免疫調節作用が期待できる乳酸菌及び菌体外多糖類
【課題】 ヒトや動物における経口的な投与による免疫調節作用が期待できる乳酸菌と菌体外多糖類を提供すること。
【解決手段】 ３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とする、新規な乳酸菌ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＴＤＳ０３０６０３株、該乳酸菌が産生する菌体外多糖類、免疫調節作用が期待できる新規な乳酸菌ラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株、これらを含有する食品、免疫調節剤並びに物性改善剤を提供する。
【解決手段】 ３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とする、新規な乳酸菌ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＴＤＳ０３０６０３株、該乳酸菌が産生する菌体外多糖類、免疫調節作用が期待できる新規な乳酸菌ラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株、これらを含有する食品、免疫調節剤並びに物性改善剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節作用が期待できる乳酸菌及び該乳酸菌が産生する菌体外多糖類、これらを用いた食品、これらを有効成分として含有する免疫調節剤、並びに物性改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌を摂取することが動物や人の健康に寄与すると考えられていることは、すでに広く知られたことである（例えば非特許文献１〜３参照）。その健康に寄与する効果のひとつに免疫調節効果がある。本明細書において免疫調節効果とは、人が摂取することで免疫系に影響を与え、抗炎症作用、抗アレルギー作用、腫瘍増殖抑制作用などを示す効果のことを意味している。
【０００３】
現在までに、乳酸菌の免疫調節作用については非常に多くの知見が知られているが、乳酸菌がもつ免疫調節効果は、それぞれの株に効果の程度が依存しており、どのような株を選択するかが重要である。それゆえ、単にラクトバチルス・ファーメンタム、あるいはラクトバチルス・ヘルベティカスということだけでは免疫調節作用を有しているとはいえない。
【０００４】
ラクトバチルス・ファーメンタムの免疫調節効果に関係する特許文献としては、特許文献１〜５などがある。
特許文献１は、ラクトバチルス・ファーメンタム変異株ＶＲＩ００３株に関する特許であるが、本発明のファーメンタム株とはＬ−アラビノース、マンノース、マルトース、トレハロースの発酵性において差異があり、全く異なるものである。
特許文献２は、ラクトバチルス・ファーメンタムの高濃度乳酸菌乾燥物をカプセルに充填することを特徴とする健康食品に関するものであるが、株の特徴付けがなされておらず、本発明のファーメンタム株を開示していない。
【０００５】
特許文献３は、ラクトバチルス・ファーメンタムを含む乳酸菌とサッカロミセス・セレビシエとの混合培養物に関するものであり、一種類の乳酸菌のみで免疫調節効果を発揮する本発明とは明らかに異なる。
特許文献４は、ラクトバチルス・ファーメンタムＣＰ３４株がＩｇＥ抗体量を減少させることを開示しているが、糖発酵性が相違していることから、本発明と全く異なる株であることは明らかである。
【０００６】
特許文献５は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の産生を促進する乳酸菌に関するものであり、具体例としてラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１を挙げている。ラクトバチルス・ファーメンタムの種々の株が様々な免疫調節作用を有していることは既に知られているが、上述のように、選択する株によってその効果は異なる。それ故、特許文献５の開示によっても本発明の発明性は否定されない。
【０００７】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタムは、菌の詳しい同定がなされており、また、菌体外多糖類を産生するという際立った特徴を有している。しかも、その多糖類の基本構造が明らかにされ、また、マウスにおいて該多糖類の免疫調節作用が明らかにされている。それゆえ、本発明のファーメンタム株は、十分に特徴付けされた独自の菌株である。
【０００８】
一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスに関しては、特許文献６〜８など、免疫調節効果にかかわる公知の情報がある。
特許文献６は、複数の乳酸菌株を組み合わせて効果を得る抗腫瘍活性剤に関するもので、一種類の菌株のみで効果が得られる本発明とは異なる。
【０００９】
特許文献７は、各種乳酸菌保存株について網羅的に、それを摂取させたＢＡＬＢ／ｃマウスでのＩｇＥの産生量を調べ、実施例として示している。ここでは、ラクトバチルス・ヘルベティカスについてはＡＴＣＣ１５００９株が例示されているが、本発明のヘルベティカス株とは明らかに異なる。また、当該実施例によると、同じ種でも株によってＩｇＥの産生量には著しい違いがあり、このような反応が株レベルで明確に異なることがわかる。
特許文献８は、複数種の乳酸菌と酵母を共生培養して得られる発酵乳を有効成分として含有する免疫増強組成物に関するものであるが、単一菌株による本発明とは別異のものである。
【００１０】
このように、種々の乳酸菌株の摂取が動物の免疫調節作用を有することは良く知られていることであるが、より優れた免疫調節作用を有する乳酸菌株の提供が求められていた。
【００１１】
【非特許文献１】Tannock, G. W.(1999).Probiotics, a critical review, Horizon scientific press.(ISBN:1-898486-15-8)
【非特許文献２】Wood, B. J. B. (1999). the lactic acid bacteria in health and disease, AN Aspen Publication
【非特許文献３】細野明義 編、発酵乳の科学−乳酸菌の機能と保健効果−、 アイ・ケイコーポレーション（２００２年）
【特許文献１】特表２００５−５３７７９１号公報
【特許文献２】特開２００５−１２４４３２号公報
【特許文献３】特開２００４−９１４３３号公報
【特許文献４】特開２００４−２６７２９号公報
【特許文献５】特開平１０−１３９６７４号公報
【特許文献６】特開２００５−９７２８０号公報
【特許文献７】特開平９−２９５９号公報
【特許文献８】特開２００６−７６９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
日本においては、国民の高齢化が進行し、その結果、国民医療費の高騰が大きな問題となっている。そこで、医療に頼るのではなく、単に食品として摂取するだけで、免疫力を高め、健康維持に役立てることができれば、医療費の低減に繋がり、国民の福祉に大きく寄与すると考えられる。
よって、本発明は、食品として摂取することにより、免疫力を高め、抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗腫瘍作用などを発揮し、体質改善を図ることができる免疫調節剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記のような課題を解決するひとつの手段として、免疫力を調節すると一般に信じられている発酵乳から、食べることで、免疫力を高め、アレルギーを低減し、癌の増殖に対して抑制効果を示すなどの免疫力を調節する作用を有する乳酸菌を探索してきた。
その結果、ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株とその菌体外多糖類及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株に、優れた免疫調節作用が期待できることを初めて明らかにした。
これらの知見に基づいて、本発明は完成されたのである。
【００１４】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）である。
請求項２に記載の本発明は、ラクトバチルス・ファーメンタムがＴＤＳ０３０６０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３８）である請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタムである。
請求項３に記載の本発明は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類である。
請求項４に記載の本発明は、請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を、生菌で１０７／ｇ以上、あるいは死菌体で０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項５に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を食品中に０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項６に記載の本発明は、請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を有効成分として含有する免疫調節剤である。
請求項７に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する免疫調節剤である。
請求項８に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤である。
請求項９に記載の本発明は、免疫調節作用が期待できるラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９）である。
請求項１０に記載の本発明は、請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項１１に記載の本発明は、請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を有効成分として含有する免疫調節剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム及びラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて製造した発酵乳等の食品を摂取することで、免疫力を高め、抗炎症効果、抗アレルギー効果、抗腫瘍効果など、体質の改善に繋がることが期待できる。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムの生産する菌体外多糖類は、食品として利用する場合には、物性を改善するという作用とともに、免疫力を調節するという２つの効果が期待できる機能性素材として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ファーメンタムは、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするものである。
本発明のラクトバチルス・ファーメンタムは、上記多糖類を菌体外に産生・蓄積するものであればどのようなものでもよく、例えばラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株が挙げられる。
【００１７】
本発明の多糖類は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される新規な多糖である。主要成分とマイナー成分の好ましい構成比は、主要成分：マイナー成分＝７５：２５〜８０：２０である。
本発明の多糖類は上記の構造を有するものであればよく、その由来は特に限定されない。例えば、ラクトバチルス・ファーメンタム等の乳酸菌、特にラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株由来のものが好適に使用できる。
【００１８】
本発明において初めて単離されたラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株（以下、単にＴＤＳ０３０６０３株と呼ぶことがある。）、及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（以下、単にＴＤＳ０３０９０３株と呼ぶことがある。）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はそれぞれＮＩＴＥ ＡＰ−３３８、ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９である。
【００１９】
ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株は、ともに家庭で作られている、工業的に作られていない伝統的発酵乳から分離されたものである。このような発酵乳は、工業的に作られたものと違い、様々な乳酸菌や酵母などによって発酵している。それ故、どのような乳酸菌から構成されているかを知るには、乳酸菌を分離同定する必要がある。
【００２０】
なお、発酵乳から乳酸菌を分離する手法は、適切な教科書が存在し、誰でも容易に実施可能である。例えばSkinner, F. A., and Lovelock, D. W. (1979). Identification methods for microbiologists Second edition. Academic Pressなどが参考になる。
【００２１】
本発明の乳酸菌の分離は、具体的には以下の通り行った。
発酵乳検体を滅菌した生理食塩水に段階希釈し、ＭＲＳ寒天培地（De Man, J. D., Rogosa, M., Sharpe, M. E. (1960).J. Appl. Bact. 23, 130-135.）、Ｍ１７寒天培地（Terzaghi, B. E., and Sandine, W. E.(1975). Appl. Environ. Microbiol. 29, 807-813.）に０．１ｍｌを塗沫し、炭酸ガス置換下で嫌気培養を３２℃で行い、画線分離して純粋な株とした。グラム陽性、カタラーゼ陰性のものを乳酸菌と見なし、生育温度試験、グルコースからのガス産生、細菌同定用検査キット ＡＰＩ−５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）を用いた糖の発酵性、及び１６ＳｒＤＮＡの部分配列に基づいて同定した。
【００２２】
ＴＤＳ０３０６０３株は、グラム陽性の桿菌でヘテロ発酵型乳酸菌である。１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく同定において、ラクトバチルス・ファーメンタムと同定された。本菌株を、乳酸菌用の培地であるＭＲＳ液体培地（ＭＲＳ寒天培地と同じ組成で、寒天を配合しないもの）で常法により培養したところ、培養物は粘稠性を示し、菌体外多糖類を産生することが示された。また、墨汁染色においても、典型的な菌体外多糖類の産生が示された。
【００２３】
なお、乳酸菌の菌体外多糖類についての知見は、例えばInternational Dairy Journal第１１巻第９号（２００１年）（乳酸菌多糖類に関する特集号）などに記載されているが、乳酸菌が特徴的に多糖類を産生する場合には、例えばピペットで当該乳酸菌の培養物を吸い取った際に、粘稠な糸曳きが見られることで容易に判定できる。
【００２４】
同様にＴＤＳ０３０９０３株は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく同定と、細菌同定用検査キットであるＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）の糖発酵性にも基づく同定によって、ラクトバチルス・ヘルベティカスと同定された。
【００２５】
ＴＤＳ０３０６０３株が生産する菌体外多糖類を核磁気共鳴分析およびメチル化分析により解析した結果、当該多糖類は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分との混合物であることが明らかとなった。
本発明の多糖類の構造の模式図を化１に示す。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明の乳酸菌２種の洗浄菌体はそれぞれ、Ｃｏｌｏｎ２６結腸癌担癌マウスを用いた経口摂取試験により、癌細胞の増殖抑制の傾向を示し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）産生を有意に抑制したので、腫瘍増殖抑制作用、抗炎症作用が期待できる。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムの培養物から分離精製した多糖類、及び本発明のヘルベティカス株菌体は、それぞれマウス由来マクロファージの培養細胞においてインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の産生を促進する傾向があった。さらに、オボアルブミン感作マウスにおいて、本発明のファーメンタムのホエー培養物の凍結乾燥物を経口投与することで、血清中のオボアルブミン特異的ＩｇＥの産生を低下させる傾向にあった。以上から、本発明の乳酸菌及び多糖類はともに、ヒトにおいてもＩ型アレルギーを抑制することが期待できる。
【００２８】
このように、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体、その多糖類及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体は、抗腫瘍作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用などの免疫調節作用を有していることから、これらを免疫調節作用を有する食品及び食品用素材並びに抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤などの免疫調節剤の製造に利用することができる。ここで、食品としてはヨーグルト、乳酸飲料、チーズ、パン、クッキーなどが挙げられるが、特に制限はない。
また、本発明の多糖類は水に容易に溶解し、水の粘稠性を高める性質を有していることから、食品用の増粘剤などの物性改善剤の製造に利用することができる。
【００２９】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品、食品用素材及び免疫調節剤は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を培地において常法で培養することにより製造することができる。
【００３０】
ここで、培養に用いる培地は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムが生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、獣乳、脱脂乳などの乳、ホエー（乳清とも呼ばれるチーズ製造等で生じる副産物）、各種合成培地などを用いることができる。
これら培地は、微量のマンガンを含んでいることが好ましい。培地中のマンガンの濃度は硫酸マンガン濃度として０．００００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％である。マンガン濃度が前記の下限値未満であると、菌体外多糖類の産生量が著しく減少するため好ましくない。なお、培地中に含まれるマンガンは、どのような形態で含まれていても良い。例えば、食品添加物や食品成分のうち、マンガンを多く含有するものとして酵母エキスなどが知られている。それゆえ、培地に酵母エキスなどを加えることで、発酵が促進され、多糖類産生量を増加させることが可能となる。また、例えば硫酸マンガンなどの無機塩として培地に添加してもよい。
【００３１】
培養温度は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムが良く生育する温度、例えば２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃とすることができる。また、培養時間は４〜４８時間、好ましくは８〜２４時間とすることができる。
【００３２】
また、本菌株はヘテロ発酵性のために、発酵中に微量の炭酸ガスを産するという特徴があり、密閉容器で発酵した場合には、容器内の圧力が上昇する。それゆえ、炭酸ガスの発生が製造上支障になる場合に、容器に充填する際には、炭酸ガスが透過しやすい材質の包材を用いた容器に充填するか、培養が十分完了した後に充填することが好ましい。
なお、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム以外の乳酸菌を培地に添加して混合培養することにより、特徴的な発酵乳を得ることができる。ここで、組み合わせる乳酸菌としては、目的にあったものであればいずれでも良い。
【００３３】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品とすることができる。
また、このようにして培養した後、得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材又は免疫調節剤として摂取することができる。例えば、培養終了後の培養物をそのまま濃縮したもの、これを粉末化したもの、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により集菌して菌体のみとしたもの、これを凍結乾燥菌体としたもの、さらに加熱処理した菌体、菌体破砕物等も本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤とすることができる。
【００３４】
さらに、上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品を製造することができる。
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を用いた食品、食品用素材、及び免疫調節剤に含まれるラクトバチルス・ファーメンタム菌体は、発酵乳以外に用いる場合には生菌体でも死菌体でも良い。何故なら、乳酸菌を経口摂取し、腸管まで到達すると、腸管上皮細胞上のM細胞から取り込まれた後に免疫器官であるパイエル板で処理され、免疫応答が開始される。この時にパイエル板に認識される部位は細胞壁成分(ペプチドグリカン、リポテイコ酸、表層タンパク質など)であることがこれまでの研究から明らかにされている。そのため、必ずしも生菌である必要がない。（Kitazawa, H., Ueha, S., Itoh, S., Watanabe, H., Konno, K., Kawai, Y., Saito, T., Itoh, T., Yamaguchi, T. (2001). Int. J. Food Microbiol. 65, 149-162.及びIliev, ID., Kitazawa, H., Shimosato, T., Katoh, S., Morita, H., He, F., Hosoda, M., Saito, T. (2005). Cell Microbiol. 7(3), 403-414.）。また、本発明に用いた経口投与による免疫学的試験では、加熱死菌体を用いて各種試験を実施している。
【００３５】
なお、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品又は食品用素材におけるラクトバチルス・ファーメンタム菌体の含有量は、生菌数では１０７／ｇ以上、重量比では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。生菌数において望ましい菌数が１０７／ｇ以上である理由は、発酵乳の日本国内の規格によって、生菌で１０７／ｇ以上と定義されているからである。死菌体においては免疫調節作用を期待しているため、マウスの経口投与試験において試験食中に０．１％含有させていたことにより、好ましくは０．１％以上としているが、菌体そのものの粉末を少量摂取しても、食品として問題がないため、上限を１００％とした。しかし、風味等を勘案すると０．１から２０％が望ましい。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を有効成分として含有する免疫改善剤におけるラクトバチルス・ファーメンタム菌体の含有量は菌体含有量では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。
【００３６】
本発明の多糖類を含有する食品、食品用素材、免疫調節剤及び物性改善剤は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を培地において培養することにより製造することができる。ここで、用いる培地や培養方法は、上記したラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品用素材及び免疫調節剤の製造方法と同様とすることができる。
【００３７】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明の多糖類を含有する食品とすることができる。
また、培養後に得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。例えば、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により菌体を除去したもの、及びこれを濃縮、精製等したもの等も本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。
【００３８】
さらに、上記本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム由来の多糖類を含有する食品を製造することができる。
【００３９】
なお、本発明の多糖類を含有する食品又は食品用素材における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
また、本発明の多糖類を有効成分として含有する免疫改善剤における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
さらに、本発明の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
【００４０】
本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品、食品用素材及び免疫調節剤は、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を培地において培養することにより製造することができる。
ここで、培養に用いる培地は、本発明のＴＤＳ０３０９０３株が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、上記のラクトバチルス・ファーメンタムと同様のものを用いることができる。また、培養方法も上記のラクトバチルス・ファーメンタムと同様とすることができるが、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃とすることができる。
なお、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス以外の乳酸菌を培地に添加して混合培養することにより、特徴的な発酵乳を得ることができる。ここで、組み合わせる乳酸菌としては、目的にあったものであればいずれでも良い。
【００４１】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品とすることができる。
また、このようにして培養した後、得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。例えば、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により集菌して菌体のみとしたもの、これを凍結乾燥菌体としたもの、さらに加熱処理した菌体、菌体破砕物等も本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤とすることができる。
【００４２】
さらに、上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品を製造することができる。
本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を用いた食品、食品用素材、及び免疫調節剤に含まれるＴＤＳ０３０９０３株菌体は、生菌体であることが好ましいが、死菌体であってもよい。死菌体であっても良い理由は、ラクトバチルス・ファーメンタムについて述べたのと同様な理由である。
【００４３】
なお、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品又は食品用素材におけるＴＤＳ０３０９０３株菌体の含有量は、生菌では１０７／ｇ以上、重量比では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。
また、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を有効成分として含有する免疫改善剤におけるＴＤＳ０３０９０３株菌体の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。このような範囲指定の理由は、ラクトバチルス・ファーメンタムについて述べたのと同様な理由である。
【実施例】
【００４４】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
なお、本発明の乳酸菌ＴＤＳ０３０６０３株及びＴＤＳ０３０９０３株は、前記したように所定の微生物保存機関に寄託されており、十分に開示されている。
【００４５】
（実施例１）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株とラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の同定
ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株の性状を調べて同定を行った。
上記乳酸菌の糖の発酵性を、それぞれ細菌同定用検査キット ＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）で調べた。なお、測定方法の詳細はメーカーの指示する方法に従った。
また、上記乳酸菌の基本的性状と１６Ｓｒ−ＤＮＡの配列に基づく同定結果を用いて最終的な同定結果とした。その結果をそれぞれ表１と表２に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
（実施例２）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株を用いた発酵乳の試作
ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株を使用して発酵乳を試作した実施例を示す。
新鮮なラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の培養液を単独で、あるいはストレプトコッカス・サーモフィラスの培養液と組み合わせてスターターとして用い、殺菌した牛乳にそれぞれ１％接種し、３０℃で１９．５時間培養した。培養後、１０℃以下まで十分冷却して、食した。
できたばかりの発酵乳は、ファーメンタム単独のものもサーモフィラスと組み合わせたものも良好な物性と風味を有していたが、ＴＤＳ０３０６０３株がヘテロ発酵性であるため、やや泡立っていた。
【００４９】
（実施例３）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株のホエー培地での菌体外多糖類の産生条件の検討
ＴＤＳ０３０６０３株をＭＲＳ液体培地で常法により培養し観察した結果、培養物が粘稠性を示し、多糖類を産生することが明らかであった。ＭＲＳ培地には硫酸マンガンが成分として０．００４重量％含まれている。この硫酸マンガンを培地成分から除いて培養した結果、著しく多糖の生成が減少することが明らかとなった。また、本菌株を種菌として用いて乳を培地として上記と同様に培養した場合にも、微量のマンガンが含まれていないと多糖の生成は少なかった。
【００５０】
そこで、本多糖類をホエー（乳清）で培養して生産する場合をモデルにして、酵母エキス等の添加物が多糖の生産に与える影響を調べた。試験した添加物はトリプトン（ＢＢＬ製）、硫酸マンガン（和光純薬製）、酵母エキス（Ｐ２Ｇ、アサヒフード＆ヘルスケア製）、酵母エキス（型番ＬＹＩＩ−Ｐ、大日本明治精糖製）、乳ペプチド（ＦＥ１３５、ＤＭＶジャパン製）であった。
ホエーパウダー（よつ葉乳業製）を１０重量％の割合で水に還元し、１２１℃で１５分間オートクレーブすると、含まれているタンパク質等が凝集物を生成した。この凝集物を遠心分離により除去し、１０％除タンパクホエー液とした。これに上述の添加物を表３に示す割合で加え、１２１℃で１５分間オ−トクレーブしたものを培地（除タンパクホエー培地）として使用した。
スターターとして使用するＴＤＳ０３０６０３株培養液は、培地由来のマンガンの影響を除くため、１％トリプトンを添加した上記の１０％除タンパクホエー液を１２１℃で１５分間オートクレーブして得た培地に、ＴＤＳ０３０６０３株のコロニー１個分を無菌的に接種し、３０℃で２４時間培養したものを用いた。このように調製したスターターは培地成分にマンガンを極微量にしか含まず、スターター自体に含まれるマンガンを培地に持ち込む影響を避けることができる。
【００５１】
このスターターを各除タンパクホエー培地に３％添加し、３０℃で２４時間培養し、１０℃に冷却後、その粘度を測定した。粘度は、Ｂ型粘度計でＲ−Ｌアダプタを使用し、回転数６０ｒｐｍの条件で測定した。なお、培養前の培養液についても、上記と同様に粘度を測定した。粘度の単位は国際単位（ＳＩＵ）であるｍＰａ・ｓ（ミリＰａｓｃａｌ ｓｅｃｏｎｄ）で表した。ちなみに、室温の水の粘度は約１ｍＰａ・ｓである。
次に、培養液中に生じた多糖のおおよその量（粗多糖類の量）をエタノール沈殿により測定した。まず、培養液に等量のエタノールを加え、５℃で一晩放置した。遠心後沈殿を回収し、イオン交換水を加え、７０℃において３０分間攪拌しながら溶解させた。遠心後、上清を回収し、凍結乾燥したものの重量を測定した。なお、多糖類の産生量の測定は、粘度が高いものについてのみ実施した。
【００５２】
結果を表３に示す。
本試験の結果、酵母エキスを５重量％といった大量に培地に添加することで、多糖類の産生が著しく促進されることが明らかになった。特に、酵母エキス（ＬＹＩＩ−Ｐ）の添加が最も効果的であった。また、発酵促進のためのペプチド類を添加することで、酵母エキスの量を減らしても多糖生成がある程度維持されることがわかった。トリプトンや乳ペプチド単独の添加では、粘度から見て多糖の生成にはあまり促進効果がないことも示された。
以上の結果から、酵母エキスなどの安全な食品添加物を添加することで、ホエーを用いて本発明の多糖類を生産することが可能であることが示された。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（実施例４）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の培養物からの菌体外多糖類の精製
イオン交換水にホエーパウダー（よつ葉乳業製）を１０重量％溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブしたものを、１２０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ってタンパクを除去した。これに、１％のトリプトンと０．００４％の硫酸マンガンを加え、１２１℃で１５分間オートクレーブしたものを培地とした。
これに、同じ培地でＴＤＳ０３０６０３株を３０℃で１日培養した前培養液を５％添加し、２５℃において２４時間培養した。培養液３Ｌに、冷却した同量のエタノールを加えて一晩５℃で放置し、遠心して沈殿をイオン交換水で回収した。さらに、イオン交換水で１Ｌにメスアップし、水酸化ナトリウムで中和し透析を行ったものを、イオン交換水で３Ｌにメスアップし、攪拌しながら７０℃で３０分間溶解させた。これを遠心し、上清を回収して凍結乾燥した。これを粗精製多糖として以下の試験に用いた。この粗精製多糖は、常温で容易に水に溶解できた。
【００５５】
（実施例５）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の生産する菌体外多糖類の粘度
実施例４で得た粗精製多糖を、蒸留水に０．０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０重量％の各濃度で溶解させ１０℃に冷却し、東機産業（株）製８０ＬＢ型粘度計を用いて粘度を測定した。測定条件は、Ｒ−Ｌアダプタを使用し、回転数１２ｒｐｍにおいて６０秒後の粘度を測定した。測定結果は表４に示す。
また、同じ粘度計を用いて、回転数６０、３０、１２ｒｐｍで測定を行った。測定結果は表５に示す。
その結果、粘度測定時の回転数が高いほど低い粘度を示すシュドプラスチック（擬塑性）粘性を示した。このことから、ＴＤＳ０３０６０３株の産生する本発明の菌体外多糖類は、水の粘稠性を高めることがわかる。また、測定データから、粘度は添加量に応じて上昇することがわかる。それ故、効果の範囲は０％超の添加であればそれに呼応して粘度の上昇が見られる。物性改善剤としては、特に多糖類の添加量の範囲を指定することなく、利用できる。しかし、添加量０．１％以上で顕著な粘度の増加が見られ、実用的には２０％未満程度が物性改善に望ましい。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
（実施例６）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の生産する菌体外多糖類の構造
（Ｉ）１Ｈ−ＮＭＲ
実施例４で調製した粗精製多糖を、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解したものを、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０アニオン交換樹脂 ２００ｍｌと混合し、攪拌しながら室温に１時間置いた。次いで、ブフナー漏斗でろ過して樹脂を除いた溶液を、水道水で４８時間、２Ｌの蒸留水で２４時間透析し、凍結乾燥することにより精製多糖を得た。
【００５９】
次に、多糖のアノマープロトン（糖の１位水素）の個数を推定するために、核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置を用いてプロトンの１次元ＮＭＲスペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を測定した。
まず、上記において精製された多糖を重水に溶解し、凍結乾燥した。この操作を３度繰り返した後に得られた凍結乾燥物（約０．５ｍｇ）の全量を重水２００μＬに溶解し、マイクロＮＭＲチューブに入れ、Ｂｒｕｋｅｒ社製ＮＭＲ装置Ａｄｖａｎｃｅ−６００ ＮＭＲにて、温度７０℃の条件下で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定を行った。その結果得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。
この結果、アノマープロトンのシグナルが４個存在し、α結合に由来するピークが２個、β結合に由来するピークが２個観測された。すなわち、当該多糖は４糖繰り返し単位で、α結合とβ結合が２個ずつであると考えられる。
【００６０】
（ＩＩ）メチル化分析
次に、本発明の多糖の構成糖残基間のグリコシド結合の様式をメチル化分析によって解析した。メチル化分析方法は、Hakomori, S. (1964). J. Biochem. (Tokyo), 55(2), 205-208.の記載に従った。
【００６１】
まず、（Ｉ）で得た精製多糖の部分メチル化アルジトールアセテートを、Stellner, K., Saito, H., and Hakomori, S. (1973). Arch. Biochem. Biophys. 155, 464-472.に記載の方法で調製した。
【００６２】
次に、それのガスクロマトグラフ重量分析（ＧＣ−ＭＳ）を常法に従って行い、その結果から、「生化学データブック」（東京化学同人）に基づいて、構成糖残基間のグリコシド結合の様式を帰属した。
ＧＣ−ＭＳにはＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ガスクロマトグラフＨＰ５８９０／重量分析計ＨＰ５９７２ＭＳＤを用い、カラムはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＤＢ−１７を用いた。温度条件は（１）１５０℃（１ｍｉｎ）、（２）１５０−２００℃（昇温速度１５℃／ｍｉｎ）、（３）２００℃であった。
【００６３】
その結果、ガスクロマトグラフィーのピークパターンを図２に、各ピークの重量分析パターンから帰属した部分メチル化アルジトールアセテートのモル比を表６に、それぞれ示す。図２中のピークＡ−Ｅは糖由来のピークであり、表６のピーク名に対応している。ピークＸは調製過程で混入した不純物のピークである。
なお、グルコースとガラクトースの判別については、既知試料の同条件下でのピークの保持時間と、下記（ＩＶ）における酸分解による構成糖分析の結果をもとに行った。
図２及び表６の結果から、本発明の多糖は、１残基の非還元末端（図２のピークＡ）と１残基の分岐点（ピークＥ）を持つ４糖繰り返しであるが、他に非還元末端由来のマイナーピーク（ピークＢ）が存在しており、非還元末端をグルコースとする主要成分と非還元末端をガラクトースとするマイナー成分の混合物であることが推察された。
【００６４】
【表６】
表６中で、Ｍｅはｍｅｔｈｙｌ、Ｇａｌはｇａｌａｃｔｏｓｅ、Ｇｌｃはｇｌｕｃｏｓｅを意味する。
【００６５】
（ＩＩＩ）構成糖の分析
本発明の多糖の単糖組成を分析するために、酸加水分解によって多糖のグリコシド結合を切断し、単糖にした上で、高速液体クロマトグラフィーによって分離定量を行った。
すなわち、まず、（Ｉ）で得た精製多糖１．５ｍｇを１．５ｍＬねじ栓付試験チューブに入れ、そこに蒸留水を０．６ｍＬ加え、多糖を懸濁させた。次いで、この多糖懸濁液に３．３Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を０．９ｍＬ加えて、１００℃に設定したアルミブロック恒温槽を用いて３時間保温し、加水分解反応を行った。反応終了後、試験チューブを凍結し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。さらに、凍結乾燥物を蒸留水に溶解して糖分析用サンプルとした。
【００６６】
構成糖の分析には、日本ダイオネクス社製のイオン交換クロマトグラフィーシステム（ＤＸ−５００）を使用した。測定は、分離カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１、溶離液：５ｍＭ ＮａＯＨ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：パルスドアンペロメトリ検出器の条件で行った。
【００６７】
その結果、ラムノース（Ｒｈａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）を含む標準糖標品のクロマトグラムを図３（ａ）に、当該多糖の酸分解物のクロマトグラムを図３（ｂ）に、それぞれ示す。
この２つのクロマトグラムの比較より、本発明の多糖を構成している単糖は、ＧａｌとＧｌｃであることが示された。また、ピークの面積比から計算した構成糖の存在比は、Ｇａｌ：Ｇｌｃ＝１：２．４−２．６であった。
【００６８】
以上の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の分析結果から、本発明の多糖は主要成分とマイナー成分の混合物であることが分かった。また、主要成分は３位置換Ｇｌｃ、６位置換Ｇａｌ、２位３位置換Ｇｌｃおよび非還元末端Ｇｌｃから成る４糖繰り返し単位であり、マイナー成分は３位置換Ｇｌｃ、６位置換Ｇａｌ、２位３位置換Ｇｌｃおよび非還元末端Ｇａｌから成る４糖繰り返し単位であると推測された。さらに、主要成分及びマイナー成分の４糖繰り返し単位には、２つのαグリコシド結合ならびにβグリコシド結合が含まれていることが分かった。
本発明の菌体外多糖類の最終的な構造の模式図を化２に示した。
【００６９】
【化２】
主要成分：マイナー成分の比率＝７５：２５〜８０：２０
【００７０】
（実施例７）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の結腸癌担癌マウスに対する経口投与の効果
（１）材料と方法
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス、メス（ＳＦＣ）を使用し、一群１０匹で試験した。Ｃｏｌｏｎ２６結腸癌細胞株を皮下に移植した結腸癌担癌マウスに対して、ＴＤＳ０３０６０３株の凍結乾燥菌体を２００μｇ／マウス／日の割合で、またＴＤＳ030903株の凍結乾燥菌体を1800μｇ／マウス／日の割合で、移植翌日より一日１回、１４日間連続経口投与した。それぞれ、１５日目に解剖を行い、脾臓、胸腺、肝臓および腫瘍部の重量、並びに、血漿中のサイトカインであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αを測定した。
【００７１】
（２）試験対象物の調製並びに投与方法
ＴＤＳ０３０６０３株及びＴＤＳ０３０９０３株は、それぞれＭＲＳ液体培地で培養し、培地ｍｌあたりの菌数を測定した。培養物を遠心分離後、適当量の水に再懸濁し、遠心、再懸濁を２回くりかえした。その後、８０℃で１０分間加熱し殺菌した。このようにして得られた洗浄菌体を凍結乾燥し、重量を測定した。凍結乾燥物ｇあたりの殺菌前の菌数を算出し、それぞれ凍結前の菌数として約１０８ＣＦＵ／日投与に相当する量となるように投与した。具体的には、約ＴＤＳ０３０６０３株の凍結乾燥菌体を４ｍｇ秤量し、４ｍｌ滅菌蒸留水で溶解した。また、ＴＤＳ０３０９０３株の凍結乾燥菌体は３６ｍｇを秤量し、４ｍｌの滅菌蒸留水に溶解した。その溶液をそれぞれ２００μＬ／マウスになるように投与した。
【００７２】
（３）Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスの作製
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて継代しているＣｏｌｏｎ２６結腸癌細胞株を用いた。０．１％トリプシン０．０２％を培養液に加えて細胞を剥離した後に、１６００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。培養液を捨て、沈殿した細胞をピペッティングしてほぐし、滅菌生理食塩水を５ｍｌ加えて混和させ、細胞数測定用に採取した。
採取した細胞浮遊液は、細胞浮遊液５０μＬ、４％トリパンブルー９５０μＬの割合で混合した後、ヘモサイトメーターを用いて顕微鏡下にて細胞数ならびにセルバイアビリティーを計測した。
一方、残りの細胞浮遊液は、再度遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞をピペッティングしてほぐし、滅菌生理食塩水を用いて細胞数１×１０６個／ｍｌになるように再浮遊させた。細胞数５×１０５個／１００μＬをマウス背側頸部皮下に注射筒を用いて移植し、Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスを作製した。
【００７３】
（４）解剖および重量測定
解剖前日からの絶食は行わない。解剖当日はネンブタール（４０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下において開腹し、腹大静脈よりヘパリン加採血を行った。脾臓、胸腺、肝臓および腫瘍部を摘出し、重量を測定した。採血した血液は、４℃、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して血漿を採血し、サイトカイン測定まで−８０℃で保存した。採血した血漿は４℃において解凍し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢＩＯＳＯＵＲＳＥ社製）を用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度を測定した。測定方法はキットの説明書の記載に従った。
試験結果は平均値±標準偏差で表し、データについては一元配置分散分析を行った後、フィッシャーのＰＬＳＤ法により、各群間の有意差検定を行った。
【００７４】
（５）結果
結果を表７に示す。
ＴＤＳ０３０６０３株投与群では、腫瘍細胞重量は対照群に比べ減少傾向であったが、対照群と有意差はなかった。炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α濃度は対照群に比べて低い値を示したが、有意差はなかった。同じく炎症性サイトカインであるＩＬ−６の濃度は、５％の危険率で対照群に比べて有意な差があった。それ故、ＴＤＳ０３０６０３株菌体は、腫瘍の増殖を抑制する傾向があり、炎症性サイトカインであるＩＬ−６の産生を抑制する物質であると確認された。
一方、ＴＤＳ０３０９０３株投与群では、腫瘍重量の増加を抑制する傾向があったが対照群と有意な差はなかった。またＴＮＦ−αについては、５％の危険率で対照群に比して有意に産生を抑制した。ＩＬ−６については、対照群に比して１％の危険率で有意に産生を抑制した。それ故、ＴＤＳ０３０９０３株菌体は、腫瘍の増殖を抑制する傾向があり、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αならびにＩＬ−６の産生を抑制する物質であると確認された。
【００７５】
以上から、ＴＤＳ０３０６０３株菌体とＴＤＳ０３０９０３株菌体の摂取によって、担癌というストレス下で、腫瘍増殖を抑制ぎみにするとともに、有意にＩＬ−６（ＴＤＳ０３０９０３株に関してはＴＮＦ−αも）の産生を抑制するので、ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株は抗炎症作用を有することが期待される。
【００７６】
【表７】
ａ： ｐ＜０．０５（対照群に比べて危険率５％で有意に差）
ａａ： ｐ＜０．０１（対照群に比べて危険率１％で有意に差）
【００７７】
（実施例８）ホエーで生産したラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の精製菌体外多糖類とラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体の抗アレルギー試験
＜材料及び方法＞
マウス由来マクロファージＪ７７４．１細胞（理研ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）を用いた。Ｊ７７４．１細胞の培養は、培地［ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）＋１０％ＦＢＳ＋５０Ｕ／ｍｌペニシリン＋５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン液（ＧＩＢＣＯ社製）＋５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール］を用いて定法に従って行った。
被検体として、ＴＤＳ０３０６０３株の培養物から分離した十分に精製した多糖類凍結乾燥物（実施例６（Ｉ）で分析用に調製した精製多糖）及びＴＤＳ０３０９０３株菌体凍結乾燥物（実施例７に用いたものと同じ）を用いた。対照として、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５３１０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＪＣＭ１１２０株の凍結乾燥菌体を用いた。これらの凍結乾燥菌体の調製は実施例７に用いた方法に準じた。
【００７８】
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ製）に、Ｊ７７４．１細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ培地で添加し、そこへサンプルを１０μｇ／ｍｌ添加後（多糖は１００μｇ／ｍｌについても実施）、３７℃、ＣＯ２５％で２４時間培養した。この培養試験はすべて２連で行った。
その後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）を用いてＩＬ−１２産生量を測定した。この試験は2連で2回実施し、合計４連の結果を平均してＩＬ−１２の濃度とした。
【００７９】
＜結果＞
結果を表８に示す。データは４連の平均値を示している。ＡＴＣＣ５３１０３株については、さらに2回の試験を行い８連の平均値を示している。
リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ社製）をポジティブコントロールとし、ＡＴＣＣ５３１０３株、ＪＣＭ１１２０株の凍結乾燥菌体を一般の乳酸菌として対照に用いた。なお、ＡＴＣＣ５３１０３株は一般にプロバイオティクスであるＬＧＧ菌として知られ、アトピー性皮膚炎に関する報告（例えば、Isolauri, E., Arvola, T., Sutas, Y., Moilanen, E., Salminen, S., (2000). Clin. Exp. Allergy, 30(11), 1604-1620.参照）があることから対照とした。
【００８０】
表８の結果から、ＴＤＳ０３０６０３株由来の菌体外多糖類は、ＬＧＧ菌（ＡＴＣＣ５３１０３株）などと同等レベルにＩＬ−１２の産生を促進しているが、この検体は菌体成分を含まないことを考慮すると極めて新規性が高い。また、この多糖は濃度依存的にＩＬ−１２の産生を促進していることがわかる。ただし、本試験ではＴＤＳ０３０６０３株菌体のみの効果については試験していない。
一方、ＴＤＳ０３０９０３株菌体においては、他の菌株に比べて相対的により強くＩＬ−１２の産生を促進している。ＩＬ−１２はサイトカインであるインターフェロン−γの強力な誘導因子であり、産生が増強されるとＴｈ１を優位な状態へ傾け、抗アレルギー効果が期待できる。
【００８１】
【表８】
【００８２】
（実施例９）動物試験（抗アレルギー効果試験）
ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の抗アレルギー効果について、オボアルブミン（ＯＶＡ）感作マウスを用いた経口投与の試験を行った。ＴＤＳ０３０６０３株は菌体外多糖類を産生するので、菌体のみを分離して投与するのではなく、菌体外多糖類を含む培養物全体での抗アレルギー効果を評価した。ＴＤＳ０３０９０３株は、実施例８と同様に菌体乾燥物について評価した。
【００８３】
＜材料及び方法＞
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、一群１０匹で試験した。
対照群の餌はＣＥ−２（クレア社製）を用いた。試験群は、ＣＥ−２にＴＤＳ０３０６０３株培養物（ホエー培地での培養物の凍結乾燥物）５％、又はＴＤＳ０３０９０３株菌体（凍結乾燥菌体）０．１％を含有するように混合し、いずれも自由摂取させた。ここで、ＴＤＳ０３０６０３株培養物の混合量をＴＤＳ０３０９０３株菌体に比べて多く設定したのは、被検体（ＴＤＳ０３０６０３株培養物）中に占める菌体成分よりも培地成分由来のものが多いことを考慮したためである。水は水道水を自由摂取させた。環境温度２５℃、湿度５５％、照明は８時〜２０時の１２時間照明とした。予備飼育期間は１週間とした。
マウスに対する免疫は２０μｇオボアルブミン（ＯＶＡ）＋２０ｍｇ水酸化アルミニウムゲルの腹腔内投与を０日目、１４日目の２回実施した。２１日目に解剖し、腹部大動脈から全採血し、血清を採取した。
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定は、ＤＳマウスＩｇＥ ＥＬＩＳＡ （ＯＶＡ）（大日本住友製薬（株）製）を用いて、製造者のプロトコールに従って行った。
【００８４】
＜結果＞
各群の血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を表９に示す。ばらつきが大きいので比較は難しいが、コントロール（対照）に比べて試験食摂取群で平均値の減少が見られた。それ故、ＴＤＳ０３０６０３株のホエー培養物とＴＤＳ０３０９０３株菌体は、ともにこのような条件下でＩｇＥを低減する効果が期待できると予想された。すなわち、これらの乳酸菌培養物あるいは菌体の摂取で、抗アレルギー効果が十分に期待できることが分かった。
【００８５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の多糖類の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】本発明の多糖類から調製した部分アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィーのピークパターンを示す図である。
【図３】本発明の多糖類の酸加水分解物の液体クロマトグラフィーのピークパターンを示す図である。（ａ）は標準糖標品の、（ｂ）は本発明の多糖類の酸加水分解物のピークパターンをそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節作用が期待できる乳酸菌及び該乳酸菌が産生する菌体外多糖類、これらを用いた食品、これらを有効成分として含有する免疫調節剤、並びに物性改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌を摂取することが動物や人の健康に寄与すると考えられていることは、すでに広く知られたことである（例えば非特許文献１〜３参照）。その健康に寄与する効果のひとつに免疫調節効果がある。本明細書において免疫調節効果とは、人が摂取することで免疫系に影響を与え、抗炎症作用、抗アレルギー作用、腫瘍増殖抑制作用などを示す効果のことを意味している。
【０００３】
現在までに、乳酸菌の免疫調節作用については非常に多くの知見が知られているが、乳酸菌がもつ免疫調節効果は、それぞれの株に効果の程度が依存しており、どのような株を選択するかが重要である。それゆえ、単にラクトバチルス・ファーメンタム、あるいはラクトバチルス・ヘルベティカスということだけでは免疫調節作用を有しているとはいえない。
【０００４】
ラクトバチルス・ファーメンタムの免疫調節効果に関係する特許文献としては、特許文献１〜５などがある。
特許文献１は、ラクトバチルス・ファーメンタム変異株ＶＲＩ００３株に関する特許であるが、本発明のファーメンタム株とはＬ−アラビノース、マンノース、マルトース、トレハロースの発酵性において差異があり、全く異なるものである。
特許文献２は、ラクトバチルス・ファーメンタムの高濃度乳酸菌乾燥物をカプセルに充填することを特徴とする健康食品に関するものであるが、株の特徴付けがなされておらず、本発明のファーメンタム株を開示していない。
【０００５】
特許文献３は、ラクトバチルス・ファーメンタムを含む乳酸菌とサッカロミセス・セレビシエとの混合培養物に関するものであり、一種類の乳酸菌のみで免疫調節効果を発揮する本発明とは明らかに異なる。
特許文献４は、ラクトバチルス・ファーメンタムＣＰ３４株がＩｇＥ抗体量を減少させることを開示しているが、糖発酵性が相違していることから、本発明と全く異なる株であることは明らかである。
【０００６】
特許文献５は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の産生を促進する乳酸菌に関するものであり、具体例としてラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１を挙げている。ラクトバチルス・ファーメンタムの種々の株が様々な免疫調節作用を有していることは既に知られているが、上述のように、選択する株によってその効果は異なる。それ故、特許文献５の開示によっても本発明の発明性は否定されない。
【０００７】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタムは、菌の詳しい同定がなされており、また、菌体外多糖類を産生するという際立った特徴を有している。しかも、その多糖類の基本構造が明らかにされ、また、マウスにおいて該多糖類の免疫調節作用が明らかにされている。それゆえ、本発明のファーメンタム株は、十分に特徴付けされた独自の菌株である。
【０００８】
一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスに関しては、特許文献６〜８など、免疫調節効果にかかわる公知の情報がある。
特許文献６は、複数の乳酸菌株を組み合わせて効果を得る抗腫瘍活性剤に関するもので、一種類の菌株のみで効果が得られる本発明とは異なる。
【０００９】
特許文献７は、各種乳酸菌保存株について網羅的に、それを摂取させたＢＡＬＢ／ｃマウスでのＩｇＥの産生量を調べ、実施例として示している。ここでは、ラクトバチルス・ヘルベティカスについてはＡＴＣＣ１５００９株が例示されているが、本発明のヘルベティカス株とは明らかに異なる。また、当該実施例によると、同じ種でも株によってＩｇＥの産生量には著しい違いがあり、このような反応が株レベルで明確に異なることがわかる。
特許文献８は、複数種の乳酸菌と酵母を共生培養して得られる発酵乳を有効成分として含有する免疫増強組成物に関するものであるが、単一菌株による本発明とは別異のものである。
【００１０】
このように、種々の乳酸菌株の摂取が動物の免疫調節作用を有することは良く知られていることであるが、より優れた免疫調節作用を有する乳酸菌株の提供が求められていた。
【００１１】
【非特許文献１】Tannock, G. W.(1999).Probiotics, a critical review, Horizon scientific press.(ISBN:1-898486-15-8)
【非特許文献２】Wood, B. J. B. (1999). the lactic acid bacteria in health and disease, AN Aspen Publication
【非特許文献３】細野明義 編、発酵乳の科学−乳酸菌の機能と保健効果−、 アイ・ケイコーポレーション（２００２年）
【特許文献１】特表２００５−５３７７９１号公報
【特許文献２】特開２００５−１２４４３２号公報
【特許文献３】特開２００４−９１４３３号公報
【特許文献４】特開２００４−２６７２９号公報
【特許文献５】特開平１０−１３９６７４号公報
【特許文献６】特開２００５−９７２８０号公報
【特許文献７】特開平９−２９５９号公報
【特許文献８】特開２００６−７６９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
日本においては、国民の高齢化が進行し、その結果、国民医療費の高騰が大きな問題となっている。そこで、医療に頼るのではなく、単に食品として摂取するだけで、免疫力を高め、健康維持に役立てることができれば、医療費の低減に繋がり、国民の福祉に大きく寄与すると考えられる。
よって、本発明は、食品として摂取することにより、免疫力を高め、抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗腫瘍作用などを発揮し、体質改善を図ることができる免疫調節剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記のような課題を解決するひとつの手段として、免疫力を調節すると一般に信じられている発酵乳から、食べることで、免疫力を高め、アレルギーを低減し、癌の増殖に対して抑制効果を示すなどの免疫力を調節する作用を有する乳酸菌を探索してきた。
その結果、ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株とその菌体外多糖類及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株に、優れた免疫調節作用が期待できることを初めて明らかにした。
これらの知見に基づいて、本発明は完成されたのである。
【００１４】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）である。
請求項２に記載の本発明は、ラクトバチルス・ファーメンタムがＴＤＳ０３０６０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３８）である請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタムである。
請求項３に記載の本発明は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類である。
請求項４に記載の本発明は、請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を、生菌で１０７／ｇ以上、あるいは死菌体で０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項５に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を食品中に０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項６に記載の本発明は、請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を有効成分として含有する免疫調節剤である。
請求項７に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する免疫調節剤である。
請求項８に記載の本発明は、請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤である。
請求項９に記載の本発明は、免疫調節作用が期待できるラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９）である。
請求項１０に記載の本発明は、請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材である。
請求項１１に記載の本発明は、請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を有効成分として含有する免疫調節剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム及びラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて製造した発酵乳等の食品を摂取することで、免疫力を高め、抗炎症効果、抗アレルギー効果、抗腫瘍効果など、体質の改善に繋がることが期待できる。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムの生産する菌体外多糖類は、食品として利用する場合には、物性を改善するという作用とともに、免疫力を調節するという２つの効果が期待できる機能性素材として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ファーメンタムは、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするものである。
本発明のラクトバチルス・ファーメンタムは、上記多糖類を菌体外に産生・蓄積するものであればどのようなものでもよく、例えばラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株が挙げられる。
【００１７】
本発明の多糖類は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される新規な多糖である。主要成分とマイナー成分の好ましい構成比は、主要成分：マイナー成分＝７５：２５〜８０：２０である。
本発明の多糖類は上記の構造を有するものであればよく、その由来は特に限定されない。例えば、ラクトバチルス・ファーメンタム等の乳酸菌、特にラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株由来のものが好適に使用できる。
【００１８】
本発明において初めて単離されたラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株（以下、単にＴＤＳ０３０６０３株と呼ぶことがある。）、及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（以下、単にＴＤＳ０３０９０３株と呼ぶことがある。）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はそれぞれＮＩＴＥ ＡＰ−３３８、ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９である。
【００１９】
ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株は、ともに家庭で作られている、工業的に作られていない伝統的発酵乳から分離されたものである。このような発酵乳は、工業的に作られたものと違い、様々な乳酸菌や酵母などによって発酵している。それ故、どのような乳酸菌から構成されているかを知るには、乳酸菌を分離同定する必要がある。
【００２０】
なお、発酵乳から乳酸菌を分離する手法は、適切な教科書が存在し、誰でも容易に実施可能である。例えばSkinner, F. A., and Lovelock, D. W. (1979). Identification methods for microbiologists Second edition. Academic Pressなどが参考になる。
【００２１】
本発明の乳酸菌の分離は、具体的には以下の通り行った。
発酵乳検体を滅菌した生理食塩水に段階希釈し、ＭＲＳ寒天培地（De Man, J. D., Rogosa, M., Sharpe, M. E. (1960).J. Appl. Bact. 23, 130-135.）、Ｍ１７寒天培地（Terzaghi, B. E., and Sandine, W. E.(1975). Appl. Environ. Microbiol. 29, 807-813.）に０．１ｍｌを塗沫し、炭酸ガス置換下で嫌気培養を３２℃で行い、画線分離して純粋な株とした。グラム陽性、カタラーゼ陰性のものを乳酸菌と見なし、生育温度試験、グルコースからのガス産生、細菌同定用検査キット ＡＰＩ−５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）を用いた糖の発酵性、及び１６ＳｒＤＮＡの部分配列に基づいて同定した。
【００２２】
ＴＤＳ０３０６０３株は、グラム陽性の桿菌でヘテロ発酵型乳酸菌である。１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく同定において、ラクトバチルス・ファーメンタムと同定された。本菌株を、乳酸菌用の培地であるＭＲＳ液体培地（ＭＲＳ寒天培地と同じ組成で、寒天を配合しないもの）で常法により培養したところ、培養物は粘稠性を示し、菌体外多糖類を産生することが示された。また、墨汁染色においても、典型的な菌体外多糖類の産生が示された。
【００２３】
なお、乳酸菌の菌体外多糖類についての知見は、例えばInternational Dairy Journal第１１巻第９号（２００１年）（乳酸菌多糖類に関する特集号）などに記載されているが、乳酸菌が特徴的に多糖類を産生する場合には、例えばピペットで当該乳酸菌の培養物を吸い取った際に、粘稠な糸曳きが見られることで容易に判定できる。
【００２４】
同様にＴＤＳ０３０９０３株は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく同定と、細菌同定用検査キットであるＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）の糖発酵性にも基づく同定によって、ラクトバチルス・ヘルベティカスと同定された。
【００２５】
ＴＤＳ０３０６０３株が生産する菌体外多糖類を核磁気共鳴分析およびメチル化分析により解析した結果、当該多糖類は、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分との混合物であることが明らかとなった。
本発明の多糖類の構造の模式図を化１に示す。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明の乳酸菌２種の洗浄菌体はそれぞれ、Ｃｏｌｏｎ２６結腸癌担癌マウスを用いた経口摂取試験により、癌細胞の増殖抑制の傾向を示し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）産生を有意に抑制したので、腫瘍増殖抑制作用、抗炎症作用が期待できる。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムの培養物から分離精製した多糖類、及び本発明のヘルベティカス株菌体は、それぞれマウス由来マクロファージの培養細胞においてインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の産生を促進する傾向があった。さらに、オボアルブミン感作マウスにおいて、本発明のファーメンタムのホエー培養物の凍結乾燥物を経口投与することで、血清中のオボアルブミン特異的ＩｇＥの産生を低下させる傾向にあった。以上から、本発明の乳酸菌及び多糖類はともに、ヒトにおいてもＩ型アレルギーを抑制することが期待できる。
【００２８】
このように、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体、その多糖類及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体は、抗腫瘍作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用などの免疫調節作用を有していることから、これらを免疫調節作用を有する食品及び食品用素材並びに抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤などの免疫調節剤の製造に利用することができる。ここで、食品としてはヨーグルト、乳酸飲料、チーズ、パン、クッキーなどが挙げられるが、特に制限はない。
また、本発明の多糖類は水に容易に溶解し、水の粘稠性を高める性質を有していることから、食品用の増粘剤などの物性改善剤の製造に利用することができる。
【００２９】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品、食品用素材及び免疫調節剤は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を培地において常法で培養することにより製造することができる。
【００３０】
ここで、培養に用いる培地は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムが生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、獣乳、脱脂乳などの乳、ホエー（乳清とも呼ばれるチーズ製造等で生じる副産物）、各種合成培地などを用いることができる。
これら培地は、微量のマンガンを含んでいることが好ましい。培地中のマンガンの濃度は硫酸マンガン濃度として０．００００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％である。マンガン濃度が前記の下限値未満であると、菌体外多糖類の産生量が著しく減少するため好ましくない。なお、培地中に含まれるマンガンは、どのような形態で含まれていても良い。例えば、食品添加物や食品成分のうち、マンガンを多く含有するものとして酵母エキスなどが知られている。それゆえ、培地に酵母エキスなどを加えることで、発酵が促進され、多糖類産生量を増加させることが可能となる。また、例えば硫酸マンガンなどの無機塩として培地に添加してもよい。
【００３１】
培養温度は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタムが良く生育する温度、例えば２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃とすることができる。また、培養時間は４〜４８時間、好ましくは８〜２４時間とすることができる。
【００３２】
また、本菌株はヘテロ発酵性のために、発酵中に微量の炭酸ガスを産するという特徴があり、密閉容器で発酵した場合には、容器内の圧力が上昇する。それゆえ、炭酸ガスの発生が製造上支障になる場合に、容器に充填する際には、炭酸ガスが透過しやすい材質の包材を用いた容器に充填するか、培養が十分完了した後に充填することが好ましい。
なお、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム以外の乳酸菌を培地に添加して混合培養することにより、特徴的な発酵乳を得ることができる。ここで、組み合わせる乳酸菌としては、目的にあったものであればいずれでも良い。
【００３３】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品とすることができる。
また、このようにして培養した後、得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材又は免疫調節剤として摂取することができる。例えば、培養終了後の培養物をそのまま濃縮したもの、これを粉末化したもの、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により集菌して菌体のみとしたもの、これを凍結乾燥菌体としたもの、さらに加熱処理した菌体、菌体破砕物等も本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤とすることができる。
【００３４】
さらに、上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品を製造することができる。
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を用いた食品、食品用素材、及び免疫調節剤に含まれるラクトバチルス・ファーメンタム菌体は、発酵乳以外に用いる場合には生菌体でも死菌体でも良い。何故なら、乳酸菌を経口摂取し、腸管まで到達すると、腸管上皮細胞上のM細胞から取り込まれた後に免疫器官であるパイエル板で処理され、免疫応答が開始される。この時にパイエル板に認識される部位は細胞壁成分(ペプチドグリカン、リポテイコ酸、表層タンパク質など)であることがこれまでの研究から明らかにされている。そのため、必ずしも生菌である必要がない。（Kitazawa, H., Ueha, S., Itoh, S., Watanabe, H., Konno, K., Kawai, Y., Saito, T., Itoh, T., Yamaguchi, T. (2001). Int. J. Food Microbiol. 65, 149-162.及びIliev, ID., Kitazawa, H., Shimosato, T., Katoh, S., Morita, H., He, F., Hosoda, M., Saito, T. (2005). Cell Microbiol. 7(3), 403-414.）。また、本発明に用いた経口投与による免疫学的試験では、加熱死菌体を用いて各種試験を実施している。
【００３５】
なお、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品又は食品用素材におけるラクトバチルス・ファーメンタム菌体の含有量は、生菌数では１０７／ｇ以上、重量比では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。生菌数において望ましい菌数が１０７／ｇ以上である理由は、発酵乳の日本国内の規格によって、生菌で１０７／ｇ以上と定義されているからである。死菌体においては免疫調節作用を期待しているため、マウスの経口投与試験において試験食中に０．１％含有させていたことにより、好ましくは０．１％以上としているが、菌体そのものの粉末を少量摂取しても、食品として問題がないため、上限を１００％とした。しかし、風味等を勘案すると０．１から２０％が望ましい。
また、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を有効成分として含有する免疫改善剤におけるラクトバチルス・ファーメンタム菌体の含有量は菌体含有量では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。
【００３６】
本発明の多糖類を含有する食品、食品用素材、免疫調節剤及び物性改善剤は、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌体を培地において培養することにより製造することができる。ここで、用いる培地や培養方法は、上記したラクトバチルス・ファーメンタム菌体を含有する食品用素材及び免疫調節剤の製造方法と同様とすることができる。
【００３７】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明の多糖類を含有する食品とすることができる。
また、培養後に得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。例えば、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により菌体を除去したもの、及びこれを濃縮、精製等したもの等も本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤又は物性改善剤とすることができる。
【００３８】
さらに、上記本発明の食品用素材、免疫調節剤又は物性改善剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム由来の多糖類を含有する食品を製造することができる。
【００３９】
なお、本発明の多糖類を含有する食品又は食品用素材における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
また、本発明の多糖類を有効成分として含有する免疫改善剤における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
さらに、本発明の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤における多糖類の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２０重量％である。
【００４０】
本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品、食品用素材及び免疫調節剤は、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を培地において培養することにより製造することができる。
ここで、培養に用いる培地は、本発明のＴＤＳ０３０９０３株が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、上記のラクトバチルス・ファーメンタムと同様のものを用いることができる。また、培養方法も上記のラクトバチルス・ファーメンタムと同様とすることができるが、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃とすることができる。
なお、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス以外の乳酸菌を培地に添加して混合培養することにより、特徴的な発酵乳を得ることができる。ここで、組み合わせる乳酸菌としては、目的にあったものであればいずれでも良い。
【００４１】
このようにして、獣乳やホエー（乳清）を発酵することにより得られた発酵物をそのまま、又は必要な後処理をして、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品とすることができる。
また、このようにして培養した後、得られた培養物（培地）をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより、本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。例えば、培養終了後の培養物から遠心分離、濾過等により集菌して菌体のみとしたもの、これを凍結乾燥菌体としたもの、さらに加熱処理した菌体、菌体破砕物等も本発明の食品用素材又は免疫調節剤とすることができる。また、上記のものをさらに通常用いられる補助剤を添加して製剤化したものや、種々の食品に配合したもの等も、本発明の免疫調節剤とすることができる。
【００４２】
さらに、上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を種々の食品に配合すること、あるいは上記本発明の食品用素材又は免疫調節剤を配合して常法により食品を製造することにより、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品を製造することができる。
本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を用いた食品、食品用素材、及び免疫調節剤に含まれるＴＤＳ０３０９０３株菌体は、生菌体であることが好ましいが、死菌体であってもよい。死菌体であっても良い理由は、ラクトバチルス・ファーメンタムについて述べたのと同様な理由である。
【００４３】
なお、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を含有する食品又は食品用素材におけるＴＤＳ０３０９０３株菌体の含有量は、生菌では１０７／ｇ以上、重量比では０．１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％である。
また、本発明のＴＤＳ０３０９０３株菌体を有効成分として含有する免疫改善剤におけるＴＤＳ０３０９０３株菌体の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。このような範囲指定の理由は、ラクトバチルス・ファーメンタムについて述べたのと同様な理由である。
【実施例】
【００４４】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
なお、本発明の乳酸菌ＴＤＳ０３０６０３株及びＴＤＳ０３０９０３株は、前記したように所定の微生物保存機関に寄託されており、十分に開示されている。
【００４５】
（実施例１）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株とラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の同定
ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株の性状を調べて同定を行った。
上記乳酸菌の糖の発酵性を、それぞれ細菌同定用検査キット ＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー製）で調べた。なお、測定方法の詳細はメーカーの指示する方法に従った。
また、上記乳酸菌の基本的性状と１６Ｓｒ−ＤＮＡの配列に基づく同定結果を用いて最終的な同定結果とした。その結果をそれぞれ表１と表２に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
（実施例２）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株を用いた発酵乳の試作
ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株を使用して発酵乳を試作した実施例を示す。
新鮮なラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の培養液を単独で、あるいはストレプトコッカス・サーモフィラスの培養液と組み合わせてスターターとして用い、殺菌した牛乳にそれぞれ１％接種し、３０℃で１９．５時間培養した。培養後、１０℃以下まで十分冷却して、食した。
できたばかりの発酵乳は、ファーメンタム単独のものもサーモフィラスと組み合わせたものも良好な物性と風味を有していたが、ＴＤＳ０３０６０３株がヘテロ発酵性であるため、やや泡立っていた。
【００４９】
（実施例３）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株のホエー培地での菌体外多糖類の産生条件の検討
ＴＤＳ０３０６０３株をＭＲＳ液体培地で常法により培養し観察した結果、培養物が粘稠性を示し、多糖類を産生することが明らかであった。ＭＲＳ培地には硫酸マンガンが成分として０．００４重量％含まれている。この硫酸マンガンを培地成分から除いて培養した結果、著しく多糖の生成が減少することが明らかとなった。また、本菌株を種菌として用いて乳を培地として上記と同様に培養した場合にも、微量のマンガンが含まれていないと多糖の生成は少なかった。
【００５０】
そこで、本多糖類をホエー（乳清）で培養して生産する場合をモデルにして、酵母エキス等の添加物が多糖の生産に与える影響を調べた。試験した添加物はトリプトン（ＢＢＬ製）、硫酸マンガン（和光純薬製）、酵母エキス（Ｐ２Ｇ、アサヒフード＆ヘルスケア製）、酵母エキス（型番ＬＹＩＩ−Ｐ、大日本明治精糖製）、乳ペプチド（ＦＥ１３５、ＤＭＶジャパン製）であった。
ホエーパウダー（よつ葉乳業製）を１０重量％の割合で水に還元し、１２１℃で１５分間オートクレーブすると、含まれているタンパク質等が凝集物を生成した。この凝集物を遠心分離により除去し、１０％除タンパクホエー液とした。これに上述の添加物を表３に示す割合で加え、１２１℃で１５分間オ−トクレーブしたものを培地（除タンパクホエー培地）として使用した。
スターターとして使用するＴＤＳ０３０６０３株培養液は、培地由来のマンガンの影響を除くため、１％トリプトンを添加した上記の１０％除タンパクホエー液を１２１℃で１５分間オートクレーブして得た培地に、ＴＤＳ０３０６０３株のコロニー１個分を無菌的に接種し、３０℃で２４時間培養したものを用いた。このように調製したスターターは培地成分にマンガンを極微量にしか含まず、スターター自体に含まれるマンガンを培地に持ち込む影響を避けることができる。
【００５１】
このスターターを各除タンパクホエー培地に３％添加し、３０℃で２４時間培養し、１０℃に冷却後、その粘度を測定した。粘度は、Ｂ型粘度計でＲ−Ｌアダプタを使用し、回転数６０ｒｐｍの条件で測定した。なお、培養前の培養液についても、上記と同様に粘度を測定した。粘度の単位は国際単位（ＳＩＵ）であるｍＰａ・ｓ（ミリＰａｓｃａｌ ｓｅｃｏｎｄ）で表した。ちなみに、室温の水の粘度は約１ｍＰａ・ｓである。
次に、培養液中に生じた多糖のおおよその量（粗多糖類の量）をエタノール沈殿により測定した。まず、培養液に等量のエタノールを加え、５℃で一晩放置した。遠心後沈殿を回収し、イオン交換水を加え、７０℃において３０分間攪拌しながら溶解させた。遠心後、上清を回収し、凍結乾燥したものの重量を測定した。なお、多糖類の産生量の測定は、粘度が高いものについてのみ実施した。
【００５２】
結果を表３に示す。
本試験の結果、酵母エキスを５重量％といった大量に培地に添加することで、多糖類の産生が著しく促進されることが明らかになった。特に、酵母エキス（ＬＹＩＩ−Ｐ）の添加が最も効果的であった。また、発酵促進のためのペプチド類を添加することで、酵母エキスの量を減らしても多糖生成がある程度維持されることがわかった。トリプトンや乳ペプチド単独の添加では、粘度から見て多糖の生成にはあまり促進効果がないことも示された。
以上の結果から、酵母エキスなどの安全な食品添加物を添加することで、ホエーを用いて本発明の多糖類を生産することが可能であることが示された。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（実施例４）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の培養物からの菌体外多糖類の精製
イオン交換水にホエーパウダー（よつ葉乳業製）を１０重量％溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブしたものを、１２０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ってタンパクを除去した。これに、１％のトリプトンと０．００４％の硫酸マンガンを加え、１２１℃で１５分間オートクレーブしたものを培地とした。
これに、同じ培地でＴＤＳ０３０６０３株を３０℃で１日培養した前培養液を５％添加し、２５℃において２４時間培養した。培養液３Ｌに、冷却した同量のエタノールを加えて一晩５℃で放置し、遠心して沈殿をイオン交換水で回収した。さらに、イオン交換水で１Ｌにメスアップし、水酸化ナトリウムで中和し透析を行ったものを、イオン交換水で３Ｌにメスアップし、攪拌しながら７０℃で３０分間溶解させた。これを遠心し、上清を回収して凍結乾燥した。これを粗精製多糖として以下の試験に用いた。この粗精製多糖は、常温で容易に水に溶解できた。
【００５５】
（実施例５）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の生産する菌体外多糖類の粘度
実施例４で得た粗精製多糖を、蒸留水に０．０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０重量％の各濃度で溶解させ１０℃に冷却し、東機産業（株）製８０ＬＢ型粘度計を用いて粘度を測定した。測定条件は、Ｒ−Ｌアダプタを使用し、回転数１２ｒｐｍにおいて６０秒後の粘度を測定した。測定結果は表４に示す。
また、同じ粘度計を用いて、回転数６０、３０、１２ｒｐｍで測定を行った。測定結果は表５に示す。
その結果、粘度測定時の回転数が高いほど低い粘度を示すシュドプラスチック（擬塑性）粘性を示した。このことから、ＴＤＳ０３０６０３株の産生する本発明の菌体外多糖類は、水の粘稠性を高めることがわかる。また、測定データから、粘度は添加量に応じて上昇することがわかる。それ故、効果の範囲は０％超の添加であればそれに呼応して粘度の上昇が見られる。物性改善剤としては、特に多糖類の添加量の範囲を指定することなく、利用できる。しかし、添加量０．１％以上で顕著な粘度の増加が見られ、実用的には２０％未満程度が物性改善に望ましい。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
（実施例６）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の生産する菌体外多糖類の構造
（Ｉ）１Ｈ−ＮＭＲ
実施例４で調製した粗精製多糖を、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）２００ｍｌに溶解したものを、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０アニオン交換樹脂 ２００ｍｌと混合し、攪拌しながら室温に１時間置いた。次いで、ブフナー漏斗でろ過して樹脂を除いた溶液を、水道水で４８時間、２Ｌの蒸留水で２４時間透析し、凍結乾燥することにより精製多糖を得た。
【００５９】
次に、多糖のアノマープロトン（糖の１位水素）の個数を推定するために、核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置を用いてプロトンの１次元ＮＭＲスペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を測定した。
まず、上記において精製された多糖を重水に溶解し、凍結乾燥した。この操作を３度繰り返した後に得られた凍結乾燥物（約０．５ｍｇ）の全量を重水２００μＬに溶解し、マイクロＮＭＲチューブに入れ、Ｂｒｕｋｅｒ社製ＮＭＲ装置Ａｄｖａｎｃｅ−６００ ＮＭＲにて、温度７０℃の条件下で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定を行った。その結果得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。
この結果、アノマープロトンのシグナルが４個存在し、α結合に由来するピークが２個、β結合に由来するピークが２個観測された。すなわち、当該多糖は４糖繰り返し単位で、α結合とβ結合が２個ずつであると考えられる。
【００６０】
（ＩＩ）メチル化分析
次に、本発明の多糖の構成糖残基間のグリコシド結合の様式をメチル化分析によって解析した。メチル化分析方法は、Hakomori, S. (1964). J. Biochem. (Tokyo), 55(2), 205-208.の記載に従った。
【００６１】
まず、（Ｉ）で得た精製多糖の部分メチル化アルジトールアセテートを、Stellner, K., Saito, H., and Hakomori, S. (1973). Arch. Biochem. Biophys. 155, 464-472.に記載の方法で調製した。
【００６２】
次に、それのガスクロマトグラフ重量分析（ＧＣ−ＭＳ）を常法に従って行い、その結果から、「生化学データブック」（東京化学同人）に基づいて、構成糖残基間のグリコシド結合の様式を帰属した。
ＧＣ−ＭＳにはＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ガスクロマトグラフＨＰ５８９０／重量分析計ＨＰ５９７２ＭＳＤを用い、カラムはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＤＢ−１７を用いた。温度条件は（１）１５０℃（１ｍｉｎ）、（２）１５０−２００℃（昇温速度１５℃／ｍｉｎ）、（３）２００℃であった。
【００６３】
その結果、ガスクロマトグラフィーのピークパターンを図２に、各ピークの重量分析パターンから帰属した部分メチル化アルジトールアセテートのモル比を表６に、それぞれ示す。図２中のピークＡ−Ｅは糖由来のピークであり、表６のピーク名に対応している。ピークＸは調製過程で混入した不純物のピークである。
なお、グルコースとガラクトースの判別については、既知試料の同条件下でのピークの保持時間と、下記（ＩＶ）における酸分解による構成糖分析の結果をもとに行った。
図２及び表６の結果から、本発明の多糖は、１残基の非還元末端（図２のピークＡ）と１残基の分岐点（ピークＥ）を持つ４糖繰り返しであるが、他に非還元末端由来のマイナーピーク（ピークＢ）が存在しており、非還元末端をグルコースとする主要成分と非還元末端をガラクトースとするマイナー成分の混合物であることが推察された。
【００６４】
【表６】
表６中で、Ｍｅはｍｅｔｈｙｌ、Ｇａｌはｇａｌａｃｔｏｓｅ、Ｇｌｃはｇｌｕｃｏｓｅを意味する。
【００６５】
（ＩＩＩ）構成糖の分析
本発明の多糖の単糖組成を分析するために、酸加水分解によって多糖のグリコシド結合を切断し、単糖にした上で、高速液体クロマトグラフィーによって分離定量を行った。
すなわち、まず、（Ｉ）で得た精製多糖１．５ｍｇを１．５ｍＬねじ栓付試験チューブに入れ、そこに蒸留水を０．６ｍＬ加え、多糖を懸濁させた。次いで、この多糖懸濁液に３．３Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を０．９ｍＬ加えて、１００℃に設定したアルミブロック恒温槽を用いて３時間保温し、加水分解反応を行った。反応終了後、試験チューブを凍結し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。さらに、凍結乾燥物を蒸留水に溶解して糖分析用サンプルとした。
【００６６】
構成糖の分析には、日本ダイオネクス社製のイオン交換クロマトグラフィーシステム（ＤＸ−５００）を使用した。測定は、分離カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１、溶離液：５ｍＭ ＮａＯＨ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：パルスドアンペロメトリ検出器の条件で行った。
【００６７】
その結果、ラムノース（Ｒｈａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）を含む標準糖標品のクロマトグラムを図３（ａ）に、当該多糖の酸分解物のクロマトグラムを図３（ｂ）に、それぞれ示す。
この２つのクロマトグラムの比較より、本発明の多糖を構成している単糖は、ＧａｌとＧｌｃであることが示された。また、ピークの面積比から計算した構成糖の存在比は、Ｇａｌ：Ｇｌｃ＝１：２．４−２．６であった。
【００６８】
以上の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の分析結果から、本発明の多糖は主要成分とマイナー成分の混合物であることが分かった。また、主要成分は３位置換Ｇｌｃ、６位置換Ｇａｌ、２位３位置換Ｇｌｃおよび非還元末端Ｇｌｃから成る４糖繰り返し単位であり、マイナー成分は３位置換Ｇｌｃ、６位置換Ｇａｌ、２位３位置換Ｇｌｃおよび非還元末端Ｇａｌから成る４糖繰り返し単位であると推測された。さらに、主要成分及びマイナー成分の４糖繰り返し単位には、２つのαグリコシド結合ならびにβグリコシド結合が含まれていることが分かった。
本発明の菌体外多糖類の最終的な構造の模式図を化２に示した。
【００６９】
【化２】
主要成分：マイナー成分の比率＝７５：２５〜８０：２０
【００７０】
（実施例７）ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の結腸癌担癌マウスに対する経口投与の効果
（１）材料と方法
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス、メス（ＳＦＣ）を使用し、一群１０匹で試験した。Ｃｏｌｏｎ２６結腸癌細胞株を皮下に移植した結腸癌担癌マウスに対して、ＴＤＳ０３０６０３株の凍結乾燥菌体を２００μｇ／マウス／日の割合で、またＴＤＳ030903株の凍結乾燥菌体を1800μｇ／マウス／日の割合で、移植翌日より一日１回、１４日間連続経口投与した。それぞれ、１５日目に解剖を行い、脾臓、胸腺、肝臓および腫瘍部の重量、並びに、血漿中のサイトカインであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αを測定した。
【００７１】
（２）試験対象物の調製並びに投与方法
ＴＤＳ０３０６０３株及びＴＤＳ０３０９０３株は、それぞれＭＲＳ液体培地で培養し、培地ｍｌあたりの菌数を測定した。培養物を遠心分離後、適当量の水に再懸濁し、遠心、再懸濁を２回くりかえした。その後、８０℃で１０分間加熱し殺菌した。このようにして得られた洗浄菌体を凍結乾燥し、重量を測定した。凍結乾燥物ｇあたりの殺菌前の菌数を算出し、それぞれ凍結前の菌数として約１０８ＣＦＵ／日投与に相当する量となるように投与した。具体的には、約ＴＤＳ０３０６０３株の凍結乾燥菌体を４ｍｇ秤量し、４ｍｌ滅菌蒸留水で溶解した。また、ＴＤＳ０３０９０３株の凍結乾燥菌体は３６ｍｇを秤量し、４ｍｌの滅菌蒸留水に溶解した。その溶液をそれぞれ２００μＬ／マウスになるように投与した。
【００７２】
（３）Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスの作製
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて継代しているＣｏｌｏｎ２６結腸癌細胞株を用いた。０．１％トリプシン０．０２％を培養液に加えて細胞を剥離した後に、１６００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。培養液を捨て、沈殿した細胞をピペッティングしてほぐし、滅菌生理食塩水を５ｍｌ加えて混和させ、細胞数測定用に採取した。
採取した細胞浮遊液は、細胞浮遊液５０μＬ、４％トリパンブルー９５０μＬの割合で混合した後、ヘモサイトメーターを用いて顕微鏡下にて細胞数ならびにセルバイアビリティーを計測した。
一方、残りの細胞浮遊液は、再度遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞をピペッティングしてほぐし、滅菌生理食塩水を用いて細胞数１×１０６個／ｍｌになるように再浮遊させた。細胞数５×１０５個／１００μＬをマウス背側頸部皮下に注射筒を用いて移植し、Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスを作製した。
【００７３】
（４）解剖および重量測定
解剖前日からの絶食は行わない。解剖当日はネンブタール（４０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下において開腹し、腹大静脈よりヘパリン加採血を行った。脾臓、胸腺、肝臓および腫瘍部を摘出し、重量を測定した。採血した血液は、４℃、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して血漿を採血し、サイトカイン測定まで−８０℃で保存した。採血した血漿は４℃において解凍し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢＩＯＳＯＵＲＳＥ社製）を用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度を測定した。測定方法はキットの説明書の記載に従った。
試験結果は平均値±標準偏差で表し、データについては一元配置分散分析を行った後、フィッシャーのＰＬＳＤ法により、各群間の有意差検定を行った。
【００７４】
（５）結果
結果を表７に示す。
ＴＤＳ０３０６０３株投与群では、腫瘍細胞重量は対照群に比べ減少傾向であったが、対照群と有意差はなかった。炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α濃度は対照群に比べて低い値を示したが、有意差はなかった。同じく炎症性サイトカインであるＩＬ−６の濃度は、５％の危険率で対照群に比べて有意な差があった。それ故、ＴＤＳ０３０６０３株菌体は、腫瘍の増殖を抑制する傾向があり、炎症性サイトカインであるＩＬ−６の産生を抑制する物質であると確認された。
一方、ＴＤＳ０３０９０３株投与群では、腫瘍重量の増加を抑制する傾向があったが対照群と有意な差はなかった。またＴＮＦ−αについては、５％の危険率で対照群に比して有意に産生を抑制した。ＩＬ−６については、対照群に比して１％の危険率で有意に産生を抑制した。それ故、ＴＤＳ０３０９０３株菌体は、腫瘍の増殖を抑制する傾向があり、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αならびにＩＬ−６の産生を抑制する物質であると確認された。
【００７５】
以上から、ＴＤＳ０３０６０３株菌体とＴＤＳ０３０９０３株菌体の摂取によって、担癌というストレス下で、腫瘍増殖を抑制ぎみにするとともに、有意にＩＬ−６（ＴＤＳ０３０９０３株に関してはＴＮＦ−αも）の産生を抑制するので、ＴＤＳ０３０６０３株とＴＤＳ０３０９０３株は抗炎症作用を有することが期待される。
【００７６】
【表７】
ａ： ｐ＜０．０５（対照群に比べて危険率５％で有意に差）
ａａ： ｐ＜０．０１（対照群に比べて危険率１％で有意に差）
【００７７】
（実施例８）ホエーで生産したラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株の精製菌体外多糖類とラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株菌体の抗アレルギー試験
＜材料及び方法＞
マウス由来マクロファージＪ７７４．１細胞（理研ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）を用いた。Ｊ７７４．１細胞の培養は、培地［ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）＋１０％ＦＢＳ＋５０Ｕ／ｍｌペニシリン＋５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン液（ＧＩＢＣＯ社製）＋５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール］を用いて定法に従って行った。
被検体として、ＴＤＳ０３０６０３株の培養物から分離した十分に精製した多糖類凍結乾燥物（実施例６（Ｉ）で分析用に調製した精製多糖）及びＴＤＳ０３０９０３株菌体凍結乾燥物（実施例７に用いたものと同じ）を用いた。対照として、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５３１０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＪＣＭ１１２０株の凍結乾燥菌体を用いた。これらの凍結乾燥菌体の調製は実施例７に用いた方法に準じた。
【００７８】
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ製）に、Ｊ７７４．１細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ培地で添加し、そこへサンプルを１０μｇ／ｍｌ添加後（多糖は１００μｇ／ｍｌについても実施）、３７℃、ＣＯ２５％で２４時間培養した。この培養試験はすべて２連で行った。
その後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）を用いてＩＬ−１２産生量を測定した。この試験は2連で2回実施し、合計４連の結果を平均してＩＬ−１２の濃度とした。
【００７９】
＜結果＞
結果を表８に示す。データは４連の平均値を示している。ＡＴＣＣ５３１０３株については、さらに2回の試験を行い８連の平均値を示している。
リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ社製）をポジティブコントロールとし、ＡＴＣＣ５３１０３株、ＪＣＭ１１２０株の凍結乾燥菌体を一般の乳酸菌として対照に用いた。なお、ＡＴＣＣ５３１０３株は一般にプロバイオティクスであるＬＧＧ菌として知られ、アトピー性皮膚炎に関する報告（例えば、Isolauri, E., Arvola, T., Sutas, Y., Moilanen, E., Salminen, S., (2000). Clin. Exp. Allergy, 30(11), 1604-1620.参照）があることから対照とした。
【００８０】
表８の結果から、ＴＤＳ０３０６０３株由来の菌体外多糖類は、ＬＧＧ菌（ＡＴＣＣ５３１０３株）などと同等レベルにＩＬ−１２の産生を促進しているが、この検体は菌体成分を含まないことを考慮すると極めて新規性が高い。また、この多糖は濃度依存的にＩＬ−１２の産生を促進していることがわかる。ただし、本試験ではＴＤＳ０３０６０３株菌体のみの効果については試験していない。
一方、ＴＤＳ０３０９０３株菌体においては、他の菌株に比べて相対的により強くＩＬ−１２の産生を促進している。ＩＬ−１２はサイトカインであるインターフェロン−γの強力な誘導因子であり、産生が増強されるとＴｈ１を優位な状態へ傾け、抗アレルギー効果が期待できる。
【００８１】
【表８】
【００８２】
（実施例９）動物試験（抗アレルギー効果試験）
ラクトバチルス・ファーメンタムＴＤＳ０３０６０３株及びラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の抗アレルギー効果について、オボアルブミン（ＯＶＡ）感作マウスを用いた経口投与の試験を行った。ＴＤＳ０３０６０３株は菌体外多糖類を産生するので、菌体のみを分離して投与するのではなく、菌体外多糖類を含む培養物全体での抗アレルギー効果を評価した。ＴＤＳ０３０９０３株は、実施例８と同様に菌体乾燥物について評価した。
【００８３】
＜材料及び方法＞
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、一群１０匹で試験した。
対照群の餌はＣＥ−２（クレア社製）を用いた。試験群は、ＣＥ−２にＴＤＳ０３０６０３株培養物（ホエー培地での培養物の凍結乾燥物）５％、又はＴＤＳ０３０９０３株菌体（凍結乾燥菌体）０．１％を含有するように混合し、いずれも自由摂取させた。ここで、ＴＤＳ０３０６０３株培養物の混合量をＴＤＳ０３０９０３株菌体に比べて多く設定したのは、被検体（ＴＤＳ０３０６０３株培養物）中に占める菌体成分よりも培地成分由来のものが多いことを考慮したためである。水は水道水を自由摂取させた。環境温度２５℃、湿度５５％、照明は８時〜２０時の１２時間照明とした。予備飼育期間は１週間とした。
マウスに対する免疫は２０μｇオボアルブミン（ＯＶＡ）＋２０ｍｇ水酸化アルミニウムゲルの腹腔内投与を０日目、１４日目の２回実施した。２１日目に解剖し、腹部大動脈から全採血し、血清を採取した。
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定は、ＤＳマウスＩｇＥ ＥＬＩＳＡ （ＯＶＡ）（大日本住友製薬（株）製）を用いて、製造者のプロトコールに従って行った。
【００８４】
＜結果＞
各群の血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を表９に示す。ばらつきが大きいので比較は難しいが、コントロール（対照）に比べて試験食摂取群で平均値の減少が見られた。それ故、ＴＤＳ０３０６０３株のホエー培養物とＴＤＳ０３０９０３株菌体は、ともにこのような条件下でＩｇＥを低減する効果が期待できると予想された。すなわち、これらの乳酸菌培養物あるいは菌体の摂取で、抗アレルギー効果が十分に期待できることが分かった。
【００８５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の多糖類の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】本発明の多糖類から調製した部分アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィーのピークパターンを示す図である。
【図３】本発明の多糖類の酸加水分解物の液体クロマトグラフィーのピークパターンを示す図である。（ａ）は標準糖標品の、（ｂ）は本発明の多糖類の酸加水分解物のピークパターンをそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）。
【請求項２】
ラクトバチルス・ファーメンタムがＴＤＳ０３０６０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３８）である請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタム。
【請求項３】
３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類。
【請求項４】
請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を、生菌で１０７／ｇ以上、あるいは死菌体で０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項５】
請求項３に記載の多糖類を食品中に０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項６】
請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を有効成分として含有する免疫調節剤。
【請求項７】
請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する免疫調節剤。
【請求項８】
請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤。
【請求項９】
免疫調節作用が期待できるラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９）。
【請求項１０】
請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項１１】
請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を有効成分として含有する免疫調節剤。
【請求項１】
３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類を産生することを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）。
【請求項２】
ラクトバチルス・ファーメンタムがＴＤＳ０３０６０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３８）である請求項１に記載のラクトバチルス・ファーメンタム。
【請求項３】
３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端グルコースから成る４糖繰り返しを単位とする主要成分と、３位置換グルコース、６位置換ガラクトース、２位３位置換グルコースおよび非還元末端ガラクトースから成る４糖繰り返しを単位とするマイナー成分と、から構成される多糖類。
【請求項４】
請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を、生菌で１０７／ｇ以上、あるいは死菌体で０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項５】
請求項３に記載の多糖類を食品中に０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項６】
請求項１あるいは２に記載のラクトバチルス・ファーメンタムの菌体を有効成分として含有する免疫調節剤。
【請求項７】
請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する免疫調節剤。
【請求項８】
請求項３に記載の多糖類を有効成分として含有する物性改善剤。
【請求項９】
免疫調節作用が期待できるラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株（ＮＩＴＥ ＡＰ−３３９）。
【請求項１０】
請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を０．１〜１００重量％含有することによって免疫調節作用が期待できる食品又は食品用素材。
【請求項１１】
請求項９に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスＴＤＳ０３０９０３株の菌体を有効成分として含有する免疫調節剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２４５５７６（Ｐ２００８−２４５５７６Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９１０６５（Ｐ２００７−９１０６５）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、経済産業省、地域新生コンソーシアム研究開発事業（新規乳酸菌差別化技術を利用した機能性発酵乳・健康食品素材）に関する委託契約に基づき産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１１８１８９４）よつ葉乳業株式会社 (7)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５０６２０６１３３）ニュテックス株式会社 (4)
【出願人】（５００５０３５５１）株式会社生物有機化学研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、経済産業省、地域新生コンソーシアム研究開発事業（新規乳酸菌差別化技術を利用した機能性発酵乳・健康食品素材）に関する委託契約に基づき産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１１８１８９４）よつ葉乳業株式会社 (7)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５０６２０６１３３）ニュテックス株式会社 (4)
【出願人】（５００５０３５５１）株式会社生物有機化学研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]