び８を参照のこと）中に移植される場合に凝集する傾向が有意に低くなることをＣＤスペクトロスコピーにより示すことができる。さらに、分子力学シミュレーションによって、ベータ２ミクログロブリンタンパク質に関連してでさえ、ＣＬヘリックスがそれ自体で構造化し、このように、実際に、頑強なフォールディングエレメントを構成することが示されている。これらの測定は、例として、抗体ドメインの構造化における必須の役割及びＩｇトポロジーに対するポジティブな影響の両方を示すことができる。
【００９８】
実施例４：ヒトＩＧＧ１ ＣＨ２ドメインの最適化
ＩｇＧ Ｆｃフラグメント（図１）内で、ＣＨ２ドメインは安定性の点で最も弱い連結である。また、ＦｃフラグメントはＩｇＧ抗体の一般的なプラットフォームとして見なすことができ、ＣＨ２ドメインの生物物理学的特性の最適化が、一方で、Ｆｃフラグメントの全安定性を増加するはずであり、他方で、普遍的に適用可能である最適化を構成するはずである。
【００９９】
この例について、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの第１ヘリックス（図９Ａ）が最適化のために選択される。追加の塩橋が、標的突然変異誘発によりその中に挿入される（図９Ｂ）。両方のＣＨドメイン、野生型（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）をＥ． ｃｏｌｉ中で発現させる。ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体中の最初のＮ末端アミノ酸は、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に由来し、ＣＬ２ドメインにおいて天然で存在しない。精製タンパク質を用いて行われた分析によって、このアプローチを使用して、二次構造及び三次構造の点で野生型ドメインから実質的に不変であるが（図１０）、しかし、４〜５℃高い融点を有する（図１１）ＣＨ２ドメインを生成することが可能であることが示される。また、第１ヘリックスを最適化することにより、組換えＣＨ２ドメインのリフォールディングにおいてより高い収率を得ることができ、それは、この突然変異ドメインの最適化されたフォールディング特性を直接的に示唆する。
【０１００】
実施例５：ＣＨＯ細胞中での最適化された抗体の発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の一過性トランスフェクションにより、最初に、ヘリックス最適化配列エレメントＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）によるＩｇＧ１抗体遺伝子のＣＨ２ドメイン中のヘリカルエレメントＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）の置換が、ＩｇＧ１分子の発現に影響を有するか否かを調べた。コトランスフェクションを以下のプラスミドの組み合わせを用いて行う：
ａ）コントロールプラスミドｐＢＩ−２６／ＩｇＧ１−ＨＣ及びｐＢＩ−４９／ＩｇＧ１−ＬＣ、ＣＨ２ドメイン中に配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）を有するモノクローナルＩｇＧ１抗体について（＝野生型配置；以下、ＩｇＧ１−ＷＴと呼ぶ）、
ｂ）ｐＢＩ−２６／ＩｇＧ１−ＨＣｈｅｌｉｘ１及びｐＢＩ−４９／ＩｇＧ１−ＬＣ、モノクローナルＩｇＧ１抗体について、それにおいて、ヒトＶＨ２ドメイン中の第１ヘリックスが、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）による配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）の置換により最適化される。
【０１０１】
３プールを各組み合わせについてトランスフェクトし、等モルの２つのプラスミドを各コトランスフェクションにおいて使用する。４８時間後、回収し、細胞培養上清中のＩｇＧ１力価をＥＬＩＳＡにより決定する。トランスフェクション効率における差を、ＳＥＡＰ発現プラスミドとのコトランスフェクション（各トランスフェクション混合物への１００ngのプラスミドの添加）及び続くＳＥＡＰ活性の測定により補正する。全てにおいて、２つの独立したトランスフェクションシリーズを行う。ＩｇＧ１分子中のＣＨ２ドメインのヘリックス領域における突然変異が、抗体の発現に悪影響を有さないことを示すことができる。得られた産物の量は、ＩｇＧ１野生型トランスフェクト細胞の量と同等である。
【０１０２】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の安定的トランスフェクションのために、上に記載の同じプラスミドの組み合わせを用いてコトランスフェクションを行う。安定的トランスフェクト細胞の選択は、４００μg/mLのＧ４１８を添加したＨＴ不含培地中でのトランスフェクションから２日後に起こる。選択後、ＤＨＦＲベースの遺伝子増幅を、１００nM ＭＴＸの添加による誘導する。物質産生のために、細胞を振盪フラスコにおいて１０日間のフェド−バッチ（fed-batch）方法中で増殖させる。精製は、抗体のＷＴ又はＨｅｌｉｘ１突然変異体について同一である。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（MabSelect rProteinA, GE Healthcare）を、製造者の指示に従い、平衡化のためのリン酸バッファー（２０mMリン酸ナトリウム、１４０mM塩化ナトリウム、ｐＨ ７．５、伝導度１６．５mS/cm）及び溶出のための５０mM酢酸（ｐＨ ３．３）を使用して行う。溶出は、１M Ｔｒｉｓ ｐＨ ８の添加によりｐＨ ５．５に調整する。２つの抗体バリアントについての精製プロファイルは同等である。
【０１０３】
抗体の熱安定性は、ThermoFluor（登録商標）方法により決定する。ＣＨ２ドメイン中の天然ヘリカルエレメントを最適化することにより、ＩｇＧ１抗体のＨｅｌｉｘ１突然変異体の熱安定性を、ＩｇＧ１−ＷＴ抗体と比較し、塩基性及び酸性の両方のバッファー条件下で増加させることができる。ｐＨ ７．１のＰＢＳ中で、Ｈｅｌｉｘ１突然変異体のＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１−ＷＴのＣＨ２ドメインよりも８℃高い融解温度を呈する。また、１００mM酢酸（ｐＨ ３．４）中では、それはさらに１８℃高い。免疫グロブリンの熱安定性におけるこの有意な増加は、治療用タンパク質の生物薬剤学的調製において非常に大きな利点である。ＣＨ２ドメインの天然ヘリカルエレメントの最適化は、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を用いて天然の配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）（この配列領域は、例えば、ヒトＩｇＧ２（配列番号１４）及びＩｇＧ４（配列番号１５）のＣＨ２ドメインにおいて存在する）を置換することにより、生物工学的に産生された治療用タンパク質の頑強性の有意な改善をもたらす。増加した温度安定性及びｐＨ安定性は、治療用タンパク質の産物安全性を増加させるために、ウイルス不活化の方法工程において特に有利である。なぜなら、この工程は酸性ｐＨで行われるからである。他の利点は、クロマトグラフィーにおける及びタンパク質製剤におけるより大きな柔軟性、より低い凝集傾向、及び改善された保存安定性である。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質の生物物理学的特性を最適化するための方法に関する。よってそれは、格別に抗体での使用に適する。しかし、それは単にこれらに制限されず、しかし、理論的には、免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバー、また、その派生物（例えばＦｃ融合タンパク質など）に拡大できる。よって本発明は、また、この種類のタンパク質の調製方法及びそれらの医学的使用に関する。
【０００２】
背景
生体分子（例えばタンパク質、ポリヌクレオチド、多糖類など）が、医薬として、診断用薬剤として、食品添加物、界面活性剤などとして、研究用試薬として、多くの他の適応のための商業的重要性をますます得ている。そのような生体分子の必要性は、通常、例えばタンパク質の場合、天然供給源から分子を単離することによっては、もはや満たすことができず、生物工学的な産生方法の使用が必要となる。
【０００３】
タンパク質の生物工学的調製は、典型的には、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの単離、及び適した発現ベクター中へのそのクローニングで開始される。適した原核又は真核発現細胞中への組換え発現ベクターのトランスフェクション及びトランスフェクトされた組換え細胞の続く選択後、後者をバイオリアクター中で培養させ、所望のタンパク質を発現させる。次に、細胞又は培養上清を回収し、その中に含まれるタンパク質を処理し、精製する。
【０００４】
抗体、特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスは、生物薬剤学的に産生される最も重要なタンパク質の１つである。それらは、基礎研究から、診断を通じ、一連の治療（例、腫瘍の処置）までの広範囲な適用を有する。抗体は複雑なグリコシル化されたタンパク質分子であり、ＩｇＧの場合、２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成されている（図１を参照のこと）。抗原の認識及び結合は、２つの同一の抗原結合部位、いわゆるパラトープを介して起こる（図１を参照のこと）。抗体の標的構造、抗原は、後者により高度に特異的に認識されるだけでなく、その結合は、また、Ｆｃフラグメントにより媒介される複数のいわゆるエフェクター機能と共役する（図１を参照のこと）。最も重要なエフェクター機能は、とりわけ、補体系（補体依存性細胞傷害：ＣＤＣ）及び抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を含む。
【０００５】
一連の適用にもかかわらず、抗体は望まれうるようには未だに広く使用されておらず、主に非常に高い生産コストのためである。従って、種々の戦略が、分子及び生産方法を改善するために採用されてきた。抗体の生物学的特性を改善するための付着点は、例えば、親和性及び抗原特異性に対する改変ならびにＦｃエフェクター機能の調節である。他のアプローチは、分子の異質性を低下させることに向けられており、例えば、前駆体、加水分解産物、タンパク質のＣ末端アミノ基の酵素的切断、脱アミノ化、様々なグリコシル化パターンもしくは誤って連結されたジスルフィド架橋、又は抗体の物理化学的特性（例えば安定性及び溶解性など）の改善により起こる。抗体の特性を最適化することは、このように、潜在的に極めて広範囲の適用を有する。
【０００６】
すべてのタンパク質が、定義された最終構造に固有のその機能を実行できるように、構造化方法（タンパク質フォールディング（folding）として公知）を受けなければならない。しばしばフォールディング中間体を介して導くこの多段階構造化方法において、ミスフォールディング及び凝集が存在しうる。タンパク質のミスフォールディングに起因しうる、又は、それらに関連する非常に多くの疾患が存在する。なぜなら、タンパク質は、それらの天然のフォールドされた状態を達成しない、又は、この天然の状態のままではないからである。これらは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び種々のアミロイドーシスを含む。この種類のタンパク質のミスフォールディングが生物工学的な産生方法において起こる場合、これは産物の力価、収率、品質及び／又は安定性を犠牲にしている。
【０００７】
多数の科学的研究において抗体の構造化方法（抗体フォールディングとして公知）の明確化が既に扱われてきた（Goto, Y. and Hamaguchi, K., Journal of Molecular Biology 156, 891-910, 1982;Thies, M. J. W. et al., Journal of Molecular Biology 293, 67-79, 1999;Feige, M. J. et al., Journal of Molecular Biology 365, 1232-1244, 2007;Feige, M. J. et al., Journal of Molecular Biology 344, 107-118, 2004）。抗体は、天然において非常に広範囲に及ぶいわゆるＩｇスーパーファミリーに属する。抗体及びそのフラグメントに関するフォールディング研究の他、このＩｇスーパーファミリーの他のメンバーもそれらのフォールディング方法について徹底的に研究されてきた（Cota, E. et al., Journal of Molecular Biology 305, 1185-1194, 2001;Hamill, S. J. et al., Journal of Molecular Biology 297, 165- 178, 2000;Paci, E. at al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 394-399, 2003）。研究の現状について以下の絵が浮かび上がっている：Ｉｇスーパーファミリーのタンパク質の構造化は、プリーツシート（pleated sheet）構造のコアにおける数個の疎水性アミノ酸の周囲から開始し（特に、鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦ）、次に、このフォールディングコアから開始する完全な構造化に終結する。図２は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバー、ベータ２ミクログロブリンの典型的なトポロジーを示す。鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦに印を付けており、それらは既に言及した通り、一般的にＩｇタンパク質のフォールディング方法のコアになると仮定される。
【０００８】
発明の概要
本発明は、天然ヘリカルエレメント（helical elements）が最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この最適化は、ヘリックス内部に追加の塩橋を導入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤又はヘリックス不安定化基（プロリン及び／又はグリシン）を除去することにより行われる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントが移植されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。この移植は、好ましくは、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン中で行われる。特に好ましい実施態様において、１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）中へ移される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックス、好ましくはαヘリックスの形成の可能性を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための方法に関する。
【００１１】
形成の確率は、好ましくは、アルゴリズム、特にＡＧＡＤＩＲアルゴリズムを使用して算出される。好ましくは、置換されたアミノ酸は、特にＡ型とＢ型及び／又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられる。置換されたアミノ酸は、ヘリカル構造を既に有する領域中に位置付けられうる。既存のヘリカルエレメントにおけるこの種類のアミノ酸交換の目的は、このエレメントでのヘリックス形成の確率を増加させることである。ヘリックス形成は、例えば、Ｉｇドメインにおいて置換すべきアミノ酸がプロリン又はグリシンである場合、好ましくは、それが先行するβプリーツシート鎖の後の少なくとも第２の位置（ｉ→ｉ＋２）に、又は、次のβプリーツシーツ鎖の前の最大で最後から２番目の位置（ｉ→ｉ−２）に位置付けられる場合に増加しうる。プロリン及びグリシンは、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により、好ましくは、アラニンにより置換される。別の可能性は、荷電側鎖を有するアミノ酸を挿入することによる塩橋の導入であり、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるようにする。反対荷電を伴う側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、場合により、この目的のために挿入され、置換されたアミノ酸の間の間隔によって、側鎖が塩橋を形成できるようにする。好ましい実施態様において、交換されたアミノ酸は、２（ｉ→ｉ＋３）、３（ｉ→ｉ＋４）、又はそれ以上のアミノ酸（ｉ→ｉ＋５）により互いに分離される。生理学的条件下で負荷電している側鎖を伴うアミノ酸は、グルタミン酸又はアスパラギン酸でよく、アルギニン、リジン、又はヒスチジンは、これらの条件下で正荷電している側鎖を有しうる。好ましい実施態様において、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが挿入される又は恐らくは既に存在している位置は、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近い。このように、二重塩橋を挿入でき、それにおいて配列は生成され、ここで３つのアミノ酸が位置ｉ、及びｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、ならびにｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に位置付けられ、ここで位置ｉ、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸は同じ荷電の側鎖を有するのに対し、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸は反対荷電を有する。この目的のために、３つの対応するアミノ酸を突然変異により挿入でき、恐らく対応するアミノ酸が開始配列中に既に存在する場合には、さらに少ないアミノ酸を挿入できる。この種類の二重塩橋において、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンは、好ましくは、中央の位置ｉ＋３、ｉ＋４、又はｉ＋５に存在する。好ましい実施態様は、交換後に、タンパク質が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、及び／又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。
【００１２】
別の局面において、本発明は、最適なヘリカルエレメントを有さない又はほとんど有さないドメイン（例えば、ベータ２ミクログロブリンのＩｇドメイン（配列番号３）、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ）、又は免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ１など）中への適したヘリカルエレメントの移植に関する。移植エレメントは、例えば、免疫グロブリンの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、もしくはＣＨ３に起因しうる、又は、本発明の方法により最適化されたそのようなエレメントのバリアントでありうる。移植は、好ましくは、４〜１２の連続アミノ酸（好ましくは約１０のアミノ酸）が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換される方法を使用して行われ、挿入アミノ酸配列は、置換される配列よりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、挿入配列は、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間の領域からのヘリカルエレメントである。適したヘリカルエレメントは、例えば、ヒトＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ配列（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からのＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトＣＬドメイン（配列番号１３）からのＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からのＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法に関し、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための先に記載した方法を、この種類のタンパク質に適用し、このようにして得られた改変タンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする。
【００１４】
別の局面において、本発明は、先に記載した本発明の方法により産生される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関する。好ましくは、それは、抗体、特に、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む完全な免疫グロブリンである。
【００１５】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）を有するタンパク質に関し、それは、この可変ドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましくは、このヘリカルエレメントは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。本発明の好ましい局面において、可変ドメインは、抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ２ドメインを含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ１ドメインを含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は改変β２ミクログロブリンに関し、それは、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメント、好ましくは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを有する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、それは、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含み、それは、配列 配列番号１、配列番号１２、もしくは配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４、もしくは配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つに含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を有するヘリカルエレメントを含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、医学的使用のための先に記載されるタンパク質に関する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、天然ヘリカルエレメントの最適化が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が、最適なヘリカルエレメントを有さない又はほとんど有さないドメインにおいて行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００２３】
本発明の利点は、本発明のタンパク質の、より大きなフォールディング効率及び安定性、より少ないミスフォールディング、及び、それによる、最終分析における、より高い価値のタンパク質の質を伴うより高い産物収率、精製方法におけるより大きな柔軟性、より遅いアンフォールディング速度、特にストレス条件下での、溶解性の改善及び凝集のより低い傾向にある。製造方法のより大きな頑強性のおかげで、この新たな方法は先行技術よりも明らかに優れている。本発明は、従って、好ましくは、組換え抗体及びＦｃ融合タンパク質を調製するための方法に適用することができる。本発明は、しかし、免疫グロブリンドメインとの相同性を伴うドメインを含むフラグメント及びその派生物又は融合タンパク質を含む免疫グロブリンスーパーファミリーの他の分子に適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＩＧＧサブクラスの抗体：２つの軽鎖を明色にしており、重鎖を暗く示す。抗原結合に関与する領域（パラトープ）、ＣＨ２ドメインのグリコシル化、及びエフェクター機能を媒介するＦｃ部分に標識する。
【図２】Ｉｇスーパーファミリーの代表としてのベータ２ミクログロブリン：ヒトベータ２ミクログロブリン（配列番号３）のβプリーツシート鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦに標識する。
【図３】免疫グロブリンＧのトポロジー：βプリーツシーツが互いに結合するＩｇＧ分子に関連するＩｇトポロジーにおける短いヘリカルエレメントを暗く示す。
【図４】ＩＧＧ１ ＣＬドメインにおけるヘリカルエレメントの位置：図中、抗体の定常ドメインにおけるヘリカルエレメントの位置を、ヒトＩｇＧ１ ＣＬドメインの例を使用して示す。βプリーツシート鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧならびにヘリカルエレメント、Ｈｅｌｉｘ１及びＨｅｌｉｘ２に標識する。
【図５】ＮＭＲスペクトロスコピーによるＣＬフォールディング中間体の特性付け：この図は、リフォールディングが完成した後の天然ピーク振幅との比較による、各関連群についてのリフォールディング中の最初のＮＭＲスペクトルにおいて得られたピーク振幅を示す。マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）の構造エレメントを、ピーク振幅の上に図式的に示す。
【図６】ＩＧＧ ＣＬドメインの構造化：マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）のフォールディング中間体における構造化の程度をＮＭＲスペクトロスコピーにより決定する。天然構造化領域を暗く示す。
【図７】ＣＤ分光学的検査：マウスカッパＣＬドメイン（破線）（ＣＬ ＷＴ；配列番号１）、ヒトベータ２ミクログロブリンループを伴うＣＬドメイン（破線＆点線）（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）ならびにヒトベータ２ミクログロブリン（直線）（β２ｍ ＷＴ；配列番号３）及びＣＬヘリックスを伴うベータ２ミクログロブリン（点線）（β２ｍからＣＬ；配列番号４）のＣＤ分光学的検査を２０℃のＰＢＳ中で行う。ベータ２ミクログロブリンヘリックスを伴うＣＬ（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）は、アンフォールドされたタンパク質のスペクトルを示し、全ての他のタンパク質は、ベータプリーツシートタンパク質の特徴を有する。
【図８】ベータ２ミクログロブリンアミロイド形成に対するヘリカルエレメントの影響：ＡＦＭ測定は、ＣＬヘリックス（β２ｍからＣＬ；配列番号４）の移植による、全ての条件下でのベータ２ミクログロブリン（β２ｍ ＷＴ；配列番号３）とのアミロイド形成における低下を例示する。測定は、ｐＨ １．５、３．０で、ならびにＰＢＳ中で、シード（＝超音波処理により断片化された原線維）の存在及び非存在において行う。
【図９】ＩＧＧ１分子のＣＨ２ドメイン：ヒトＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメイン（Ａ）内に最適化されたＨｅｌｉｘ１を位置付けること（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）、及び、追加の塩橋を挿入すること、及び、ヘリックス破壊剤プロリン（Ｂ）を除去することによるＨｅｌｉｘ１の最適化（突然変異：ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）からＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９））。
【図１０】Ｈｅｌｉｘ１最適化された突然変異体を伴う野生型ＣＨ２ドメインの構造比較：ＦＵＶ−ＣＤスペクトル（Ａ）及びＮＵＶ−ＣＤスペクトル（Ｂ）は、結果的に二次構造及び三次構造であり、実質的に、ＩｇＧ１ ＣＨ２野生型ドメイン（破線）（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（実線）（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）について同一である。
【図１１】熱安定性研究：野生型ＣＨ２ドメイン（破線）（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（実線）（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）の熱安定性を、ＦＵＶ−ＣＤスペクトロスコピーにより２１８nmで測定する。加熱速度は２０℃／時である。野生型の融点は５６．０℃に決定され、突然変異体の融点は６０．４℃である。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明のこの説明の範囲内で使用される用語及びサインは、以下で定義される以下の意味を有する。一般用語「含む」は、より具体的な用語「からなる」を含む。さらに、用語「単数」及び「複数」は制限的に使用されない。
【００２６】
本発明は、生物物理学的特性を改善させるため、特に、安定性、フォールディング効率を増加させるため、及び、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質ならびにこのようにして改変された実際のタンパク質の凝集を低下させるための方法に関する。免疫グロブリンスーパーファミリーは、現在、７６０を上回る異なるタンパク質を含む。経済的に最も重要なグループは、免疫グロブリン（抗体）からなる。種々のカテゴリーの免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷ。他のメンバーは、細胞表面上の抗原受容体（例、Ｔ細胞受容体）、免疫系の共受容体及び共刺激分子、抗原提示に関与するタンパク質（例、ＭＨＣ分子）、及び特定のサイトカイン受容体及び細胞内筋肉タンパク質である。免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、共通の構造エレメント、いわゆる免疫グロブリンドメイン（Ｉｇドメイン）により特徴付けられる。Ｉｇドメインは共通の基本構造を有する。それらは、典型的には、約７０〜１１０のアミノ酸からなり（しかし、２００を上回るアミノ酸を伴う例も存在する）、しばしば、分子内ジスルフィド架橋を含む。クラスＩｇＧの抗体は、例えば、４つのサブユニット、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖で構成され、各場合において、それらは、共有結合ジスルフィド架橋により一緒に連結され、ｙ形状構造を形成する。各軽鎖は、２つのＩｇドメイン、いわゆる可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）Ｉｇドメインを含み、各重鎖が４つのそのようなＩｇドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む。クラスＩｇＭ及びＩｇＥの抗体は、追加の定常ドメイン（ＣＨ４）を含む。Ｉｇドメインは、特徴的な二次構造、免疫グロブリンのフォールディングパターン（英語で、「Ｉｇフォールド」）、逆平行βプリーツシート鎖の２つのシートにより形成される疎水性コアを伴うサンドイッチ様構造を有する（図４を参照のこと）。三次元表示は、折り畳みシートを連想させる。ペプチド基はシート中に位置付けられ、介在するＣ原子は複数の折り畳みシートの端に位置付けられる。複数の鎖のペプチド結合が互いに相互作用する。安定化のために必要とされる水素架橋結合が、ポリペプチド骨格に沿って形成され、約７．０Åの距離の対で生じる。折り畳みシートにおいて、隣接アミノ酸間の間隔は、有意によりコンパクトなαヘリックスにおいてよりもずっと大きい。間隔は、ヘリックス中の０．１５nmと比較し、０．３５nmである。
しかし、側基が一緒に近接しているため、大きなプリーツシート領域は、一般的に、側基残基が比較的小さく、全てが等しく荷電していない場合にだけ形成される。
【００２７】
βプリーツシートを同定するために、ＣＤ（「円二色性」）スペクトロスコピー及びＮＭＲ（「核磁気共鳴」）スペクトロスコピーを使用してよく、頻度を統計的に評価するために、ラマチャンドランプロットを使用してよい（Ramachandran, G. N. et al., J. Mol. Biol. 7, 95-99, 1963）。個々のβ鎖を、それらが配列中で現れる順番に従い、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、又はＣ’、Ｃ’’と呼ぶ。Ｉｇフォールドの安定化は、サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸の相互作用、鎖間の水素架橋、及び存在する場合、Ｂ鎖及びＦ鎖のシステイン基間での高度に保存されたジスルフィド結合により補助される。２つのシステイン間に位置付けられるアミノ酸の数は変動しうるが、一般的に、５５〜７５の間のアミノ酸である。免疫グロブリンの可変ドメインは、典型的には、９つのβ鎖を含み、定常ドメインは、典型的には、７つのβ鎖を含む。
【００２８】
β鎖間の配列領域が、高い配列可変性を伴う非構造化ループにより、又は、特に免疫グロブリンの定常ドメインにおいて、短いヘリカルエレメントにより形成される。ヘリックスは、タンパク質中の右手又は左手スパイラル二次構造であり、それにおいて、主鎖の各ＮＨ基が、主鎖のカルボニル基を伴う水素架橋結合に入る。右手αヘリックスにおいて、水素架橋結合により及ぶ距離は、４つのアミノ酸である（ｉ＋４→ｉ水素架橋結合）。αヘリックスにおいて、１ターンは、１．５Å（０．１５nm）のレベルでの３．６のアミノ酸基に対応する；各アミノ酸は、このように、１００°によるオフセットである。さらなるヘリックス形状は、３１０ヘリックス（ｉ＋３→ｉ水素架橋結合）及びπヘリックス（ｉ＋５→ｉ水素架橋結合）である。アミノ酸の側鎖は、ヘリックスの外側に位置付けられる。タンパク質中の典型的なヘリックスは、約１０のアミノ酸（３ターン又はコイル）で構成されるが、しかし、わずか４つのアミノ酸で構成されるヘリカルエレメント又は４０までのアミノ酸で構成されるヘリックスも公知である。タンパク質中のヘリカル二次構造は、それ自体が公知の方法、例えば、ｘ線構造解析又は核磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲスペクトロスコピー）を使用して実験的に決定できる。ヘリックス形成の確率は、また、しかし、アミノ酸配列に基づき適したアルゴリズムを使用して決定してよい（Munoz, V. & Serrano, L. (1997). Development of the Multiple Sequence Approximation within the Agadir Model of α-helix Formation. Comparison with Zimm-Bragg and Lifson-Roig Formalisms. Biopolymers 41, 495-509; Lacroix, E., Viguera AR & Serrano, L.(1998). Elucidating the folding problem of a-helices: Local motifs, long-range electrostatics, ionic strength dependence and prediction of NMR parameters.J. Mol. Biol. 284, 173-191）。上記の参考文献において記載されるＡＧＡＤＩＲアルゴリズムが、本発明の範囲内で好ましい。免疫グロブリンの定常ドメインの場合において、ヘリカルエレメントは、βプリーツシート鎖ＡとＢならびにＥとＦの間に位置付けられる。
【００２９】
本発明は、ヘリカル構造が、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性に重要であるとの知見に基づく。この種類のヘリカルエレメントを最適化することにより、特にアミノ酸配列を変化させることにより（それによってヘリックス形成、好ましくはαヘリックスの可能性の増加をもたらす）、生物物理学的特性を改善することが可能であり、特に安定性（例、熱安定性、ｐＨ安定性）、フォールディング効率、及び溶解性をこのように増加させることができ、アンフォールディング速度ならびにミスフォールディングの傾向、凝集、又はアミロイド形成をこのように低下させることができる。
【００３０】
以下でアミノ酸配列中の「先行する」又は「続く」位置を参照する場合、用語「先行する」は配列のＮ末端に近いことを意味し、用語「続く」は配列のＣ末端に近いことを意味する。
【００３１】
高分解能ＮＭＲスペクトロスコピーを使用して、抗体ドメインのフォールディング経路が、実質的な原子分解を用いて明らかにされている（図５及び６を参照のこと）。これは、このドメイン、ＣＬドメインのフォールディングが、天然のシス状態へのＴｙｒ３４−Ｐｒｏ３５結合の異性化により限定されるとの事実により可能になる。低温では、この方法は極めて遅く、故に、フォールディング経路はＮＭＲスペクトロスコピーに直接的に受け入れられる。天然構造への途中で、部分的折り畳み構造、いわゆるフォールディング中間体が形成されることが見出された。フォールディング中間体において、ドメインの短いヘリカルエレメントが既に十分に構造化されており、タンパク質の全ての他の領域がわずかに部分的に構造化されていることが高度に有意である。図５及び６はこの状態を例示しており、特に、抗体ドメインの短いヘリカルエレメントが高度に構造化されているのに対し、フォールディング核と仮定される鎖Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦがそれほど構造化されていないことが明白である。ヘリカルエレメントの特性を最適化することにより、抗体の生物物理学的特性（例、安定性、溶解性、フォールディング効率）は、ポジティブな影響を受けることができ、また、ドメイン間、例えば、可変ドメイン（ヘリカルエレメントに接近できない）中へのヘリカルエレメントの移植によってもポジティブな影響を受けることができる。本発明の別の利点は、本質的にプリーツシート構造を有するタンパク質を最適化することは、その特性が実質的により良く理解されている短いヘリカルエレメントを介して行われ、結果的に、プリーツシート構造よりも容易に改変されるという事実である。
【００３２】
本発明は、天然ヘリカルエレメントが最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を産生するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この最適化は、ヘリックス内部に追加の塩橋を挿入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤（プロリン及び／又はグリシン）を除去することにより行われる。免疫グロブリンのフォールディングパターンを含むタンパク質とは、本発明の範囲内で、先に記載する構造の少なくとも１つのＩｇドメインを有するタンパク質を意味する。特に、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、及び、従って好ましくは、免疫グロブリンである。しかし、本発明は、また、天然においてこの形態で存在しないが、しかし、Ｉｇドメインを有する人工タンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質（例えば抗リウマチ活性物質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）であるエタネルセプトなど）に関する。抗体とは、本発明に関連して、天然において存在し、例えば、哺乳動物を抗原で免疫することにより得ることができる種類の免疫グロブリンだけでなく、パラトープを有し、それ自体で、又は、別のＩｇドメインと一緒に、抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＩｇドメインを有する場合の、人工タンパク質も意味する。そのようなＩｇドメインは、例えば、免疫グロブリンの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）である。
【００３３】
従来、２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる免疫グロブリンの内、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４の重鎖を伴うクラスＩｇＧの免疫グロブリンが好ましい。これらの免疫グロブリンは、天然でモノクローナル又はポリクローナルでありうる、それらは霊長類（特にヒト）、げっ歯類、又は他の哺乳動物の配列を含みうる、及び、キメラ又はヒト化配列でありうる。ヒト又はヒト化免疫グロブリンが好ましい。免疫グロブリンは、また、それらのドメイン中に、本発明の方法の最適化に加えて、分子の特性を変化させることが可能であるアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含みうる。このように、例えば、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、アポトーシス誘導、又はＦｃＲｎ媒介性ホメオスタシスなどが調節されうる。潜在的な脱アミド部位、酸化部位、及びグリコシル化部位を除去する、又は、重鎖のＣ末端リジンを欠失させることにより、例えば、分子の異質性を低下させることができる。
【００３４】
完全な免疫グロブリンの他、当業者は、Ｉｇドメインを含む、それが由来する多数のタンパク質に精通している。このように、当業者には、例えば、免疫グロブリンのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｃフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ−Ｆｃ融合タンパク質、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの融合体からなる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖又は軽鎖の可変ドメインだけからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばＶＨ ＶＨＨ又はＶＬ ｄＡｂ（ラクダ由来のドメイン抗体ならびにこれらのコンストラクトのミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、及び融合タンパク質を含む）が公知である。
【００３５】
Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原結合＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域により一緒に保持される両鎖の可変領域からなる。それらは、例えば、パパインなどのプロテアーゼでの処理により、又は、ＤＮＡクローニングにより従来の抗体から産生されうる。他の抗体フラグメントは、ペプシンでのタンパク質消化により産生できるＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００３６】
遺伝子クローニング又はデノボ遺伝子合成により、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけからなる短くなった抗体フラグメントを調製することも可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（フラグメント可変＝可変部分のフラグメント）として公知である。定常鎖のシステイン基を介した共有結合が、これらのＦｖフラグメントにおいて可能ではないため、これらのＦｖフラグメントは、しばしば、特定の他の方法により安定化される。この目的のために、重鎖及び軽鎖の可変領域は、しばしば、約１０〜３０のアミノ酸、特に好ましくは１５のアミノ酸の短いフラグメントを用いて一緒に連結される。これによって、ＶＨとＶＬがペプチドリンカーにより一緒に連結される単一のポリペプチド鎖が産生される。そのような抗体フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる。ｓｃＦｖ抗体の例が公知であり、記載されている。
【００３７】
過去数年において、種々の戦略が、多量体ｓｃＦｖ派生物を産生するために開発されている。その意図は、薬物動態学的特性が改善され、結合力が増加した組換え抗体を産生することである。ｓｃＦｖフラグメントの多量体化を達成するために、それらを、多量体ドメインを伴う融合タンパク質として産生する。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ又はヘリックス構造（「コイルドコイル構造」）のＣＨ３領域（例えば、ロイシンジッパードメインなど）でありうる。他の戦略において、ｓｃＦｖフラグメントのＶＨ領域とＶＬ領域間の相互作用を、多量体化のために使用する（例、ジア、トリ、及びペンタボディ）。
用語「ジアボディ」を当技術分野において使用し、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を示す。ｓｃＦｖ分子中のペプチドリンカーを５〜１０のアミノ酸に短くすることによって、ＶＨ／ＶＬ鎖を重ね合わせることによるホモ二量体の形成がもたらされる。ジアボディは、加えて、挿入されたジスルフィド架橋により安定化されうる。ジアボディの例を文献中に見出すことができる。
【００３８】
用語「ミニボディ」を当技術分野において使用し、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を示す。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、二量体化領域として含む融合タンパク質からなる。これは、ヒンジ領域、またＩｇＧ及びリンカー領域を用いて、ｓｃＦｖフラグメントを連結する。
【００３９】
用語「トリアボディ」を当技術分野において使用し、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ派生物を示す。リンカー配列を使用しないＶＨ−ＶＬの直接融合によって、三量体の形成が導かれる。
【００４０】
二価、三価、又は四価構造を有する、当技術分野においてミニ抗体として公知のフラグメントも、ｓｃＦｖフラグメントの派生物である。多量体化は、二量体、三量体、又は四量体のコイルドコイル構造を用いて達成される。
【００４１】
当業者は、また、ＩｇＮＡＲ（「新たな抗原受容体」）として公知であるサメ及びエイからの免疫グロブリンを知っている。これらは、１つの可変領域及び５つの定常領域からなる鎖の二量体を形成する（Flajnik, M. F., Nature Reviews, Immunology 2, 688-698, 2002）。
【００４２】
また、当業者は、わずか２つの短くなった重鎖（各々が１つの可変ドメイン及び２つの定常ドメインを有する）からなる、ラマ又はラクダ科の他の動物からの抗体も知っている（Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363, 446-448, 1993）。当業者には、これらの短くなった重鎖の１つ又は複数の可変ドメインだけからなるこれらのラクダ抗体の派生物及びバリアントも公知である。そのような分子は、ドメイン抗体としても公知である。単一ドメイン抗体も、他の種からの、例えば、マウス及びヒトからの、又はヒト化形態での配列に基づき公知である（Holt et al., Trends in Biotechnology 21(11)、484 - 490, 2003）。これらのドメイン抗体のバリアントは、複数の可変ドメインからなる分子を含み、ペプチドリンカーにより互いに共有結合される。血清中での半減期を延長するために、ドメイン抗体を他のポリペプチド単位、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分と、又は、血清中に生じるタンパク質、例えばアルブミンなどと融合させてもよい。
【００４３】
用語「ヘリカルエレメント」及び「ヘリックス」を、本発明に関連して、同義語として使用する。それらは、４〜１２のアミノ酸、好ましくは６〜１２の、最も好ましくは８、９、又は１０のアミノ酸のアミノ酸配列に関連し、ヘリックスを形成できる。
【００４４】
本発明に関連する「最適化」により、タンパク質の一次構造における変化を意味し、それにより、このタンパク質中でヘリカルエレメントを形成する可能性が増加し、又は、それにより、ヘリカルエレメントがこのタンパク質中に作製され、このタンパク質の生物物理学的特性、特にそのフォールディング効率、安定性、溶解性、及び凝集傾向（最適化により低下する）を改善することを目的とする。タンパク質の一次構造を変化させる好ましい方法は、そのアミノ酸配列を突然変異させること、即ち、少なくとも１つのアミノ酸の交換（置換）、除去（欠失）、又は導入（挿入）である。これは、通常、このアミノ酸配列をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を対応して変化させ、続いて、この（組換え）ＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより行う。当業者は、これを行うために当業者に利用可能な標準的方法を有する。
【００４５】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法に関する。好ましくは、この移植は、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン中に行われる。移植とは、これに関連し、４〜１２のアミノ酸のアミノ酸配列の、同じ長さの別のアミノ酸配列による置換を意味する。特に好ましい実施態様において、１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン（例、ＶＬ又はＶＨ）に移される。
【００４６】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックスの形成の確率を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善する方法に関する。形成の確率は、好ましくは、アルゴリズム、特にＡＧＡＤＩＲアルゴリズムを使用して算出される。好ましくは、交換されるアミノ酸は、特にＡ型とＢ型又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中にある。置換されるアミノ酸は、ヘリカル構造を既に有する領域中にありうる。既存のヘリカルエレメントにおけるアミノ酸交換の目的は、このエレメントのヘリックス形成の確率を増加させることである。ヘリックス形成は、例えば、Ｉｇドメインにおいて置換されるべきアミノ酸がプロリン又はグリシンである場合、好ましくは、それが先行するβプリーツシート鎖の後の少なくとも第２の位置（ｉ→ｉ＋２）に、又は、次のβプリーツシーツ鎖の前の最大で最後から２番目の位置（ｉ→ｉ−２）に位置付けられる場合に増加しうる。プロリン又はグリシンは、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により、好ましくは、アラニンにより置換される。別の可能性は、荷電側鎖を有するアミノ酸を導入することによる塩橋の導入であり、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるようにする。所望の場合、反対荷電の側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が挿入され、置換されたアミノ酸の間の間隔を選択し、側鎖が塩橋を形成できるようにする。好ましい実施態様において、交換されるアミノ酸は、２（ｉ→ｉ＋３）、３（ｉ→ｉ＋４）、又はそれ以上のアミノ酸により互いに分離される。生理学的条件下で負荷電している側鎖を伴う、使用されうるアミノ酸の例は、グルタミン酸又はアスパラギン酸を含み、一方、アルギニン、リジン、又はヒスチジンは、これらの条件下で正荷電している側鎖を有する。好ましい実施態様において、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが挿入される又は場合により既に存在している位置は、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近い。また、二重塩橋を挿入でき、それにおいて配列は生成され、ここで３つのアミノ酸が位置ｉ及び、ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、ならびにｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に位置付けられ、ここで位置ｉ及び、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸は同じ荷電の側鎖を有するが、しかし、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸は反対荷電を有する。この目的のために、３つの対応するアミノ酸を突然変異により挿入でき、恐らくは、対応するアミノ酸が開始配列中に既に存在する場合にはさらに少ないアミノ酸を挿入してよい。この種類の二重塩橋において、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンは、好ましくは、中央の位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５中に存在する。好ましい実施態様は、交換後、タンパク質が、ヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたヘリックス配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からの配列ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトラムダＣＬドメイン（配列番号１３）からの配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からの配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。
【００４７】
別の局面において、本発明は、最適なヘリカルエレメントを有さない、又は、ほとんど有さないドメイン（例えば、ベータ２ミクログロブリンのＩｇドメイン（配列番号３）、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ）、又は免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ１など）中への適したヘリカルエレメントの移植に関する。移植されるエレメントは、例えば、免疫グロブリンの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、もしくはＣＨ３に起因しうる、又は、本発明の方法により最適化されたそのようなエレメントのバリアントでありうる。移植は、好ましくは、４〜１２の連続アミノ酸（好ましくは約１０のアミノ酸）が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換され、挿入アミノ酸配列が、置換配列よりも高いヘリックス形成の確率を有する方法を使用して行われる。好ましい実施態様において、挿入配列は、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間の領域からのヘリカルエレメントである。適したヘリカルエレメントは、例えば、ヒトＣＨ２ドメイン（配列番号５、配列番号１４、又は配列番号１５）からの配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）又はそれから最適化されたＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ配列（配列番号９）、マウスカッパＣＬドメイン（配列番号１）からの配列ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ヒトＣＬドメイン（配列番号１３）からの配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はヒトカッパＣＬドメイン（配列番号１２）からの配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法に関し、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための先に記載した方法を、この種類のタンパク質に適用し、このようにして得られた改変タンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする。宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によるタンパク質の調製方法、及び、所望の発現タンパク質（目的のタンパク質）の続く精製の方法は、当業者に十分に周知である。特に、当業者は、真核生物の宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスターの卵巣からの細胞株（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、ＣＨＯ細胞）又はマウスミエローマ細胞からの細胞株（例、ＮＳ０細胞）において免疫グロブリンを発現させる方法に精通しているであろう。特定の抗体フォーマット、例えばドメイン抗体などを、有利に、原核生物の宿主細胞（例、Ｅ． ｃｏｌｉ）又は酵母細胞において産生してもよい。
【００４９】
別の局面において、本発明は、先に記載される本発明の方法により産生される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関する。好ましくは、それは抗体、特に、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む完全免疫グロブリンである。
【００５０】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメイン（ＶＬ又はＶＨ）を有するタンパク質に関し、それはこの可変ドメインにおいてヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。天然の可変ドメインは、この種類のヘリカルエレメントを含まず、そのようなエレメントの導入によりそれらの生物物理学的特性を改善することができる。一実施態様において、この種類の可変ドメインは、免疫グロブリンの可変ドメインにおいて天然に存在する同じ長さの任意のアミノ酸配列よりも高いヘリックス形成の確率を伴うヘリカルエレメントを含む。この種類の天然の可変ドメインについてのレファレンスは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋのデータベース中に受入番号ＡＡＫ１９９３６（ＩｇＧ１ ＶＨ）及びＡＡＫ６２６７２（ＩｇＧ１ ＶＬ）の下で寄託されている可変ドメインでありうる。好ましい実施態様において、本発明の可変ドメインは、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含む。特に好ましくは、ヘリカルエレメントは、プリーツシート鎖ＥとＦの間に位置付けられる。
【００５１】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。配列番号５は、そのようなドメインのためのレファレンスとして役立ちうる。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、配列ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、ヘリカルエレメントは、ＣＨ２ドメインのプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間に位置付けられる。
【００５２】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質に関し、それは、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメント又は同じ長さの任意のアミノ酸配列よりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又は配列ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを含むＣＨ１ドメインを含む。好ましくは、ヘリカルエレメントは、ＣＨ１ドメインのプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦの間に位置付けられる。
【００５３】
別の局面において、本発明は、Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメント、好ましくは配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を有するヘリカルエレメントを有する改変されたβ２ミクログロブリンに関する。
【００５４】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、それがＩｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを含み、それは、配列 配列番号１、配列番号１２、もしくは配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４、もしくは配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つにおいて含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する。好ましい実施態様において、この種類のタンパク質は、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を有するヘリカルエレメントを含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質に関し、配列 配列番号４、配列番号６、及び／又は配列番号９を含む。
【００５６】
別の局面において、本発明は、先に記載される、治療又は診断法における医学的使用のためのタンパク質に関する。Ｉｇフォールディングパターンを有する抗体及び他のタンパク質の医学的使用が、当業者に公知であり、多くのそのような物質が薬物として認可されている（例、リツキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト）。特に、当業者は、そのような物質の製剤を調製し（例えば、生理学的緩衝水溶液）、適応される場合にはこの種類の薬物を投与する（例えば、静脈内注射又は注入）ための方法に精通している。
【００５７】
別の局面において、本発明は、天然ヘリカルエレメントが最適化されていることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法に関する。
【００５８】
別の局面において、本発明は、天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植を、好ましくは、ヘリカルエレメントを有さない又はそれほど適さないヘリカルエレメントを有するドメインにおいて行うことを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変する生物工学的方法に関する。
【００５９】
以下は、本発明に関連して重要であるさらなる定義及び説明である：
【００６０】
本発明のタンパク質は、好ましくは、宿主細胞における組換え発現により産生される。宿主細胞中に導入される発現ベクターを使用する。発現ベクターは「目的の遺伝子」を含み、それは、目的の産物をコードする任意の長さのヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物又は「目的の産物」は、一般的に、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はそのフラグメントもしくは派生物である。しかし、それはＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡでもよい。目的の遺伝子は、その全長で、短くなった形態で、融合遺伝子として又は標識された遺伝子として存在しうる。それは、ゲノムＤＮＡ又は好ましくはｃＤＮＡもしくは対応するフラグメントもしくは融合物でありうる。目的の遺伝子は天然遺伝子配列でありうる、又は、それは突然変異もしくは別の方法で改変されうる。そのような改変は、特定の宿主細胞に適応するためのコドン最適化及びヒト化を含む。目的の遺伝子は、例えば、分泌型、細胞質内型、核局在型、膜結合型、又は細胞表面結合型ポリペプチドをコードしうる。
【００６１】
用語「核酸」、「ヌクレオチド配列」、又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びそのフラグメントならびに単鎖又は二重鎖として生じ、遺伝子のコード鎖又は非コード鎖を表わすことができるゲノム又は合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを示す。核酸配列は、標準的技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性の突然変異誘発、又はオリゴヌクレオチド配列からのデノボ合成などを使用して改変してよい。
【００６２】
本発明に関連する生物薬剤学的な意義を伴うタンパク質／ポリペプチドは、例えば、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又は免疫グロブリン及び他のタンパク質（例、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、及びその派生物又はフラグメント）を含む。一般的に、これらは、アゴニストもしくはアンタゴニスト及び／又は治療的用途もしくは診断的用途を有する物質である。
【００６３】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」をアミノ酸配列又はタンパク質について使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語は、また、反応、例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、又はタンパク質プロセシングなどにより翻訳後改変されたタンパク質を含む。ポリペプチドの構造を、例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入及び他のタンパク質（例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分など）との融合により、その生物学的活性を保持しながら改変してよい。また、ポリペプチドは多量体化し、ホモマー及びヘテロマーを形成しうる。
【００６４】
発現ベクターは、理論的には、当技術分野において公知の従来方法により調製してよい。また、ベクターの機能的成分（例、適したプロモーター、エンハンサー、ターミネーションシグナル及びポリアデニル化シグナル、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー、複製開始点、及びスプライシングシグナル）に関する記載がある。従来のクローニングベクターを使用してそれらを産生してよい（例、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、又はウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単純ヘルペスウイルス、ならびに合成もしくは人工染色体又はミニ染色体など）。真核生物の発現ベクターは、典型的には、原核生物の配列、例えば、細菌中でのベクターの複製及び選択を可能にする複製起点及び抗生物質耐性遺伝子なども含む。ポリヌクレオチド配列の導入のための複数のクローニング部位を含む、多くの真核生物の発現ベクターが公知であり、一部を、種々の企業、例えば、Stratagene, La Jolla（CA, USA）；Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）；Promega（Madison, WI, USA）又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto, CA, USA）などから商業的に入手してよい。
【００６５】
真核生物又は原核生物の宿主細胞を、適した発現ベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換する。酵母細胞及び哺乳動物細胞は、好ましくは、真核生物の宿主細胞として使用される。前者は、特に、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）であり、後者は、特に、げっ歯類細胞、例えば、マウス、ラット、及びハムスター細胞株などである。細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｐ．エルギノーサ（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が、好ましくは、原核生物の宿主細胞として使用され、その内、大腸菌が特に好ましい。本発明の発現ベクターを用いた対応する細胞のトランスフェクション又は形質転換の成功は、形質転換細胞、遺伝子改変細胞、組換え細胞、又はトランスジェニック細胞をもたらし、それらも本発明の対象である。
【００６６】
本発明の目的のための好ましい真核生物の宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はこれらの細胞株の派生体／子孫などである。特に好ましくは、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＢＨＫ２１細胞、特にＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。また、適しているのは、マウスからのミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞ならびにこれらの細胞株の派生体／子孫である。しかし、これらの細胞株の派生体及び子孫、他の哺乳動物細胞（制限はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯類の細胞株を含む）、真核細胞（制限はされないが、酵母、昆虫、トリ、及び植物の細胞を含む）も宿主細胞として生物薬剤学的タンパク質の産生のために使用してよい。
【００６７】
ポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターの１つを用いた真核生物の宿主細胞のトランスフェクションを、従来の方法により行う。トランスフェクションの適した方法は、例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例、ＤＥＡＥデキストラン）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、及びウイルス感染を含む。
【００６８】
ポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターの１つを用いた原核生物の宿主細胞の形質転換を、従来の方法を使用して行う。適した方法は、例えば、エレクトロポレーション、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、ポリエチレングリコール、又はジメチルスルホキシドを用いた細胞の化学処理、バクテリオファージ形質導入を含む。
【００６９】
本発明に従い、安定なトランスフェクションが好ましくは行われ、それにおいて、コンストラクトが、宿主細胞のゲノム中又は人工染色体／ミニ染色体中のいずれかに組込まれる、又は、エピソームとして宿主細胞中に安定に含まれる。問題になっている宿主細胞において異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度及び発現を与えるトランスフェクション方法が好ましい。
【００７０】
宿主細胞が、好ましくは、樹立され、順応され、無血清条件下で、場合により、動物タンパク質／ペプチドを含まない培地中で培養される。商業的に入手可能な培地の例は、ハムＦ１２（Sigma, Deisenhofen, DE）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）、ＹＭ（Sigma）、ＹＰＤ（Invitrogen）、及び合成「ドロップアウト」酵母培地（Sigma）を含む。これらの培地の各々には、場合により、種々の化合物、例えば、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例、インスリン、トランスフェリン、表皮増殖因子、インスリン様増殖因子）、塩（例、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸）、バッファー（例、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例、アデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコース又は他の等価の栄養分、抗生物質、及び／又は微量元素を添加してよい。無血清培地が本発明に従って好ましいが、宿主細胞は、適量の血清を混合した培地を使用して培養してもよい。
【００７１】
原核生物の宿主細胞の培養のために、商業的にも利用可能な多数の公知の培地が存在する。例は、ＬＢ、ＴＢ、Ｍ９、ＳＯＣ、ＹＴ、及びＮＺ培地（Sigma）を含む。
【００７２】
１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の選択のために、１つ又は複数の適した選択薬剤を培地に加える、又は、増殖に必須の添加剤（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を欠く適した「ドロップアウト（drop-out）」培地を使用する。
【００７３】
遺伝子発現及び高産生宿主細胞の選択：
用語「遺伝子発現」又は「発現」は、宿主細胞における異種遺伝子配列の転写及び／又は翻訳に関する。発現率は、一般的に、宿主細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づき、又は、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の産生量に基づき決定することができる。選択されたヌクレオチド配列の転写により産生されるｍＲＮＡの量は、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、又はＰＣＲ法（例、定量的ＰＣＲ）により決定することができる。選択されたヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、プロテインＡ ＨＰＬＣ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性の検出、タンパク質の免疫染色、それに続くＦＡＣＳ分析又は蛍光顕微鏡法、ＦＡＣＳ分析又は蛍光顕微鏡による蛍光タンパク質の直接検出により決定することもできる。
【００７４】
別の局面において、本発明のタンパク質は、産生細胞が増殖し、目的のコード遺伝子産物を産生するために使用される方法において産生される。このために、選択された高産生細胞を、好ましくは無血清培養液において、好ましくは浮遊培養において、目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で培養する。目的のタンパク質／産物は、好ましくは、分泌された遺伝子産物として、細胞培養液から得られる。タンパク質が分泌シグナルなしで発現される場合、しかし、遺伝子産物は細胞ライセートから単離することもできる。他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質を実質的に含まない純粋で均質な産物を得るために、従来の精製手順を行う。最初に、細胞及び細胞残屑を培養液又はライセートから除去する。所望の遺伝子産物を、次に、混入する可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば、免疫親和性及びイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ又はセファデックスでのクロマトグラフィー、シリカ又は陽イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥなど）により除くことができる。組換え宿主細胞により発現される異種タンパク質の精製をもたらす方法は、当業者に公知であり、文献において記載されている。
【００７５】
本発明を、本明細書において、例として一部の実施態様を参照することにより記載する。
【００７６】
実施例
略語
ＡＦＭ：原子間力顕微鏡法
β２ｍ：β２ミクログロブリン
ｂｐ：塩基対
ＣＤ：円二色性
ＣＨ２：重鎖Ｉｇの第２定常ドメイン
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬ：軽鎖Ｉｇの定常ドメイン
ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸還元酵素
Ｅ． ｃｏｌｉ：大腸菌
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法
ＦＵＶ：遠紫外線
ＧｄｍＣｌ：塩酸グアニジン
ＧＳＨ：グルタチオン
ＧＳＳＧ：グルタチオンジスルフィド
ＨＳＱＣ：異核種単一量子コヒーレンス法
ＨＣ：重鎖
ＨＴ：ヒポキサンチン／チミジン
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ｋｂ：キロベース
ＬＣ：軽鎖
ｍＡｋ：モノクローナル抗体
ＭＤ：分子動力学
ＭＴＸ：メトトレキサート
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＮＰＴ：ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ
ＮＵＶ：近紫外線
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＥＡＰ：分泌型アルカリホスファターゼ
ＷＴ：野生型
【００７７】
方法
細菌中でのタンパク質産生及び精製
タンパク質の発現のために、組換えＥ． ｃｏｌｉ細菌ＢＬ２１ ＤＥ３（Stratagene, CA, USA）を３７℃のＬＢ選択培地中で振盪フラスコにおいて３００rpmで一晩培養する。ＮＭＲ測定のためのアイソトープ標識タンパク質を産生するために、組換え細菌を、単一窒素源として１５Ｎ塩化アンモニウムを、又は、場合により、追加で単一炭素源として１３Ｃグルコースを伴うＭ９最少培地（Sigma）中で培養する。
【００７８】
次に、「封入体」を単離する。このために、細菌を遠心により除去し、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビター中に再懸濁させる。細胞をフレンチプレス中で溶解させ、２% ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と混合し、４℃で３０分間撹拌する。遠心（２０，０００rpm、３０分間）により、「封入体」をペレットとして単離し、次に、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビター中で２回再懸濁させ、再び遠心（２０，０００rpm、３０分間）して捨てた。タンパク質β２ｍ ＷＴ（配列番号３）、β２ｍからＣＬ（配列番号４）、ＣＨ２ ＷＴ（配列番号５）、及びＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体（配列番号６）については、封入体のペレットを次に１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０mM ＥＤＴＡ、８M尿素に再懸濁し、１００mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０mM ＥＤＴＡ、５M尿素中で平衡化させたＱセファロースカラムに加えた。全てのタンパク質がフロースルー中にあり、４℃の２５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１００mMアルギニン、１０mM ＥＤＴＡ、１mM ＧＳＳＧ、０．５mM ＧＳＨ中での透析により一晩リフォールディングさせる。次に、タンパク質を濃縮させ、最終的に、ＰＢＳ中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ ゲルろ過カラムを通して精製する。
【００７９】
Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むタンパク質ＣＬ ＷＴ（配列番号１）、ＣＬ Ｐ３５Ａ（配列番号７）、及びＣＬからβ２ｍ（配列番号２）を精製するために、封入体を１００mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、６M ＧｄｍＣｌ、２０mM β-メルカプトエタノール中で２時間、２０℃で可溶化させる。不溶性成分を次に遠心（４８０００g、２５分間、２０℃）により除く。上清を、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、４M ＧｄｍＣｌ中で５倍希釈し、ニッケルキレートカラム（Ni-NTA、Qiagen）に加える。５カラム容積での洗浄後、溶出を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ４）、４M ＧｄｍＣｌで行う。透折によるリフォールディングを、４℃の２５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５mM ＥＤＴＡ、１mM酸化グルタチオン中で一晩行う。凝集物を遠心（４８０００g、２５分間、４℃）により除く。Ｎ末端Ｈｉｓタグを除去するために、０．２５単位のトロンビン（Novagen）を、４℃で１６時間、タンパク質１ミリグラム当たりに加える。さらなる遠心後、タンパク質を、最終的に、２０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、１００mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲルろ過カラムを通して精製する。
【００８０】
ＣＤスペクトロスコピー
ＣＤ測定をＪａｓｃｏＪ−７１５分光偏光計で行う。測定を２０℃のＰＢＳ中で行う。
【００８１】
遠ＵＶ ＣＤスペクトルを、０．２mmの石英ディッシュ中で、タンパク質濃度５０μMで１９５〜２５０nmから測定し、近ＵＶ ＣＤスペクトルを、５mmの石英ディッシュ中で、タンパク質濃度５０〜１００μMで２５０〜３２０nmから測定する。測定を２０℃のＰＢＳ中で行う。スペクトルを各場合において１６倍に蓄積し、平均し、バッファー補正する。温度遷移をそれぞれ２１８nm（ＣＨ２ ＷＴ／突然変異体）又は２０５nm（ＣＬ、β２ｍ ＷＴ／突然変異体）で、１０μMのタンパク質濃度のＰＢＳ中で、１mm石英ディッシュにおいて２０℃／時の加熱速度で測定する。
【００８２】
ＡＦＭ測定
原線維化実験のために、ＰＢＳ（１：１）中の１００μMタンパク質溶液を、バッファーＡ（２５mM酢酸ナトリウム、２５mMリン酸ナトリウム、ｐＨ １．５又は２．５）と混合する。最終ｐＨ値は、このように、それぞれｐＨ １．５又はｐＨ ３．０である。溶液を、７日間、穏やかに傾けながら３７℃でインキュベートし、次に２０μLの溶液を新しい雲母表面に加えて、滅菌ろ過水で３回洗浄し、次にＡＦＭ中で分析する。スキャン速度１．５μm/分のＡＦＭ接触モードを使用する。測定を、Digital Instruments Multimode Scanning Probe顕微鏡及びＤＮＰ−Ｓ２０チップを使用して行う。「シード（Seeds）」を、１０分間、超音波槽中でインキュベートすることによりベータ２ミクログロブリン原線維（ｐＨ １．５）から生成する。「シーディング（Seeding）」実験のために、２μlの「シード」を１００μlの混合物に加える。
【００８３】
ＮＭＲ測定
特記なき場合、全てのスペクトルを２５℃で、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ６００、ＤＭＸ７５０、及びＡＶＡＮＣＥ９００分光計において測定する。割当を、標準的な三重共鳴スペクトルを使用して試みる。リフォールディング実験及びリアルタイムＨＳＱＣ測定のために、ＣＬを、２Ｍ塩化グアニジウム中でアンフォールドさせ、次に、氷冷ＰＢＳで１：１０希釈する。フォールディングプロセス中でのＨＳＱＣ測定を２℃で１４分毎に行い、ＳＰＡＲＫＹを使用して分析する。
【００８４】
遺伝子合成
野生型ＣＨ２ドメイン及びＣＬドメインについての配列領域を、ＰＣＲにより、ヒトＩｇＧ１抗体遺伝子又はマウス抗体ＭＡＫ３３のカッパ鎖から増幅させる（Augustine, J. G. et al., J. Biol. Chem. 276 (5), 3287-3294, 2001）。Ｐ３５Ａ突然変異を、ＣＬドメイン中に、変異プラマーを使用したＰＣＲ突然変異誘発により挿入する。Ｅ． ｃｏｌｉ中での発現のために、ヘリックス最適化したＣＨ２突然変異体、β２ｍ−ＷＴ、及びＣＬヘリックスを移植したβ２ｍ突然変異体のＣＨ２ドメインについての配列領域をデノボで合成する（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中での完全抗体の発現のために、ヘリックス突然変異を、変異プライマーを使用したＰＣＲ突然変異誘発により、ＩｇＧ１抗体遺伝子の野生型ＣＨ２ドメイン中に挿入する。
【００８５】
真核細胞の培養及びトランスフェクション
細胞ＣＨＯ−ＤＧ４４／ｄｈｆｒ-/-を、細胞培養フラスコにおいて、ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE）を添加した無血清ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中で浮遊細胞として、３７℃で、加湿空気及び５% ＣＯ２中で持続的に培養する。細胞数及び生存を、Cedex（Innovatis）を用いて決定し、細胞を次に濃度１〜３×１０５個/mLで播種し、２〜３日毎に継代する。
【００８６】
ＣＨＯ−ＤＧ４４のトランスフェクションのために、Lipofectamine Plus Reagent（Invitrogen）を使用する。各トランスフェクションバッチについて、合計１．０〜１．１μgのプラスミドＤＮＡ、４μLのLipofectamine、及び６μLのPlus試薬を製造者の指示に従って混合し、容積２００μL中で、０．８mlのＨＴ添加ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中の６×１０５個の細胞に加える。細胞インキュベーター中での３７℃で３時間のインキュベーション後、２mLのＨＴ添加ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加える。４８時間の培養期間後、トランスフェクション混合物を回収するか（一過性トランスフェクション）、又は、選択に供する。１つの発現ベクターがＤＨＦＲ選択マーカーを含み、他のベクターがＮＰＴ選択マーカーを含むため、トランスフェクションから２日後、コトランスフェクトした細胞を、ＤＨＦＲ及びＮＰＴベースの選択のためにヒポキサンチン及びチミジンを加えていないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中に移し、Ｇ４１８（Invitrogen）も培地中に濃度４００μg/mLで加える。
【００８７】
組込まれた異種遺伝子のＤＨＦＲベースの遺伝子増幅を、ＨＴ不含ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地への濃度５〜２０００nMでの選択薬剤ＭＴＸ（Sigma）の添加により行う。
【００８８】
発現ベクター
ＣＨＯ−ＤＧ４４中での発現のために、ｐＡＤ−ＣＭＶベクターに基づく真核生物の発現ベクターを使用し（Werner, R. G. et al., Arzneimittel-Forschung/Drug Research 48, 870-880, 1998）、ＣＭＶエンハンサー／ＣＭＶプロモーターの組み合わせを介した異種遺伝子の発現を媒介する。第１ベクターｐＢＩ−２６は、増幅可能な選択マーカーとして作用するｄｈｆｒミニ遺伝子を含む。第２ベクターｐＢＩ−４９において、ｄｈｆｒミニ遺伝子をＮＰＴ遺伝子により置換する。この目的のために、ＮＰＴ選択マーカー（ＳＶ４０初期プロモーター及びＴＫポリアデニル化シグナルを含む）を、市販のプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）から１６４０bpのＢｓｕ３６Ｉフラグメントとして単離した。Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いたフラグメントの平滑化（ｔｏｐｐｉｎｇ ｕｐ）反応後、フラグメントを第１ベクターの３７５０bpのＢｓｕ３６Ｉ／ＳｔｕＩフラグメント（同様にＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理した）と連結した。次に、ＮＰＴ遺伝子を改変した。それはＮＰＴバリアントＦ２４０Ｉ（Ｐｈｅ２４０Ｉｌｅ）であり、そのクローニングはＷＯ２００４／０５０８８４において記載されている。
【００８９】
大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３（Stratagene, CA, USA）中での発現のために、ベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）を使用する。
【００９０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の上清における発現抗体の定量化を、標準的手順に従ってＥＬＩＳＡを使用し、一方ではヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Dianova, Hamburg, DE）を、他方ではＡＰ抱合ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Sigma）を使用して行う。使用したスタンダードは、各場合における発現抗体と同じアイソタイプの精製抗体である。
【００９１】
ＳＥＡＰアッセイ
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からの培養上清中のＳＥＡＰ力価を、製造者（Roche Diagnostics GmbH）の操作指示に従ってSEAP Reporter Gene Assaysを使用して定量化する。
【００９２】
ThermoFluor（登録商標）方法
最適化されたタンパク質／免疫グロブリンの熱安定性を分析するために、ThermoFluor（登録商標）方法に基づくｑＰＣＲシステム（Ｍｘ３００５ＰＴＭ； Stratagene）を使用する。ソルバトクロミック／環境感受性の蛍光色素が、タンパク質の熱安定性におけるわずかな変化の指標として使用される。この蛍光色素は、水溶液中で小さな量子収率を有し、温度上昇の結果としてアンフォールドするタンパク質の疎水性の非天然構造と相互作用する。既にアンフォールドしたタンパク質ドメインと色素の相互作用は、検出された蛍光における有意な増加をもたらす（Cummings M. D. et al., Journal of Biomolecular Screening 854 - 863, 2006）。
【００９３】
２５〜９５℃の温度範囲における１分当たり１℃の間隔でのタンパク質プローブの測定が容積２０μL中で起こり、２μMタンパク質及び４ｘＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ（５０００ｘＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ原液から調製；Invitrogen）を、各場合において試験すべきバッファー中で使用する。
【００９４】
実施例１：免疫グロブリンドメインの生物物理学的特性を改善するための手法
第一工程は、最適化の標的として選択された免疫グロブリンドメイン中にヘリックスが存在しない場合、ヘリカルエレメント又は対応するループを同定することである。抗体の定常ドメインの場合、ヘリックスは、例えば、βプリーツシート鎖ＡとＢ及びＥとＦの間に常に位置付けられる（図４）。これらの領域の同定後、最適化を以下の計画に従って行う：
【００９５】
１．全てのプロリン基及び／又はグリシン基を、別のアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換する（優先すべきポイント２との不一致が存在しない場合）。置換すべき基が、先行するβプリーツシート鎖の後の最初の基又は続くβプリーツシート鎖の前の最後の基ではない場合にだけ置換を行う。
２．次に、ヘリックスを追加の塩橋の挿入により安定化する。これは、既存のアミノ酸を、異なる荷電の荷電側鎖を有するアミノ酸で置換することにより行う。アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の任意の組み合わせを使用してよい。置換すべき基を、２、３、又は４個のアミノ酸により分離させ、ヘリックス中での塩橋の形成を確実にしなければならず、挿入された荷電基が、例えば、ナンバリングｉ及びｉ＋３、ｉ及びｉ＋４、又はｉ及びｉ＋５を有するようにする。上記の基の全ての順列が可能である。好ましくは、しかし、アルギニン、リジン、又はヒスチジンが、アスパラギン酸又はグルタミン酸よりもＣ末端により近く挿入される。二重塩橋も、それらがヘリックス長と一致し、指定された全ての他の点例えば、基ｉ、及びｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９が、先に記載した通りに置換される場合、理論的に可能である。基ｉ、及びｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９は、各々が同じ荷電を有し、一方、基ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５は反対荷電を有する。位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５では、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンを好ましくは使用すべきである。この工程において、タンパク質の表面上に位置付けられる溶媒暴露基だけを置換すべきである。
３．ポイント１及び／又は２に記載される最適化を受けない全ての残りの基を、αヘリックスの形成の確率の増加をもたらすアミノ酸により置換する。コンピューターアルゴリズムＡｇａｄｉｒ（Internet ad-dress: http://www.embl.de/Services/serrano/agadir/ agadir-start.html）又はαヘリックスの形成の確率を予測するための任意の他のアルゴリズムが、基礎を形成する。この工程において、タンパク質の表面上に位置付けられる溶媒暴露基だけを置換すべきである。
一般的に、見出されるべきヘリカルエレメントが存在しない抗体の可変ドメイン及び／又は他の抗体のドメイン及び／又は他の免疫グロブリンドメインについて、対応するループを、最初に、抗体の定常ドメイン、好ましくは最適化すべき分子が起因する同じ生物のＩｇＧ１サブクラスのＣＬドメインからのヘリックスにより置換すべきである。次に、最適化を上の手順に従って行う。
【００９６】
実施例２：ＣＬドメインのタンパク質フォールディングの研究
抗体ドメインのフォールディング経路の重要な決定基を確かめるために、高分解能構造研究を、マウスＭＡＫ３３ ＣＬドメイン及びスポット突然変異体（ＣＬ−Ｐ３５Ａ）について行う。タンパク質ＣＬ ＷＴ（配列番号１）及びＣＬ−Ｐ１３５Ａ（配列番号７）をＥ． ｃｏｌｉ中で組換え産生させる。ＣＬ ＷＴ中の最初の４つのＮ末端アミノ酸の各々は、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に由来し、ＣＬドメインにおいて天然に存在しない。ＮＭＲスペクトロスコピーを、変性剤ＧｄｍＣｌ中でのアンフォールディング後、リアルタイムに低温でＣＬドメインのフォールディングをモニターするために使用できる（図５及び６）。鎖ＡとＢの間及び鎖ＥとＦの間の２つの短いヘリカルエレメントが、主なフォールディング中間体において既に完全に構造化されていることが見出される（図５及び６）。このように、それらが、これら及び他の抗体ドメインのフォールディングプロセスにおいて重要な役割を果たすことを仮定することができる。ＣＬドメインをフォールドする速度決定工程は、その前にフォールディング中間体が集合され、プロリン基３５のトランスからシスへの異性化である。従って、この基はアラニンについて交換され、それは常にトランスで存在するはずである。この方法では、フォールディング中間体を平衡状態で安定化させることができる。それに関するＮＭＲ研究によって、ＷＴ−ＣＬドメインに関する動態学的研究が確認される：２つの短いヘリックスは、ＣＬドメイン中の完全に構造化されたエレメントだけである。
【００９７】
実施例３：ヘリカルエレメントの移植
ＣＨ１ドメイン（わずかに顕著なヘリックスだけを有する）及び可変ドメイン（ヘリックスを有さない）中への、特に、抗体の定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及びＣＨ３からのヘリカルエレメントの移入が、１つの可能なアプローチである。ヘリックスの追加の又は代わりの最適化のために、例えば、ヘリックス内に追加の塩橋を用い、ヘリックス破壊剤（プロリン基又はグリシン基）を除くことが可能である。このアプローチでの生存を、マウスＩｇＧ及びベータ２ミクログロブリンのカッパ軽鎖のＣＬドメインに関する試験により実証することができる。遺伝子改変により、βプリーツシート鎖ＡとＢ又はＥとＦを連結するＣＬ中の２つのヘリカルエレメント（図５）を、ベータ２ミクログロブリンからの対応する非構造化領域（図２）（ＣＬからβ２ｍ；配列番号２）と交換する。逆に、ベータ２ミクログロブリン中の非構造化領域を、ＣＬからの対応するヘリカルエレメント（β２ｍからＣＬ；配列番号４）により置換する。タンパク質ＣＬからβ２ｍ及びβ２ｍからＣＬならびに、コントロールとして、野生型配列β２ｍ（配列番号３）及びＣＬ（配列番号１）をＥ． ｃｏｌｉ中で組換え産生させる。ＣＬ ＷＴ中の最初の４つのＮ末端アミノ酸又はＣＬからβ２ｍ中の最初のＮ末端アミノ酸は、各場合において、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に起因し、ＣＬドメインにおいて天然で存在しない。ＣＬは、そのヘリックス（＝ＣＬからβ２ｍ）の非存在において、その天然構造にもはやフォールドできないのに対し、ベータ２ミクログロブリンは、ＣＬヘリックスがベータ２ミクログロブリン配列（β２ｍからＣＬ）（図７及び８を参照のこと）中に移植される場合に凝集する傾向が有意に低くなることをＣＤスペクトロスコピーにより示すことができる。さらに、分子力学シミュレーションによって、ベータ２ミクログロブリンタンパク質に関連してでさえ、ＣＬヘリックスがそれ自体で構造化し、このように、実際に、頑強なフォールディングエレメントを構成することが示されている。これらの測定は、例として、抗体ドメインの構造化における必須の役割及びＩｇトポロジーに対するポジティブな影響の両方を示すことができる。
【００９８】
実施例４：ヒトＩＧＧ１ ＣＨ２ドメインの最適化
ＩｇＧ Ｆｃフラグメント（図１）内で、ＣＨ２ドメインは安定性の点で最も弱い連結である。また、ＦｃフラグメントはＩｇＧ抗体の一般的なプラットフォームとして見なすことができ、ＣＨ２ドメインの生物物理学的特性の最適化が、一方で、Ｆｃフラグメントの全安定性を増加するはずであり、他方で、普遍的に適用可能である最適化を構成するはずである。
【００９９】
この例について、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの第１ヘリックス（図９Ａ）が最適化のために選択される。追加の塩橋が、標的突然変異誘発によりその中に挿入される（図９Ｂ）。両方のＣＨドメイン、野生型（ＣＨ２ ＷＴ；配列番号５）及びＨｅｌｉｘ１突然変異体（ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体；配列番号６）をＥ． ｃｏｌｉ中で発現させる。ＣＨ２ Ｈｅｌｉｘ１突然変異体中の最初のＮ末端アミノ酸は、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中への選ばれたクローニング戦略に由来し、ＣＬ２ドメインにおいて天然で存在しない。精製タンパク質を用いて行われた分析によって、このアプローチを使用して、二次構造及び三次構造の点で野生型ドメインから実質的に不変であるが（図１０）、しかし、４〜５℃高い融点を有する（図１１）ＣＨ２ドメインを生成することが可能であることが示される。また、第１ヘリックスを最適化することにより、組換えＣＨ２ドメインのリフォールディングにおいてより高い収率を得ることができ、それは、この突然変異ドメインの最適化されたフォールディング特性を直接的に示唆する。
【０１００】
実施例５：ＣＨＯ細胞中での最適化された抗体の発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の一過性トランスフェクションにより、最初に、ヘリックス最適化配列エレメントＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）によるＩｇＧ１抗体遺伝子のＣＨ２ドメイン中のヘリカルエレメントＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）の置換が、ＩｇＧ１分子の発現に影響を有するか否かを調べた。コトランスフェクションを以下のプラスミドの組み合わせを用いて行う：
ａ）コントロールプラスミドｐＢＩ−２６／ＩｇＧ１−ＨＣ及びｐＢＩ−４９／ＩｇＧ１−ＬＣ、ＣＨ２ドメイン中に配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）を有するモノクローナルＩｇＧ１抗体について（＝野生型配置；以下、ＩｇＧ１−ＷＴと呼ぶ）、
ｂ）ｐＢＩ−２６／ＩｇＧ１−ＨＣｈｅｌｉｘ１及びｐＢＩ−４９／ＩｇＧ１−ＬＣ、モノクローナルＩｇＧ１抗体について、それにおいて、ヒトＶＨ２ドメイン中の第１ヘリックスが、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）による配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）の置換により最適化される。
【０１０１】
３プールを各組み合わせについてトランスフェクトし、等モルの２つのプラスミドを各コトランスフェクションにおいて使用する。４８時間後、回収し、細胞培養上清中のＩｇＧ１力価をＥＬＩＳＡにより決定する。トランスフェクション効率における差を、ＳＥＡＰ発現プラスミドとのコトランスフェクション（各トランスフェクション混合物への１００ngのプラスミドの添加）及び続くＳＥＡＰ活性の測定により補正する。全てにおいて、２つの独立したトランスフェクションシリーズを行う。ＩｇＧ１分子中のＣＨ２ドメインのヘリックス領域における突然変異が、抗体の発現に悪影響を有さないことを示すことができる。得られた産物の量は、ＩｇＧ１野生型トランスフェクト細胞の量と同等である。
【０１０２】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の安定的トランスフェクションのために、上に記載の同じプラスミドの組み合わせを用いてコトランスフェクションを行う。安定的トランスフェクト細胞の選択は、４００μg/mLのＧ４１８を添加したＨＴ不含培地中でのトランスフェクションから２日後に起こる。選択後、ＤＨＦＲベースの遺伝子増幅を、１００nM ＭＴＸの添加による誘導する。物質産生のために、細胞を振盪フラスコにおいて１０日間のフェド−バッチ（fed-batch）方法中で増殖させる。精製は、抗体のＷＴ又はＨｅｌｉｘ１突然変異体について同一である。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（MabSelect rProteinA, GE Healthcare）を、製造者の指示に従い、平衡化のためのリン酸バッファー（２０mMリン酸ナトリウム、１４０mM塩化ナトリウム、ｐＨ ７．５、伝導度１６．５mS/cm）及び溶出のための５０mM酢酸（ｐＨ ３．３）を使用して行う。溶出は、１M Ｔｒｉｓ ｐＨ ８の添加によりｐＨ ５．５に調整する。２つの抗体バリアントについての精製プロファイルは同等である。
【０１０３】
抗体の熱安定性は、ThermoFluor（登録商標）方法により決定する。ＣＨ２ドメイン中の天然ヘリカルエレメントを最適化することにより、ＩｇＧ１抗体のＨｅｌｉｘ１突然変異体の熱安定性を、ＩｇＧ１−ＷＴ抗体と比較し、塩基性及び酸性の両方のバッファー条件下で増加させることができる。ｐＨ ７．１のＰＢＳ中で、Ｈｅｌｉｘ１突然変異体のＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１−ＷＴのＣＨ２ドメインよりも８℃高い融解温度を呈する。また、１００mM酢酸（ｐＨ ３．４）中では、それはさらに１８℃高い。免疫グロブリンの熱安定性におけるこの有意な増加は、治療用タンパク質の生物薬剤学的調製において非常に大きな利点である。ＣＨ２ドメインの天然ヘリカルエレメントの最適化は、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を用いて天然の配列領域ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）（この配列領域は、例えば、ヒトＩｇＧ２（配列番号１４）及びＩｇＧ４（配列番号１５）のＣＨ２ドメインにおいて存在する）を置換することにより、生物工学的に産生された治療用タンパク質の頑強性の有意な改善をもたらす。増加した温度安定性及びｐＨ安定性は、治療用タンパク質の産物安全性を増加させるために、ウイルス不活化の方法工程において特に有利である。なぜなら、この工程は酸性ｐＨで行われるからである。他の利点は、クロマトグラフィーにおける及びタンパク質製剤におけるより大きな柔軟性、より低い凝集傾向、及び改善された保存安定性である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ヘリカルエレメントが最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法。
【請求項２】
最適化が、ヘリックス内部に追加の塩橋を導入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤を除去することにより行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
天然の又は最適化されたヘリカルエレメントが移植されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法。
【請求項４】
１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン中へ移されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックスの形成の可能性を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための方法。
【請求項６】
形成の確率がアルゴリズムを使用して算出される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
置換アミノ酸が、２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
置換アミノ酸が、Ａ型とＢ型の２つのβプリーツシート鎖間及び／又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
置換アミノ酸が、ヘリカル構造を既に有する領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
プロリン又はグリシンが、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により置換されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
荷電側鎖を有するアミノ酸が、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるように挿入されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
反対荷電を有する側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が挿入され、２つのアミノ酸間の間隔によって、側鎖が塩橋を形成できるようにすることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
２つの置換アミノ酸が、２つ又はそれ以上のアミノ酸（（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５））により互いに分離されることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
２つの挿入アミノ酸の１つがグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、他のアミノ酸がアルギニン、リジン、又はヒスチジンであることを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
アルギニン、リジン又はヒスチジンが挿入される又は恐らく既に存在している位置が、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近いことを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
配列が生成される、ここで３つまでのアミノ酸が位置ｉ及び、ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５ならびに、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に挿入され、位置ｉ及び、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸が同じ荷電の側鎖を有するのに対し、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸が反対荷電を有することを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
中央位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５で、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンが導入される又は場合により既に存在していることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
交換後に、タンパク質が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）、及び／又はＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
４〜１２の連続アミノ酸が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換され、挿入アミノ酸配列が、置換配列よりも高いヘリックス形成の確率を有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
挿入配列が、免疫グロブリンの軽鎖（ＣＬ）又は重鎖（ＣＨ）の定常ドメインからのヘリカルエレメントであることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
挿入配列が、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦ間の領域からのヘリカルエレメントであることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
挿入配列が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）を含むことを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法をこのタンパク質に適用し、このようにして得られたタンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法により調製される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質。
【請求項２５】
抗体であることを特徴とする、請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２６】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメインを有するタンパク質であって、それがこの可変ドメイン中にヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２７】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質であって、それが、この定常ドメインにおいて、配列 配列番号５を有するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２８】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質であって、それが、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２９】
ヘリカルエレメントが、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を含むことを特徴とする、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３０】
ヘリカルエレメントが、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を含むことを特徴とする、請求項２６又は２８記載のタンパク質。
【請求項３１】
Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを有し、それが、配列 配列番号１、配列番号１２又は配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４又は配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つにおいて含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質。
【請求項３２】
ヘリカルエレメントが配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を含むことを特徴とする、請求項３１記載のタンパク質。
【請求項３３】
医薬使用のための請求項２４〜３１のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項３４】
天然ヘリカルエレメントの最適化が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法。
【請求項３５】
天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法。
【請求項１】
天然ヘリカルエレメントが最適化されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法。
【請求項２】
最適化が、ヘリックス内部に追加の塩橋を導入すること、及び／又は、ヘリックス破壊剤を除去することにより行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
天然の又は最適化されたヘリカルエレメントが移植されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質を調製するための生物工学的方法。
【請求項４】
１つ又は複数のヘリカルエレメントが、少なくとも１つの定常ドメインＣＬ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３から、少なくとも１つのＣＨ１定常ドメイン及び／又は可変ドメイン中へ移されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｉｇドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸が、ヘリックスの形成の可能性を増加させる別のアミノ酸により置換されることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質の生物物理学的特性を改善するための方法。
【請求項６】
形成の確率がアルゴリズムを使用して算出される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
置換アミノ酸が、２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
置換アミノ酸が、Ａ型とＢ型の２つのβプリーツシート鎖間及び／又はＥ型とＦ型の２つのβプリーツシート鎖間の領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
置換アミノ酸が、ヘリカル構造を既に有する領域中に位置付けられることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
プロリン又はグリシンが、プロリンでもグリシンでもないアミノ酸により置換されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
荷電側鎖を有するアミノ酸が、反対荷電の側鎖を有するアミノ酸から（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５）の間隔であるように挿入されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
反対荷電を有する側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が挿入され、２つのアミノ酸間の間隔によって、側鎖が塩橋を形成できるようにすることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
２つの置換アミノ酸が、２つ又はそれ以上のアミノ酸（（ｉ→ｉ＋３）、（ｉ→ｉ＋４）、又は（ｉ→ｉ＋５））により互いに分離されることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
２つの挿入アミノ酸の１つがグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、他のアミノ酸がアルギニン、リジン、又はヒスチジンであることを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
アルギニン、リジン又はヒスチジンが挿入される又は恐らく既に存在している位置が、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挿入される又は場合により既に存在している位置よりも、Ｃ末端に近いことを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
配列が生成される、ここで３つまでのアミノ酸が位置ｉ及び、ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５ならびに、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９に挿入され、位置ｉ及び、ｉ＋７、ｉ＋８又はｉ＋９のアミノ酸が同じ荷電の側鎖を有するのに対し、位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５のアミノ酸が反対荷電を有することを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
中央位置ｉ＋３、ｉ＋４又はｉ＋５で、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアルギニンが導入される又は場合により既に存在していることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
交換後に、タンパク質が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）、及び／又はＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
４〜１２の連続アミノ酸が同じ又はより大きい長さのアミノ酸配列により置換され、挿入アミノ酸配列が、置換配列よりも高いヘリックス形成の確率を有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
挿入配列が、免疫グロブリンの軽鎖（ＣＬ）又は重鎖（ＣＨ）の定常ドメインからのヘリカルエレメントであることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
挿入配列が、免疫グロブリンのＣＬ又はＣＨドメインのβプリーツシート鎖ＡとＢ及び／又はＥとＦ間の領域からのヘリカルエレメントであることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
挿入配列が、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）を含むことを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質を調製するための方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法をこのタンパク質に適用し、このようにして得られたタンパク質を宿主細胞において発現させることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法により調製される、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質。
【請求項２５】
抗体であることを特徴とする、請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２６】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及び少なくとも１つの可変ドメインを有するタンパク質であって、それがこの可変ドメイン中にヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２７】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ２型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質であって、それが、この定常ドメインにおいて、配列 配列番号５を有するＣＨ２ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２８】
免疫グロブリンのフォールディングパターン及びＣＨ１型の少なくとも１つの定常ドメインを有するタンパク質であって、それが、この定常ドメインにおいて、ヒトにおいて天然に存在するＣＨ１ドメインのヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有するヘリカルエレメントを含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２９】
ヘリカルエレメントが、配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を含むことを特徴とする、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３０】
ヘリカルエレメントが、配列ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号８）、ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）、ＴＫＤＥＹＥＲＨ（配列番号１０）、ＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳ（配列番号１６）、又はＳＫＡＤＹＥＫＨＫ（配列番号１１）を含むことを特徴とする、請求項２６又は２８記載のタンパク質。
【請求項３１】
Ｉｇドメイン中に少なくとも１つのヘリカルエレメントを有し、それが、配列 配列番号１、配列番号１２又は配列番号１３（ＣＬ ＷＴ）又は配列番号５、配列番号１４又は配列番号１５（ＣＨ２ ＷＴ）の１つにおいて含まれるヘリカルエレメントよりも高いヘリックス形成の確率を有する、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有するタンパク質。
【請求項３２】
ヘリカルエレメントが配列ＫＡＥＤＴＬＨＩＳＲ（配列番号９）を含むことを特徴とする、請求項３１記載のタンパク質。
【請求項３３】
医薬使用のための請求項２４〜３１のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項３４】
天然ヘリカルエレメントの最適化が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法。
【請求項３５】
天然の又は最適化されたヘリカルエレメントの移植が行われることを特徴とする、免疫グロブリンのフォールディングパターンを有する抗体又はタンパク質の生物物理学的特性を改変するための生物工学的方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５２６５９５（Ｐ２０１１−５２６５９５Ａ）
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５４４４（Ｐ２０１１−５１５４４４）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００７５８
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００７５８
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
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