喘息の処置
【課題】喘息の新規な処置方法を提供すること。
【解決手段】喘息の処置方法につき開示する。この方法は、ＶＬＡ−４を認識する抗体、ポリペプチドもしくは他の分子、たとえば好酸球のような或る種の白血球の表面で発現される蛋白質を投与することからなっている。本発明は、喘息罹患者に有効量のたとえばモノクローナル抗体ＨＰ１／２のような抗−ＶＬＡ−４抗体を投与する工程からなる方法を提供する。抗−ＶＬＡ−４抗体は慢性アレルゲン誘発喘息を有する患者にインビボで有利に投与され、アレルゲンに対する後期反応を阻止すると共に気道過反応性を軽減させる。
【解決手段】喘息の処置方法につき開示する。この方法は、ＶＬＡ−４を認識する抗体、ポリペプチドもしくは他の分子、たとえば好酸球のような或る種の白血球の表面で発現される蛋白質を投与することからなっている。本発明は、喘息罹患者に有効量のたとえばモノクローナル抗体ＨＰ１／２のような抗−ＶＬＡ−４抗体を投与する工程からなる方法を提供する。抗−ＶＬＡ−４抗体は慢性アレルゲン誘発喘息を有する患者にインビボで有利に投与され、アレルゲンに対する後期反応を阻止すると共に気道過反応性を軽減させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は喘息の処置に関するものである。より詳細には本発明は、喘息の処置におけるベリーレイト抗原−４（Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４）（ＶＬＡ−４）、すなわち内皮細胞リセプタ血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）のための或る種の白血球におけるリガンドを認識する抗体の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
喘息は広範な可逆性気道狭窄（気管支収縮）および各種の刺激に対する気道の過敏性増大（過反応症）を特徴とする気道の症状である。喘息の周知された徴候、たとえば咳、喘鳴、胸詰、呼吸困難は気道平滑筋の収縮、気管支粘液分泌の増加および炎症によって生ずる。殆ど致命的でないが、喘息は世界中の学齢児童の１０〜２０％を占めると推定され、小児喘息の病院収容が近年劇的に増大しており、米国の１調査が示すところでは喘息を有する１５才未満の児童の病院収容は少なくとも１９７０年から１９８４年の間に少なくとも１４５％増大している（Ｍ．Ｒ．シアーズ、１９９０［１］参照）。全体として、１，０００万人のアメリカ人（人口の４％）が喘息を有すると推定され、約４０億ドルがその処置に毎年費やされている（Ｌ．Ｋ．アルトマン、１９９１［２］；Ｃ．スタール、１９９１［３］）。
【０００３】
喘息の原因は完全には理解されていないが、急性喘息症状を引き起こす薬剤の研究は、喘息が個人の環境における特定アレルゲンに対し反応する個人の免疫学的反応であるという理論を支持している。これらの「引き金」は、気道過反応性の一時的増大を引き起こすことにより喘息を悪化させる。気道過反応性を誘発することが判明している引き金はアレルゲン吸入、個人が敏感になっている（たとえば職業的露呈による）低分子量物質の吸入、ウィルス性もしくはマイコプラズマ性呼吸器感染、並びにたとえばオゾンおよび二酸化窒素のような酸化性ガスを包含する。これら「誘発性」引き金は運動、冷気、感情ストレス、薬理学的引き金、刺激剤の吸入を包含する気管支痙攣症状の「興奮性」引き金とは区別することができる。誘発性引き金の一般的特徴は、気道炎症を伴うことである。興奮性引き金は平滑筋収縮（気管支痙攣）を生ぜしめ、これは気道反応性の増大でなく或る程度の過反応性に依存する（Ｄ．Ｗ．コッククロフト、１９９０［４］参照）。
【０００４】
気道炎症が一時的（急性）および永続的な気道過反応性の原因であるという認識は、喘息罹患者の処置に衝撃を与えている。喘息の早期治療は気管支収縮に集中し、多くの有効な気管支拡張剤の開発をもたらしている。最も一般的に処方されるものはβ２−アドレノセプタ作用剤（エピネフィリン、イソプロテレノール、アルブテロール、サルメテロールなど）、キサンチン（カフェイン、テオフィリンなど）およびコリノセプタ拮抗剤（アトロピン、アセチルコリンなど）であった。しかしながら極く最近、抗炎症剤が喘息の最も重要な治療として気管支拡張剤の代替になり始めた。一般的に処方される喘息用の抗炎症剤はジソジウムクロモグリケート（ＤＳＣＧ）、ネドクロミルソジウム、ケトチフェンのような抗ヒスタミン剤およびプレドニゾロンのようなコルチコステロイドを包含する（Ｆ．Ｍ．Ｃ．クス、１９９０［５］およびＰ．Ｍ．オービルネ、１９９０［６］参照）。
【０００５】
喘息における炎症反応は粘膜により覆われた組織に典型的であって血管拡張、血漿滲出、たとえば好中球、単球、大食細胞、リンパ球および好酸球のような炎症性細胞の炎症部位に対する補充および常在性組織細胞（たとえばマスト細胞）による炎症性媒介物の放出または炎症細胞の移動を特徴とする（Ｊ．Ｃ．ホッグ、１９９０ ［７］）。アレルゲン誘発の喘息において、罹患者はしばしばアレルゲンに対する露出に二重の応答を示し、すなわち露出の直後に開始して露出の１〜２時間後まで持続する「早期」反応、およびそれに続く露出後の約３時間で開始して露出後の８〜１０時間もしくはそれ以上にわたりしばしば持続する「後期」反応を示す（Ｄ．Ｗ．コッククロフト、１９９０［４］）。アレルゲン誘発喘息における後期反応および持続性の過反応症は、炎症肺組織への白血球および特に好酸球の補充に関連している（Ｗ．Ｍ．アブラハム等、１９８８［８］）。好酸球は数種の炎症性媒介物、たとえば１５−ＨＥＴＥ、ロイコトリエンＣ４、ＰＡＦ、カチオン性蛋白質、好酸球ペルオキシダーゼを放出することが知られている（Ｋ．Ｆ．チャング、１９９０［９］）。
【０００６】
喘息を処置するため使用される多くの薬剤は、炎症反応を調整する炎症性媒介物の放出の作用を阻止し或いは中和することが判明している。たとえば、β２−アドレノセプタ作用剤およびＤＳＣＧはマスト細胞の有力な安定剤であって、マスト細胞はヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、並びに好中球および好酸球の走化性因子を包含する多くの媒介物を放出することができる。他の例としてはコルチコステロイド、たとえばステロイドホルモンリセプタとの複合体はたとえばリポコルチンのような蛋白質の合成をもたらして抗炎症作用を生ぜしめる（Ｆ．Ｍ．Ｃ．クス、１９９０［５］）。
【０００７】
公知の喘息薬物投与は肺への白血球補充に若干の作用を示すが（Ｗ．Ｍ．アブラハム等、１９９０［８］）、これら薬剤はいずれも炎症組織への白血球の移動を直接阻止するのに有効ではない。
【０００８】
炎症性白血球は、内皮細胞の表面で発現されて白血球表面蛋白もしくは蛋白複合体に対するリセプタとして作用する細胞付着分子によって炎症の部位に補充される。最近、好酸球は血管内皮に対する３種の異なる細胞付着経路に関与して細胞間付着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、内皮細胞付着分子−１（ＥＬＡＭ−１）および血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）を発現する細胞に結合することが判明した（Ｐ．Ｆ．ウェラー等、１９９１［１０］；Ｇ．Ｍ．ワルシュ等、１９９１［１１］；Ｂ．Ｓ．ボホナー等、１９９１［１２］；およびＡ．ドブリナ等、１９９１［１３］）。ＶＣＡＭ１は、好酸球を包含する各種のリンパ細胞で発現されるα４β１ インテグリン、すなわちＶＬＡ−４に結合する（ウェラー等、１９９１［１０］；エリシス等、１９９０［１４］）。好酸球がＶＬＡ−４を発現するという事実は、ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１に結合するがＶＣＡＭ−１には結合しない好中球のような他の炎症細胞から好酸球を区別する。
【０００９】
ＶＬＡ−４媒介の付着経路が喘息モデルで研究されて、炎症肺組織への白血球補充におけるＶＬＡ−４の可能な役割を検討した。今回、抗−ＶＬＡ−４抗体の投与はアレルギー性ヒツジにおける後期反応と気道過反応症との両者を阻止することが突き止められた。驚くことに、抗−ＶＬＡ−４の投与はアレルゲン攻撃誘発の４時間後に肺における好中球および好酸球の両者の個数を、両細胞がこれらを肺組織に補充しうる代替の付着経路を有するとしても減少させた。また驚くことに、処置されたヒツジにおける過反応症の阻止は、好中球および好酸球を含む白血球の浸潤が経時的に顕著には低下しなくても、１週間まで持続することが観察された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要点）
本発明は喘息の新規な処置方法を提供し、さらに喘息の処置に有用な新規な医薬組成物をも提供する。特に本発明は、喘息罹患者に有効量のたとえばモノクローナル抗体ＨＰ１／２のような抗−ＶＬＡ−４抗体を投与する工程からなる方法を提供する。抗−ＶＬＡ−４抗体は慢性アレルゲン誘発喘息を有する患者にインビボで有利に投与され、アレルゲンに対する後期反応を阻止すると共に気道過反応性を軽減させる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 喘息に罹患した哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体からなる組成物を投与することを特徴とする喘息の処置方法。
（項目２） 抗−ＶＬＡ−４抗体組成物を静脈内投与する項目１に記載の方法。
（項目３） 抗−ＶＬＡ−４抗体組成物を吸入によりエアロゾルとして投与する項目１に記載の方法。
（項目４） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５およびＰ４Ｃ２から選択される項目１に記載の方法。
（項目５） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片である項目１に記載の方法。
（項目６） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するような投与量で投与する項目１に記載の方法。
（項目７） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するような投与量にて投与する項目６に記載の方法。
（項目８） 組成物を、少なくとも１０μｇ／ｍｌの哺乳動物における抗体の血漿レベルを与えるのに有効な量で投与する項目１に記載の方法。
（項目９） 組成物を、喘息罹患者が過敏性であるアレルゲンに露呈する前に投与する項目１に記載の方法。
（項目１０） 哺乳動物がヒトである項目１に記載の方法。
（項目１１） 組成物を、哺乳動物が過敏性であるアレルゲンに露呈した後に投与する項目１に記載の方法。
（項目１２） アレルギー性喘息に罹患した哺乳動物に対し抗体、組換抗体、キメラ抗体、これら抗体の断片、ＶＬＡ−４のα４サブユニットに結合しうるポリペプチドもしくは小分子または前記したこれらの組合せ物を、罹患者が過敏性であるアレルゲンに対する後期反応を阻止しまたはアレルゲン攻撃誘発の後の前記哺乳動物にて気道過敏症を減少させるのに有効な量で投与することを特徴とする喘息の処置方法。
（項目１３） 抗体、ポリペプチドもしくは分子がモノクローナル抗体ＨＰ１／２；この種の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２もしくはＦ（ｖ）断片；可溶性ＶＣＡＭ−１ポリペプチド；またはＶＬＡ−４のＶＣＡＭ−１結合性ドメインに結合する小分子から選択される項目１２に記載の方法。
（項目１４） 組成物が複数の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体またはそのＶＬＡ−４結合性断片からなる項目１２に記載の方法。
（項目１５） 組成物が抗−ＶＬＡ−４の他に抗−ＥＬＡＭ−１抗体もしくは抗−ＩＣＡＭ−１抗体または抗−ＥＬＡＭ−１抗体と抗−ＩＣＡＭ−１抗体との両者を含む項目１２に記載の方法。
（項目１６） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片である項目１２に記載の方法。
（項目１７） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を供給するような投与量にて投与する項目１２に記載の方法。
（項目１８） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を供給するような投与量にて投与する項目１７に記載の方法。
（項目１９） 組成物を、７日間にわたり少なくとも１０μｇ／ｍｌの哺乳動物における抗体の血漿レベルを与えるのに有効な量で投与する項目１２に記載の方法。
（項目２０） 喘息症の哺乳動物における後期反応を軽減させ、またはその気道過敏症を顕著に減少させるのに有効な医薬組成物であって、医薬上許容しうるキャリヤ中で実質的にＶＬＡ−４を認識するモノクローナル抗体よりなる医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、二重応答アレルギー性ヒツジにおいてアレルゲン（アスカリス・スウム抗原）に対する反応に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の作用を示すグラフである。比肺抵抗（ＳＲＬ）における変化％をアレルゲン攻撃誘発の後に経時的に測定する。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図２】図２は、最初に投与してから経時的に測定したヒツジにおけるモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の血漿濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、二重応答ヒツジにおける気道過反応性に対するモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の効果を示すグラフである。１％（重量／容量）カルバコール溶液（公知の気管支収縮剤）（これは希釈剤のみを用いて得られる数値よりも比肺抵抗を４００％増大させる）の積算呼吸数における呼吸単位（ＢＵ）で測定した気道反応性を示す。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図４】図４（第４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ図を含む）は、アスカリス・スウム抗原のみを投与したアレルギー性ヒツジおよびモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）で予備処置した後のアレルギー性ヒツジにおける気管支肺胞洗浄により検出された全細胞数（第４Ａ図）、並びに異なる白血球（リンパ球（第４Ｂ図）、好中球（第４Ｃ図）および好酸球（第４Ｃ図））のレベルを示す一連の４種のグラフである。全細胞およびリンパ球もしくは好中球もしくは好酸球であった全細胞の比率をアレルゲン攻撃誘発の４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後および１週間後の時点で測定した。
【図５】図５は、二重応答アレルギー性ヒツジにおけるアレルゲン（アスカリス・スウム抗原）に対する反応に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（１６ｍｇ、エアロゾル）および１Ｅ６（１６ｍｇ、エアロゾル）の効果を示すグラフである。比肺抵抗（ＳＲＬ）における変化％をアレルゲン攻撃誘発の後に経時的に測定した。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図６】図６は、二重応答ヒツジにおける気道過反応性に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（１６ｍｇ、エアロゾル）および１Ｅ６（１６ｍｇ、エアロゾル）の効果を示すグラフである。１％（重量／容量）カルバコール溶液（公知の気管支収縮剤）（これは希釈剤のみを用いて得られる数値よりも比肺抵抗を４００％増大させる）の積算呼吸数における呼吸単位（ＢＵ）で測定した気道反応性を示す。星印は統計的に有意な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
モノクローナル抗体を産生する技術は周知である。要するに、不死細胞ライン（典型的には骨髄腫細胞）を所定の抗原（たとえばＶＬＡ−４）を発現する全細胞で免疫化した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄液を抗原に対する抗体につきスクリーニングする（一般にコーラー等、１９７５［１５］参照）。
【００１３】
免疫化は標準的方法を用いて行なうことができる。単位投与量および免疫化方式は、免疫化される哺乳動物の種類、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型的には免疫化された哺乳動物を出血させ、各血液試料からの血清を適するスクリーニング分析により特定の抗体につき分析する。たとえば抗−ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４−発現性細胞からの１２５Ｉ標識細胞溶解物の免疫沈澱により同定することができる（サンチェズ・マドリッド等、１９８６［１６］およびヘムラー等、１９８７［１７］）。さらに抗−ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４を認識すると思われる抗体と共にインキュベートしたＲａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定することによりフロー・サイトメトリーによっても同定することができる （エリシス等、１９９０［１４］参照）。ハイブリドーマ細胞の産生に用いられるリンパ球は典型的には、この種のスクリーニング分析を用いて抗−ＶＬＡ−４抗体の存在につき陽性と既に試験された血清を有する免疫化された哺乳動物から分離される。
【００１４】
典型的には、不死細胞ライン（たとえば骨髄腫細胞ライン）はリンパ球と同じ種類の哺乳動物から得られる。好適な不死細胞ラインはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞ラインである。
【００１５】
典型的にはＨＡＴ−感受性のマウス骨髄腫細胞を、分子量１５００のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ １５００」）を用いてマウス脾細胞に融合させる。次いで、融合から得られるハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択し、この培地は未融合および非産生融合の骨髄腫細胞を死滅させる（未融合の脾細胞は形質転換されないので数日間後に死滅する）。所望の抗体を産生するハイブリドーマをハイブリドーマ培養上澄液をスクリーニングして検出する。たとえば抗−ＶＬＡ−４抗体を産生すべく作成したハイブリドーマは、たとえばトランスフェクトされたＫ−５６２細胞のような組換α４サブユニット−発現性細胞ラインに結合する能力を持った分泌抗体につきハイブリドーマ培養上澄液を試験してスクリーニングすることができる（エリシス等［１４］参照）。
【００１６】
抗−ＶＬＡ−４抗体を産生させるには、この種のスクリーニング分析にて陽性と試験されたハイブリドーマ細胞を、これらハイブリドーマ細胞によりモノクローナル抗体を培地中へ分泌させるのに充分な条件および時間にて栄養培地で培養した。ハイブリドーマ細胞に適する組織培養技術および培地は周知されている。細胞を除いたハイブリドーマ培養上澄液を集め、抗−ＶＬＡ−４抗体を必要に応じさらに周知方法で精製することができる。
【００１７】
或いは、ハイブリドーマ細胞を未免疫化マウスの腹腔内に注射して所望の抗体を産生させることもできる。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖して抗体を分泌し、この抗体は腹液として蓄積する。この抗体を、腹腔内から注射器により腹液を抜取って回収することができる。
【００１８】
数種の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が従来記載されている（たとえばサンチェズ−マドリッド等、１９８６［１６］；ヘムラー等、１９８７［１７］；プリド等、１９９１［１９］参照）。ここの実験ではＨＰ１／２と称する抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体（バイオジェン・インコーポレーション社・ケンブリッジ、ＭＡから入手）を使用した。抗−ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２の重鎖および軽鎖の可変領域はクローン化され、配列決定され、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域と組合せて発現されている。この種のキメラＨＰ１／２抗体はネズミＨＰ１／２抗体に特異性および能力において類似し、本発明による処置方法に有用である。同様に、人間適合させた組換抗−ＶＬＡ−４抗体もこれら方法に有用である。ＨＰ１／２ ＶＨ ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示す。ＨＰ１／２ ＶＫ ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示す。
【００１９】
たとえばＨＰ１／２のようなモノクローナル抗体およびＶＬＡ−４のα鎖を認識しうる他の抗−ＶＬＡ−４抗体（たとえばＭＡｂ ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５、Ｐ４Ｃ２）が本発明に有用である。抗体はＶＬＡ−α４鎖のＢ１もしくはＢ２エピトープを認識することが特に好ましい（プリド等、１９９１［１９］参照）。特定の理論に拘束されるものでないが、本発明の方法に使用される抗−ＶＬＡ−４抗体はアレルゲン攻撃誘発の後の少なくとも最初の期間にわたり肺の炎症部分へのＶＬＡ−４発現性リンパ球の移動を特異的に阻止することができる。ＶＬＡ−４白血球移動の阻止は次いで白血球浸潤の病理学的二次作用、たとえば毒性物質の放出、可溶性炎症細胞媒介物の誘発、白血球走化性作用剤（たとえば好中球走化性因子）の誘発などを防止する。その結果、アレルゲンに対する後期反応および気道の持続過敏性を軽減することができる。或いは、抗−ＶＬＡ−４抗体は炎症媒介物および／または細胞走化性作用剤の放出に必要な信号導入を軽減することができる。
【００２０】
本発明の方法は、アレルギー性喘息に罹患した哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体からなる組成物を投与することを特徴とする。下記する実施例は喘息ヤギで観察された結果を示す。しかしながら、ヤギとヒトとの間における生理学的反応および薬理学的作用の類似性が記載されており（たとえばＷ．Ｍ．アブラハム、１９８９［２０］参照）、さらにヤギと他の動物との喘息モデル（ウサギ、リスザル、モルモットおよび感作したイヌ）の間における類似性も記載されている（たとえばＷ．Ｍ．アブラハム等、１９８８［８］参照）。したがって、ここで報告する結果はアレルギー性喘息に罹患した人間を含む任意の哺乳動物に適切かつ適用され、本発明の方法はこれらに有用である。
【００２１】
本発明により投与される抗−ＶＬＡ−４抗体は、喘息誘発性アレルゲンに露呈する前に予防投与することができる。さらに、抗体をアレルゲン露呈の時点もしくはその直後、後期反応の程度を軽減させる早期反応と後期反応との間、或いは気道過反応性を減少もしくは除去するアレルゲン露呈後の任意の時点で投与すれば有利な作用が得られる。
【００２２】
抗−ＶＬＡ−４抗体は、抗−ＶＬＡ−４抗体と医薬上許容しうるキャリヤとから組成物として投与することができる。好ましくは、組成物は静脈内注射に適する形態である。さらに、無菌の水溶液または燐酸塩緩衝塩水溶液の形態の抗体組成物も考えられ、例えば吸入器により噴霧され喘息罹患者が肺中へ直接に吸入することができる。投与量は特定アレルゲンに対する喘息罹患者の感受性、露呈時のアレルゲン濃度および露呈の頻度／持続時間、提案される投与方式（たとえば注射もしくは吸入）、所望の抗体の血漿レベル、特定抗体の効果または気道反応性を抑制する抗体の組合せ、抗体組成物の消失速度もしくは半減期、並びにアレルギー性喘息の処置を経験した医者に熟知される他の因子に応じて変化する。一般に、投与量は１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲に抗体の血漿レベルを維持するよう計算かつ調整されるが、それより高いもしくは低い投与量も患者の年齢、感受性、耐性および他の特性、炎症の急激性、病気の履歴および過程、並びに担当医により日常的に考慮される同様な因子を考えて可能である。用いる抗体の効能および半減期に応じ、処置を受ける患者の体重に対し約０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体、特に好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体を使用するのが好適である。
【００２３】
適する医薬キャリヤは、たとえば無菌の塩水および生理学的緩衝溶液を包含する。吸入投与には燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）が好適である。医薬組成物はさらに、活性成分の放出を調節し或いは患者体内におけるその存在を長期化させるよう処方することもできる。多数の適する薬物放出系がこの目的で知られており、たとえばヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小球などを包含する。
【００２４】
さらに本発明の目的には、ＶＬＡ−４のα４ サブユニットに結合しうる抗体を用いねばならないことも認識されよう。モノクローナル抗体を使用するのが好適である。
【００２５】
天然産の抗体の他に、代案としてＶＬＡ−４に結合しうる適する組換抗体も使用することができる。この種の組換抗体は、組換ＤＮＡ技術により産生される抗体、たとえば宿主細胞を所望抗体の免疫グロブリン軽および重鎖をコードするＤＮＡを含有した適する発現ベクターで形質転換させて産生させた抗体、並びに抗−ＶＬＡ−４抗体の重鎖および／または軽鎖のヒンジおよび定常領域の幾つかまたは全部が、異なる種の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応領域で置換されている組換キメラ抗体を用いることもできる（すなわち、好ましくは投与抗体に対する免疫反応を最小化させるため処置される喘息罹患者と同じ種のもの）（たとえばＰ．Ｔ．ジョーンズ等、１９８６ ［２１］；Ｅ．Ｓ．ワード等、１９８９［２２］および米国特許第４，８１６，３９７号（ボス等）［２３］参照、これら全てを参考のためここに引用する）。
【００２６】
さらに、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２およびＦ（ｖ）断片のような抗−ＶＬＡ−４抗体のＶＬＡ−４結合性断片；重鎖モノマーもしくはダイマー；軽鎖モノマーもしくはダイマー；並びに１個の重鎖と１個の軽鎖とよりなるダイマーもここで考えられる。この種の抗体断片は化学法により、たとえば完全抗体をたとえばペプシンもしくはパパインのようなプロテアーゼで切断させるか、或いは組換ＤＮＡ技術により、たとえば端を切取った重鎖および／または軽鎖遺伝子により形質転換された宿主細胞を用いて産生させることもできる。重鎖および軽鎖モノマーも同様に、完全抗体をたとえばジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）もしくはβ−メルカプトエタノールのような還元剤で処理して、或いは所望の重鎖もしくは軽鎖またはその両者をコードするＤＮＡで形質転換された宿主を用いて産生することができる。
【００２７】
さらに上記の検討から明らかなように、ＶＬＡ−４−媒介結合を阻止またはブロックする他のポリペプチドおよび分子も、抗−ＶＬＡ−４抗体と同様に喘息の処置に有効である。たとえば、ＶＣＡＭ−１（ＶＬＡ−４の内皮細胞リセプタ）の可溶型またはその断片を投与して、ＶＬＡ−４結合部位に競合させることにより抗ＶＬＡ−４抗体の投与と同様な作用を得ることもできる。たとえばＶＬＡ−４−リガンドの結合ドメインを模倣すると共にＶＬＡ−４のリセプタドメインに適合する、たとえばオリゴ糖のような小分子も用いることができる（Ｊ．Ｊ．デブリン等１９９０［２４］；Ｊ．Ｋ．スコットおよびＧ．Ｏ．スミス、１９９０［２５］、並びに米国特許第４，８３３，０９２号（ゲイセン）［２６］参照、これら全てを参考のためここに引用する）。アレルギー患者における後期反応または気道過反応性を効果的に阻止するＶＬＡ−４結合性ポリペチチドもしくは分子の使用がここでは喘息を処置するための代案法として考えられる。
【００２８】
さらに、抗−ＶＬＡ−４抗体を気道反応性に対し治療効果を有する他の抗体と組合せて使用することも考えられる。たとえば、ここに報告した有利な作用がＶＣＡＭ−１−発現性内皮細胞に対する白血球補充の阻止に基づく程度に応じて、抗−ＶＬＡ−４抗体と、白血球抗原と内皮細胞リセプタ分子との間の付着を阻害する他の抗体との組合せが有利である。たとえば本発明による抗−ＶＬＡ−４抗体を使用する他、抗−ＥＬＡＭ−１および／または抗−ＩＣＡＭ−１の抗体の使用も有利である（グンデル等、１９９１［２７］；ウェグナー等、１９９０［２８］参照）。
【００２９】
適するビヒクルにて処方すれば、ここで考えられる医薬組成物はたとえば経口的、食道内もしくは鼻腔内、気管支内（局部処置、たとえば気管支鏡を介する）により、さらに皮下、筋肉内、静脈内、動脈内もしくは非経口的に任意適する手段で投与することができる。通常の吸入を介する投与が好適である。
【実施例】
【００３０】
実施例
アブラハム等［８］により実質的に記載されたように実験を行なった。要するに、アスカリス・スウム抽出物（グリアー・ダイアグノスチックス社、レノワ、ＮＣ）の１：１０００もしくは１：１０，０００希釈物に対する天然のアレルギー皮膚反応を有するアレルギー性ヒツジを試験し、アスカリス・スウム抗原による吸入攻撃誘発に対し早期および後期気道反応（「二重応答」）を示すヒツジを選択した。気道における呼吸メカニクスおよび物理的変化を測定するため、ヒツジを頭を固定した俯位に拘束した。バルーンカテーテルを食道下側に対する２％リドカイン溶液での局部麻酔下で一方の鼻腔中に前進させると共に、拘束した気管内チューブを他方の鼻腔中に前進させ（可撓性の光学繊維気管支鏡を案内として用いる）、エアロゾル攻撃誘発に際し気道メカニクスを測定した。胸膜圧を、胃食道接合部から５〜１０ｃｍに位置せしめた食道バルーンカテーテル（１ｍｌの空気を充填）で推定した。この位置にて、末端呼吸胸膜圧は−２〜−５ｃｍＨ２Ｏの範囲であった。バルーンを設置した後、これを実験の持続時間にわたり所定位置に留めるよう固定した。気管における側圧を横穴カテーテル（内径２．５ｍｍ）で測定し、このカーテルを気管内チューブの先端に対し遠位方向に前進させて設置した。経肺圧（気管圧と胸膜圧との間の圧力差）を差圧トランスジューサ・カテーテルシステム（ＭＰ４５、バリダイン、ノースリッジ、ＣＡ）で測定した。圧力トランスジューサ・カテーテルシステムは、周波数９Ｈｚに対する圧力と流動との間の相変化を示さなかった。気管内チューブの近位端部をフライヒ・ニューモタコグラフ（ダイナ・サイエンシス社、ブルー・ベル、ＰＡ）に接続することにより肺抵抗（ＲＬ）を測定した。流動圧および経肺圧を示す信号をオシロスコープ記録計（モデルＤＲ−１２型；エレクトロニクス・フォー・メディスン社、ホワイト・プレイン、ＮＹ）に記録し、この記録計を経胸圧、呼吸容量（デジタル積算により得られる）および中間容積技術による流動からの胸抵抗（ＲＬ）を５〜１０回の呼吸により分析して自動計算するコンピュータに連結した。胸部ガス容積（Ｖｔｇ）を、一定容積の人体プレチスモグラフにおけるＲＬの測定の直後に測定した。比肺抵抗 （ＳＲＬ ）をこれら数値から計算した（ＳＲＬ ＝Ｖｔｇ×ＲＬ）。
【００３１】
吸入カルバコールに対する投与量反応曲線を、作成して気道反応性を決定した。投与量反応曲線を緩衝液（ＰＢＳ）単独の吸入直後およびＰＢＳ中にてカルバコールの濃度を増大させた１０回の呼吸の各連続投与の後に採取したＳＲＬの測定値を用いてプロットした。カルバコールの濃度はＰＢＳ中で０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％および４．０％ｗ／ｖとした。ＳＲＬ がＰＢＳ値から４００％を越えて上昇した際または最高のカルバコール濃度が投与された後に、刺激試験を中止した。気道反応性を、投与量反応曲線から後緩衝値を４００％越える比肺抵抗（ＰＤ４００％）に増大する呼吸単位（ＢＵ）における積算カルバコール量を計算することにより決定した。１呼吸単位は、１％ｗ／ｖカルバコール溶液の１呼吸として規定した。すなわち、気道過反応性の抑制が大きいほど、対照で見られると同じ気管支収縮を観察する前に必要とされる呼吸単位数が大となる。
【００３２】
各ヒツジを対照試験にかけ、ここではプラシーボ（添加剤なしのＰＢＳ）を３０分間にわたり予備処理として用いた後、アスカリス・スウム抗原（グリア・ダイアグノスティックス社、レノワ、ＮＣ）でアレルゲン攻撃誘発した。次いで、このヒツジを同一の試験にかけたが、ただし１ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体ＨＰ１／２を各ヒツジに抗原攻撃誘発の３０分間前に投与した。プラシーボ（緩衝剤対照またはアイソトープ適合の抗体（１Ｅ６、抗−ＬＦＡ３）対照）およびＨＰ１／２組成物を静脈内注射により投与した。ＨＰ１／２組成物（および１Ｅ６対照）は、ハイブリドーマ（バイオジェン・インコーポレーション社、ケンブリッジ、ＭＡ）から入手した純抗体を無菌の内生毒素フリーのＰＢＳに希釈すると共に各ヒツジの体重に対し１ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するよう調整して作成した。抗原溶液を使い捨て薬用ネブライザ（レインドロップ（登録商標）、ピューリタン・ベネット社、レネクサ、ＫＳ）を用いエアロゾルとして供給し、このネブライザはエアロゾルをアンダーセン・カスケード・インパクタにより測定して３．２μＭ（幾何学的ＳＤ１．９）の質量平均空気力学直径を有するエアロゾルを与えた。アスカリス・スウム抽出物をＰＢＳで８２，０００蛋白質窒素単位（ＰＮＵ）／ｍｌの濃度まで希釈した。ネブライザの出口をプラスチックＴ管に指向させ、その１端部をハーバード・レスピレータの吸入口に接続した。電磁弁と２０ｐｓｉ圧縮空気源とよりなるネブライザおよび電磁弁に接続された投与計を、ハーバード・レスピレータの吸入サイクルの開始時点で１秒間作動させた。エアロゾルは波状で５００ｍｌ容積を毎分２０回の呼吸速度で２０分間にわたり供給した。各ヒツジは同等量の抗原（４００回の呼吸）で対照およびＨＰ１／２の試験につき攻撃誘発した。さらに、投与量反応曲線につきカルバコールエアロゾルを上記のネブライザにより発生させた。
【００３３】
細胞分析のため、気管支肺胞洗浄（ＢＬＡ）を各ヒツジにつき行なった。特殊設計した８０ｃｍの光学繊維気管支鏡の遠位端部を、ランダム選択された気管支サブセグメントに緩徐に挿入した。肺洗浄を３×３０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を３９℃にて緩和に吸引して行ない、その際気管支鏡の操作チャンネルに接続した３０ｍｌの注射器を用いた。洗浄戻り液を集め、ガーゼに通過させて粘液を除去し、次いで４２０×ｇにて１５分間遠心分離した。上澄液をデカントし、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。懸濁物の１部を血液計チャンバに移して全細胞を推定した。生存の全細胞をトリパンブルー排除により推定した。第２の細胞懸濁物部分を細胞分離器（１０分間にわたり６００ｒｐｍ）にて遠心分離し、ライト・ギエムサ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）で染色し、１００倍で観察して細胞集団を確認した。スライド１枚当り５００個の細胞が、細胞数差を確認すべく特性化された。特性化した細胞は表皮細胞、大食細胞、好塩基球、単球および未同定細胞（「その他」と名付ける種類に分類）とをリンパ球、好中球および好酸球の他に含んだ。
【００３４】
抗体および白血球のカウント数の血漿レベルを末梢脚静脈もしくは頸静脈からの静脈血試料（約５ｍｌ）から決定した。
【００３５】
実施例１
８匹の二重応答アレルギー性ヒツジを用いる気道攻撃誘発試験を上記手順にしたがって行なった。基線（ＢＳＬ）気道反応性（ＰＤ４００％）を抗原攻撃誘発の２〜３日前に確立し、基線気管肺胞洗浄（ＢＡＬ）を攻撃誘発の１日前に行なった。攻撃誘発の当日、比肺抵抗（ＳＲＬ）の基線値を測定し、次いでヒツジに緩衝剤（対照）またはＨＰ１／２を注射により投与した。この最初の投与（「処理」）の後、ＳＲＬ を測定し、処理の３０分間後にヒツジをアスカリス・スウム抗原で攻撃誘発した。ＳＲＬを攻撃誘発の直後、攻撃誘発してから１〜６時間にわたり毎時間、６．５〜８時間の範囲で３０分間毎、並びに抗原攻撃誘発してから２４時間、４８時間および１週間（すなわち１６８時間）の後に測定した。ＢＡＬはＳＲＬ測定の後に４時間、８時間、２４時間および４８時間、並びに１週間にて行なった。これらの試験にて末梢血液を抜取り、全白血球のカウント数および細胞集団の測定を処理前（基線）、攻撃誘発の直後、並びに攻撃誘発してから１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、２４時間および４８時間、並びに１週間の後に行なった。この試験の結果を図面に示す： 第１図は、検体ヒツジにおける抗原誘発の気道反応に対するＨＰ１／２処理の効果を示す。ＨＰ１／２の処理は、対照により示される後期反応の顕著な阻止（実質的に完全）を与えた。
【００３６】
第２図は、抗原攻撃誘発の直後および次いで攻撃誘発の１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、２４時間および４８時間の後に測定した処理検体におけるＨＰ１／２の血漿濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。均衡化した後、抗体濃度は約２０μｇ／ｍｌの濃度に落ち着き、この濃度は４８時間の時点まで維持された。
【００３７】
第３図は、気道反応性に対するＨＰ１／２の処理の効果を示すグラフである。抗原攻撃誘発の２４時間、４８時間および１週間の後、処理された検体は気道反応性の顕著な減少を示した。抗原攻撃誘発の２週間後においてさえ、処理された検体は気道反応性の減少を示し続けた。抗体の実質的に完全な阻止効果が１週間まで持続するという事実は特に驚異的であり、処理の治療価値の点で有望である。
【００３８】
第４図は、抗原攻撃誘発の４時間、８時間、２４時間および４８時間後、並びに抗原攻撃誘発の１週間後に行なったＢＡＬの結果を示す一連のグラフである。結果は、処理検体から回収された全細胞にて、対照と対比し顕著な変化を示さない。しかしながら、処理検体は、攻撃誘発してから４時間後の時点にて好中球および好酸球の両者レベルの減少を示した。抗−ＶＬＡ−４の投与が好中球の補充に影響を与えない、何故なら好中球はＶＬＡ−４を発現しないからと予想すると、これは若干驚異的である。さらに、好中球と好酸球との両者は内皮に対する付着に関与する他のリガンドを発現し、両種の細胞はＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１経路およびＣＤＸ／ＥＬＡＭ−１経路を介し内皮細胞に結合することが示されている。
【００３９】
抗−ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２による同様な治療効果が、検体をＨＰ１／２抗体により抗原攻撃誘発の２時間後に処置した際にも観察され、これは上記したように攻撃誘発の３０分間前と対比される。ＨＰ１／２の効果は投与量依存性であった。たとえば、投与量を０．２ｍｇ／ｋｇまで減少させれば、後期反応に対する保護は充分でなかった。１Ｅ６（抗−ＬＦＡ３）をアイソトープ適合対照抗体としてＨＰ１／２の処理に用いた抗原攻撃誘発試験に関し、早期反応もしくは後期反応に対する効果は対照試験で１Ｅ６を用いて観察されなかった。１Ｅ６抗体を産生する１Ｅ６−２Ｃ１２ハイブリドーマ細胞ラインはＡＴＣＣ ＨＢ １０６９３として寄託されている。
【００４０】
実施例２
抗体のエアロゾル供給の効能を検討するため次の実験を行なった。試験は上記と実質的に同様に行なったが、ただし２匹のヒツジを用いると共にＨＰ１／２をエアロゾルとしてネブライザを介し供給した（投与量＝動物１匹当り８ｍｇのＨＰ１／２、抗原攻撃誘発の３０分間前に投与）。
【００４１】
対照ヒツジ（プラシーボを投与）において後期反応は基線値の１２６％というＳＲＬの平均上昇を特徴とするのに対し、ヒツジを抗−ＶＬＡ−４抗体で処理すればＳＲＬ の平均上昇は基線の２６％であった。これらの結果は後期反応の約８０％阻止に相当する。これら結果はさらに、２４時間における気道反応性の約７０％阻止を示した。この試験から明らかなように、抗体の吸入供給を用いて本発明の利点を得ることができる。
【００４２】
これらデータを、ＨＰ１／２（ｎ＝５）もしくは１Ｅ６（ｎ＝４）の１６ｍｇ／ｋｇエアロゾル投与量を用いて確認し、対照（アイソタイプ適合１Ｅ６（抗−ＬＦＡ３）抗体対照）と共に５匹のヒツジに拡大した。第５図および第６図は、抗原攻撃誘発を行なう３０分間前のこの投与量におけるＨＰ１／２エアロゾルでの処理が後期反応および気道過反応性を阻止するにも有効であることを示す。ＨＰ１／２エアロゾル処理は、１Ｅ６対照により経験される後期反応の顕著（実際には、実質的に完全）な阻止を与えた。１Ｅ６エアロゾル処理は効果がなかった。匹敵する保護は静脈内試験およびエアロゾル試験の両者で達成されたが、エアロゾル試験においてＨＰ１／２により与えられる保護は検出しうる薬剤の血中レベルなしに達成された。ＨＰ１／２のこの効果は、同じ投与量の１Ｅ６が保護作用を示さないので特異的である（たとえば１Ｅ６で処理された動物はＰＣ４００にて顕著な低下を示したのに対し、ＨＰ１／２はこの作用を阻止した）。ＨＰ１／２と１Ｅ６との間の生理学的反応における差は、これら群における全ＷＢＣの欠如またはカウント差の結果ではない。全ＷＢＣおよびＨＰ１／２と１Ｅ６との群における差は、静脈内試験で見られたと同様な反応のパターンを示した。
【００４３】
以上本発明の方法を実施例として示したが、これらは決して本発明を限定するものでない。上記の開示から当業者には多くの改変が可能であることも明らかであろう。たとえば、用いる実際の投与量、用いる抗体もしくは抗体断片の種類、投与方式、正確な組成、処置の投与時間および投与方式、並びに多くの他の特徴は全て本発明の思想および範囲を逸脱することなく改変することが可能である。
【００４４】
（引用刊行物）
【００４５】
（配列表）
【技術分野】
【０００１】
本発明は喘息の処置に関するものである。より詳細には本発明は、喘息の処置におけるベリーレイト抗原−４（Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４）（ＶＬＡ−４）、すなわち内皮細胞リセプタ血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）のための或る種の白血球におけるリガンドを認識する抗体の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
喘息は広範な可逆性気道狭窄（気管支収縮）および各種の刺激に対する気道の過敏性増大（過反応症）を特徴とする気道の症状である。喘息の周知された徴候、たとえば咳、喘鳴、胸詰、呼吸困難は気道平滑筋の収縮、気管支粘液分泌の増加および炎症によって生ずる。殆ど致命的でないが、喘息は世界中の学齢児童の１０〜２０％を占めると推定され、小児喘息の病院収容が近年劇的に増大しており、米国の１調査が示すところでは喘息を有する１５才未満の児童の病院収容は少なくとも１９７０年から１９８４年の間に少なくとも１４５％増大している（Ｍ．Ｒ．シアーズ、１９９０［１］参照）。全体として、１，０００万人のアメリカ人（人口の４％）が喘息を有すると推定され、約４０億ドルがその処置に毎年費やされている（Ｌ．Ｋ．アルトマン、１９９１［２］；Ｃ．スタール、１９９１［３］）。
【０００３】
喘息の原因は完全には理解されていないが、急性喘息症状を引き起こす薬剤の研究は、喘息が個人の環境における特定アレルゲンに対し反応する個人の免疫学的反応であるという理論を支持している。これらの「引き金」は、気道過反応性の一時的増大を引き起こすことにより喘息を悪化させる。気道過反応性を誘発することが判明している引き金はアレルゲン吸入、個人が敏感になっている（たとえば職業的露呈による）低分子量物質の吸入、ウィルス性もしくはマイコプラズマ性呼吸器感染、並びにたとえばオゾンおよび二酸化窒素のような酸化性ガスを包含する。これら「誘発性」引き金は運動、冷気、感情ストレス、薬理学的引き金、刺激剤の吸入を包含する気管支痙攣症状の「興奮性」引き金とは区別することができる。誘発性引き金の一般的特徴は、気道炎症を伴うことである。興奮性引き金は平滑筋収縮（気管支痙攣）を生ぜしめ、これは気道反応性の増大でなく或る程度の過反応性に依存する（Ｄ．Ｗ．コッククロフト、１９９０［４］参照）。
【０００４】
気道炎症が一時的（急性）および永続的な気道過反応性の原因であるという認識は、喘息罹患者の処置に衝撃を与えている。喘息の早期治療は気管支収縮に集中し、多くの有効な気管支拡張剤の開発をもたらしている。最も一般的に処方されるものはβ２−アドレノセプタ作用剤（エピネフィリン、イソプロテレノール、アルブテロール、サルメテロールなど）、キサンチン（カフェイン、テオフィリンなど）およびコリノセプタ拮抗剤（アトロピン、アセチルコリンなど）であった。しかしながら極く最近、抗炎症剤が喘息の最も重要な治療として気管支拡張剤の代替になり始めた。一般的に処方される喘息用の抗炎症剤はジソジウムクロモグリケート（ＤＳＣＧ）、ネドクロミルソジウム、ケトチフェンのような抗ヒスタミン剤およびプレドニゾロンのようなコルチコステロイドを包含する（Ｆ．Ｍ．Ｃ．クス、１９９０［５］およびＰ．Ｍ．オービルネ、１９９０［６］参照）。
【０００５】
喘息における炎症反応は粘膜により覆われた組織に典型的であって血管拡張、血漿滲出、たとえば好中球、単球、大食細胞、リンパ球および好酸球のような炎症性細胞の炎症部位に対する補充および常在性組織細胞（たとえばマスト細胞）による炎症性媒介物の放出または炎症細胞の移動を特徴とする（Ｊ．Ｃ．ホッグ、１９９０ ［７］）。アレルゲン誘発の喘息において、罹患者はしばしばアレルゲンに対する露出に二重の応答を示し、すなわち露出の直後に開始して露出の１〜２時間後まで持続する「早期」反応、およびそれに続く露出後の約３時間で開始して露出後の８〜１０時間もしくはそれ以上にわたりしばしば持続する「後期」反応を示す（Ｄ．Ｗ．コッククロフト、１９９０［４］）。アレルゲン誘発喘息における後期反応および持続性の過反応症は、炎症肺組織への白血球および特に好酸球の補充に関連している（Ｗ．Ｍ．アブラハム等、１９８８［８］）。好酸球は数種の炎症性媒介物、たとえば１５−ＨＥＴＥ、ロイコトリエンＣ４、ＰＡＦ、カチオン性蛋白質、好酸球ペルオキシダーゼを放出することが知られている（Ｋ．Ｆ．チャング、１９９０［９］）。
【０００６】
喘息を処置するため使用される多くの薬剤は、炎症反応を調整する炎症性媒介物の放出の作用を阻止し或いは中和することが判明している。たとえば、β２−アドレノセプタ作用剤およびＤＳＣＧはマスト細胞の有力な安定剤であって、マスト細胞はヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、並びに好中球および好酸球の走化性因子を包含する多くの媒介物を放出することができる。他の例としてはコルチコステロイド、たとえばステロイドホルモンリセプタとの複合体はたとえばリポコルチンのような蛋白質の合成をもたらして抗炎症作用を生ぜしめる（Ｆ．Ｍ．Ｃ．クス、１９９０［５］）。
【０００７】
公知の喘息薬物投与は肺への白血球補充に若干の作用を示すが（Ｗ．Ｍ．アブラハム等、１９９０［８］）、これら薬剤はいずれも炎症組織への白血球の移動を直接阻止するのに有効ではない。
【０００８】
炎症性白血球は、内皮細胞の表面で発現されて白血球表面蛋白もしくは蛋白複合体に対するリセプタとして作用する細胞付着分子によって炎症の部位に補充される。最近、好酸球は血管内皮に対する３種の異なる細胞付着経路に関与して細胞間付着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、内皮細胞付着分子−１（ＥＬＡＭ−１）および血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）を発現する細胞に結合することが判明した（Ｐ．Ｆ．ウェラー等、１９９１［１０］；Ｇ．Ｍ．ワルシュ等、１９９１［１１］；Ｂ．Ｓ．ボホナー等、１９９１［１２］；およびＡ．ドブリナ等、１９９１［１３］）。ＶＣＡＭ１は、好酸球を包含する各種のリンパ細胞で発現されるα４β１ インテグリン、すなわちＶＬＡ−４に結合する（ウェラー等、１９９１［１０］；エリシス等、１９９０［１４］）。好酸球がＶＬＡ−４を発現するという事実は、ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１に結合するがＶＣＡＭ−１には結合しない好中球のような他の炎症細胞から好酸球を区別する。
【０００９】
ＶＬＡ−４媒介の付着経路が喘息モデルで研究されて、炎症肺組織への白血球補充におけるＶＬＡ−４の可能な役割を検討した。今回、抗−ＶＬＡ−４抗体の投与はアレルギー性ヒツジにおける後期反応と気道過反応症との両者を阻止することが突き止められた。驚くことに、抗−ＶＬＡ−４の投与はアレルゲン攻撃誘発の４時間後に肺における好中球および好酸球の両者の個数を、両細胞がこれらを肺組織に補充しうる代替の付着経路を有するとしても減少させた。また驚くことに、処置されたヒツジにおける過反応症の阻止は、好中球および好酸球を含む白血球の浸潤が経時的に顕著には低下しなくても、１週間まで持続することが観察された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要点）
本発明は喘息の新規な処置方法を提供し、さらに喘息の処置に有用な新規な医薬組成物をも提供する。特に本発明は、喘息罹患者に有効量のたとえばモノクローナル抗体ＨＰ１／２のような抗−ＶＬＡ−４抗体を投与する工程からなる方法を提供する。抗−ＶＬＡ−４抗体は慢性アレルゲン誘発喘息を有する患者にインビボで有利に投与され、アレルゲンに対する後期反応を阻止すると共に気道過反応性を軽減させる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 喘息に罹患した哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体からなる組成物を投与することを特徴とする喘息の処置方法。
（項目２） 抗−ＶＬＡ−４抗体組成物を静脈内投与する項目１に記載の方法。
（項目３） 抗−ＶＬＡ−４抗体組成物を吸入によりエアロゾルとして投与する項目１に記載の方法。
（項目４） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５およびＰ４Ｃ２から選択される項目１に記載の方法。
（項目５） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片である項目１に記載の方法。
（項目６） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するような投与量で投与する項目１に記載の方法。
（項目７） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するような投与量にて投与する項目６に記載の方法。
（項目８） 組成物を、少なくとも１０μｇ／ｍｌの哺乳動物における抗体の血漿レベルを与えるのに有効な量で投与する項目１に記載の方法。
（項目９） 組成物を、喘息罹患者が過敏性であるアレルゲンに露呈する前に投与する項目１に記載の方法。
（項目１０） 哺乳動物がヒトである項目１に記載の方法。
（項目１１） 組成物を、哺乳動物が過敏性であるアレルゲンに露呈した後に投与する項目１に記載の方法。
（項目１２） アレルギー性喘息に罹患した哺乳動物に対し抗体、組換抗体、キメラ抗体、これら抗体の断片、ＶＬＡ−４のα４サブユニットに結合しうるポリペプチドもしくは小分子または前記したこれらの組合せ物を、罹患者が過敏性であるアレルゲンに対する後期反応を阻止しまたはアレルゲン攻撃誘発の後の前記哺乳動物にて気道過敏症を減少させるのに有効な量で投与することを特徴とする喘息の処置方法。
（項目１３） 抗体、ポリペプチドもしくは分子がモノクローナル抗体ＨＰ１／２；この種の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２もしくはＦ（ｖ）断片；可溶性ＶＣＡＭ−１ポリペプチド；またはＶＬＡ−４のＶＣＡＭ−１結合性ドメインに結合する小分子から選択される項目１２に記載の方法。
（項目１４） 組成物が複数の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体またはそのＶＬＡ−４結合性断片からなる項目１２に記載の方法。
（項目１５） 組成物が抗−ＶＬＡ−４の他に抗−ＥＬＡＭ−１抗体もしくは抗−ＩＣＡＭ−１抗体または抗−ＥＬＡＭ−１抗体と抗−ＩＣＡＭ−１抗体との両者を含む項目１２に記載の方法。
（項目１６） 抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片である項目１２に記載の方法。
（項目１７） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を供給するような投与量にて投与する項目１２に記載の方法。
（項目１８） 組成物を、喘息罹患者の体重に対し１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を供給するような投与量にて投与する項目１７に記載の方法。
（項目１９） 組成物を、７日間にわたり少なくとも１０μｇ／ｍｌの哺乳動物における抗体の血漿レベルを与えるのに有効な量で投与する項目１２に記載の方法。
（項目２０） 喘息症の哺乳動物における後期反応を軽減させ、またはその気道過敏症を顕著に減少させるのに有効な医薬組成物であって、医薬上許容しうるキャリヤ中で実質的にＶＬＡ−４を認識するモノクローナル抗体よりなる医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、二重応答アレルギー性ヒツジにおいてアレルゲン（アスカリス・スウム抗原）に対する反応に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の作用を示すグラフである。比肺抵抗（ＳＲＬ）における変化％をアレルゲン攻撃誘発の後に経時的に測定する。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図２】図２は、最初に投与してから経時的に測定したヒツジにおけるモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の血漿濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、二重応答ヒツジにおける気道過反応性に対するモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）の効果を示すグラフである。１％（重量／容量）カルバコール溶液（公知の気管支収縮剤）（これは希釈剤のみを用いて得られる数値よりも比肺抵抗を４００％増大させる）の積算呼吸数における呼吸単位（ＢＵ）で測定した気道反応性を示す。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図４】図４（第４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ図を含む）は、アスカリス・スウム抗原のみを投与したアレルギー性ヒツジおよびモノクローナル抗体ＨＰ１／２（静脈内）で予備処置した後のアレルギー性ヒツジにおける気管支肺胞洗浄により検出された全細胞数（第４Ａ図）、並びに異なる白血球（リンパ球（第４Ｂ図）、好中球（第４Ｃ図）および好酸球（第４Ｃ図））のレベルを示す一連の４種のグラフである。全細胞およびリンパ球もしくは好中球もしくは好酸球であった全細胞の比率をアレルゲン攻撃誘発の４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後および１週間後の時点で測定した。
【図５】図５は、二重応答アレルギー性ヒツジにおけるアレルゲン（アスカリス・スウム抗原）に対する反応に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（１６ｍｇ、エアロゾル）および１Ｅ６（１６ｍｇ、エアロゾル）の効果を示すグラフである。比肺抵抗（ＳＲＬ）における変化％をアレルゲン攻撃誘発の後に経時的に測定した。星印は統計的に有意な結果を示す。
【図６】図６は、二重応答ヒツジにおける気道過反応性に及ぼすモノクローナル抗体ＨＰ１／２（１６ｍｇ、エアロゾル）および１Ｅ６（１６ｍｇ、エアロゾル）の効果を示すグラフである。１％（重量／容量）カルバコール溶液（公知の気管支収縮剤）（これは希釈剤のみを用いて得られる数値よりも比肺抵抗を４００％増大させる）の積算呼吸数における呼吸単位（ＢＵ）で測定した気道反応性を示す。星印は統計的に有意な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
モノクローナル抗体を産生する技術は周知である。要するに、不死細胞ライン（典型的には骨髄腫細胞）を所定の抗原（たとえばＶＬＡ−４）を発現する全細胞で免疫化した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄液を抗原に対する抗体につきスクリーニングする（一般にコーラー等、１９７５［１５］参照）。
【００１３】
免疫化は標準的方法を用いて行なうことができる。単位投与量および免疫化方式は、免疫化される哺乳動物の種類、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型的には免疫化された哺乳動物を出血させ、各血液試料からの血清を適するスクリーニング分析により特定の抗体につき分析する。たとえば抗−ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４−発現性細胞からの１２５Ｉ標識細胞溶解物の免疫沈澱により同定することができる（サンチェズ・マドリッド等、１９８６［１６］およびヘムラー等、１９８７［１７］）。さらに抗−ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４を認識すると思われる抗体と共にインキュベートしたＲａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定することによりフロー・サイトメトリーによっても同定することができる （エリシス等、１９９０［１４］参照）。ハイブリドーマ細胞の産生に用いられるリンパ球は典型的には、この種のスクリーニング分析を用いて抗−ＶＬＡ−４抗体の存在につき陽性と既に試験された血清を有する免疫化された哺乳動物から分離される。
【００１４】
典型的には、不死細胞ライン（たとえば骨髄腫細胞ライン）はリンパ球と同じ種類の哺乳動物から得られる。好適な不死細胞ラインはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞ラインである。
【００１５】
典型的にはＨＡＴ−感受性のマウス骨髄腫細胞を、分子量１５００のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ １５００」）を用いてマウス脾細胞に融合させる。次いで、融合から得られるハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択し、この培地は未融合および非産生融合の骨髄腫細胞を死滅させる（未融合の脾細胞は形質転換されないので数日間後に死滅する）。所望の抗体を産生するハイブリドーマをハイブリドーマ培養上澄液をスクリーニングして検出する。たとえば抗−ＶＬＡ−４抗体を産生すべく作成したハイブリドーマは、たとえばトランスフェクトされたＫ−５６２細胞のような組換α４サブユニット−発現性細胞ラインに結合する能力を持った分泌抗体につきハイブリドーマ培養上澄液を試験してスクリーニングすることができる（エリシス等［１４］参照）。
【００１６】
抗−ＶＬＡ−４抗体を産生させるには、この種のスクリーニング分析にて陽性と試験されたハイブリドーマ細胞を、これらハイブリドーマ細胞によりモノクローナル抗体を培地中へ分泌させるのに充分な条件および時間にて栄養培地で培養した。ハイブリドーマ細胞に適する組織培養技術および培地は周知されている。細胞を除いたハイブリドーマ培養上澄液を集め、抗−ＶＬＡ−４抗体を必要に応じさらに周知方法で精製することができる。
【００１７】
或いは、ハイブリドーマ細胞を未免疫化マウスの腹腔内に注射して所望の抗体を産生させることもできる。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖して抗体を分泌し、この抗体は腹液として蓄積する。この抗体を、腹腔内から注射器により腹液を抜取って回収することができる。
【００１８】
数種の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が従来記載されている（たとえばサンチェズ−マドリッド等、１９８６［１６］；ヘムラー等、１９８７［１７］；プリド等、１９９１［１９］参照）。ここの実験ではＨＰ１／２と称する抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体（バイオジェン・インコーポレーション社・ケンブリッジ、ＭＡから入手）を使用した。抗−ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２の重鎖および軽鎖の可変領域はクローン化され、配列決定され、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域と組合せて発現されている。この種のキメラＨＰ１／２抗体はネズミＨＰ１／２抗体に特異性および能力において類似し、本発明による処置方法に有用である。同様に、人間適合させた組換抗−ＶＬＡ−４抗体もこれら方法に有用である。ＨＰ１／２ ＶＨ ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示す。ＨＰ１／２ ＶＫ ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示す。
【００１９】
たとえばＨＰ１／２のようなモノクローナル抗体およびＶＬＡ−４のα鎖を認識しうる他の抗−ＶＬＡ−４抗体（たとえばＭＡｂ ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５、Ｐ４Ｃ２）が本発明に有用である。抗体はＶＬＡ−α４鎖のＢ１もしくはＢ２エピトープを認識することが特に好ましい（プリド等、１９９１［１９］参照）。特定の理論に拘束されるものでないが、本発明の方法に使用される抗−ＶＬＡ−４抗体はアレルゲン攻撃誘発の後の少なくとも最初の期間にわたり肺の炎症部分へのＶＬＡ−４発現性リンパ球の移動を特異的に阻止することができる。ＶＬＡ−４白血球移動の阻止は次いで白血球浸潤の病理学的二次作用、たとえば毒性物質の放出、可溶性炎症細胞媒介物の誘発、白血球走化性作用剤（たとえば好中球走化性因子）の誘発などを防止する。その結果、アレルゲンに対する後期反応および気道の持続過敏性を軽減することができる。或いは、抗−ＶＬＡ−４抗体は炎症媒介物および／または細胞走化性作用剤の放出に必要な信号導入を軽減することができる。
【００２０】
本発明の方法は、アレルギー性喘息に罹患した哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体からなる組成物を投与することを特徴とする。下記する実施例は喘息ヤギで観察された結果を示す。しかしながら、ヤギとヒトとの間における生理学的反応および薬理学的作用の類似性が記載されており（たとえばＷ．Ｍ．アブラハム、１９８９［２０］参照）、さらにヤギと他の動物との喘息モデル（ウサギ、リスザル、モルモットおよび感作したイヌ）の間における類似性も記載されている（たとえばＷ．Ｍ．アブラハム等、１９８８［８］参照）。したがって、ここで報告する結果はアレルギー性喘息に罹患した人間を含む任意の哺乳動物に適切かつ適用され、本発明の方法はこれらに有用である。
【００２１】
本発明により投与される抗−ＶＬＡ−４抗体は、喘息誘発性アレルゲンに露呈する前に予防投与することができる。さらに、抗体をアレルゲン露呈の時点もしくはその直後、後期反応の程度を軽減させる早期反応と後期反応との間、或いは気道過反応性を減少もしくは除去するアレルゲン露呈後の任意の時点で投与すれば有利な作用が得られる。
【００２２】
抗−ＶＬＡ−４抗体は、抗−ＶＬＡ−４抗体と医薬上許容しうるキャリヤとから組成物として投与することができる。好ましくは、組成物は静脈内注射に適する形態である。さらに、無菌の水溶液または燐酸塩緩衝塩水溶液の形態の抗体組成物も考えられ、例えば吸入器により噴霧され喘息罹患者が肺中へ直接に吸入することができる。投与量は特定アレルゲンに対する喘息罹患者の感受性、露呈時のアレルゲン濃度および露呈の頻度／持続時間、提案される投与方式（たとえば注射もしくは吸入）、所望の抗体の血漿レベル、特定抗体の効果または気道反応性を抑制する抗体の組合せ、抗体組成物の消失速度もしくは半減期、並びにアレルギー性喘息の処置を経験した医者に熟知される他の因子に応じて変化する。一般に、投与量は１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲に抗体の血漿レベルを維持するよう計算かつ調整されるが、それより高いもしくは低い投与量も患者の年齢、感受性、耐性および他の特性、炎症の急激性、病気の履歴および過程、並びに担当医により日常的に考慮される同様な因子を考えて可能である。用いる抗体の効能および半減期に応じ、処置を受ける患者の体重に対し約０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗体、特に好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体を使用するのが好適である。
【００２３】
適する医薬キャリヤは、たとえば無菌の塩水および生理学的緩衝溶液を包含する。吸入投与には燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）が好適である。医薬組成物はさらに、活性成分の放出を調節し或いは患者体内におけるその存在を長期化させるよう処方することもできる。多数の適する薬物放出系がこの目的で知られており、たとえばヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小球などを包含する。
【００２４】
さらに本発明の目的には、ＶＬＡ−４のα４ サブユニットに結合しうる抗体を用いねばならないことも認識されよう。モノクローナル抗体を使用するのが好適である。
【００２５】
天然産の抗体の他に、代案としてＶＬＡ−４に結合しうる適する組換抗体も使用することができる。この種の組換抗体は、組換ＤＮＡ技術により産生される抗体、たとえば宿主細胞を所望抗体の免疫グロブリン軽および重鎖をコードするＤＮＡを含有した適する発現ベクターで形質転換させて産生させた抗体、並びに抗−ＶＬＡ−４抗体の重鎖および／または軽鎖のヒンジおよび定常領域の幾つかまたは全部が、異なる種の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応領域で置換されている組換キメラ抗体を用いることもできる（すなわち、好ましくは投与抗体に対する免疫反応を最小化させるため処置される喘息罹患者と同じ種のもの）（たとえばＰ．Ｔ．ジョーンズ等、１９８６ ［２１］；Ｅ．Ｓ．ワード等、１９８９［２２］および米国特許第４，８１６，３９７号（ボス等）［２３］参照、これら全てを参考のためここに引用する）。
【００２６】
さらに、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２およびＦ（ｖ）断片のような抗−ＶＬＡ−４抗体のＶＬＡ−４結合性断片；重鎖モノマーもしくはダイマー；軽鎖モノマーもしくはダイマー；並びに１個の重鎖と１個の軽鎖とよりなるダイマーもここで考えられる。この種の抗体断片は化学法により、たとえば完全抗体をたとえばペプシンもしくはパパインのようなプロテアーゼで切断させるか、或いは組換ＤＮＡ技術により、たとえば端を切取った重鎖および／または軽鎖遺伝子により形質転換された宿主細胞を用いて産生させることもできる。重鎖および軽鎖モノマーも同様に、完全抗体をたとえばジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）もしくはβ−メルカプトエタノールのような還元剤で処理して、或いは所望の重鎖もしくは軽鎖またはその両者をコードするＤＮＡで形質転換された宿主を用いて産生することができる。
【００２７】
さらに上記の検討から明らかなように、ＶＬＡ−４−媒介結合を阻止またはブロックする他のポリペプチドおよび分子も、抗−ＶＬＡ−４抗体と同様に喘息の処置に有効である。たとえば、ＶＣＡＭ−１（ＶＬＡ−４の内皮細胞リセプタ）の可溶型またはその断片を投与して、ＶＬＡ−４結合部位に競合させることにより抗ＶＬＡ−４抗体の投与と同様な作用を得ることもできる。たとえばＶＬＡ−４−リガンドの結合ドメインを模倣すると共にＶＬＡ−４のリセプタドメインに適合する、たとえばオリゴ糖のような小分子も用いることができる（Ｊ．Ｊ．デブリン等１９９０［２４］；Ｊ．Ｋ．スコットおよびＧ．Ｏ．スミス、１９９０［２５］、並びに米国特許第４，８３３，０９２号（ゲイセン）［２６］参照、これら全てを参考のためここに引用する）。アレルギー患者における後期反応または気道過反応性を効果的に阻止するＶＬＡ−４結合性ポリペチチドもしくは分子の使用がここでは喘息を処置するための代案法として考えられる。
【００２８】
さらに、抗−ＶＬＡ−４抗体を気道反応性に対し治療効果を有する他の抗体と組合せて使用することも考えられる。たとえば、ここに報告した有利な作用がＶＣＡＭ−１−発現性内皮細胞に対する白血球補充の阻止に基づく程度に応じて、抗−ＶＬＡ−４抗体と、白血球抗原と内皮細胞リセプタ分子との間の付着を阻害する他の抗体との組合せが有利である。たとえば本発明による抗−ＶＬＡ−４抗体を使用する他、抗−ＥＬＡＭ−１および／または抗−ＩＣＡＭ−１の抗体の使用も有利である（グンデル等、１９９１［２７］；ウェグナー等、１９９０［２８］参照）。
【００２９】
適するビヒクルにて処方すれば、ここで考えられる医薬組成物はたとえば経口的、食道内もしくは鼻腔内、気管支内（局部処置、たとえば気管支鏡を介する）により、さらに皮下、筋肉内、静脈内、動脈内もしくは非経口的に任意適する手段で投与することができる。通常の吸入を介する投与が好適である。
【実施例】
【００３０】
実施例
アブラハム等［８］により実質的に記載されたように実験を行なった。要するに、アスカリス・スウム抽出物（グリアー・ダイアグノスチックス社、レノワ、ＮＣ）の１：１０００もしくは１：１０，０００希釈物に対する天然のアレルギー皮膚反応を有するアレルギー性ヒツジを試験し、アスカリス・スウム抗原による吸入攻撃誘発に対し早期および後期気道反応（「二重応答」）を示すヒツジを選択した。気道における呼吸メカニクスおよび物理的変化を測定するため、ヒツジを頭を固定した俯位に拘束した。バルーンカテーテルを食道下側に対する２％リドカイン溶液での局部麻酔下で一方の鼻腔中に前進させると共に、拘束した気管内チューブを他方の鼻腔中に前進させ（可撓性の光学繊維気管支鏡を案内として用いる）、エアロゾル攻撃誘発に際し気道メカニクスを測定した。胸膜圧を、胃食道接合部から５〜１０ｃｍに位置せしめた食道バルーンカテーテル（１ｍｌの空気を充填）で推定した。この位置にて、末端呼吸胸膜圧は−２〜−５ｃｍＨ２Ｏの範囲であった。バルーンを設置した後、これを実験の持続時間にわたり所定位置に留めるよう固定した。気管における側圧を横穴カテーテル（内径２．５ｍｍ）で測定し、このカーテルを気管内チューブの先端に対し遠位方向に前進させて設置した。経肺圧（気管圧と胸膜圧との間の圧力差）を差圧トランスジューサ・カテーテルシステム（ＭＰ４５、バリダイン、ノースリッジ、ＣＡ）で測定した。圧力トランスジューサ・カテーテルシステムは、周波数９Ｈｚに対する圧力と流動との間の相変化を示さなかった。気管内チューブの近位端部をフライヒ・ニューモタコグラフ（ダイナ・サイエンシス社、ブルー・ベル、ＰＡ）に接続することにより肺抵抗（ＲＬ）を測定した。流動圧および経肺圧を示す信号をオシロスコープ記録計（モデルＤＲ−１２型；エレクトロニクス・フォー・メディスン社、ホワイト・プレイン、ＮＹ）に記録し、この記録計を経胸圧、呼吸容量（デジタル積算により得られる）および中間容積技術による流動からの胸抵抗（ＲＬ）を５〜１０回の呼吸により分析して自動計算するコンピュータに連結した。胸部ガス容積（Ｖｔｇ）を、一定容積の人体プレチスモグラフにおけるＲＬの測定の直後に測定した。比肺抵抗 （ＳＲＬ ）をこれら数値から計算した（ＳＲＬ ＝Ｖｔｇ×ＲＬ）。
【００３１】
吸入カルバコールに対する投与量反応曲線を、作成して気道反応性を決定した。投与量反応曲線を緩衝液（ＰＢＳ）単独の吸入直後およびＰＢＳ中にてカルバコールの濃度を増大させた１０回の呼吸の各連続投与の後に採取したＳＲＬの測定値を用いてプロットした。カルバコールの濃度はＰＢＳ中で０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％および４．０％ｗ／ｖとした。ＳＲＬ がＰＢＳ値から４００％を越えて上昇した際または最高のカルバコール濃度が投与された後に、刺激試験を中止した。気道反応性を、投与量反応曲線から後緩衝値を４００％越える比肺抵抗（ＰＤ４００％）に増大する呼吸単位（ＢＵ）における積算カルバコール量を計算することにより決定した。１呼吸単位は、１％ｗ／ｖカルバコール溶液の１呼吸として規定した。すなわち、気道過反応性の抑制が大きいほど、対照で見られると同じ気管支収縮を観察する前に必要とされる呼吸単位数が大となる。
【００３２】
各ヒツジを対照試験にかけ、ここではプラシーボ（添加剤なしのＰＢＳ）を３０分間にわたり予備処理として用いた後、アスカリス・スウム抗原（グリア・ダイアグノスティックス社、レノワ、ＮＣ）でアレルゲン攻撃誘発した。次いで、このヒツジを同一の試験にかけたが、ただし１ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体ＨＰ１／２を各ヒツジに抗原攻撃誘発の３０分間前に投与した。プラシーボ（緩衝剤対照またはアイソトープ適合の抗体（１Ｅ６、抗−ＬＦＡ３）対照）およびＨＰ１／２組成物を静脈内注射により投与した。ＨＰ１／２組成物（および１Ｅ６対照）は、ハイブリドーマ（バイオジェン・インコーポレーション社、ケンブリッジ、ＭＡ）から入手した純抗体を無菌の内生毒素フリーのＰＢＳに希釈すると共に各ヒツジの体重に対し１ｍｇ／ｋｇの抗体を供給するよう調整して作成した。抗原溶液を使い捨て薬用ネブライザ（レインドロップ（登録商標）、ピューリタン・ベネット社、レネクサ、ＫＳ）を用いエアロゾルとして供給し、このネブライザはエアロゾルをアンダーセン・カスケード・インパクタにより測定して３．２μＭ（幾何学的ＳＤ１．９）の質量平均空気力学直径を有するエアロゾルを与えた。アスカリス・スウム抽出物をＰＢＳで８２，０００蛋白質窒素単位（ＰＮＵ）／ｍｌの濃度まで希釈した。ネブライザの出口をプラスチックＴ管に指向させ、その１端部をハーバード・レスピレータの吸入口に接続した。電磁弁と２０ｐｓｉ圧縮空気源とよりなるネブライザおよび電磁弁に接続された投与計を、ハーバード・レスピレータの吸入サイクルの開始時点で１秒間作動させた。エアロゾルは波状で５００ｍｌ容積を毎分２０回の呼吸速度で２０分間にわたり供給した。各ヒツジは同等量の抗原（４００回の呼吸）で対照およびＨＰ１／２の試験につき攻撃誘発した。さらに、投与量反応曲線につきカルバコールエアロゾルを上記のネブライザにより発生させた。
【００３３】
細胞分析のため、気管支肺胞洗浄（ＢＬＡ）を各ヒツジにつき行なった。特殊設計した８０ｃｍの光学繊維気管支鏡の遠位端部を、ランダム選択された気管支サブセグメントに緩徐に挿入した。肺洗浄を３×３０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を３９℃にて緩和に吸引して行ない、その際気管支鏡の操作チャンネルに接続した３０ｍｌの注射器を用いた。洗浄戻り液を集め、ガーゼに通過させて粘液を除去し、次いで４２０×ｇにて１５分間遠心分離した。上澄液をデカントし、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。懸濁物の１部を血液計チャンバに移して全細胞を推定した。生存の全細胞をトリパンブルー排除により推定した。第２の細胞懸濁物部分を細胞分離器（１０分間にわたり６００ｒｐｍ）にて遠心分離し、ライト・ギエムサ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）で染色し、１００倍で観察して細胞集団を確認した。スライド１枚当り５００個の細胞が、細胞数差を確認すべく特性化された。特性化した細胞は表皮細胞、大食細胞、好塩基球、単球および未同定細胞（「その他」と名付ける種類に分類）とをリンパ球、好中球および好酸球の他に含んだ。
【００３４】
抗体および白血球のカウント数の血漿レベルを末梢脚静脈もしくは頸静脈からの静脈血試料（約５ｍｌ）から決定した。
【００３５】
実施例１
８匹の二重応答アレルギー性ヒツジを用いる気道攻撃誘発試験を上記手順にしたがって行なった。基線（ＢＳＬ）気道反応性（ＰＤ４００％）を抗原攻撃誘発の２〜３日前に確立し、基線気管肺胞洗浄（ＢＡＬ）を攻撃誘発の１日前に行なった。攻撃誘発の当日、比肺抵抗（ＳＲＬ）の基線値を測定し、次いでヒツジに緩衝剤（対照）またはＨＰ１／２を注射により投与した。この最初の投与（「処理」）の後、ＳＲＬ を測定し、処理の３０分間後にヒツジをアスカリス・スウム抗原で攻撃誘発した。ＳＲＬを攻撃誘発の直後、攻撃誘発してから１〜６時間にわたり毎時間、６．５〜８時間の範囲で３０分間毎、並びに抗原攻撃誘発してから２４時間、４８時間および１週間（すなわち１６８時間）の後に測定した。ＢＡＬはＳＲＬ測定の後に４時間、８時間、２４時間および４８時間、並びに１週間にて行なった。これらの試験にて末梢血液を抜取り、全白血球のカウント数および細胞集団の測定を処理前（基線）、攻撃誘発の直後、並びに攻撃誘発してから１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、２４時間および４８時間、並びに１週間の後に行なった。この試験の結果を図面に示す： 第１図は、検体ヒツジにおける抗原誘発の気道反応に対するＨＰ１／２処理の効果を示す。ＨＰ１／２の処理は、対照により示される後期反応の顕著な阻止（実質的に完全）を与えた。
【００３６】
第２図は、抗原攻撃誘発の直後および次いで攻撃誘発の１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、２４時間および４８時間の後に測定した処理検体におけるＨＰ１／２の血漿濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。均衡化した後、抗体濃度は約２０μｇ／ｍｌの濃度に落ち着き、この濃度は４８時間の時点まで維持された。
【００３７】
第３図は、気道反応性に対するＨＰ１／２の処理の効果を示すグラフである。抗原攻撃誘発の２４時間、４８時間および１週間の後、処理された検体は気道反応性の顕著な減少を示した。抗原攻撃誘発の２週間後においてさえ、処理された検体は気道反応性の減少を示し続けた。抗体の実質的に完全な阻止効果が１週間まで持続するという事実は特に驚異的であり、処理の治療価値の点で有望である。
【００３８】
第４図は、抗原攻撃誘発の４時間、８時間、２４時間および４８時間後、並びに抗原攻撃誘発の１週間後に行なったＢＡＬの結果を示す一連のグラフである。結果は、処理検体から回収された全細胞にて、対照と対比し顕著な変化を示さない。しかしながら、処理検体は、攻撃誘発してから４時間後の時点にて好中球および好酸球の両者レベルの減少を示した。抗−ＶＬＡ−４の投与が好中球の補充に影響を与えない、何故なら好中球はＶＬＡ−４を発現しないからと予想すると、これは若干驚異的である。さらに、好中球と好酸球との両者は内皮に対する付着に関与する他のリガンドを発現し、両種の細胞はＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１経路およびＣＤＸ／ＥＬＡＭ−１経路を介し内皮細胞に結合することが示されている。
【００３９】
抗−ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２による同様な治療効果が、検体をＨＰ１／２抗体により抗原攻撃誘発の２時間後に処置した際にも観察され、これは上記したように攻撃誘発の３０分間前と対比される。ＨＰ１／２の効果は投与量依存性であった。たとえば、投与量を０．２ｍｇ／ｋｇまで減少させれば、後期反応に対する保護は充分でなかった。１Ｅ６（抗−ＬＦＡ３）をアイソトープ適合対照抗体としてＨＰ１／２の処理に用いた抗原攻撃誘発試験に関し、早期反応もしくは後期反応に対する効果は対照試験で１Ｅ６を用いて観察されなかった。１Ｅ６抗体を産生する１Ｅ６−２Ｃ１２ハイブリドーマ細胞ラインはＡＴＣＣ ＨＢ １０６９３として寄託されている。
【００４０】
実施例２
抗体のエアロゾル供給の効能を検討するため次の実験を行なった。試験は上記と実質的に同様に行なったが、ただし２匹のヒツジを用いると共にＨＰ１／２をエアロゾルとしてネブライザを介し供給した（投与量＝動物１匹当り８ｍｇのＨＰ１／２、抗原攻撃誘発の３０分間前に投与）。
【００４１】
対照ヒツジ（プラシーボを投与）において後期反応は基線値の１２６％というＳＲＬの平均上昇を特徴とするのに対し、ヒツジを抗−ＶＬＡ−４抗体で処理すればＳＲＬ の平均上昇は基線の２６％であった。これらの結果は後期反応の約８０％阻止に相当する。これら結果はさらに、２４時間における気道反応性の約７０％阻止を示した。この試験から明らかなように、抗体の吸入供給を用いて本発明の利点を得ることができる。
【００４２】
これらデータを、ＨＰ１／２（ｎ＝５）もしくは１Ｅ６（ｎ＝４）の１６ｍｇ／ｋｇエアロゾル投与量を用いて確認し、対照（アイソタイプ適合１Ｅ６（抗−ＬＦＡ３）抗体対照）と共に５匹のヒツジに拡大した。第５図および第６図は、抗原攻撃誘発を行なう３０分間前のこの投与量におけるＨＰ１／２エアロゾルでの処理が後期反応および気道過反応性を阻止するにも有効であることを示す。ＨＰ１／２エアロゾル処理は、１Ｅ６対照により経験される後期反応の顕著（実際には、実質的に完全）な阻止を与えた。１Ｅ６エアロゾル処理は効果がなかった。匹敵する保護は静脈内試験およびエアロゾル試験の両者で達成されたが、エアロゾル試験においてＨＰ１／２により与えられる保護は検出しうる薬剤の血中レベルなしに達成された。ＨＰ１／２のこの効果は、同じ投与量の１Ｅ６が保護作用を示さないので特異的である（たとえば１Ｅ６で処理された動物はＰＣ４００にて顕著な低下を示したのに対し、ＨＰ１／２はこの作用を阻止した）。ＨＰ１／２と１Ｅ６との間の生理学的反応における差は、これら群における全ＷＢＣの欠如またはカウント差の結果ではない。全ＷＢＣおよびＨＰ１／２と１Ｅ６との群における差は、静脈内試験で見られたと同様な反応のパターンを示した。
【００４３】
以上本発明の方法を実施例として示したが、これらは決して本発明を限定するものでない。上記の開示から当業者には多くの改変が可能であることも明らかであろう。たとえば、用いる実際の投与量、用いる抗体もしくは抗体断片の種類、投与方式、正確な組成、処置の投与時間および投与方式、並びに多くの他の特徴は全て本発明の思想および範囲を逸脱することなく改変することが可能である。
【００４４】
（引用刊行物）
【００４５】
（配列表）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２８５４４４（Ｐ２０１０−２８５４４４Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６８７０９（Ｐ２０１０−１６８７０９）
【出願日】平成２２年７月２７日（２０１０．７．２７）
【分割の表示】特願２００２−２８６９１０（Ｐ２００２−２８６９１０）の分割
【原出願日】平成５年１月１２日（１９９３．１．１２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２７日（２０１０．７．２７）
【分割の表示】特願２００２−２８６９１０（Ｐ２００２−２８６９１０）の分割
【原出願日】平成５年１月１２日（１９９３．１．１２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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