微生物の活性制御方法
【課題】所望の微生物の生育や活性を選択的に制御する。
【解決手段】活性制御対象微生物２を含む培養液４に電極９,１０,１１を浸漬し、作用極９に電位を印加して培養液４の酸化還元電位を活性制御対象微生物２の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物２を選択的に活性化する。培養液４の酸化還元電位の制御は、作用極９に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質３を培養液４に含ませて、作用極９に印加された電位により酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにする。
【解決手段】活性制御対象微生物２を含む培養液４に電極９,１０,１１を浸漬し、作用極９に電位を印加して培養液４の酸化還元電位を活性制御対象微生物２の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物２を選択的に活性化する。培養液４の酸化還元電位の制御は、作用極９に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質３を培養液４に含ませて、作用極９に印加された電位により酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の活性制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、培養液の酸化還元電位を制御して所望の微生物を選択的に活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用するため、新しい概念に基づく微生物の培養技術が多数開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、環境汚染物質である六価クロムを無害な三価クロムに還元する能力を有するクロム還元菌を集積培養する技術が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShwanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしたものである。
【０００４】
ここで、六価クロム以外にも、様々な物質が環境汚染物質として知られている。例えば、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物は、土壌や地下水等に広く分布する環境汚染物質として知られている。これらの有機塩素化合物は水への溶解度が低く、地下環境に蓄積しやすいため、物理的・化学的な浄化や好気性微生物を利用した浄化が困難である。近年になって、有機塩素化合物を電子受容体として嫌気呼吸を行うことで生育している微生物群が発見され、バイオレメディエーションへの適用が期待されている。
【特許文献１】特開２００６−５５１３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＣＥやＤＣＥ等の有機塩素化合物を電子受容体として嫌気呼吸を行う脱塩素微生物は、培養が困難である。また、脱塩素微生物以外にも、培養が難しい微生物が自然界には多数存在している。したがって、このような難培養微生物の培養手法の確立が望まれている。
【０００６】
また、バイオレメディエーションへの適用に際しては、微生物を単に培養するに留まらず、その活性を制御して、微生物の持つ機能の制御を行うことが重要である。
【０００７】
そこで、本発明は、所望の微生物の生育や活性を選択的に制御することを可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、地下環境に存在している微生物が、呼吸に用いる電子受容体の種類に応じて異なる酸化還元電位環境に生育していることから、微生物の培養を行う際の培養液の酸化還元電位が、微生物の生育状況に何らかの影響を与えるのではないかと考え、種々検討を行った。その結果、ＰＣＥを電子受容体として嫌気呼吸を行う脱塩素微生物を培養する際の培養液の酸化還元電位をある特定の範囲に制御することで、非常に優れた脱塩素活性を示すことを知見し、本願発明に至った。
【０００９】
かかる知見に基づく請求項１に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物を含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の酸化還元電位を活性制御対象微生物の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物を選択的に活性化するようにしている。
【００１０】
このように、培養液自体の酸化還元電位を活性制御対象微生物の至適範囲に制御することで、培養液が活性制御対象微生物にとって至適な環境となるので、活性制御対象微生物を活性化し易くなる。一方、活性制御対象微生物以外の微生物にとっては至適な環境ではなくなるので、活性化し難くなる。したがって、活性制御対象微生物を選択的に活性化することが可能となり、活性制御対象微生物の機能を最大限に発揮させることが可能となる。
【００１１】
尚、本明細書において「活性化」とは、活性制御対象微生物が増殖することにより活性制御対象微生物群の機能が高まることと、機能している活性制御対象微生物の割合を高めることにより制御対象微生物群の機能が高まることの両方を意味している。
【００１２】
次に、請求項２に記載の微生物の活性制御方法は、請求項１に記載の微生物の活性制御方法において、培養液の酸化還元電位の制御を、電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を培養液に含ませて、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにしている。
【００１３】
このように、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することで、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。
【００１４】
また、請求項３に記載の微生物の活性制御方法は、請求項１に記載の微生物の活性制御方法において、培養液には、活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質をさらに含むようにしている。
【００１５】
活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質を培養液に含ませることで、活性制御対象微生物が呼吸を行うようになる。したがって、活性制御対象微生物の活性化をさらに促進させることができる。
【００１６】
また、請求項４に記載の微生物の活性制御方法は、活性対象微生物の活性化を嫌気環境下で行うようにしている。したがって、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。
【００１７】
次に、請求項５に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満に制御するようにしている。
【００１８】
請求項６に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ〜−０．２Ｖ未満に制御するようにしている。
【００１９】
請求項７に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満に制御するようにしている。
【００２０】
請求項８に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物を硫酸還元菌として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．６Ｖ〜−０．１Ｖに制御するようにしている。
【００２１】
したがって、培養液を活性制御対象微生物であるテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物、硫酸還元菌の生育に至適な環境とすることができるので、各微生物を選択的に活性化して脱塩素活性や硫酸還元活性を高めることができる。
【００２２】
ここで、銀・塩化銀電極は標準水素電極に対して＋０．２２Ｖの値を示す。そして、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位に０．２２Ｖを加えることにより、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位を標準水素電極に対する酸化還元電位に換算することができる。したがって、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位から、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位を換算することができる。例えば、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位をＸ（Ｖ）、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位をＡ（Ｖ）とし、銀・塩化銀電極以外の電極の標準水素電極に対する電位をＢ（Ｖ）とすると、以下の式により、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位Ａを換算することができる。
[数式１] Ａ＝Ｘ＋０．２２−Ｂ
【００２３】
つまり、数式１により得られるＡは、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位と同義であり、このようにして換算することに得られる酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【００２４】
例えば、銀・塩化銀電極以外の電極として飽和カロメル電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．２４Ｖであり、請求項５に記載の酸化還元電位の範囲は、−０．７２Ｖ超〜−０．５２Ｖと換算することができる。
【００２５】
また、銀・塩化銀電極以外の電極として 水銀・硫酸水銀（Ｉ）電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．６６Ｖであり、請求項５に記載の酸化還元電位の範囲は、−１．１４Ｖ超〜−０．９４Ｖと換算することができ、このようにして換算される酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２６】
請求項１に記載の発明によれば、活性制御対象微生物の増殖と、機能している活性制御対象微生物の割合の増大により制御対象微生物群の機能を高めることができる。しかも、活性制御対象微生物以外の微生物にとっては至適な環境ではなくなるので、活性化し難くなる。したがって、活性制御対象微生物を選択的に活性化することが可能となり、活性制御対象微生物の機能を最大限に発揮させることが可能となる。また、活性対象微生物を選択的に増殖することができるので、所望の微生物の選択的な培養が可能になる。さらに、培養液の酸化還元電位を制御するだけで、微生物の活性制御が行えるので、非常に簡便且つ低コストである。
【００２７】
請求項２に記載の発明によれば、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。
【００２８】
請求項３に記載の発明によれば、活性制御対象微生物に呼吸を行わせて、活性制御対象微生物の活性化をさらに促進させることができる。しかも、電子受容体物質が環境汚染物質等の有害物質である場合には、有害物質の処理を行いつつ、有害物質を処理できる活性制御微生物を選択的に増殖、培養させることができるという、非常に有利な効果を得ることができる。
【００２９】
請求項４に記載の発明によれば、活性対象微生物の活性化を嫌気環境下で行うようにしている。したがって、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。
【００３０】
請求項５に記載の発明によれば、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＰＣＥをＤＣＥに脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３１】
請求項６に記載の発明によれば、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＤＣＥをエチレン（ＥＴＨ）に脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３２】
請求項７に記載の発明によれば、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＶＣをＥＴＨに脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３３】
請求項８に記載の発明によれば、硫酸還元菌を選択的に活性化することができる。したがって、硫酸イオンを硫化水素に還元する機能を最大限に発揮させることができると共に、硫酸還元菌の選択的な培養も可能となる。さらに、硫酸還元と相補的にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を分解する作用が知られている硫酸還元菌においては、ベンゼン、トルエンなどを分解する機能を最大限に発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３５】
図１に、本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の一例として、電気培養装置１を用いた場合について説明する。本発明の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物２を含む培養液４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液４の酸化還元電位を活性制御対象微生物２の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物２を選択的に活性化するものである。つまり、培養液４自体の酸化還元電位を制御することにより、活性制御対象微生物２にとって至適な環境として、活性制御対象微生物２を選択的に活性化できる新規な方法である。
【００３６】
電解槽５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られている。培養槽７と対極槽８には培養液４が充填され、培養槽７には作用極９及び参照電極１１が、対極槽８には対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能としている。
【００３７】
培養槽７には、酸化還元物質３がさらに添加される。
【００３８】
酸化還元物質３としては、培養液４に浸されている作用極９と可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であり、且つ、活性制御対象微生物２に対して毒性を示さない物質であればよい。例えば、土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する。
[化学反応式１] Ｆｅ(III) ＋ ｅ− ＝ Ｆｅ(II)
【００３９】
ここで、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＥＤＴＡである。
【００４０】
鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンを用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であり、好ましい。つまり、土壌そのものを培養液４に添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液の酸化還元電位が制御できる場合がある。尚、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。
【００４１】
尚、酸化還元物質３の培養槽７への添加量は、培養液４の酸化還元電位を制御できる量であれば特に限定されないが、培養液４の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると酸化還元電位の制御を十分に行うことができない可能性があり、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液に完全に溶解しなかったり、微生物の生育阻害を生じる可能性がある。
【００４２】
また、電子受容体物質１３を培養槽７に添加してもよい。この場合は、活性制御対象微生物２に呼吸を行わせることで、さらに効率よく活性制御を行うことができる。
【００４３】
電子受容体物質１３としては、活性制御対象微生物２に呼吸を行わせることのできる物質であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＥ脱塩素微生物に対してテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ＤＣＥ脱塩素微生物に対してジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ＶＣ脱塩素微生物に対して塩化ビニル、硝酸還元菌に対して硝酸イオン、硫酸還元菌に対して硫酸イオン、メタン生成菌に対して二酸化炭素、クロロベンゼン脱塩素微生物に対してクロロベンゼン、クロロフェノール脱塩素微生物に対してクロロフェノール、クロム還元菌に対してクロムイオン、キノン還元菌に対してキノン、水銀還元菌に対して水銀イオン、カドミウム還元菌に対してカドミウムイオン、鉄還元菌に対して鉄イオンが挙げられる。
【００４４】
尚、電子受容体物質１３を培養槽７に添加しなくとも、微生物の活性を制御することが可能である。例えば、予め生育させた活性制御対象微生物２を培養槽７に投入し、培養液４の酸化還元電位を制御することで、機能している活性制御対象微生物２の割合を増やすことにより、活性制御対象微生物２の活性化を図ることができる。
【００４５】
ここで、本発明の微生物の活性制御方法において、活性対象微生物２の生育環境は嫌気環境としている。この場合、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。嫌気環境は、例えば電気培養装置１の電解槽５をボックス（不図示）内に入れ、当該ボックス内に水素ガス、二酸化炭素、不活性ガス（窒素、希ガス）、またはそれらの混合ガスを充填することにより形成することができるが、このような方法に限定されるものではない。
【００４６】
尚、本実施形態では、活性対象微生物２の生育環境は嫌気環境としているが、活性対象微生物２の生育環境を好気雰囲気とし、好気性微生物や通性微生物を活性制御対象微生物として培養液４を至適な酸化還元電位に制御することで、その活性化を効率良く行うこともできる。
【００４７】
次に、培養液４の酸化還元電位について説明する。培養液４の酸化還元電位は、数式１に示すネルンストの式により表される。
【００４８】
[数式２] Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）
【００４９】
数式２において、Ｅは溶液の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液中に含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位を制御することができる。つまり、酸化還元物質３が培養液４の酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４の組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。
【００５０】
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１間の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を一定の電位Ｖに制御し、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位が一定に制御される。ここで、培養液４の酸化還元電位は、作用極９の酸化還元電位に相当する。したがって、設定電位Ｖ、つまり、参照電極１１に対する作用極９の電位が培養液４の酸化還元電位に相当する。
【００５１】
例として、酸化還元電位が＋０．５Ｖの培養液の酸化還元電位を−０．５Ｖに制御する場合について図１５に基づいて説明する。初期状態、つまり作用極９に電位を印加していない場合は、作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１との間の電位差である＋０．５Ｖとなる（図１５の（１））。次に、設定電位を−０．５Ｖとして電位制御を開始すると、作用極９の電位は瞬時に設定電位となり、培養液４中の酸化還元物質３が酸化還元反応を生じて、酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比が制御され、培養液４の電位が徐々に設定電位に近づき（図１５の（２））、定常状態となって、培養液４の酸化還元電位が−０．５Ｖとなる（図１５の（３））。このときの作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１の電位差である−０．５Ｖとなる。
【００５２】
ここで、酸化還元電位は、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当するので、参照電極１１の種類により酸化還元電位の値は変化する。本明細書における酸化還元電位は、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極に対する値としているが、参照電極１１は銀・塩化銀電極に限られるものではない。銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合の酸化還元電位は上述した方法により容易に換算でき、銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合に換算した酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。尚、以降に記載する酸化還元電位の値は銀・塩化銀電極に対する値である。
【００５３】
尚、培養槽７に投入された微生物が酸化還元物質を酸化あるいは還元することにより、Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、可逆性の酸化還元物質を用いることで、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、酸化還元電位を一定値に保つことができる。
【００５４】
ここで、電解槽５を二槽に区画しているイオン交換膜６は、一価の陽イオンのみを透過する膜である。したがって、二価の鉄イオンや三価の鉄イオンは透過しないので、酸化還元物質３が対極槽８に移動することはない。したがって、酸化還元物質３は培養槽７で繰り返し利用できる。対極槽８に設置された対極９では、作用極９の逆反応として水素の還元・酸化反応が生じる。また、膜間のイオン電流の伝達は、培養液に含まれる水素イオン、ナトリウムイオン(Ｎａ＋)、カリウムイオン（Ｋ＋）などの一価の陽イオンにより行われる。このような電気化学反応が電解槽５で進行し、培養液の酸化還元電位が一定に制御される。
【００５５】
活性制御対象微生物２の酸化還元電位の至適範囲は、以下に説明する微生物の活性評価試験により導き出すことができる。即ち、酸化還元電位以外の培養条件を全て揃え、酸化還元電位をある範囲内、例えば−１Ｖ〜１Ｖの範囲内で条件振りして、培養を行う。さらに比較条件として、電圧を印加しない条件でも培養を行っておく。培養を開始する前には、活性制御対象微生物２の電子受容体物質１３を培養液に加えておく。そして、数日間培養した後に、培養液中の電子受容体物質１３の濃度を測定してその減少量を測定し、比較条件よりも電子受容体物質１３の減少量が多い酸化還元電位条件のものが、活性が高いことになり、その酸化還元電位条件が至適範囲となる。
【００５６】
本発明者等は、この活性評価試験により、ＰＣＥ脱塩素微生物、ＤＣＥ脱塩素微生物、ＶＣ脱塩素微生物、硫酸還元菌の酸化還元電位の至適範囲を得た。
【００５７】
ＰＣＥ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）をＤＣＥ（ジクロロエチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満、より好ましくは−０．６５Ｖ〜−０．５５Ｖ、さらに好ましくは−０．６Ｖである。−０．５Ｖ以上、−０．７Ｖ以下の酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＰＣＥ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。
【００５８】
ＰＣＥ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Desulfitobacterium, Dehalococcoides, Dehalobacter, Geobacterである。
【００５９】
ＤＣＥ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＤＣＥ（ジクロロエチレン）をＥＴＨ（エチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．６Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、好ましくは−０．５５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、より好ましくは−０．５〜−０．２Ｖ未満、さらに好ましくは−０．４Ｖ〜−０．２Ｖ未満、最も好ましくは−０．３Ｖである。−０．６Ｖ以下、−０．２Ｖ以上の酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＤＣＥ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。
【００６０】
ＤＣＥ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Dehalococcoidesである。
【００６１】
ＶＣ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＶＣ（塩化ビニル）をＥＴＨ（エチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、より好ましくは−０．２５Ｖ超〜−０．４５Ｖ未満、最も好ましくは−０．４〜−０．３Ｖである。この範囲を超える酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＶＣ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。尚、本発明者等の実験によると、酸化還元電位を−０．６Ｖとすることで、ＶＣ脱塩素活性が高まることが確認された。したがって、−０．６Ｖ付近にも酸化還元電位の至適範囲が存在することが示唆される。
【００６２】
ＶＣ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Dehalococcoidesである。
【００６３】
硫酸還元菌は、嫌気呼吸により、硫酸イオンを硫化水素に還元する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．６Ｖ〜−０．１Ｖ、特に、−０．６Ｖ、−０．１Ｖとすることで、硫酸還元活性を高めることができる。−０．６Ｖ未満、−０．１Ｖ超では、電圧を印加せずに培養した場合よりも硫酸還元活性が低下してしまう可能性がある。
【００６４】
硫酸還元菌としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobacula, Desulfobacterである。
【００６５】
酸化還元電位を至適範囲に制御することで、活性制御対象微生物の活性を高めることができる。つまり、活性制御対象微生物が増殖することによりその機能が高まる効果と、機能している活性制御対象微生物の割合を高めることによりその機能が高まる効果により活性を高めることができる。逆に言えば、酸化還元電位を至適範囲外に制御することで、活性制御対象微生物の活性を低下させることができる。つまり、活性制御対象微生物が減少することによりその機能が低下させる効果と、機能している微生物の割合を少なくしてその機能を低下させる効果により活性を低下させることができる。
【００６６】
このようにして活性制御対象微生物の活性を制御する方法を利用することで、ある特定の機能性微生物の集積培養を行うことができる。また、培養のみに留まらず、ある種の微生物だけを機能させて、バイオレメディエーションを行うことができる。例えば、ＰＣＥ脱塩素微生物、ＤＣＥ脱塩素微生物が混在している培養液の酸化還元電位を−０．６Ｖとすることで、ＰＣＥ脱塩素微生物のみが選択的に活性化して機能するし、酸化還元電位を−０．３Ｖとすれば、ＤＣＥ脱塩素微生物のみが選択的に活性化する。
【００６７】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図１３（Ａ）に示すようなマイクロアレイ電気培養装置１’を使用した電位制御方法により本発明の微生物の活性制御方法を実施してもよい。具体的には、電解槽５に培養液４を充填し、対極１０及び参照電極１１を浸漬する。そして、容器底部をイオン交換膜６で構成した複数の微小培養器１５に培養液４、活性制御対象微生物２及び酸化還元物質３を充填し、これを電解槽５に充填された培養液４に浸す。作用極９は微小培養器１５の培養液４中にぞれぞれ浸漬する。つまり、図１に示した電気培養装置１における培養槽７がマイクロアレイ電気培養装置１’の微小培養器１５に相当し、微小培養器１５の外側部が図１に示した電気培養装置１における対極槽８に相当する。作用極９、対極１０及び参照電極１１は多チャンネル電位制御装置１２に結線され、各微小培養器１５の培養液４の作用極９の電位をそれぞれ厳密に設定可能とした参照電極統合型のマイクロアレイ電気培養装置としている。ここで、図１３（Ｂ）に示すように、参照電極１１を各微小培養器１５に浸漬して、各微小培養器１５の培養液４の作用極９の電位を厳密に設定可能とした参照電極分離型のマイクロアレイ電気分解装置としてもよい。尚、図１３において、●は、微小培養器１５を簡略化して記載したものである。
【００６８】
図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示すマイクロアレイ電気培養装置を用いることで、各々の微小培養器１５に対して種々の酸化還元電位を印加できる。したがって、少量のサンプルを用いて活性を最大にする最適な酸化還元電位を割り出すことが可能となる。また、方々から取り集めた環境微生物を各微小培養器に植菌し、目的の活性を最大にする電位を一律に与えることで、高い活性を持った微生物を含む培養液を検出することが可能となる。
【００６９】
また、図１４に示すように、活性制御対象微生物２を通過させないメンブレンフィルタ１６で培養槽７を仕切って処理槽１７を形成し、処理槽１７に環境汚染物質１３ａを含んだ被処理液１８を入れて、これを分解処理するようにしてもよい。即ち、環境汚染物質１３ａは処理槽１７と培養槽７との間の濃度勾配によりメンブレンリアクタ１６を通過して処理槽１７から培養槽７に移動する。環境汚染物質１３ａが培養槽７に添加されている活性制御対象微生物２に対して電子受容体となる物質の場合には、被処理液１８に含まれている環境汚染物質１３ａが活性制御対象微生物２により分解処理される。環境汚染物質１３ａが分解されて生成した分解物１３ａ’も培養槽７と処理槽１７との間の濃度勾配によりメンブレンリアクタ１６を通過して培養槽７から処理槽１７に移動するので、処理槽１７に入れた被処理液１８は最終的に環境汚染物質１３ａが除去されて分解物１３ａ’が含まれる。培養槽７の活性制御対象微生物２は培養液４の酸化還元電位が制御されて活性化されているので、環境汚染物物質１３ａを効率よく分解処理できるバイオリアクターとなる。尚、この形態において、培養液４内で十分にイオン電流が流れない場合には、被処理液１８に酸化還元物質３を添加するようにしても良い。
【実施例】
【００７０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００７１】
（実施例１）
活性制御対象微生物２をＰＣＥ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００７２】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、ＮＨ４Ｃｌ；０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．４ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．４９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０５ｇ、ＫＣｌ；０．０５２ｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１ｍＬの微量金属溶液を加えた。微量金属溶液は、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＺｎＳＯ４；３０ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；５ｍｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．５ｇ、ＰＣＥ；１００ｐｐｍ（０．１ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、培養液４ａ、４ｂ共に希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０に調整した。
【００７３】
（２）培養装置
ＰＣＥ脱塩素微生物の培養には図２に示す電気培養装置１を使用した。電解槽５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。
【００７４】
培養槽７には培養液４ｂを充填し、対極槽８には培養液４ａを充填した。
【００７５】
培養に際しては、電解槽５をアクリル製の嫌気ボックス１４内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽（不図示）内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時水素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。
【００７６】
（３）培養液の酸化還元電位制御性
培養液の酸化還元電位制御性を確認するため、培養液４ｂのサイクリックボルタモグラムを測定した。測定には電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ｂ、ＢＡＳ社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により実施した。この際、電解系は３極式で行い、電極反応を見るための作用極には炭素円盤電極（面積：７．０６５ｍｍ２、ＢＡＳ社）を、参照電極には銀・塩化銀電極（ＲＥ−１Ｂ、ＢＡＳ社）、さらに電流を流すための対極には白金棒電極（１ｍｍ径×５ｃｍ、自作）を使用した。
【００７７】
測定結果を図３に示す。横軸（電位）は、銀・塩化銀参照電極に対する値である。酸化方向に電位を変化させた場合にはＦｅ(II)→Ｆｅ(III)の反応に起因する酸化電流が発生し、還元方向に電位を変化させた場合にはＦｅ(III)→Ｆｅ(II)の反応に起因する還元電流が発生することが確認された。また、ヒステリシスもほとんど見られなかった。したがって、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡを培養液に添加することにより、−１．０Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲で酸化還元電位を安定に長期に亘って制御できることが明らかとなった。
【００７８】
（４）ＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＰＣＥ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は、３週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を２，６，９，１２日間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＰＣＥの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＰＣＥの濃度をガスクロマトグラフィー（GC390B、GLサイエンス社）により測定した。
【００７９】
結果を図４に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＰＣＥ値が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＰＣＥ脱塩素活性を示すことが確認された。酸化還元電位を−０．７Ｖ、−０．５Ｖとして培養した条件では、培養期間を２日間とした場合には、比較データよりも高いＰＣＥ脱塩素活性を示すことが確認されたが、培養期間が６日間の場合には、比較データよりも低いＰＣＥ脱塩素活性を示した。したがって、−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満、好ましくは−０．６ＶがＰＣＥ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。また、−０．５Ｖ以上、−０．７Ｖ以下の酸化還元電位では、ＰＣＥ脱塩素微生物の活性が低下することが明らかとなった。
【００８０】
（５）培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係
（４）より至適酸化還元電位と判断した−０．６Ｖにおける培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群及びその初期添加量は（４）と同様とした。培養期間は、１、２、４週間とした。比較データを得るため、電圧印加を行わずに培養を行った。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を４日間おこなった。この培養液のＰＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００８１】
結果を図５に示す。縦軸の相対活性は、比較データのＰＣＥ濃度を１として計算した数値である。培養期間が４週間になると、相対活性が３、つまり、電圧印加を行わずに培養を行った場合よりも３倍高いＰＣＥ脱塩素活性を示した。したがって、培養液をＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位に制御することで、長期に亘って安定した活性の維持が可能であることが確認された。
【００８２】
（６）培養時の酸化還元電位と微生物生育数の関係
培養時の酸化還元電位と微生物の生育数の相関を調べるための実験を行った。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群及びその初期添加量は（４）と同様とした。培養時の酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養し、これを比較データとした。培養期間は、１週間、２週間、３週間とした。微生物数は、光学顕微鏡観察による菌数カウントによって計測した。
【００８３】
結果を図６に示す。培養時の酸化還元電位により微生物生育数に変化が見られることが確認された。３週間後の生育数を比較すると、−０．７Ｖ、−０．５Ｖで最も多くなり、−０．６Ｖで最も少なくなった。−０．７Ｖ、−０．５ＶはＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位を逸脱した電位であることから、−０．７Ｖ、−０．５ＶでＰＣＥ脱塩素微生物群に含まれていた他の微生物の増殖が優先的に起こったことが考えられる。この結果から、ＰＣＥ脱塩素微生物以外の微生物も、その微生物にとっての至適酸化還元電位として培養すれば、選択的に培養できることが示唆された。
（７）培養期間中の培養液中電流量
（６）の実験を行った際に、培養液の電流値を１日目から２５日目まで測定した。その結果を図７に示す。酸化還元電位を−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖとした場合には、３日目に電流値が安定した。酸化還元電位を−０．３Ｖ、−０．１Ｖとした場合には、５日目に電流値が安定した。酸化還元電位を−０．２Ｖとした場合には、７日目に電流値が安定した。どの酸化還元電位条件においても一週間程度で電流値の安定が見られた。
【００８４】
したがって、ＰＣＥ脱塩素微生物群に存在している微生物により、酸化還元物質である鉄イオンが酸化還元されても、Ｆｅ(II)とＦｅ(III)の比を一定に制御して、酸化還元電位を培養初期から安定に制御できることが確認された。また、ＰＣＥ脱塩素微生物群に存在している微生物による鉄イオンの酸化還元反応は、どの酸化還元電位条件においても一週間程度で定常状態となることが確認された。また、この結果から、活性制御対象微生物に対する電子受容体物質が培養液中で酸化還元物質として機能するような場合であっても、酸化還元電位を一定に制御して活性制御対象微生物を選択的に活性化できることがわかった。つまり、電子受容体物質が酸化体と還元体に可逆的に変化するような物質の場合、電子受容体物質を酸化還元物質として用いることが可能であることがわかった。
【００８５】
（実施例２）
活性制御対象微生物２をＤＣＥ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００８６】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．７８ｇ、ＮａＨＣＯ３；２．５２ｇ、トリスヒドロキシアミノメタン；２．２９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０１５ｇ、Ｎａ２Ｓ；０．４８ｇ、ＦｅＣｌ２；０．２ｇ、レザズリン；１ｍｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１０ｍＬのミネラル溶液と１ｍＬのTrace elementを加えた。ミネラル溶液は、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５０ｇ、ＮａＣｌ；５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；２０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ；３０ｇ、ＫＣｌ；３０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。trace elementは、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１ｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．９ｇ、ＺｎＣｌ２；０．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．０４ｇ、Ｈ３ＢＯ３；０．０６ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；０．４４ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．１ｇ、ＤＣＥ；５．８ｐｐｍ（０．００５８ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０に調整した。
【００８７】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例１と同様のものを用いたが、ＤＣＥ脱塩素微生物の継代培養条件と揃えるため、嫌気ボックス１４に注入するガスは、水素と二酸化炭素の混合ガス（Ｈ２：ＣＯ２＝８０：２０）とした。
【００８８】
（３）ＤＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＤＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＤＣＥ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＤＣＥ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は３週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を一週間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＤＣＥの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＤＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００８９】
結果を図８に示す。酸化還元電位を−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＤＣＥ値が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＤＣＥ脱塩素活性を示すことが確認された。−０．６Ｖでは比較データとより若干高い残存ＤＣＥ値となり、−０．７Ｖから−０．３Ｖまでは、残存ＤＣＥ値が徐々に低くなる傾向が見られ、−０．２ＶでＤＣＥ残存濃度が急激に増加した。したがって、−０．６Ｖ超〜−０．２Ｖ未満がＰＣＥ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。また、−０．６Ｖ以下、−０．２Ｖ以上の酸化還元電位では、ＤＣＥ脱塩素微生物の活性が低下することが明らかとなった。
【００９０】
（実施例３）
活性制御対象微生物２をＶＣ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００９１】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．７８ｇ、ＮａＨＣＯ３；２．５２ｇ、トリスヒドロキシアミノメタン；２．２９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１０ｍＬのミネラル溶液と１ｍＬのTrace elementを加えた。ミネラル溶液は、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５０ｇ、ＮａＣｌ；５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；２０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ；３０ｇ、ＫＣｌ；３０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。trace elementは、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１ｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．９ｇ、ＺｎＣｌ２；０．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．０４ｇ、Ｈ３ＢＯ３；０．０６ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；０．４４ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．１ｇ、ＶＣ；１０ｐｐｍ（０．０１ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
【００９２】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例２と同様のものを用いた。
【００９３】
（３）ＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＶＣ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＶＣ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖ、０．０Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は一週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を一週間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＶＣの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＶＣとＥＴＨの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００９４】
結果を図９に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＶＣ値が低く、ＥＴＨ発生量が高かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＶＣ脱塩素活性を示すことが確認された。０．０Ｖ、−０．１Ｖ、−０．２Ｖ、−０．５Ｖでは比較データよりＶＣ脱塩素活性が低かった。したがって、−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満がＶＣ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。尚、−０．６ＶもＶＣ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位となり得ることが示唆された。
【００９５】
（４）培養期間とＶＣ脱塩素活性の関係
培養期間とＶＣ脱塩素活性の関係について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＶＣ脱塩素微生物群と、その初期添加量は（３）と同様とした。酸化還元電位は、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖ、０．０Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は三週間とした。培養後の培養液のＯＤ６６０値を測定した。測定には分光光度計(U−3010分光光度計、HITACHI社)を用いた。
【００９６】
結果を図１０に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより微生物生育数が多いことが確認された。これらの酸化還元電位では、ＶＣ脱塩素活性が高いことが（３）で確認されている。したがって、培養液をＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位に制御することで、長期に亘って安定した活性の維持が可能であることが確認された。
【００９７】
（実施例４）
活性制御対象微生物２を硫酸還元菌として、至適酸化還元電位を検討した。
【００９８】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、乳酸ナトリウム；４．０ｍＬ、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；５．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；１．０ｇ、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
【００９９】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例１と同様のものを用いたが、硫酸還元菌の継代培養条件と揃えるため、嫌気ボックス１４に注入するガスは、窒素ガスとした。
【０１００】
（３）硫酸還元菌の至適酸化還元電位
硫酸還元菌の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。硫酸還元菌群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。硫酸還元菌群の初期添加量は５０ｍＬに対して１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を１ｍＬとした。酸化還元電位は、０．４Ｖ、−０．１Ｖ、−０．６Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は一週間とした。この培養液の硫酸イオン（ＳＯ４２−）濃度をイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。また、硫酸還元菌群無添加で且つ電圧印加を行わなかった培養液についても硫酸イオン濃度を測定し、これをｃｏｎｔｒｏｌとした。
【０１０１】
結果を図１１に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．１Ｖとして培養した条件では、比較データより硫酸イオン濃度が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高い硫酸還元活性を示すことが確認された。０．４Ｖでは比較データより硫酸還元活性が低かった。したがって、−０．６Ｖ〜−０．１Ｖが硫酸還元菌にとっての至適酸化還元電位であると判断した。特に、−０．１Ｖ付近と、−０．６Ｖ付近に酸化還元電位を制御することで硫酸還元菌の硫酸還元活性を高められることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図２】実験に使用した電気培養装置の概念図である。
【図３】Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡを添加した培養液のサイクリックボルタンメトリー測定結果を示す図である。
【図４】ＰＣＥ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図５】培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係を示す図である。
【図６】ＰＣＥ脱塩素微生物群の微生物生育数の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図７】培養期間中の培養液の電流値変化を示す図である。
【図８】ＤＣＥ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図９】ＶＣ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１０】ＶＣ脱塩素微生物群の微生物生育数の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１１】硫酸還元活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１２】ＰＣＥからＥＴＨまでの一連の脱塩素反応を示す図である。
【図１３】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の他の例を示す概念図である。
【図１４】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態のさらに他の例を示す概念図である。
【図１５】培養液の酸化還元電位の制御に関する図である。
【符号の説明】
【０１０３】
２ 活性制御対象微生物
３ 酸化還元物質
４,４ａ,４ｂ 培養液
９ 作用極
１０ 対極
１１ 参照電極
１３ 電子受容体物質
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の活性制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、培養液の酸化還元電位を制御して所望の微生物を選択的に活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用するため、新しい概念に基づく微生物の培養技術が多数開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、環境汚染物質である六価クロムを無害な三価クロムに還元する能力を有するクロム還元菌を集積培養する技術が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShwanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしたものである。
【０００４】
ここで、六価クロム以外にも、様々な物質が環境汚染物質として知られている。例えば、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物は、土壌や地下水等に広く分布する環境汚染物質として知られている。これらの有機塩素化合物は水への溶解度が低く、地下環境に蓄積しやすいため、物理的・化学的な浄化や好気性微生物を利用した浄化が困難である。近年になって、有機塩素化合物を電子受容体として嫌気呼吸を行うことで生育している微生物群が発見され、バイオレメディエーションへの適用が期待されている。
【特許文献１】特開２００６−５５１３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＣＥやＤＣＥ等の有機塩素化合物を電子受容体として嫌気呼吸を行う脱塩素微生物は、培養が困難である。また、脱塩素微生物以外にも、培養が難しい微生物が自然界には多数存在している。したがって、このような難培養微生物の培養手法の確立が望まれている。
【０００６】
また、バイオレメディエーションへの適用に際しては、微生物を単に培養するに留まらず、その活性を制御して、微生物の持つ機能の制御を行うことが重要である。
【０００７】
そこで、本発明は、所望の微生物の生育や活性を選択的に制御することを可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、地下環境に存在している微生物が、呼吸に用いる電子受容体の種類に応じて異なる酸化還元電位環境に生育していることから、微生物の培養を行う際の培養液の酸化還元電位が、微生物の生育状況に何らかの影響を与えるのではないかと考え、種々検討を行った。その結果、ＰＣＥを電子受容体として嫌気呼吸を行う脱塩素微生物を培養する際の培養液の酸化還元電位をある特定の範囲に制御することで、非常に優れた脱塩素活性を示すことを知見し、本願発明に至った。
【０００９】
かかる知見に基づく請求項１に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物を含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の酸化還元電位を活性制御対象微生物の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物を選択的に活性化するようにしている。
【００１０】
このように、培養液自体の酸化還元電位を活性制御対象微生物の至適範囲に制御することで、培養液が活性制御対象微生物にとって至適な環境となるので、活性制御対象微生物を活性化し易くなる。一方、活性制御対象微生物以外の微生物にとっては至適な環境ではなくなるので、活性化し難くなる。したがって、活性制御対象微生物を選択的に活性化することが可能となり、活性制御対象微生物の機能を最大限に発揮させることが可能となる。
【００１１】
尚、本明細書において「活性化」とは、活性制御対象微生物が増殖することにより活性制御対象微生物群の機能が高まることと、機能している活性制御対象微生物の割合を高めることにより制御対象微生物群の機能が高まることの両方を意味している。
【００１２】
次に、請求項２に記載の微生物の活性制御方法は、請求項１に記載の微生物の活性制御方法において、培養液の酸化還元電位の制御を、電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を培養液に含ませて、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにしている。
【００１３】
このように、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することで、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。
【００１４】
また、請求項３に記載の微生物の活性制御方法は、請求項１に記載の微生物の活性制御方法において、培養液には、活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質をさらに含むようにしている。
【００１５】
活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質を培養液に含ませることで、活性制御対象微生物が呼吸を行うようになる。したがって、活性制御対象微生物の活性化をさらに促進させることができる。
【００１６】
また、請求項４に記載の微生物の活性制御方法は、活性対象微生物の活性化を嫌気環境下で行うようにしている。したがって、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。
【００１７】
次に、請求項５に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満に制御するようにしている。
【００１８】
請求項６に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ〜−０．２Ｖ未満に制御するようにしている。
【００１９】
請求項７に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物をビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満に制御するようにしている。
【００２０】
請求項８に記載の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物を硫酸還元菌として、培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．６Ｖ〜−０．１Ｖに制御するようにしている。
【００２１】
したがって、培養液を活性制御対象微生物であるテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物、硫酸還元菌の生育に至適な環境とすることができるので、各微生物を選択的に活性化して脱塩素活性や硫酸還元活性を高めることができる。
【００２２】
ここで、銀・塩化銀電極は標準水素電極に対して＋０．２２Ｖの値を示す。そして、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位に０．２２Ｖを加えることにより、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位を標準水素電極に対する酸化還元電位に換算することができる。したがって、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位から、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位を換算することができる。例えば、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位をＸ（Ｖ）、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位をＡ（Ｖ）とし、銀・塩化銀電極以外の電極の標準水素電極に対する電位をＢ（Ｖ）とすると、以下の式により、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位Ａを換算することができる。
[数式１] Ａ＝Ｘ＋０．２２−Ｂ
【００２３】
つまり、数式１により得られるＡは、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位と同義であり、このようにして換算することに得られる酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【００２４】
例えば、銀・塩化銀電極以外の電極として飽和カロメル電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．２４Ｖであり、請求項５に記載の酸化還元電位の範囲は、−０．７２Ｖ超〜−０．５２Ｖと換算することができる。
【００２５】
また、銀・塩化銀電極以外の電極として 水銀・硫酸水銀（Ｉ）電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．６６Ｖであり、請求項５に記載の酸化還元電位の範囲は、−１．１４Ｖ超〜−０．９４Ｖと換算することができ、このようにして換算される酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２６】
請求項１に記載の発明によれば、活性制御対象微生物の増殖と、機能している活性制御対象微生物の割合の増大により制御対象微生物群の機能を高めることができる。しかも、活性制御対象微生物以外の微生物にとっては至適な環境ではなくなるので、活性化し難くなる。したがって、活性制御対象微生物を選択的に活性化することが可能となり、活性制御対象微生物の機能を最大限に発揮させることが可能となる。また、活性対象微生物を選択的に増殖することができるので、所望の微生物の選択的な培養が可能になる。さらに、培養液の酸化還元電位を制御するだけで、微生物の活性制御が行えるので、非常に簡便且つ低コストである。
【００２７】
請求項２に記載の発明によれば、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。
【００２８】
請求項３に記載の発明によれば、活性制御対象微生物に呼吸を行わせて、活性制御対象微生物の活性化をさらに促進させることができる。しかも、電子受容体物質が環境汚染物質等の有害物質である場合には、有害物質の処理を行いつつ、有害物質を処理できる活性制御微生物を選択的に増殖、培養させることができるという、非常に有利な効果を得ることができる。
【００２９】
請求項４に記載の発明によれば、活性対象微生物の活性化を嫌気環境下で行うようにしている。したがって、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。
【００３０】
請求項５に記載の発明によれば、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＰＣＥをＤＣＥに脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３１】
請求項６に記載の発明によれば、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＤＣＥをエチレン（ＥＴＨ）に脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３２】
請求項７に記載の発明によれば、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物を選択的に活性化することができる。したがって、ＶＣをＥＴＨに脱塩素化する機能を最大限に発揮させることができると共に、ビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物の選択的な培養も可能となる。
【００３３】
請求項８に記載の発明によれば、硫酸還元菌を選択的に活性化することができる。したがって、硫酸イオンを硫化水素に還元する機能を最大限に発揮させることができると共に、硫酸還元菌の選択的な培養も可能となる。さらに、硫酸還元と相補的にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を分解する作用が知られている硫酸還元菌においては、ベンゼン、トルエンなどを分解する機能を最大限に発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３５】
図１に、本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の一例として、電気培養装置１を用いた場合について説明する。本発明の微生物の活性制御方法は、活性制御対象微生物２を含む培養液４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液４の酸化還元電位を活性制御対象微生物２の至適範囲に制御し、活性制御対象微生物２を選択的に活性化するものである。つまり、培養液４自体の酸化還元電位を制御することにより、活性制御対象微生物２にとって至適な環境として、活性制御対象微生物２を選択的に活性化できる新規な方法である。
【００３６】
電解槽５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られている。培養槽７と対極槽８には培養液４が充填され、培養槽７には作用極９及び参照電極１１が、対極槽８には対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能としている。
【００３７】
培養槽７には、酸化還元物質３がさらに添加される。
【００３８】
酸化還元物質３としては、培養液４に浸されている作用極９と可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であり、且つ、活性制御対象微生物２に対して毒性を示さない物質であればよい。例えば、土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する。
[化学反応式１] Ｆｅ(III) ＋ ｅ− ＝ Ｆｅ(II)
【００３９】
ここで、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＥＤＴＡである。
【００４０】
鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンを用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であり、好ましい。つまり、土壌そのものを培養液４に添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液の酸化還元電位が制御できる場合がある。尚、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。
【００４１】
尚、酸化還元物質３の培養槽７への添加量は、培養液４の酸化還元電位を制御できる量であれば特に限定されないが、培養液４の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると酸化還元電位の制御を十分に行うことができない可能性があり、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液に完全に溶解しなかったり、微生物の生育阻害を生じる可能性がある。
【００４２】
また、電子受容体物質１３を培養槽７に添加してもよい。この場合は、活性制御対象微生物２に呼吸を行わせることで、さらに効率よく活性制御を行うことができる。
【００４３】
電子受容体物質１３としては、活性制御対象微生物２に呼吸を行わせることのできる物質であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＥ脱塩素微生物に対してテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ＤＣＥ脱塩素微生物に対してジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ＶＣ脱塩素微生物に対して塩化ビニル、硝酸還元菌に対して硝酸イオン、硫酸還元菌に対して硫酸イオン、メタン生成菌に対して二酸化炭素、クロロベンゼン脱塩素微生物に対してクロロベンゼン、クロロフェノール脱塩素微生物に対してクロロフェノール、クロム還元菌に対してクロムイオン、キノン還元菌に対してキノン、水銀還元菌に対して水銀イオン、カドミウム還元菌に対してカドミウムイオン、鉄還元菌に対して鉄イオンが挙げられる。
【００４４】
尚、電子受容体物質１３を培養槽７に添加しなくとも、微生物の活性を制御することが可能である。例えば、予め生育させた活性制御対象微生物２を培養槽７に投入し、培養液４の酸化還元電位を制御することで、機能している活性制御対象微生物２の割合を増やすことにより、活性制御対象微生物２の活性化を図ることができる。
【００４５】
ここで、本発明の微生物の活性制御方法において、活性対象微生物２の生育環境は嫌気環境としている。この場合、嫌気性微生物や通性微生物（通常は好気的環境を好むが、嫌気環境下でも生育可能な微生物）を活性制御対象微生物として、その活性化を効率良く行うことができる。嫌気環境は、例えば電気培養装置１の電解槽５をボックス（不図示）内に入れ、当該ボックス内に水素ガス、二酸化炭素、不活性ガス（窒素、希ガス）、またはそれらの混合ガスを充填することにより形成することができるが、このような方法に限定されるものではない。
【００４６】
尚、本実施形態では、活性対象微生物２の生育環境は嫌気環境としているが、活性対象微生物２の生育環境を好気雰囲気とし、好気性微生物や通性微生物を活性制御対象微生物として培養液４を至適な酸化還元電位に制御することで、その活性化を効率良く行うこともできる。
【００４７】
次に、培養液４の酸化還元電位について説明する。培養液４の酸化還元電位は、数式１に示すネルンストの式により表される。
【００４８】
[数式２] Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）
【００４９】
数式２において、Ｅは溶液の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液中に含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位を制御することができる。つまり、酸化還元物質３が培養液４の酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４の組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。
【００５０】
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１間の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を一定の電位Ｖに制御し、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位が一定に制御される。ここで、培養液４の酸化還元電位は、作用極９の酸化還元電位に相当する。したがって、設定電位Ｖ、つまり、参照電極１１に対する作用極９の電位が培養液４の酸化還元電位に相当する。
【００５１】
例として、酸化還元電位が＋０．５Ｖの培養液の酸化還元電位を−０．５Ｖに制御する場合について図１５に基づいて説明する。初期状態、つまり作用極９に電位を印加していない場合は、作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１との間の電位差である＋０．５Ｖとなる（図１５の（１））。次に、設定電位を−０．５Ｖとして電位制御を開始すると、作用極９の電位は瞬時に設定電位となり、培養液４中の酸化還元物質３が酸化還元反応を生じて、酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比が制御され、培養液４の電位が徐々に設定電位に近づき（図１５の（２））、定常状態となって、培養液４の酸化還元電位が−０．５Ｖとなる（図１５の（３））。このときの作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１の電位差である−０．５Ｖとなる。
【００５２】
ここで、酸化還元電位は、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当するので、参照電極１１の種類により酸化還元電位の値は変化する。本明細書における酸化還元電位は、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極に対する値としているが、参照電極１１は銀・塩化銀電極に限られるものではない。銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合の酸化還元電位は上述した方法により容易に換算でき、銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合に換算した酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。尚、以降に記載する酸化還元電位の値は銀・塩化銀電極に対する値である。
【００５３】
尚、培養槽７に投入された微生物が酸化還元物質を酸化あるいは還元することにより、Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、可逆性の酸化還元物質を用いることで、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、酸化還元電位を一定値に保つことができる。
【００５４】
ここで、電解槽５を二槽に区画しているイオン交換膜６は、一価の陽イオンのみを透過する膜である。したがって、二価の鉄イオンや三価の鉄イオンは透過しないので、酸化還元物質３が対極槽８に移動することはない。したがって、酸化還元物質３は培養槽７で繰り返し利用できる。対極槽８に設置された対極９では、作用極９の逆反応として水素の還元・酸化反応が生じる。また、膜間のイオン電流の伝達は、培養液に含まれる水素イオン、ナトリウムイオン(Ｎａ＋)、カリウムイオン（Ｋ＋）などの一価の陽イオンにより行われる。このような電気化学反応が電解槽５で進行し、培養液の酸化還元電位が一定に制御される。
【００５５】
活性制御対象微生物２の酸化還元電位の至適範囲は、以下に説明する微生物の活性評価試験により導き出すことができる。即ち、酸化還元電位以外の培養条件を全て揃え、酸化還元電位をある範囲内、例えば−１Ｖ〜１Ｖの範囲内で条件振りして、培養を行う。さらに比較条件として、電圧を印加しない条件でも培養を行っておく。培養を開始する前には、活性制御対象微生物２の電子受容体物質１３を培養液に加えておく。そして、数日間培養した後に、培養液中の電子受容体物質１３の濃度を測定してその減少量を測定し、比較条件よりも電子受容体物質１３の減少量が多い酸化還元電位条件のものが、活性が高いことになり、その酸化還元電位条件が至適範囲となる。
【００５６】
本発明者等は、この活性評価試験により、ＰＣＥ脱塩素微生物、ＤＣＥ脱塩素微生物、ＶＣ脱塩素微生物、硫酸還元菌の酸化還元電位の至適範囲を得た。
【００５７】
ＰＣＥ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）をＤＣＥ（ジクロロエチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満、より好ましくは−０．６５Ｖ〜−０．５５Ｖ、さらに好ましくは−０．６Ｖである。−０．５Ｖ以上、−０．７Ｖ以下の酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＰＣＥ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。
【００５８】
ＰＣＥ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Desulfitobacterium, Dehalococcoides, Dehalobacter, Geobacterである。
【００５９】
ＤＣＥ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＤＣＥ（ジクロロエチレン）をＥＴＨ（エチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．６Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、好ましくは−０．５５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、より好ましくは−０．５〜−０．２Ｖ未満、さらに好ましくは−０．４Ｖ〜−０．２Ｖ未満、最も好ましくは−０．３Ｖである。−０．６Ｖ以下、−０．２Ｖ以上の酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＤＣＥ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。
【００６０】
ＤＣＥ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Dehalococcoidesである。
【００６１】
ＶＣ脱塩素微生物は、嫌気呼吸により、図１２に示す脱塩素反応のうち、ＶＣ（塩化ビニル）をＥＴＨ（エチレン）に脱塩素化する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満、より好ましくは−０．２５Ｖ超〜−０．４５Ｖ未満、最も好ましくは−０．４〜−０．３Ｖである。この範囲を超える酸化還元電位では、電圧を印加せずに培養した場合よりもＶＣ脱塩素活性が低下してしまうので好ましくない。尚、本発明者等の実験によると、酸化還元電位を−０．６Ｖとすることで、ＶＣ脱塩素活性が高まることが確認された。したがって、−０．６Ｖ付近にも酸化還元電位の至適範囲が存在することが示唆される。
【００６２】
ＶＣ脱塩素微生物としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Dehalococcoidesである。
【００６３】
硫酸還元菌は、嫌気呼吸により、硫酸イオンを硫化水素に還元する微生物である。この微生物の酸化還元電位の至適範囲は、−０．６Ｖ〜−０．１Ｖ、特に、−０．６Ｖ、−０．１Ｖとすることで、硫酸還元活性を高めることができる。−０．６Ｖ未満、−０．１Ｖ超では、電圧を印加せずに培養した場合よりも硫酸還元活性が低下してしまう可能性がある。
【００６４】
硫酸還元菌としては新規の又は公知の微生物を用いることができる。例えば、Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobacula, Desulfobacterである。
【００６５】
酸化還元電位を至適範囲に制御することで、活性制御対象微生物の活性を高めることができる。つまり、活性制御対象微生物が増殖することによりその機能が高まる効果と、機能している活性制御対象微生物の割合を高めることによりその機能が高まる効果により活性を高めることができる。逆に言えば、酸化還元電位を至適範囲外に制御することで、活性制御対象微生物の活性を低下させることができる。つまり、活性制御対象微生物が減少することによりその機能が低下させる効果と、機能している微生物の割合を少なくしてその機能を低下させる効果により活性を低下させることができる。
【００６６】
このようにして活性制御対象微生物の活性を制御する方法を利用することで、ある特定の機能性微生物の集積培養を行うことができる。また、培養のみに留まらず、ある種の微生物だけを機能させて、バイオレメディエーションを行うことができる。例えば、ＰＣＥ脱塩素微生物、ＤＣＥ脱塩素微生物が混在している培養液の酸化還元電位を−０．６Ｖとすることで、ＰＣＥ脱塩素微生物のみが選択的に活性化して機能するし、酸化還元電位を−０．３Ｖとすれば、ＤＣＥ脱塩素微生物のみが選択的に活性化する。
【００６７】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図１３（Ａ）に示すようなマイクロアレイ電気培養装置１’を使用した電位制御方法により本発明の微生物の活性制御方法を実施してもよい。具体的には、電解槽５に培養液４を充填し、対極１０及び参照電極１１を浸漬する。そして、容器底部をイオン交換膜６で構成した複数の微小培養器１５に培養液４、活性制御対象微生物２及び酸化還元物質３を充填し、これを電解槽５に充填された培養液４に浸す。作用極９は微小培養器１５の培養液４中にぞれぞれ浸漬する。つまり、図１に示した電気培養装置１における培養槽７がマイクロアレイ電気培養装置１’の微小培養器１５に相当し、微小培養器１５の外側部が図１に示した電気培養装置１における対極槽８に相当する。作用極９、対極１０及び参照電極１１は多チャンネル電位制御装置１２に結線され、各微小培養器１５の培養液４の作用極９の電位をそれぞれ厳密に設定可能とした参照電極統合型のマイクロアレイ電気培養装置としている。ここで、図１３（Ｂ）に示すように、参照電極１１を各微小培養器１５に浸漬して、各微小培養器１５の培養液４の作用極９の電位を厳密に設定可能とした参照電極分離型のマイクロアレイ電気分解装置としてもよい。尚、図１３において、●は、微小培養器１５を簡略化して記載したものである。
【００６８】
図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示すマイクロアレイ電気培養装置を用いることで、各々の微小培養器１５に対して種々の酸化還元電位を印加できる。したがって、少量のサンプルを用いて活性を最大にする最適な酸化還元電位を割り出すことが可能となる。また、方々から取り集めた環境微生物を各微小培養器に植菌し、目的の活性を最大にする電位を一律に与えることで、高い活性を持った微生物を含む培養液を検出することが可能となる。
【００６９】
また、図１４に示すように、活性制御対象微生物２を通過させないメンブレンフィルタ１６で培養槽７を仕切って処理槽１７を形成し、処理槽１７に環境汚染物質１３ａを含んだ被処理液１８を入れて、これを分解処理するようにしてもよい。即ち、環境汚染物質１３ａは処理槽１７と培養槽７との間の濃度勾配によりメンブレンリアクタ１６を通過して処理槽１７から培養槽７に移動する。環境汚染物質１３ａが培養槽７に添加されている活性制御対象微生物２に対して電子受容体となる物質の場合には、被処理液１８に含まれている環境汚染物質１３ａが活性制御対象微生物２により分解処理される。環境汚染物質１３ａが分解されて生成した分解物１３ａ’も培養槽７と処理槽１７との間の濃度勾配によりメンブレンリアクタ１６を通過して培養槽７から処理槽１７に移動するので、処理槽１７に入れた被処理液１８は最終的に環境汚染物質１３ａが除去されて分解物１３ａ’が含まれる。培養槽７の活性制御対象微生物２は培養液４の酸化還元電位が制御されて活性化されているので、環境汚染物物質１３ａを効率よく分解処理できるバイオリアクターとなる。尚、この形態において、培養液４内で十分にイオン電流が流れない場合には、被処理液１８に酸化還元物質３を添加するようにしても良い。
【実施例】
【００７０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００７１】
（実施例１）
活性制御対象微生物２をＰＣＥ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００７２】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、ＮＨ４Ｃｌ；０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．４ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．４９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０５ｇ、ＫＣｌ；０．０５２ｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１ｍＬの微量金属溶液を加えた。微量金属溶液は、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；５ｍｇ、ＺｎＳＯ４；３０ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；５ｍｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．５ｇ、ＰＣＥ；１００ｐｐｍ（０．１ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、培養液４ａ、４ｂ共に希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０に調整した。
【００７３】
（２）培養装置
ＰＣＥ脱塩素微生物の培養には図２に示す電気培養装置１を使用した。電解槽５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。
【００７４】
培養槽７には培養液４ｂを充填し、対極槽８には培養液４ａを充填した。
【００７５】
培養に際しては、電解槽５をアクリル製の嫌気ボックス１４内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽（不図示）内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時水素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。
【００７６】
（３）培養液の酸化還元電位制御性
培養液の酸化還元電位制御性を確認するため、培養液４ｂのサイクリックボルタモグラムを測定した。測定には電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ｂ、ＢＡＳ社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により実施した。この際、電解系は３極式で行い、電極反応を見るための作用極には炭素円盤電極（面積：７．０６５ｍｍ２、ＢＡＳ社）を、参照電極には銀・塩化銀電極（ＲＥ−１Ｂ、ＢＡＳ社）、さらに電流を流すための対極には白金棒電極（１ｍｍ径×５ｃｍ、自作）を使用した。
【００７７】
測定結果を図３に示す。横軸（電位）は、銀・塩化銀参照電極に対する値である。酸化方向に電位を変化させた場合にはＦｅ(II)→Ｆｅ(III)の反応に起因する酸化電流が発生し、還元方向に電位を変化させた場合にはＦｅ(III)→Ｆｅ(II)の反応に起因する還元電流が発生することが確認された。また、ヒステリシスもほとんど見られなかった。したがって、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡを培養液に添加することにより、−１．０Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲で酸化還元電位を安定に長期に亘って制御できることが明らかとなった。
【００７８】
（４）ＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＰＣＥ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は、３週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を２，６，９，１２日間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＰＣＥの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＰＣＥの濃度をガスクロマトグラフィー（GC390B、GLサイエンス社）により測定した。
【００７９】
結果を図４に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＰＣＥ値が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＰＣＥ脱塩素活性を示すことが確認された。酸化還元電位を−０．７Ｖ、−０．５Ｖとして培養した条件では、培養期間を２日間とした場合には、比較データよりも高いＰＣＥ脱塩素活性を示すことが確認されたが、培養期間が６日間の場合には、比較データよりも低いＰＣＥ脱塩素活性を示した。したがって、−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満、好ましくは−０．６ＶがＰＣＥ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。また、−０．５Ｖ以上、−０．７Ｖ以下の酸化還元電位では、ＰＣＥ脱塩素微生物の活性が低下することが明らかとなった。
【００８０】
（５）培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係
（４）より至適酸化還元電位と判断した−０．６Ｖにおける培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群及びその初期添加量は（４）と同様とした。培養期間は、１、２、４週間とした。比較データを得るため、電圧印加を行わずに培養を行った。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を４日間おこなった。この培養液のＰＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００８１】
結果を図５に示す。縦軸の相対活性は、比較データのＰＣＥ濃度を１として計算した数値である。培養期間が４週間になると、相対活性が３、つまり、電圧印加を行わずに培養を行った場合よりも３倍高いＰＣＥ脱塩素活性を示した。したがって、培養液をＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位に制御することで、長期に亘って安定した活性の維持が可能であることが確認された。
【００８２】
（６）培養時の酸化還元電位と微生物生育数の関係
培養時の酸化還元電位と微生物の生育数の相関を調べるための実験を行った。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＰＣＥ脱塩素微生物群及びその初期添加量は（４）と同様とした。培養時の酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養し、これを比較データとした。培養期間は、１週間、２週間、３週間とした。微生物数は、光学顕微鏡観察による菌数カウントによって計測した。
【００８３】
結果を図６に示す。培養時の酸化還元電位により微生物生育数に変化が見られることが確認された。３週間後の生育数を比較すると、−０．７Ｖ、−０．５Ｖで最も多くなり、−０．６Ｖで最も少なくなった。−０．７Ｖ、−０．５ＶはＰＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位を逸脱した電位であることから、−０．７Ｖ、−０．５ＶでＰＣＥ脱塩素微生物群に含まれていた他の微生物の増殖が優先的に起こったことが考えられる。この結果から、ＰＣＥ脱塩素微生物以外の微生物も、その微生物にとっての至適酸化還元電位として培養すれば、選択的に培養できることが示唆された。
（７）培養期間中の培養液中電流量
（６）の実験を行った際に、培養液の電流値を１日目から２５日目まで測定した。その結果を図７に示す。酸化還元電位を−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖとした場合には、３日目に電流値が安定した。酸化還元電位を−０．３Ｖ、−０．１Ｖとした場合には、５日目に電流値が安定した。酸化還元電位を−０．２Ｖとした場合には、７日目に電流値が安定した。どの酸化還元電位条件においても一週間程度で電流値の安定が見られた。
【００８４】
したがって、ＰＣＥ脱塩素微生物群に存在している微生物により、酸化還元物質である鉄イオンが酸化還元されても、Ｆｅ(II)とＦｅ(III)の比を一定に制御して、酸化還元電位を培養初期から安定に制御できることが確認された。また、ＰＣＥ脱塩素微生物群に存在している微生物による鉄イオンの酸化還元反応は、どの酸化還元電位条件においても一週間程度で定常状態となることが確認された。また、この結果から、活性制御対象微生物に対する電子受容体物質が培養液中で酸化還元物質として機能するような場合であっても、酸化還元電位を一定に制御して活性制御対象微生物を選択的に活性化できることがわかった。つまり、電子受容体物質が酸化体と還元体に可逆的に変化するような物質の場合、電子受容体物質を酸化還元物質として用いることが可能であることがわかった。
【００８５】
（実施例２）
活性制御対象微生物２をＤＣＥ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００８６】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．７８ｇ、ＮａＨＣＯ３；２．５２ｇ、トリスヒドロキシアミノメタン；２．２９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０１５ｇ、Ｎａ２Ｓ；０．４８ｇ、ＦｅＣｌ２；０．２ｇ、レザズリン；１ｍｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１０ｍＬのミネラル溶液と１ｍＬのTrace elementを加えた。ミネラル溶液は、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５０ｇ、ＮａＣｌ；５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；２０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ；３０ｇ、ＫＣｌ；３０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。trace elementは、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１ｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．９ｇ、ＺｎＣｌ２；０．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．０４ｇ、Ｈ３ＢＯ３；０．０６ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；０．４４ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．１ｇ、ＤＣＥ；５．８ｐｐｍ（０．００５８ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０に調整した。
【００８７】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例１と同様のものを用いたが、ＤＣＥ脱塩素微生物の継代培養条件と揃えるため、嫌気ボックス１４に注入するガスは、水素と二酸化炭素の混合ガス（Ｈ２：ＣＯ２＝８０：２０）とした。
【００８８】
（３）ＤＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＤＣＥ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＤＣＥ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＤＣＥ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．７Ｖ、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は３週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を一週間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＤＣＥの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＤＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００８９】
結果を図８に示す。酸化還元電位を−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＤＣＥ値が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＤＣＥ脱塩素活性を示すことが確認された。−０．６Ｖでは比較データとより若干高い残存ＤＣＥ値となり、−０．７Ｖから−０．３Ｖまでは、残存ＤＣＥ値が徐々に低くなる傾向が見られ、−０．２ＶでＤＣＥ残存濃度が急激に増加した。したがって、−０．６Ｖ超〜−０．２Ｖ未満がＰＣＥ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。また、−０．６Ｖ以下、−０．２Ｖ以上の酸化還元電位では、ＤＣＥ脱塩素微生物の活性が低下することが明らかとなった。
【００９０】
（実施例３）
活性制御対象微生物２をＶＣ脱塩素微生物として、至適酸化還元電位を検討した。
【００９１】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．７８ｇ、ＮａＨＣＯ３；２．５２ｇ、トリスヒドロキシアミノメタン；２．２９ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解した無機塩培地に、１０ｍＬのミネラル溶液と１ｍＬのTrace elementを加えた。ミネラル溶液は、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；５０ｇ、ＮａＣｌ；５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；２０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ；３０ｇ、ＫＣｌ；３０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。trace elementは、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１ｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．９ｇ、ＺｎＣｌ２；０．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．０４ｇ、Ｈ３ＢＯ３；０．０６ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；０．４４ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；０．１ｇ、ＶＣ；１０ｐｐｍ（０．０１ｇ添加）、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．８４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
【００９２】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例２と同様のものを用いた。
【００９３】
（３）ＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位
ＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＶＣ脱塩素微生物群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。ＶＣ脱塩素微生物群の初期添加量は１００ｍＬに対して１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を５ｍＬとした。酸化還元電位は、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖ、０．０Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は一週間とした。培養後に培養液を１ｍＬ分取した。
次に、分取した培養液を、新鮮な培養液４ｂが１０ｍＬ入っているバイアル瓶内に入れて植菌（再懸濁）し、通常（電圧印加を行わない）の培養を一週間おこなった。通常培養時には、バイアル瓶の蓋を閉めて、ＶＣの揮発を防ぐと共に、バイアル瓶内を嫌気条件とした。この培養液のＶＣとＥＴＨの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
【００９４】
結果を図９に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより残存ＶＣ値が低く、ＥＴＨ発生量が高かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高いＶＣ脱塩素活性を示すことが確認された。０．０Ｖ、−０．１Ｖ、−０．２Ｖ、−０．５Ｖでは比較データよりＶＣ脱塩素活性が低かった。したがって、−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満がＶＣ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位であると判断した。尚、−０．６ＶもＶＣ脱塩素微生物にとっての至適酸化還元電位となり得ることが示唆された。
【００９５】
（４）培養期間とＶＣ脱塩素活性の関係
培養期間とＶＣ脱塩素活性の関係について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。ＶＣ脱塩素微生物群と、その初期添加量は（３）と同様とした。酸化還元電位は、−０．６Ｖ、−０．５Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖ、−０．２Ｖ、−０．１Ｖ、０．０Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は三週間とした。培養後の培養液のＯＤ６６０値を測定した。測定には分光光度計(U−3010分光光度計、HITACHI社)を用いた。
【００９６】
結果を図１０に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．４Ｖ、−０．３Ｖとして培養した条件では、比較データより微生物生育数が多いことが確認された。これらの酸化還元電位では、ＶＣ脱塩素活性が高いことが（３）で確認されている。したがって、培養液をＶＣ脱塩素微生物の至適酸化還元電位に制御することで、長期に亘って安定した活性の維持が可能であることが確認された。
【００９７】
（実施例４）
活性制御対象微生物２を硫酸還元菌として、至適酸化還元電位を検討した。
【００９８】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、乳酸ナトリウム；４．０ｍＬ、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；５．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、酵母エキス；１．０ｇ、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
【００９９】
（２）培養装置
電気培養装置１は実施例１と同様のものを用いたが、硫酸還元菌の継代培養条件と揃えるため、嫌気ボックス１４に注入するガスは、窒素ガスとした。
【０１００】
（３）硫酸還元菌の至適酸化還元電位
硫酸還元菌の至適酸化還元電位について検討した。
図２に示す電気培養装置１を培養に使用した。硫酸還元菌群は、土壌より取得し馴化したものを継代培養して用いた。硫酸還元菌群の初期添加量は５０ｍＬに対して１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を１ｍＬとした。酸化還元電位は、０．４Ｖ、−０．１Ｖ、−０．６Ｖとした。また、電圧印加を行わずに培養を行い、これを比較データとした。培養期間は一週間とした。この培養液の硫酸イオン（ＳＯ４２−）濃度をイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。また、硫酸還元菌群無添加で且つ電圧印加を行わなかった培養液についても硫酸イオン濃度を測定し、これをｃｏｎｔｒｏｌとした。
【０１０１】
結果を図１１に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．１Ｖとして培養した条件では、比較データより硫酸イオン濃度が低かったことから、電圧印加を行わずに培養した条件よりも高い硫酸還元活性を示すことが確認された。０．４Ｖでは比較データより硫酸還元活性が低かった。したがって、−０．６Ｖ〜−０．１Ｖが硫酸還元菌にとっての至適酸化還元電位であると判断した。特に、−０．１Ｖ付近と、−０．６Ｖ付近に酸化還元電位を制御することで硫酸還元菌の硫酸還元活性を高められることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図２】実験に使用した電気培養装置の概念図である。
【図３】Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡを添加した培養液のサイクリックボルタンメトリー測定結果を示す図である。
【図４】ＰＣＥ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図５】培養期間とＰＣＥ脱塩素活性の関係を示す図である。
【図６】ＰＣＥ脱塩素微生物群の微生物生育数の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図７】培養期間中の培養液の電流値変化を示す図である。
【図８】ＤＣＥ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図９】ＶＣ脱塩素活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１０】ＶＣ脱塩素微生物群の微生物生育数の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１１】硫酸還元活性の酸化還元電位依存性を示す図である。
【図１２】ＰＣＥからＥＴＨまでの一連の脱塩素反応を示す図である。
【図１３】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態の他の例を示す概念図である。
【図１４】本発明の微生物の活性制御方法の実施形態のさらに他の例を示す概念図である。
【図１５】培養液の酸化還元電位の制御に関する図である。
【符号の説明】
【０１０３】
２ 活性制御対象微生物
３ 酸化還元物質
４,４ａ,４ｂ 培養液
９ 作用極
１０ 対極
１１ 参照電極
１３ 電子受容体物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性制御対象微生物を含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して前記培養液の酸化還元電位を前記活性制御対象微生物の至適範囲に制御し、前記活性制御対象微生物を選択的に活性化することを特徴とする微生物の活性制御方法。
【請求項２】
前記酸化還元電位の制御は、前記電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を前記培養液に含ませて、前記電極に印加された電位により前記酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行う請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項３】
前記培養液には、前記活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質がさらに含まれている請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項４】
前記活性制御対象微生物の活性化を嫌気環境下で行う請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項５】
前記活性制御対象微生物はテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項６】
前記活性制御対象微生物はジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ〜−０．２Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項７】
前記活性制御対象微生物はビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項８】
前記活性制御対象微生物は硫酸還元菌であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．６Ｖ〜−０．１Ｖに制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項１】
活性制御対象微生物を含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して前記培養液の酸化還元電位を前記活性制御対象微生物の至適範囲に制御し、前記活性制御対象微生物を選択的に活性化することを特徴とする微生物の活性制御方法。
【請求項２】
前記酸化還元電位の制御は、前記電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を前記培養液に含ませて、前記電極に印加された電位により前記酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行う請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項３】
前記培養液には、前記活性制御対象微生物の電子受容体として機能する物質がさらに含まれている請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項４】
前記活性制御対象微生物の活性化を嫌気環境下で行う請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項５】
前記活性制御対象微生物はテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．７Ｖ超〜−０．５Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項６】
前記活性制御対象微生物はジクロロエチレン（ＤＣＥ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ〜−０．２Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項７】
前記活性制御対象微生物はビニルクロライド（ＶＣ）脱塩素微生物であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．５Ｖ超〜−０．２Ｖ未満に制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【請求項８】
前記活性制御対象微生物は硫酸還元菌であり、前記培養液の酸化還元電位を銀・塩化銀電極に対して−０．６Ｖ〜−０．１Ｖに制御する請求項１に記載の微生物の活性制御方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１５】
【公開番号】特開２００８−５４６４６（Ｐ２００８−５４６４６Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３８９０１（Ｐ２００６−２３８９０１）
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月３日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５８回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム／生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」に関し、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月３日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５８回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム／生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」に関し、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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