抗腫瘍剤
【課題】腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供する。
【解決手段】ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
【解決手段】ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍又は癌の治療としては、化学療法、放射線治療法及び外科療法などが知られており、例えば癌の発症メカニズム等に基づいて種々の治療方法が開発されているが、癌の転移や再発などの問題もあって、より効果的な治療方法を目指して未だに開発が続けられている。
例えば、特許文献１には、新規な癌転移関連遺伝子を同定し、このインビボにおける機能を阻害若しくは抑制する核酸を含む癌の転移抑制用組成物が開示されている。
また特許文献２には、癌細胞の遊走に関与し、癌の浸潤及び癌の転移を抑制することが推測されているリン酸化βカテニンを選択的に認識する抗体と、これを含む癌の治療剤や癌の診断剤等を開示している。
【０００３】
一方、テネイシンＣは、免疫組織を除いた正常細胞においてはほとんど発現が認められないが、炎症、腫瘍等の病態時に発現が誘導される化合物である。
テネイシンＣを検出する方法として、いくつかの抗テネイシンＣ抗体が知られている（例えば、特許文献３、４参照）。またテネイシンＣをマーカーとして、関節炎の診断を行なう方法が知られている（例えば、特許文献５参照）。
【０００４】
テネイシンＣを構成するポリペプチドには、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチン（ＦＮ）III様ドメイン、およびフィブリノーゲン様ドメインが含まれている。このうちフィブロネクチンIII様ドメインでは、基本的な８種の反復配列（１〜８）と、その５番目と６番目の間に挿入される９種のスプライシングされる反復配列（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）とが連続していることが知られている。
【０００５】
またこれらのスプライシングされる反復配列部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であり、テネイシンＣがＭＭＰにより切断されて生成するペプチドは種々の機能を有していると考えられている。
例えば、このテネイシンＣのＦＮIII様ドメインにおけるＡ２ドメインに由来するペプチド（以下、「ＴＮIIIＡ２」ということがある）は、インテグリンの活性化を引き起こすペプチドとして知られている（例えば、非特許文献１参照）。
また、テネイシンＣのＦＮIIIの反復配列のうちＢドメインには、乳癌細胞株に対して遊走促進作用、及びＤＮＡ合成活性向上作用があることが知られている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０４７１６号公報
【特許文献２】特開２００５−８９３５４号公報
【特許文献３】特開２００４−２１７５４６号公報
【特許文献４】特開２００２−２３４９００号公報
【特許文献５】特開２００４−１３８４８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937, (2007)
【非特許文献２】J.Pathol.,Vol.162, pp.1857-1867,(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍又は癌の治療には、周囲の正常細胞に対する影響を抑えつつ腫瘍細胞の活性のみを選択的に阻害することが求められる。このため、腫瘍細胞の悪性化に特徴的とも言える増殖態様や転移に対して効果的な阻害活性を示す抗腫瘍剤が必要となる。
従って本発明の目的は、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］ ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
［２］ 前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体である［１］に記載の抗腫瘍剤。
［３］ 前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体である［１］又は［２］に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１にかかるポリペプチドＴＮIIIＡ２誘導性の細胞接着に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の抑制効果を示す図である。
【図２】本発明の実施例２にかかる基底膜下浸潤実験の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３にかかる細胞増殖実験（ＷＳＴアッセイ）の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（対照群）の結果を示す染色像である。
【図４Ｂ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（ＴＮIIIＡ２添加群）の結果を示す染色像である。
【図４Ｃ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（ＴＮ−Ｃ添加群）の結果を示す染色像である。
【図５Ａ】本発明の実施例４にかかる乳癌組織の免疫染色像（抗ＴＮ−Ｃ抗体）の結果を示す染色像である。
【図５Ｂ】本発明の実施例４にかかる乳癌組織の免疫染色像（抗ＴＮIIIＡ２抗体）の結果を示す染色像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗腫瘍剤は、ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部位に由来するペプチドを認識する抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むものである。
本発明によれば、上記抗ＴＮIIIＡ２抗体が、腫瘍細胞の増殖及び浸潤に対する阻害能を有するので、抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍の治療又は予防剤として使用することができる。
即ち、腫瘍の転移などに大きく関与することが示唆されているＭＭＰ（マトリックス・メタロ・プロテアーゼ）が存在すると、テネイシンＣからＴＮIIIＡ２様断片が遊離し、腫瘍細胞上のインテグリンが活性化することにより、腫瘍細胞の増殖が過剰となるばかりか、腫瘍細胞が基底膜を超えて移動（浸潤）する。特定の理論には拘束されないが、このような機能を有するＴＮIIIＡ２の作用を抗ＴＮIIIＡ２抗体が阻害することによって、腫瘍形成やその悪性化が効果的に抑制され、その結果、腫瘍の治療効果を奏するものと推測される。
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１４】
本発明における抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトテネイシンＣのＦＮIII様ドメインのＡ２配列部分に由来するペプチド（ＴＮIIIＡ２）を認識できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
また、抗原認識部位が保存されていれば免疫反応性の断片であってもよい。
【００１５】
ＴＮIIIＡ２は、ＲＳＴＤＬＰＧＬＫＡＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＣ（配列番号１）の２２個のアミノ酸からなるペプチドである（J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937（2007）参照）。本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ＴＮIIIＡ２を認識する抗体であって、配列番号１で示されるＴＮIIIＡ２のアミノ酸配列のうち少なくとも一部をエピトープとするものである。抗ＴＮIIIＡ２に認識されるエピトープとしては、ＹＴＩＴＩＲＧＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであればよい。
【００１６】
前記ＴＮIIIＡ２を認識する抗体を作製するために用いられるペプチド、即ち本発明にかかる抗ＴＮIIIＡ２抗体が認識するペプチド（標的ペプチド）としては、配列番号２を含むペプチドであればよく、全長（配列番号１）であってもよい。抗原性や安定性を高める観点から、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに、リンカー機能又はリンカー機能を有する１つ以上の化合物、たとえばアミノ酸を追加してもよい。このような付加的なアミノ酸としては、キャリアタンパク質を結合するためのアミノ酸を配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに付与可能とするアミノ酸を挙げることができ、例えばシステイン又はスレオニン、その他、例えば酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸等を挙げることができ、これらを１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。標的ペプチドとしては、中でも、ＣＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴ（配列番号３）のアミノ酸配列であることが、抗体作製効率の観点から更に好ましい。
【００１７】
前記ＴＮIIIＡ２を認識する抗体は、上述した標的ペプチドを用いて、通常行われる方法によって調製することができる。
例えば、ポリクローナル抗体であれば、次のようにして得てもよい。前記配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列のいずれか又はこれらの混合物を標的ペプチドとして使用し、この標的ペプチドをウサギ等の小動物に免疫して血清を得る。得られた血清を公知の抗体精製手段、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１８】
また、例えばモノクローナル抗体であれば、前記標的ペプチドを、マウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、前記標的ペプチドと結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１９】
なお標的ペプチドは、抗原性を高めるために公知のキャリアタンパク質との融合タンパク質として免役に用いてもよい。このようなキャリアタンパク質としては、この目的で使用される公知の分子であれば特に制限なく使用することができ、例えば、ＫＬＨ、ＧＳＴ、ＢＳＡなどを挙げることができる。
【００２０】
本抗ＴＮIIIＡ２抗体によって増殖又は浸潤が阻害される腫瘍の種類としては、特に制限はなく、肉腫又は癌のいずれであってもよく、例えば、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、肝細胞癌、大腸癌、膵臓癌、頭頚部癌及び前立腺癌などの癌や、線維肉腫、骨肉腫などの肉腫類、或いは神経膠腫などを挙げることができるが、特に、浸潤を起こしやすい乳癌、肺癌、神経膠腫などに対して適用されることが好ましい。
【００２１】
本発明の抗腫瘍剤は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。また投与量についても患者の年齢、症状等により適宜選択することができる。
【００２２】
本発明の抗腫瘍剤は、投与経路に応じて医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の抗腫瘍剤は、抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むものであればよく、抗ＴＮIIIＡ２抗体に他の物質を結合した融合型抗ＴＮIIIＡ２抗体としてもよい。抗ＴＮIIIＡ２抗体に融合可能な物質としては、例えば、ドキソルビシン、シスプラチン等の他の抗腫瘍剤を挙げることができる。これにより、抗ＴＮIIIＡ２抗体による直接的な抗腫瘍活性のみならず、融合された抗腫瘍剤による抗腫瘍効果も期待できる。抗ＴＮIIIＡ２抗体にこれらの他の抗腫瘍剤を融合する場合には、抗ＴＮIIIＡ２抗体の活性を損なわない限り、例えば、リンカーを介して共有結合することによって、或いは金属イオンとの配位結合などの当業界で既知の融合又は結合方法を適用して、抗ＴＮIIIＡ２抗体の活性を損なわない部位、例えば抗体の定常域（Ｃ領域）などに、対象となる他の抗腫瘍剤を融合又は結合することができる。
【００２４】
また、本発明は、腫瘍の疑いのある患者又は腫瘍が既に発生している患者に対して、本発明にかかる抗腫瘍剤を投与することを含む腫瘍の治療方法を含む。ここで、「治療」には、症状の改善であればよく、病巣の肥大抑制又は縮小、転移速度の緩和又は転移の停止も、確認できる範囲でこの用語に包含される。
【００２５】
患者への投与量としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、一般に、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤、好ましくは静脈内注射とすることができる。
患者への投与方法としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤を挙げることができ、これらの投与方法から患者の状態によって適宜選択すればよい。本発明の抗体の治療上有効用量は、症状の程度や患者の状態によって異なるが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができるが、これに限定されない。また、投与頻度は、例えば、毎日２回ないし１週間に１回の範囲とすることができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００２７】
［実施例１］
＜抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の作製＞
アミノ酸配列ＣＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴ（配列番号３）を有するペプチドを、常法により合成した。合成したペプチドを、ハプテンとしてＫＬＨに融合し、得られた融合ペプチドを抗原ペプチドとして用いた。免疫は家兎を用いた通常の方法に従って行った。得られた目的とする抗体を含む混合物を通常の方法により精製した。
以上のようにして、ヒトＴＮIIIＡ２に対するポリクローナル抗体（抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体）を３種類（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３）得た。
【００２８】
＜抗体活性の評価＞
上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２ポリクローナル抗体の抗体活性を、ヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着の抑制作用を指標とし、以下のようにして評価した。結果を図１に示した。
【００２９】
細胞培地としてＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社）（２０％ＦＢＳ（JRH Biosciences社）添加）を用い、ＫＯＰ２．１６細胞（マウス骨髄由来血管内皮細胞株）を９６穴プレートの各ウェルに５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。培養上清の１００μＬを取り除き、２０％ＴＣＡ水溶液を１００μＬ添加した後、４℃で一晩もしくは常温で１時間放置して固相化した。これをＰＢＳ×５、ＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）×１、ＰＢＳ×１で順次洗浄し、各ウェルをＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートを作製した。
【００３０】
上記で得られたＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートの各ウェルに１２．５μｇ／ｍＬのヒトＴＮIIIＡ２を含むＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）を加えた。上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体（Ｎｏ．１〜３）を濃度が１．５μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、Ｋ５６２細胞（白血病細胞株）を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でそれぞれ播種して、３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養した。
ホルマリンを添加してさらに１時間常温で放置して固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、リリーマイヤー・ヘマトキシリン染色を行なった。光学顕微鏡で観察し、所定の視野内の接着細胞数を計数した。
【００３１】
図１から、正常ウサギＩｇＧではヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着は抑制されないのに対して、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は細胞接着を用量依存的に抑制することが分かる。またＮｏ．１〜３のいずれの抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体も同等の抗体活性を示すことが分かる。さらに本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、マグネシウムイオンで誘導される細胞接着の抑制作用を示さなかった。
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトＴＮIIIＡ２に特異的に結合し、その機能を抑制できることが分かる。
【００３２】
［実施例２］
＜浸潤阻害活性評価＞
乳癌細胞を用いて、腫瘍細胞の基底膜下浸潤に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして評価した。
なお、基底膜モデルとしては、ＥＨＳマトリゲルを被覆したメンブレンフィルターを使用した。比較対象として用いた４Ｆ１０ＴＴ抗体は、ＴＮ−Ｃ分子内のＥＧＦ様ドメインをエピトープとする抗ヒトテネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）抗体（ＩＢＬ社）を用いた。ヒトテネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ、又はＴＮＣ）は、ヒト由来黒色皮腫細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（理研セルバンクから購入）を大量に培養し、コンフレント到達後に培地を無血清のＤＭＥＭと入れ替え、その１週間後に回収された培養上清を、以前に報告された方法（J. Tissue Culture Methods., Vol.16, pp.201-204 (1994)）に従い精製したものを使用した。マウス乳癌細胞株ＭＭＴ細胞がタンパク質分解酵素ＭＭＰを産生することは、確認済みである（データなし）。
【００３３】
基底膜マトリックスとしてＥＨＳ肉腫粗抽出物（６．０ｍｇ／ｍＬ；岩城硝子社）を０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳで５倍に希釈したものに、フィブロネクチン（ＦＮ：J. Biol. Chem., Vol.226, pp.8807-8813 (1991)に記載された方法に従って精製）を１０μｇ／ｍＬで加え、その溶液をガラス板上に滴下し、その上から多孔性（５．０μｍ）メンブレンフィルターを被せ、４℃かつ湿潤条件下で一晩放置することによって、フィルターにＥＨＳ肉腫粗抽出物とフィブロネクチンとの混合物（以下、「マトリゲル」）を被覆した。
このフィルターを、マトリゲル被覆面を下にしてトランスウェルチャンバーにセットした。ＲＰＭＩ１６４０（０．５％透析ウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）添加）を用いて３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＭＭＴ細胞（マウス乳腫瘍細胞株）を、チャンバーの上室に播種した。次いで、ＴＮ−Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＴＮＩＩＩＡ２抗体（２０μｇ／ｍｌ）及び４Ｆ１０ＴＴ抗体（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００３４】
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間インキュベートした後、フィルターの上側を綿棒で擦り、非浸潤細胞を取り除いた。その後フィルターを回収し、４％ホルマリン／５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液に浸し、室温で１時間放置することでフィルターの下側へ浸潤した細胞を固定した。クリスタルバイオレット染色液で細胞を染色した後、１００倍顕微鏡下であらかじめ決められた４領域の浸潤細胞数を計測した。
結果を表１及び図２に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１及び図２に示されるように、ＴＮ−Ｃを加えると浸潤する細胞数が増加していることから、ＴＮ−Ｃの存在によって癌が転移することが示唆された。このようなＴＮ−Ｃの存在下に抗ＴＮIIIＡ２抗体を添加すると、浸潤する細胞数が低下することから、抗ＴＮIIIＡ２抗体によってＴＮ−Ｃの効果が抑制されることがわかった。それに対して、ＴＮ−Ｃの他の領域に対する公知の抗体４Ｆ１０ＴＴを加えても、浸潤する細胞数は低下しなかった。
このことから、抗ＴＮIIIＡ２抗体は、基底膜を越えて細胞が浸潤することを抑制できるとわかる。
【００３７】
［実施例３］
＜増殖阻害活性評価＞
（１）乳癌細胞の増殖試験
乳癌細胞を用いて、腫瘍細胞の増殖に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして評価した。
９６穴プレートにＲＰＭＩ１６４０（０．５％ｄＦＢＳ）で１．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＭＴＴ細胞を、ＴＮ−Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＴＮＩＩＩＡ２抗体（２０μｇ／ｍｌ）、４Ｆ１０ＴＴ抗体（２０μｇ／ｍｌ）又はＭＭＰ−２／−９阻害剤（２５μＭ）とともに播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、ＷＳＴ法に準じてＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同人化学社）を用いて評価した。
結果を表２及び図３に示す。なお吸光度はＯ．Ｄ．４５０ｎｍの値である。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２及び図３に示されるように、ＭＭＰ−２／−９阻害剤および抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ＴＮ−Ｃが誘導するＭＭＴの増殖促進を抑制することが分かった。さらに、ペプチドＴＮIIIＡ２を単独で添加すると、ＭＭＴの生存／増殖は、ＴＮIIIＡ２の濃度依存的に促進した（データ示さず）。従って、ＴＮ−Ｃ分子中のＴＮIIIＡ２活性部位がＭＭＴの生存／増殖を促進することがわかった。
【００４０】
（２）正常細胞の増殖試験
正常細胞株を用いて、正常細胞の悪性化に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして検討した。
９６穴プレートにＤＭＥＭ（日水製薬社）（１０％ＣＳ（JRH Biosciences社）添加）で２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＴＮIIIＡ２（５０μｇ／ｍｌ）またはＴＮ−Ｃ（５μｇ／ｍｌ）とともに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。１週間後に培地の半分を入れ替え、更に１週間後にクリスタルバイオレットで細胞を染色した後、１００倍顕微鏡下で細胞塊の形成を評価した。
結果を図４に示す。
【００４１】
図４Ａに示されるように、対照群では、細胞は増殖して単一層を形成後、単一層を維持していた。即ち、対照群では増殖しても細胞間の接触が生じると増殖を停止する接触阻害を示し、正常細胞の性状を示した。
これに対してＴＮIIIＡ２を添加した細胞群（図４Ｂ）及びＴＮ−Ｃを添加した細胞群（図４Ｃ）ではいずれも、フォーカス形成と思われる細胞の重層化の促進が認められた。即ち、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃは、正常細胞の悪性化に密接に関与していることが示唆された。
従って、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃによる正常細胞の悪性化は、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃの活性を阻止する物質、例えば、実施例２においてＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃの浸潤阻害を誘導した抗ＴＮIIIＡ２抗体を添加することにより、効果的に阻止できる。
【００４２】
［実施例４］
＜乳癌組織におけるＴＮIIIＡ２の発現＞
実際の腫瘍組織における抗ＴＮIIIＡ２抗体の効果を検討するため、腫瘍組織におけるＴＮ−Ｃ及びＴＮIIIＡ２の局在を以下のようにして確認した。
ヒト乳がん組織標本（パラフィン切片）には、三重大学医学部付属病院で乳がんの診断で切除された組織を、倫理委員会の承認の下、患者の同意を得て用いた。本切片を常法にしたがい脱パラフィン後、抗ＴＮ−Ｃモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ抗体）又は抗ＴＮIIIＡ２ポリクローナル抗体を用いてＰＡＰ（ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体）法により免疫染色し、ＴＮ−ＣおよびＴＮIIIＡ２の局在を評価した。
結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す（２００倍）。黒矢頭は染色された部分を示す。
【００４３】
図５Ｂに示されるように、乳癌組織に対する抗ＴＮIIIＡ２抗体による染色は、基底膜及び胞巣間質に比較的広範に認められた。また図５Ａに示されるように、抗ＴＮ−Ｃ抗体による染色も同様であった。ＴＮIIIＡ２は、通常ＴＮ−Ｃ分子内では立体構造的に隠蔽されており、ＭＭＰ−２を始めとするタンパク質分解酵素の作用等により露出することが確認されている。これらのことから、乳癌組織での抗ＴＮIIIＡ２抗体による染色によって、乳癌組織においてＴＮIIIＡ２の露出が増大していることが示された。このことは、in vitro だけでなく、腫瘍組織においてもＴＮIIIＡ２が露出しており、周囲の腫瘍細胞に対して影響を与えていることを示しており、生体への抗ＴＮIIIＡ２抗体を投与することによりその影響を阻害できることが示唆された。
【００４４】
このように、ＴＮIIIＡ２は、腫瘍細胞の浸潤及び重層化を伴う細胞増殖を促進する作用を有することが明らかとなり、抗ＴＮIIIＡ２抗体を用いることによって、このようなＴＮIIIＡ２の活性を阻止できることが示された。
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIＡ２抗体は、腫瘍細胞の浸潤及び増殖を阻害し、腫瘍の悪性化を効果的に抑制できることが分かる。
【００４５】
従って、本発明によれば、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍又は癌の治療としては、化学療法、放射線治療法及び外科療法などが知られており、例えば癌の発症メカニズム等に基づいて種々の治療方法が開発されているが、癌の転移や再発などの問題もあって、より効果的な治療方法を目指して未だに開発が続けられている。
例えば、特許文献１には、新規な癌転移関連遺伝子を同定し、このインビボにおける機能を阻害若しくは抑制する核酸を含む癌の転移抑制用組成物が開示されている。
また特許文献２には、癌細胞の遊走に関与し、癌の浸潤及び癌の転移を抑制することが推測されているリン酸化βカテニンを選択的に認識する抗体と、これを含む癌の治療剤や癌の診断剤等を開示している。
【０００３】
一方、テネイシンＣは、免疫組織を除いた正常細胞においてはほとんど発現が認められないが、炎症、腫瘍等の病態時に発現が誘導される化合物である。
テネイシンＣを検出する方法として、いくつかの抗テネイシンＣ抗体が知られている（例えば、特許文献３、４参照）。またテネイシンＣをマーカーとして、関節炎の診断を行なう方法が知られている（例えば、特許文献５参照）。
【０００４】
テネイシンＣを構成するポリペプチドには、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチン（ＦＮ）III様ドメイン、およびフィブリノーゲン様ドメインが含まれている。このうちフィブロネクチンIII様ドメインでは、基本的な８種の反復配列（１〜８）と、その５番目と６番目の間に挿入される９種のスプライシングされる反復配列（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）とが連続していることが知られている。
【０００５】
またこれらのスプライシングされる反復配列部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であり、テネイシンＣがＭＭＰにより切断されて生成するペプチドは種々の機能を有していると考えられている。
例えば、このテネイシンＣのＦＮIII様ドメインにおけるＡ２ドメインに由来するペプチド（以下、「ＴＮIIIＡ２」ということがある）は、インテグリンの活性化を引き起こすペプチドとして知られている（例えば、非特許文献１参照）。
また、テネイシンＣのＦＮIIIの反復配列のうちＢドメインには、乳癌細胞株に対して遊走促進作用、及びＤＮＡ合成活性向上作用があることが知られている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０４７１６号公報
【特許文献２】特開２００５−８９３５４号公報
【特許文献３】特開２００４−２１７５４６号公報
【特許文献４】特開２００２−２３４９００号公報
【特許文献５】特開２００４−１３８４８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937, (2007)
【非特許文献２】J.Pathol.,Vol.162, pp.1857-1867,(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍又は癌の治療には、周囲の正常細胞に対する影響を抑えつつ腫瘍細胞の活性のみを選択的に阻害することが求められる。このため、腫瘍細胞の悪性化に特徴的とも言える増殖態様や転移に対して効果的な阻害活性を示す抗腫瘍剤が必要となる。
従って本発明の目的は、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］ ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
［２］ 前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体である［１］に記載の抗腫瘍剤。
［３］ 前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体である［１］又は［２］に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１にかかるポリペプチドＴＮIIIＡ２誘導性の細胞接着に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の抑制効果を示す図である。
【図２】本発明の実施例２にかかる基底膜下浸潤実験の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３にかかる細胞増殖実験（ＷＳＴアッセイ）の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（対照群）の結果を示す染色像である。
【図４Ｂ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（ＴＮIIIＡ２添加群）の結果を示す染色像である。
【図４Ｃ】本発明の実施例３にかかるフォーカス形成実験（ＴＮ−Ｃ添加群）の結果を示す染色像である。
【図５Ａ】本発明の実施例４にかかる乳癌組織の免疫染色像（抗ＴＮ−Ｃ抗体）の結果を示す染色像である。
【図５Ｂ】本発明の実施例４にかかる乳癌組織の免疫染色像（抗ＴＮIIIＡ２抗体）の結果を示す染色像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗腫瘍剤は、ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部位に由来するペプチドを認識する抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むものである。
本発明によれば、上記抗ＴＮIIIＡ２抗体が、腫瘍細胞の増殖及び浸潤に対する阻害能を有するので、抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍の治療又は予防剤として使用することができる。
即ち、腫瘍の転移などに大きく関与することが示唆されているＭＭＰ（マトリックス・メタロ・プロテアーゼ）が存在すると、テネイシンＣからＴＮIIIＡ２様断片が遊離し、腫瘍細胞上のインテグリンが活性化することにより、腫瘍細胞の増殖が過剰となるばかりか、腫瘍細胞が基底膜を超えて移動（浸潤）する。特定の理論には拘束されないが、このような機能を有するＴＮIIIＡ２の作用を抗ＴＮIIIＡ２抗体が阻害することによって、腫瘍形成やその悪性化が効果的に抑制され、その結果、腫瘍の治療効果を奏するものと推測される。
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１４】
本発明における抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトテネイシンＣのＦＮIII様ドメインのＡ２配列部分に由来するペプチド（ＴＮIIIＡ２）を認識できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
また、抗原認識部位が保存されていれば免疫反応性の断片であってもよい。
【００１５】
ＴＮIIIＡ２は、ＲＳＴＤＬＰＧＬＫＡＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＣ（配列番号１）の２２個のアミノ酸からなるペプチドである（J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937（2007）参照）。本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ＴＮIIIＡ２を認識する抗体であって、配列番号１で示されるＴＮIIIＡ２のアミノ酸配列のうち少なくとも一部をエピトープとするものである。抗ＴＮIIIＡ２に認識されるエピトープとしては、ＹＴＩＴＩＲＧＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであればよい。
【００１６】
前記ＴＮIIIＡ２を認識する抗体を作製するために用いられるペプチド、即ち本発明にかかる抗ＴＮIIIＡ２抗体が認識するペプチド（標的ペプチド）としては、配列番号２を含むペプチドであればよく、全長（配列番号１）であってもよい。抗原性や安定性を高める観点から、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに、リンカー機能又はリンカー機能を有する１つ以上の化合物、たとえばアミノ酸を追加してもよい。このような付加的なアミノ酸としては、キャリアタンパク質を結合するためのアミノ酸を配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに付与可能とするアミノ酸を挙げることができ、例えばシステイン又はスレオニン、その他、例えば酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸等を挙げることができ、これらを１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。標的ペプチドとしては、中でも、ＣＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴ（配列番号３）のアミノ酸配列であることが、抗体作製効率の観点から更に好ましい。
【００１７】
前記ＴＮIIIＡ２を認識する抗体は、上述した標的ペプチドを用いて、通常行われる方法によって調製することができる。
例えば、ポリクローナル抗体であれば、次のようにして得てもよい。前記配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列のいずれか又はこれらの混合物を標的ペプチドとして使用し、この標的ペプチドをウサギ等の小動物に免疫して血清を得る。得られた血清を公知の抗体精製手段、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１８】
また、例えばモノクローナル抗体であれば、前記標的ペプチドを、マウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、前記標的ペプチドと結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１９】
なお標的ペプチドは、抗原性を高めるために公知のキャリアタンパク質との融合タンパク質として免役に用いてもよい。このようなキャリアタンパク質としては、この目的で使用される公知の分子であれば特に制限なく使用することができ、例えば、ＫＬＨ、ＧＳＴ、ＢＳＡなどを挙げることができる。
【００２０】
本抗ＴＮIIIＡ２抗体によって増殖又は浸潤が阻害される腫瘍の種類としては、特に制限はなく、肉腫又は癌のいずれであってもよく、例えば、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、肝細胞癌、大腸癌、膵臓癌、頭頚部癌及び前立腺癌などの癌や、線維肉腫、骨肉腫などの肉腫類、或いは神経膠腫などを挙げることができるが、特に、浸潤を起こしやすい乳癌、肺癌、神経膠腫などに対して適用されることが好ましい。
【００２１】
本発明の抗腫瘍剤は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。また投与量についても患者の年齢、症状等により適宜選択することができる。
【００２２】
本発明の抗腫瘍剤は、投与経路に応じて医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の抗腫瘍剤は、抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むものであればよく、抗ＴＮIIIＡ２抗体に他の物質を結合した融合型抗ＴＮIIIＡ２抗体としてもよい。抗ＴＮIIIＡ２抗体に融合可能な物質としては、例えば、ドキソルビシン、シスプラチン等の他の抗腫瘍剤を挙げることができる。これにより、抗ＴＮIIIＡ２抗体による直接的な抗腫瘍活性のみならず、融合された抗腫瘍剤による抗腫瘍効果も期待できる。抗ＴＮIIIＡ２抗体にこれらの他の抗腫瘍剤を融合する場合には、抗ＴＮIIIＡ２抗体の活性を損なわない限り、例えば、リンカーを介して共有結合することによって、或いは金属イオンとの配位結合などの当業界で既知の融合又は結合方法を適用して、抗ＴＮIIIＡ２抗体の活性を損なわない部位、例えば抗体の定常域（Ｃ領域）などに、対象となる他の抗腫瘍剤を融合又は結合することができる。
【００２４】
また、本発明は、腫瘍の疑いのある患者又は腫瘍が既に発生している患者に対して、本発明にかかる抗腫瘍剤を投与することを含む腫瘍の治療方法を含む。ここで、「治療」には、症状の改善であればよく、病巣の肥大抑制又は縮小、転移速度の緩和又は転移の停止も、確認できる範囲でこの用語に包含される。
【００２５】
患者への投与量としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、一般に、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤、好ましくは静脈内注射とすることができる。
患者への投与方法としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤を挙げることができ、これらの投与方法から患者の状態によって適宜選択すればよい。本発明の抗体の治療上有効用量は、症状の程度や患者の状態によって異なるが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができるが、これに限定されない。また、投与頻度は、例えば、毎日２回ないし１週間に１回の範囲とすることができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００２７】
［実施例１］
＜抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の作製＞
アミノ酸配列ＣＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴ（配列番号３）を有するペプチドを、常法により合成した。合成したペプチドを、ハプテンとしてＫＬＨに融合し、得られた融合ペプチドを抗原ペプチドとして用いた。免疫は家兎を用いた通常の方法に従って行った。得られた目的とする抗体を含む混合物を通常の方法により精製した。
以上のようにして、ヒトＴＮIIIＡ２に対するポリクローナル抗体（抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体）を３種類（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３）得た。
【００２８】
＜抗体活性の評価＞
上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２ポリクローナル抗体の抗体活性を、ヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着の抑制作用を指標とし、以下のようにして評価した。結果を図１に示した。
【００２９】
細胞培地としてＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社）（２０％ＦＢＳ（JRH Biosciences社）添加）を用い、ＫＯＰ２．１６細胞（マウス骨髄由来血管内皮細胞株）を９６穴プレートの各ウェルに５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。培養上清の１００μＬを取り除き、２０％ＴＣＡ水溶液を１００μＬ添加した後、４℃で一晩もしくは常温で１時間放置して固相化した。これをＰＢＳ×５、ＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）×１、ＰＢＳ×１で順次洗浄し、各ウェルをＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートを作製した。
【００３０】
上記で得られたＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートの各ウェルに１２．５μｇ／ｍＬのヒトＴＮIIIＡ２を含むＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）を加えた。上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体（Ｎｏ．１〜３）を濃度が１．５μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、Ｋ５６２細胞（白血病細胞株）を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でそれぞれ播種して、３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養した。
ホルマリンを添加してさらに１時間常温で放置して固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、リリーマイヤー・ヘマトキシリン染色を行なった。光学顕微鏡で観察し、所定の視野内の接着細胞数を計数した。
【００３１】
図１から、正常ウサギＩｇＧではヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着は抑制されないのに対して、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は細胞接着を用量依存的に抑制することが分かる。またＮｏ．１〜３のいずれの抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体も同等の抗体活性を示すことが分かる。さらに本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、マグネシウムイオンで誘導される細胞接着の抑制作用を示さなかった。
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトＴＮIIIＡ２に特異的に結合し、その機能を抑制できることが分かる。
【００３２】
［実施例２］
＜浸潤阻害活性評価＞
乳癌細胞を用いて、腫瘍細胞の基底膜下浸潤に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして評価した。
なお、基底膜モデルとしては、ＥＨＳマトリゲルを被覆したメンブレンフィルターを使用した。比較対象として用いた４Ｆ１０ＴＴ抗体は、ＴＮ−Ｃ分子内のＥＧＦ様ドメインをエピトープとする抗ヒトテネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）抗体（ＩＢＬ社）を用いた。ヒトテネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ、又はＴＮＣ）は、ヒト由来黒色皮腫細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（理研セルバンクから購入）を大量に培養し、コンフレント到達後に培地を無血清のＤＭＥＭと入れ替え、その１週間後に回収された培養上清を、以前に報告された方法（J. Tissue Culture Methods., Vol.16, pp.201-204 (1994)）に従い精製したものを使用した。マウス乳癌細胞株ＭＭＴ細胞がタンパク質分解酵素ＭＭＰを産生することは、確認済みである（データなし）。
【００３３】
基底膜マトリックスとしてＥＨＳ肉腫粗抽出物（６．０ｍｇ／ｍＬ；岩城硝子社）を０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳで５倍に希釈したものに、フィブロネクチン（ＦＮ：J. Biol. Chem., Vol.226, pp.8807-8813 (1991)に記載された方法に従って精製）を１０μｇ／ｍＬで加え、その溶液をガラス板上に滴下し、その上から多孔性（５．０μｍ）メンブレンフィルターを被せ、４℃かつ湿潤条件下で一晩放置することによって、フィルターにＥＨＳ肉腫粗抽出物とフィブロネクチンとの混合物（以下、「マトリゲル」）を被覆した。
このフィルターを、マトリゲル被覆面を下にしてトランスウェルチャンバーにセットした。ＲＰＭＩ１６４０（０．５％透析ウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）添加）を用いて３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＭＭＴ細胞（マウス乳腫瘍細胞株）を、チャンバーの上室に播種した。次いで、ＴＮ−Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＴＮＩＩＩＡ２抗体（２０μｇ／ｍｌ）及び４Ｆ１０ＴＴ抗体（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００３４】
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間インキュベートした後、フィルターの上側を綿棒で擦り、非浸潤細胞を取り除いた。その後フィルターを回収し、４％ホルマリン／５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液に浸し、室温で１時間放置することでフィルターの下側へ浸潤した細胞を固定した。クリスタルバイオレット染色液で細胞を染色した後、１００倍顕微鏡下であらかじめ決められた４領域の浸潤細胞数を計測した。
結果を表１及び図２に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１及び図２に示されるように、ＴＮ−Ｃを加えると浸潤する細胞数が増加していることから、ＴＮ−Ｃの存在によって癌が転移することが示唆された。このようなＴＮ−Ｃの存在下に抗ＴＮIIIＡ２抗体を添加すると、浸潤する細胞数が低下することから、抗ＴＮIIIＡ２抗体によってＴＮ−Ｃの効果が抑制されることがわかった。それに対して、ＴＮ−Ｃの他の領域に対する公知の抗体４Ｆ１０ＴＴを加えても、浸潤する細胞数は低下しなかった。
このことから、抗ＴＮIIIＡ２抗体は、基底膜を越えて細胞が浸潤することを抑制できるとわかる。
【００３７】
［実施例３］
＜増殖阻害活性評価＞
（１）乳癌細胞の増殖試験
乳癌細胞を用いて、腫瘍細胞の増殖に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして評価した。
９６穴プレートにＲＰＭＩ１６４０（０．５％ｄＦＢＳ）で１．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＭＴＴ細胞を、ＴＮ−Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＴＮＩＩＩＡ２抗体（２０μｇ／ｍｌ）、４Ｆ１０ＴＴ抗体（２０μｇ／ｍｌ）又はＭＭＰ−２／−９阻害剤（２５μＭ）とともに播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、ＷＳＴ法に準じてＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同人化学社）を用いて評価した。
結果を表２及び図３に示す。なお吸光度はＯ．Ｄ．４５０ｎｍの値である。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２及び図３に示されるように、ＭＭＰ−２／−９阻害剤および抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ＴＮ−Ｃが誘導するＭＭＴの増殖促進を抑制することが分かった。さらに、ペプチドＴＮIIIＡ２を単独で添加すると、ＭＭＴの生存／増殖は、ＴＮIIIＡ２の濃度依存的に促進した（データ示さず）。従って、ＴＮ−Ｃ分子中のＴＮIIIＡ２活性部位がＭＭＴの生存／増殖を促進することがわかった。
【００４０】
（２）正常細胞の増殖試験
正常細胞株を用いて、正常細胞の悪性化に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の阻害活性を以下のようにして検討した。
９６穴プレートにＤＭＥＭ（日水製薬社）（１０％ＣＳ（JRH Biosciences社）添加）で２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＴＮIIIＡ２（５０μｇ／ｍｌ）またはＴＮ−Ｃ（５μｇ／ｍｌ）とともに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。１週間後に培地の半分を入れ替え、更に１週間後にクリスタルバイオレットで細胞を染色した後、１００倍顕微鏡下で細胞塊の形成を評価した。
結果を図４に示す。
【００４１】
図４Ａに示されるように、対照群では、細胞は増殖して単一層を形成後、単一層を維持していた。即ち、対照群では増殖しても細胞間の接触が生じると増殖を停止する接触阻害を示し、正常細胞の性状を示した。
これに対してＴＮIIIＡ２を添加した細胞群（図４Ｂ）及びＴＮ−Ｃを添加した細胞群（図４Ｃ）ではいずれも、フォーカス形成と思われる細胞の重層化の促進が認められた。即ち、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃは、正常細胞の悪性化に密接に関与していることが示唆された。
従って、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃによる正常細胞の悪性化は、ＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃの活性を阻止する物質、例えば、実施例２においてＴＮIIIＡ２及びＴＮ−Ｃの浸潤阻害を誘導した抗ＴＮIIIＡ２抗体を添加することにより、効果的に阻止できる。
【００４２】
［実施例４］
＜乳癌組織におけるＴＮIIIＡ２の発現＞
実際の腫瘍組織における抗ＴＮIIIＡ２抗体の効果を検討するため、腫瘍組織におけるＴＮ−Ｃ及びＴＮIIIＡ２の局在を以下のようにして確認した。
ヒト乳がん組織標本（パラフィン切片）には、三重大学医学部付属病院で乳がんの診断で切除された組織を、倫理委員会の承認の下、患者の同意を得て用いた。本切片を常法にしたがい脱パラフィン後、抗ＴＮ−Ｃモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ抗体）又は抗ＴＮIIIＡ２ポリクローナル抗体を用いてＰＡＰ（ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体）法により免疫染色し、ＴＮ−ＣおよびＴＮIIIＡ２の局在を評価した。
結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す（２００倍）。黒矢頭は染色された部分を示す。
【００４３】
図５Ｂに示されるように、乳癌組織に対する抗ＴＮIIIＡ２抗体による染色は、基底膜及び胞巣間質に比較的広範に認められた。また図５Ａに示されるように、抗ＴＮ−Ｃ抗体による染色も同様であった。ＴＮIIIＡ２は、通常ＴＮ−Ｃ分子内では立体構造的に隠蔽されており、ＭＭＰ−２を始めとするタンパク質分解酵素の作用等により露出することが確認されている。これらのことから、乳癌組織での抗ＴＮIIIＡ２抗体による染色によって、乳癌組織においてＴＮIIIＡ２の露出が増大していることが示された。このことは、in vitro だけでなく、腫瘍組織においてもＴＮIIIＡ２が露出しており、周囲の腫瘍細胞に対して影響を与えていることを示しており、生体への抗ＴＮIIIＡ２抗体を投与することによりその影響を阻害できることが示唆された。
【００４４】
このように、ＴＮIIIＡ２は、腫瘍細胞の浸潤及び重層化を伴う細胞増殖を促進する作用を有することが明らかとなり、抗ＴＮIIIＡ２抗体を用いることによって、このようなＴＮIIIＡ２の活性を阻止できることが示された。
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIＡ２抗体は、腫瘍細胞の浸潤及び増殖を阻害し、腫瘍の悪性化を効果的に抑制できることが分かる。
【００４５】
従って、本発明によれば、腫瘍の悪性化を効果的に抑制する抗腫瘍剤を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するポリペプチドを認識する抗体を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体である請求項１又は請求項２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１】
ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するポリペプチドを認識する抗体を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体である請求項１又は請求項２に記載の抗腫瘍剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−３１０８４（Ｐ２０１２−３１０８４Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７０９７５（Ｐ２０１０−１７０９７５）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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