新規血管新生阻害剤及びその製造方法
【課題】本発明は、安価なブラジル産パフィアの根茎から抽出されてなる安全性に優れた血管新生阻害組成物を提供する。
【解決手段】ブラジル産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤、該血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の治療剤。
【解決手段】ブラジル産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤、該血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、南米ブラジル産パフィア由来の成分を有効成分とする血管新生阻害作用を有する組成物に関するものである。さらに詳しくは、本発明はパフィアの根からの抽出物を有効成分とする血管新生阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、わが国の死因の第一位の疾患であり、罹患率も一貫して増加し続けている。厚生労働省の人口動態統計によると、現在では３人に1人という高い割合で、何らかの悪性腫瘍が原因で死亡している。
【０００３】
悪性腫瘍の治療法としては、医療現場では主に薬物、化学、物理などの各療法により、悪性腫瘍を直接攻撃するという対症療法が施されている。しかし、これらの方法では、悪性腫瘍だけでなく周りの正常な組織にも障害を与え、さらに生体が本来持っている免疫力や自然治癒力までも急激に低下させることになり、それが原因で患者が死に至る場合が多い。このようなことから、副作用の少ない安全な治療法に対する要望は日々高まりを見せており、罹患した場合の新たな治療法の開発に加えて、罹患しないための予防にも重点がおかれるようになっている。
【０００４】
最近、新たな悪性腫瘍の治療法として、悪性腫瘍組織の血管の新生を阻害することを応用する方法が注目されている。悪性腫瘍組織は、血管新生を促進するための物質を産生することで、自らの組織に栄養分や酸素等を吸収するための血管を新たに形成し、十分な血液を供給し続け、異常な増殖を繰り返すという性質を持っている。血管新生阻害作用を応用した悪性腫瘍の治療は、この腫瘍組織への血液の経路を遮断して腫瘍組織の増殖を防ぐものである。
【０００５】
血管新生抑制作用は、悪性腫瘍のみではなく、加齢性黄斑変性症、リウマチ、関節症、糖尿病や糖尿病性網膜症、心臓病、動脈硬化、腎臓病、その他の様々な疾患に深く関与していることから、これらの疾患に対して予防および副作用が無く安全に治療する上においても、天然物由来の血管新生抑制作用を有する物質の早期提供が強く求められており、今や、世界中の製薬企業が血管新生阻害剤の探索・開発に取り組んでいる。
【０００６】
血管新生阻害作用を有する天然物由来の活性成分としては、例えば、特許文献１〜４に報告例がある。
【０００７】
特許文献１には、血管新生阻害活性を有するシイタケ菌糸体抽出物、および血管新生を阻害すべき疾患を治療するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む医薬組成物、もしくは血管新生を阻害するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物が記載されている。
【０００８】
特許文献２には、Streptomyces系微生物の培養液を原料として、血管新生阻害物質をスクリーニングし精製した結果、ボレリジン（Borrelidin） の類縁化合物４種を単離、構造確認したことが記載されている。
【０００９】
特許文献３には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するＷＢ１８５９株を培養して、得た酸性黄色粉末、ＦＲ９０１４８４物質がすぐれた血管新生阻害作用及び抗腫瘍作用を有することが記載されている。
【００１０】
さらに特許文献４には、微生物の培養液を原料として、血管新生阻害物質をスクリーニングし精製して得たボレリジン（Borrelidin）が血管新生の異常増殖を伴う各種疾患の予防および治療剤として期待されていることが記載されている。
【００１１】
一方、パフィアはブラジルをはじめとする南米地方に特有に自生する植物で、ブラジル人参とも言われ、万病に効くアダプトゲンとして伝承的に利用されてきた。現在では、世界のハーブ療法専門家から認知されており、貧血、疲労、ストレス、糖尿、免疫機能の向上、に効果を示すことが報告されている。この他にも、白血病、関節炎、喘息、高血圧やリウマチ等の慢性疾患にも効果があると言う興味深い知見も報告されている。
【００１２】
特許文献５には、パフィア属に属する植物およびキランソウ属に属する植物からなる群から選ばれる少なくとも１種の植物の粉末、抽出物または該抽出物の粗精製物もしくは精製物が、生体内でのコラーゲン生合成を促進し、組織合成能を回復することが可能であり、加齢変化に伴う組織の疲労、機能の低下を改善することが出来、更には、褥瘡など様々な皮膚創傷、骨粗鬆症等にも効果を発揮し、そして生薬由来のものを有効成分としているため、副作用が比較的少なく、長期間投与が可能であることが記載されている。
【００１３】
パフィアを利用した発明として、特許文献６には、パフィア属植物の加工物を日常的に常用することにより、顕著な抗アレルギー作用を発揮することが記載されている。
【００１４】
特許文献７には、パフィア（Ｐｆａｆｆｉａ）属に属する植物の加工物及びフラボノイドを含んでなる組成物が副作用の低い、健康の維持・増進ならびに疾患の予防・治療に効果を示す組成物であることが記載されている。
【特許文献１】特開2004-196791号公報
【特許文献２】特開平9-227549号公報
【特許文献３】特開平5-255366号公報
【特許文献４】特開平8-173176号公報
【特許文献５】特開2003-277286号公報
【特許文献６】特開2002-308795号公報
【特許文献７】特開平11-100325号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
パフィア根茎の抽出物には、前記したように、様々な生理活性があることが確かめられているが、これらが血管新生阻害効果を持つということはこれまで全く知られていなかった。
【００１６】
本発明は、安価なブラジル産パフィアの根茎から抽出されてなる安全性に優れた血管新生阻害組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究した結果、南米ブラジル産パフィアの根茎から抽出される成分に、優れた血管新生阻害効果が存在することを見いだした。かかる知見に基づき、更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち、本発明は以下の血管新生阻害剤等を提供する。
【００１９】
項１．南米産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【００２０】
項２．項１に記載の血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の予防又は治療剤。
【００２１】
項３．血管新生を伴う疾患が眼科疾患、癌疾患又は皮膚疾患である項２に記載の予防又は治療剤。
【００２２】
項４．項１に記載の血管新生阻害剤を含む飲食品。
【００２３】
項５．前記飲食品が、機能性食品、栄養補助食品又は健康飲食品である項４に記載の飲食品。
【００２４】
以下、本発明を詳述する。
【００２５】
本発明の血管新生阻害剤は、南米産パフィアからの抽出物を有効成分として含有する。
【００２６】
本発明の南米産（特にブラジル産）パフィアの抽出物は、パフィアの根、茎、葉、花、実、種等いずれの部位から抽出されたものでもよい。中でも、パフィアの根茎から抽出したものが好ましい。パフィアは、そのまま抽出に供することができるが、乾燥した後粉砕したうえで抽出に供するのが好ましい。
【００２７】
パフィアの抽出方法としては、例えば、水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法等の公知の方法が用いられる。中でも、溶剤抽出法が好ましく採用される。
【００２８】
具体的には、例えば、次のようにして抽出することができる。まず、パフィア根茎を日光で十分に乾燥させた後、細かく粉砕する。粉砕物にエタノール等のアルコールを添加し、室温にて7〜10日間静置して有効成分を抽出する。このパフィア抽出物は、そのまま血管新生阻害剤として用いることが可能である。
【００２９】
或いは、必要に応じて、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離してもよい。例えば、パフィア抽出物から植物組織等の抽出残渣をろ別して抽出液を得て、該抽出液を濃縮して濃縮液とする。該濃縮液を乾燥して乾燥粉末としてもよい。乾燥は、90〜100℃程度の温度でスプレー・ドライ法を用いて乾燥するのが好ましい。
【００３０】
乾燥粉末の形態は特に限定はなく、用途に応じて適宜その形態を選択できる。例えば、乾燥粉末は、粉体サイズ：90%メッシュ60パス、色：薄褐色、水分：7%以下、pH（25℃）：5.0±0.5、水溶性：有、濃度：0.400±0.05g/cm3の規格のものが例示される。
【００３１】
或いは、必要に応じて、抽出液をアルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、血管新生阻害作用を有する画分を取り出して得られる精製物を、血管新生阻害剤とすることができる。溶出溶媒は、公知のものを用いればよい。
【００３２】
上記のようにして得られるパフィア抽出物（抽出液、濃縮液、精製物等）は、ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞において、管腔形成を優位に阻害する、即ち、優れた血管新生阻害作用を有している。具体的には、実施例１及び２を参照。そのため、パフィア抽出物をそのまま、又は適当な担体、賦型剤、添加物等を併用して血管新生阻害剤とすることができる。本発明の血管新生阻害剤では、その効果が有効に発揮されるかぎり、種々の原料や成分を配合することができ、例えば、通常の飲食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等がよい。また、血管新生を抑制する作用を有する他の素材を併用することもできる。
【００３３】
本発明の血管新生阻害剤は、血管新生阻害剤および血管新生を伴う疾患、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、角膜新生血管症等の眼科疾患、固形腫瘍、血管腫、腫瘍の増殖または転移等の癌疾患、などの予防剤、治療剤および抑制剤として有用である。
【００３４】
次に、本発明の血管新生阻害剤の具体的な態様としては飲食品、食品添加物、食品素材、医薬品、医薬部外品、ペットフード、家畜・家禽用飼料等を例示できる。とりわけ飲食品及び医薬品が好適である。
【００３５】
飲食品の態様としては、パフィア抽出物をそのまま又はこれを含む前記血管新生阻害剤を、液状、ゲル状、粉末状又は固形状の食品に添加した形態が挙げられる。該食品の具体例としては、果実飲料、清涼飲料、茶、スープ、ゼリー、ヨーグルト、プリン、ケーキミックス、ふりかけ、味噌、醤油、ドレッシング、マヨネーズ、焼肉のたれ等の調味料、麺類、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ジャム、牛乳、クリーム、バターやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、オイル、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー等が例示される。
【００３６】
他に、乳液状形態食又は食品業界で一般的に使用される担体を添加した形態などのものを調製してもよい。乳液状形態のものは、例えば、油相部にパフィア抽出物又はこれを含む前記血管新生阻害剤を添加し、更に大豆油、コーン油等の液状の脂肪や、食品用乳化剤として多量に使われている安全性の高い親油性界面活性剤である脂肪酸エステルをはじめ、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルを加え、水相部に、増粘安定剤である増粘多糖類であるカラギーナン、ローカストビーンガム、グァーガム、または、レシチンなどの食品用乳化剤などを添加し、乳化することによって調製できる。
【００３７】
特に飲料の形態としては、ソーダやコーラなどの炭酸系飲料水、フルーツジュースや野菜ジュースなどの非炭酸系飲料水、に加え、スポーツ飲料、中国茶、日本茶、コーヒー、紅茶、ココアなどが挙げられる。
【００３８】
また、必要に応じてグリセロール、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工素材、セルロース末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白質、糖質、色素、香料、その他の前記食用添加剤等と共に粉末、顆粒、ペレット、錠剤等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに成形したり、あるいはドリンク類にして機能性食品、栄養補助食品、健康食品等として利用できる。このとき、血管新生阻害作用を有する公知の食用素材を併用した組成物は好適である。なお、本発明の飲食品は極めて多種類の形態にわたり、前記の例示に限定されるものではないが、前記の機能性食品、栄養補助食品や健康食品の形態が望ましい。
【００３９】
本発明では、飲食品における血管新生阻害剤の配合量は、当該飲食品の種類、形態、利用目的や配合する血管新生阻害剤の種類、形態等により適宜選択することができ、例えば、一般の加工食品類に添加する場合では、飲食品全重量に対し概ね０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜３重量％であればよい。なお、本発明の血管新生阻害剤は安全性が高く、そのまま食用に供しても差し支えない。
【００４０】
医薬品の態様としては、血管新生阻害作用を有効に発揮し得る範囲で、公知の賦形剤や添加剤を必要に応じて加え、常法により加工して錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、経皮吸収剤、注射剤、点眼剤、眼軟膏剤等の製剤とすることができる。これを経口投与、経腸投与、血管投与又は皮内投与して、血管新生の抑制、腫瘍の抑制、免疫賦活のうちの少なくとも１つの作用効果を発現させるために利用でき、及び血管の新生、腫瘍の増殖や転移、免疫能の低下等にともなう各種疾病の予防又は治療のために用いられる。
【００４１】
本発明の血管新生阻害剤の配合量は、その形態や医薬用製剤の種類、形態、用法及び用量等により適宜選択することができ、医薬用製剤全重量に対し概ね０．００１〜７重量％である。経口投与する場合の摂取量は特に限定されるものではないが、パフィア抽出物として、成人（体重６０Ｋｇ）１日あたり０．００１〜２ｇ、好ましくは０．０１〜１ｇを１回または数回に分けて投与すればよい。
【００４２】
特に、本発明の効果を発揮する摂取量としては、成人（体重６０Ｋｇ）１日あたり１００〜３００ｍｇ（特に２００ｍｇ）であり、その製剤形態としては、カプセル剤（粉末）、錠剤、散剤又は顆粒剤が好ましい。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の血管新生阻害剤は、パフィア抽出物を含むものであり、優れた血管新生阻害作用を有している。そのため、飲食品、医薬品等として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１（血管新生阻害試験に用いたサンプルの調製）
まず、パフィア根茎を日光で十分に乾燥させた後、細かく粉砕した。粉砕物にエタノールを添加し、室温にて7日から10日間静置し、有効成分を抽出した。植物組織等の抽出残渣をろ過することにより除去し、抽出液を濃縮した。濃縮液は90−100度の高温下スプレー・ドライ法で乾燥させることにより、乾燥粉末を得た。残った液体画分は賦形剤であるマルトデキストリンに置換した。乾燥粉末は、粉体サイズ：90%メッシュ60パス、色：薄褐色、水分：7%以下、pH（25℃）：5.0±0.5、水溶性：有、濃度：0.400±0.05 g/cm3の規格のものに統一した。
【００４６】
上記のパフィア根茎からの抽出物を2000μg秤量後、1mlの培地で溶解し、ろ過滅菌（0.22μm）後、10倍希釈（2回）を行い、20μg/ml、200μg/mlの濃度のサンプルを調製した。20μg/ml、200μg/ml、2000μg/mlの各濃度のサンプルに管腔形成を促進する標準物質であるVEGF-A（10ng/ml）を同量ずつ混合し、以下の実験に用いた。
【００４７】
評価対照として、管腔形成を促進する標準物質であるVEGF-A（10ng/ml）と管腔形成を阻害する標準物質であるSuramin（50mM）を同量ずつ混合したものを同様に実験に用いた。コントロールとしてVEGF-A（5ng/ml）とSuramin(25mM)を用いた。
【００４８】
実施例２（血管新生阻害実験）
血管新生阻害実験は、血管新生キット（Angiogenesis Kit、製品番号：KZ-1000、クラボウ社製）を用いて次のようにして行った。
【００４９】
ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞を最適濃度で共培養し、管腔形成初期段階の増殖状態にあるものに上記各サンプルを添加し、11日間培養（4,7,9日後にサンプルを含む培地を交換）後、管腔形成をMouse anti-human CD31とGoat anti-mouse IgG AlkP Conjugateを用いて染色後、顕微鏡観察した。血管新生阻害効果について、形成された管腔様網目構造を評価した。
【００５０】
その結果を図１〜図６に示す。
【００５１】
図１はVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、明確な管腔が形成されていることが観察される。
【００５２】
図２はSuramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔はほとんど形成されていない。
【００５３】
図３はVEGF-A5ng/mlとSuramin 25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔の形成は認められるが、図１に比べてSuraminによって阻害されていることが判る。
【００５４】
図４はパフィア抽出物1000μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔はほとんど形成されていない。
【００５５】
図５はパフィア抽出物100μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔形成がパフィアによって阻害されていることが観察される。
【００５６】
図６はパフィア抽出物10μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔の形成は認められるが、Suraminと同程度あるいはそれ以上パフィアによって阻害されていることが判る。
【００５７】
さらに、各well（ウェル）の中央付近の４点の顕微鏡写真を撮影後、血管新生定量ソフトウェア（Angiogenesis Image Analyzer、製品番号：V.2.0.0、クラボウ社製）を用いて、これらの結果を定量的に評価した。上記の血管新生阻害実験において、形成された管腔の面積と長さの平均値（ｎ＝４）を比較したものである。値が小さいほど血管新生活性が阻害されていることを意味する。その結果を、表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
これらの結果より、パフィア抽出物は、濃度に依存して管腔形成を阻害し、1000μgでは完全に管腔形成を阻害した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】VEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図２】Suramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図３】VEGF-A5ng/mlとSuramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図４】パフィア抽出物1000μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図５】パフィア抽出物100μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図６】パフィア抽出物10μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、南米ブラジル産パフィア由来の成分を有効成分とする血管新生阻害作用を有する組成物に関するものである。さらに詳しくは、本発明はパフィアの根からの抽出物を有効成分とする血管新生阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、わが国の死因の第一位の疾患であり、罹患率も一貫して増加し続けている。厚生労働省の人口動態統計によると、現在では３人に1人という高い割合で、何らかの悪性腫瘍が原因で死亡している。
【０００３】
悪性腫瘍の治療法としては、医療現場では主に薬物、化学、物理などの各療法により、悪性腫瘍を直接攻撃するという対症療法が施されている。しかし、これらの方法では、悪性腫瘍だけでなく周りの正常な組織にも障害を与え、さらに生体が本来持っている免疫力や自然治癒力までも急激に低下させることになり、それが原因で患者が死に至る場合が多い。このようなことから、副作用の少ない安全な治療法に対する要望は日々高まりを見せており、罹患した場合の新たな治療法の開発に加えて、罹患しないための予防にも重点がおかれるようになっている。
【０００４】
最近、新たな悪性腫瘍の治療法として、悪性腫瘍組織の血管の新生を阻害することを応用する方法が注目されている。悪性腫瘍組織は、血管新生を促進するための物質を産生することで、自らの組織に栄養分や酸素等を吸収するための血管を新たに形成し、十分な血液を供給し続け、異常な増殖を繰り返すという性質を持っている。血管新生阻害作用を応用した悪性腫瘍の治療は、この腫瘍組織への血液の経路を遮断して腫瘍組織の増殖を防ぐものである。
【０００５】
血管新生抑制作用は、悪性腫瘍のみではなく、加齢性黄斑変性症、リウマチ、関節症、糖尿病や糖尿病性網膜症、心臓病、動脈硬化、腎臓病、その他の様々な疾患に深く関与していることから、これらの疾患に対して予防および副作用が無く安全に治療する上においても、天然物由来の血管新生抑制作用を有する物質の早期提供が強く求められており、今や、世界中の製薬企業が血管新生阻害剤の探索・開発に取り組んでいる。
【０００６】
血管新生阻害作用を有する天然物由来の活性成分としては、例えば、特許文献１〜４に報告例がある。
【０００７】
特許文献１には、血管新生阻害活性を有するシイタケ菌糸体抽出物、および血管新生を阻害すべき疾患を治療するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む医薬組成物、もしくは血管新生を阻害するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物が記載されている。
【０００８】
特許文献２には、Streptomyces系微生物の培養液を原料として、血管新生阻害物質をスクリーニングし精製した結果、ボレリジン（Borrelidin） の類縁化合物４種を単離、構造確認したことが記載されている。
【０００９】
特許文献３には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するＷＢ１８５９株を培養して、得た酸性黄色粉末、ＦＲ９０１４８４物質がすぐれた血管新生阻害作用及び抗腫瘍作用を有することが記載されている。
【００１０】
さらに特許文献４には、微生物の培養液を原料として、血管新生阻害物質をスクリーニングし精製して得たボレリジン（Borrelidin）が血管新生の異常増殖を伴う各種疾患の予防および治療剤として期待されていることが記載されている。
【００１１】
一方、パフィアはブラジルをはじめとする南米地方に特有に自生する植物で、ブラジル人参とも言われ、万病に効くアダプトゲンとして伝承的に利用されてきた。現在では、世界のハーブ療法専門家から認知されており、貧血、疲労、ストレス、糖尿、免疫機能の向上、に効果を示すことが報告されている。この他にも、白血病、関節炎、喘息、高血圧やリウマチ等の慢性疾患にも効果があると言う興味深い知見も報告されている。
【００１２】
特許文献５には、パフィア属に属する植物およびキランソウ属に属する植物からなる群から選ばれる少なくとも１種の植物の粉末、抽出物または該抽出物の粗精製物もしくは精製物が、生体内でのコラーゲン生合成を促進し、組織合成能を回復することが可能であり、加齢変化に伴う組織の疲労、機能の低下を改善することが出来、更には、褥瘡など様々な皮膚創傷、骨粗鬆症等にも効果を発揮し、そして生薬由来のものを有効成分としているため、副作用が比較的少なく、長期間投与が可能であることが記載されている。
【００１３】
パフィアを利用した発明として、特許文献６には、パフィア属植物の加工物を日常的に常用することにより、顕著な抗アレルギー作用を発揮することが記載されている。
【００１４】
特許文献７には、パフィア（Ｐｆａｆｆｉａ）属に属する植物の加工物及びフラボノイドを含んでなる組成物が副作用の低い、健康の維持・増進ならびに疾患の予防・治療に効果を示す組成物であることが記載されている。
【特許文献１】特開2004-196791号公報
【特許文献２】特開平9-227549号公報
【特許文献３】特開平5-255366号公報
【特許文献４】特開平8-173176号公報
【特許文献５】特開2003-277286号公報
【特許文献６】特開2002-308795号公報
【特許文献７】特開平11-100325号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
パフィア根茎の抽出物には、前記したように、様々な生理活性があることが確かめられているが、これらが血管新生阻害効果を持つということはこれまで全く知られていなかった。
【００１６】
本発明は、安価なブラジル産パフィアの根茎から抽出されてなる安全性に優れた血管新生阻害組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究した結果、南米ブラジル産パフィアの根茎から抽出される成分に、優れた血管新生阻害効果が存在することを見いだした。かかる知見に基づき、更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち、本発明は以下の血管新生阻害剤等を提供する。
【００１９】
項１．南米産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【００２０】
項２．項１に記載の血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の予防又は治療剤。
【００２１】
項３．血管新生を伴う疾患が眼科疾患、癌疾患又は皮膚疾患である項２に記載の予防又は治療剤。
【００２２】
項４．項１に記載の血管新生阻害剤を含む飲食品。
【００２３】
項５．前記飲食品が、機能性食品、栄養補助食品又は健康飲食品である項４に記載の飲食品。
【００２４】
以下、本発明を詳述する。
【００２５】
本発明の血管新生阻害剤は、南米産パフィアからの抽出物を有効成分として含有する。
【００２６】
本発明の南米産（特にブラジル産）パフィアの抽出物は、パフィアの根、茎、葉、花、実、種等いずれの部位から抽出されたものでもよい。中でも、パフィアの根茎から抽出したものが好ましい。パフィアは、そのまま抽出に供することができるが、乾燥した後粉砕したうえで抽出に供するのが好ましい。
【００２７】
パフィアの抽出方法としては、例えば、水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法等の公知の方法が用いられる。中でも、溶剤抽出法が好ましく採用される。
【００２８】
具体的には、例えば、次のようにして抽出することができる。まず、パフィア根茎を日光で十分に乾燥させた後、細かく粉砕する。粉砕物にエタノール等のアルコールを添加し、室温にて7〜10日間静置して有効成分を抽出する。このパフィア抽出物は、そのまま血管新生阻害剤として用いることが可能である。
【００２９】
或いは、必要に応じて、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離してもよい。例えば、パフィア抽出物から植物組織等の抽出残渣をろ別して抽出液を得て、該抽出液を濃縮して濃縮液とする。該濃縮液を乾燥して乾燥粉末としてもよい。乾燥は、90〜100℃程度の温度でスプレー・ドライ法を用いて乾燥するのが好ましい。
【００３０】
乾燥粉末の形態は特に限定はなく、用途に応じて適宜その形態を選択できる。例えば、乾燥粉末は、粉体サイズ：90%メッシュ60パス、色：薄褐色、水分：7%以下、pH（25℃）：5.0±0.5、水溶性：有、濃度：0.400±0.05g/cm3の規格のものが例示される。
【００３１】
或いは、必要に応じて、抽出液をアルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、血管新生阻害作用を有する画分を取り出して得られる精製物を、血管新生阻害剤とすることができる。溶出溶媒は、公知のものを用いればよい。
【００３２】
上記のようにして得られるパフィア抽出物（抽出液、濃縮液、精製物等）は、ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞において、管腔形成を優位に阻害する、即ち、優れた血管新生阻害作用を有している。具体的には、実施例１及び２を参照。そのため、パフィア抽出物をそのまま、又は適当な担体、賦型剤、添加物等を併用して血管新生阻害剤とすることができる。本発明の血管新生阻害剤では、その効果が有効に発揮されるかぎり、種々の原料や成分を配合することができ、例えば、通常の飲食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等がよい。また、血管新生を抑制する作用を有する他の素材を併用することもできる。
【００３３】
本発明の血管新生阻害剤は、血管新生阻害剤および血管新生を伴う疾患、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、角膜新生血管症等の眼科疾患、固形腫瘍、血管腫、腫瘍の増殖または転移等の癌疾患、などの予防剤、治療剤および抑制剤として有用である。
【００３４】
次に、本発明の血管新生阻害剤の具体的な態様としては飲食品、食品添加物、食品素材、医薬品、医薬部外品、ペットフード、家畜・家禽用飼料等を例示できる。とりわけ飲食品及び医薬品が好適である。
【００３５】
飲食品の態様としては、パフィア抽出物をそのまま又はこれを含む前記血管新生阻害剤を、液状、ゲル状、粉末状又は固形状の食品に添加した形態が挙げられる。該食品の具体例としては、果実飲料、清涼飲料、茶、スープ、ゼリー、ヨーグルト、プリン、ケーキミックス、ふりかけ、味噌、醤油、ドレッシング、マヨネーズ、焼肉のたれ等の調味料、麺類、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ジャム、牛乳、クリーム、バターやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、オイル、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー等が例示される。
【００３６】
他に、乳液状形態食又は食品業界で一般的に使用される担体を添加した形態などのものを調製してもよい。乳液状形態のものは、例えば、油相部にパフィア抽出物又はこれを含む前記血管新生阻害剤を添加し、更に大豆油、コーン油等の液状の脂肪や、食品用乳化剤として多量に使われている安全性の高い親油性界面活性剤である脂肪酸エステルをはじめ、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルを加え、水相部に、増粘安定剤である増粘多糖類であるカラギーナン、ローカストビーンガム、グァーガム、または、レシチンなどの食品用乳化剤などを添加し、乳化することによって調製できる。
【００３７】
特に飲料の形態としては、ソーダやコーラなどの炭酸系飲料水、フルーツジュースや野菜ジュースなどの非炭酸系飲料水、に加え、スポーツ飲料、中国茶、日本茶、コーヒー、紅茶、ココアなどが挙げられる。
【００３８】
また、必要に応じてグリセロール、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工素材、セルロース末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白質、糖質、色素、香料、その他の前記食用添加剤等と共に粉末、顆粒、ペレット、錠剤等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに成形したり、あるいはドリンク類にして機能性食品、栄養補助食品、健康食品等として利用できる。このとき、血管新生阻害作用を有する公知の食用素材を併用した組成物は好適である。なお、本発明の飲食品は極めて多種類の形態にわたり、前記の例示に限定されるものではないが、前記の機能性食品、栄養補助食品や健康食品の形態が望ましい。
【００３９】
本発明では、飲食品における血管新生阻害剤の配合量は、当該飲食品の種類、形態、利用目的や配合する血管新生阻害剤の種類、形態等により適宜選択することができ、例えば、一般の加工食品類に添加する場合では、飲食品全重量に対し概ね０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜３重量％であればよい。なお、本発明の血管新生阻害剤は安全性が高く、そのまま食用に供しても差し支えない。
【００４０】
医薬品の態様としては、血管新生阻害作用を有効に発揮し得る範囲で、公知の賦形剤や添加剤を必要に応じて加え、常法により加工して錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、経皮吸収剤、注射剤、点眼剤、眼軟膏剤等の製剤とすることができる。これを経口投与、経腸投与、血管投与又は皮内投与して、血管新生の抑制、腫瘍の抑制、免疫賦活のうちの少なくとも１つの作用効果を発現させるために利用でき、及び血管の新生、腫瘍の増殖や転移、免疫能の低下等にともなう各種疾病の予防又は治療のために用いられる。
【００４１】
本発明の血管新生阻害剤の配合量は、その形態や医薬用製剤の種類、形態、用法及び用量等により適宜選択することができ、医薬用製剤全重量に対し概ね０．００１〜７重量％である。経口投与する場合の摂取量は特に限定されるものではないが、パフィア抽出物として、成人（体重６０Ｋｇ）１日あたり０．００１〜２ｇ、好ましくは０．０１〜１ｇを１回または数回に分けて投与すればよい。
【００４２】
特に、本発明の効果を発揮する摂取量としては、成人（体重６０Ｋｇ）１日あたり１００〜３００ｍｇ（特に２００ｍｇ）であり、その製剤形態としては、カプセル剤（粉末）、錠剤、散剤又は顆粒剤が好ましい。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の血管新生阻害剤は、パフィア抽出物を含むものであり、優れた血管新生阻害作用を有している。そのため、飲食品、医薬品等として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１（血管新生阻害試験に用いたサンプルの調製）
まず、パフィア根茎を日光で十分に乾燥させた後、細かく粉砕した。粉砕物にエタノールを添加し、室温にて7日から10日間静置し、有効成分を抽出した。植物組織等の抽出残渣をろ過することにより除去し、抽出液を濃縮した。濃縮液は90−100度の高温下スプレー・ドライ法で乾燥させることにより、乾燥粉末を得た。残った液体画分は賦形剤であるマルトデキストリンに置換した。乾燥粉末は、粉体サイズ：90%メッシュ60パス、色：薄褐色、水分：7%以下、pH（25℃）：5.0±0.5、水溶性：有、濃度：0.400±0.05 g/cm3の規格のものに統一した。
【００４６】
上記のパフィア根茎からの抽出物を2000μg秤量後、1mlの培地で溶解し、ろ過滅菌（0.22μm）後、10倍希釈（2回）を行い、20μg/ml、200μg/mlの濃度のサンプルを調製した。20μg/ml、200μg/ml、2000μg/mlの各濃度のサンプルに管腔形成を促進する標準物質であるVEGF-A（10ng/ml）を同量ずつ混合し、以下の実験に用いた。
【００４７】
評価対照として、管腔形成を促進する標準物質であるVEGF-A（10ng/ml）と管腔形成を阻害する標準物質であるSuramin（50mM）を同量ずつ混合したものを同様に実験に用いた。コントロールとしてVEGF-A（5ng/ml）とSuramin(25mM)を用いた。
【００４８】
実施例２（血管新生阻害実験）
血管新生阻害実験は、血管新生キット（Angiogenesis Kit、製品番号：KZ-1000、クラボウ社製）を用いて次のようにして行った。
【００４９】
ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞を最適濃度で共培養し、管腔形成初期段階の増殖状態にあるものに上記各サンプルを添加し、11日間培養（4,7,9日後にサンプルを含む培地を交換）後、管腔形成をMouse anti-human CD31とGoat anti-mouse IgG AlkP Conjugateを用いて染色後、顕微鏡観察した。血管新生阻害効果について、形成された管腔様網目構造を評価した。
【００５０】
その結果を図１〜図６に示す。
【００５１】
図１はVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、明確な管腔が形成されていることが観察される。
【００５２】
図２はSuramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔はほとんど形成されていない。
【００５３】
図３はVEGF-A5ng/mlとSuramin 25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔の形成は認められるが、図１に比べてSuraminによって阻害されていることが判る。
【００５４】
図４はパフィア抽出物1000μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔はほとんど形成されていない。
【００５５】
図５はパフィア抽出物100μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔形成がパフィアによって阻害されていることが観察される。
【００５６】
図６はパフィア抽出物10μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真であり、管腔の形成は認められるが、Suraminと同程度あるいはそれ以上パフィアによって阻害されていることが判る。
【００５７】
さらに、各well（ウェル）の中央付近の４点の顕微鏡写真を撮影後、血管新生定量ソフトウェア（Angiogenesis Image Analyzer、製品番号：V.2.0.0、クラボウ社製）を用いて、これらの結果を定量的に評価した。上記の血管新生阻害実験において、形成された管腔の面積と長さの平均値（ｎ＝４）を比較したものである。値が小さいほど血管新生活性が阻害されていることを意味する。その結果を、表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
これらの結果より、パフィア抽出物は、濃度に依存して管腔形成を阻害し、1000μgでは完全に管腔形成を阻害した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】VEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図２】Suramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図３】VEGF-A5ng/mlとSuramin25mMを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図４】パフィア抽出物1000μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図５】パフィア抽出物100μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【図６】パフィア抽出物10μgとVEGF-A5ng/mlを用いて血管内皮細胞の管腔形成の様子を顕微鏡観察した写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
南米産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
血管新生を伴う疾患が眼科疾患、癌疾患又は皮膚疾患である請求項２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
請求項１に記載の血管新生阻害剤を含む飲食品。
【請求項５】
前記飲食品が、機能性食品、栄養補助食品又は健康飲食品である請求項４に記載の飲食品。
【請求項１】
南米産パフィアの抽出物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の血管新生阻害剤を含む血管新生を伴う疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
血管新生を伴う疾患が眼科疾患、癌疾患又は皮膚疾患である請求項２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
請求項１に記載の血管新生阻害剤を含む飲食品。
【請求項５】
前記飲食品が、機能性食品、栄養補助食品又は健康飲食品である請求項４に記載の飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２７３７３９（Ｐ２００６−２７３７３９Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９３７２６（Ｐ２００５−９３７２６）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３０００６１１１２）株式会社ラティーナ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３０００６１１１２）株式会社ラティーナ (2)
【Ｆターム（参考）】
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